1 zusammenfassung
Werbung
Aktivitätserhöhung der α-Sekretasen ADAM10 und TACE bei der Proteolyse des Amyloid-Vorläuferproteins DISSERTATION zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ am Fachbereich Chemie und Pharmazie der JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITÄT in Mainz ANDREAS ANDERS geboren in Bad Homburg vor der Höhe Mainz 2001 Fachbereich Chemie und Pharmazie der Johannes Gutenberg-Universität Dekan: 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatter: Datum der mündlichen Prüfung: 12.11.2001 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 1 2 EINLEITUNG .................................................................................................. 3 2.1 NEUROCHEMIE DER ALZHEIMER-DEMENZ ............................................................ 3 2.1.1 Die zentrale Rolle des β-Amyloidpeptids........................................................... 4 2.1.2 Die Konkurrenz zwischen der α- und der β-Sekretase ...................................... 7 2.1.2.1 Disintegrin-Metalloproteinasen.......................................................................... 8 2.1.2.2 Die α-Sekretase TACE ................................................................................... 11 2.1.2.3 Die α-Sekretase ADAM10............................................................................... 14 2.1.2.4 Die β-Sekretase BACE ................................................................................... 15 2.2 DIE FAMILIE DER PROPROTEIN-KONVERTASEN .................................................. 17 2.2.1 Die Proprotein-Konvertase Furin..................................................................... 20 2.2.2 Die Proprotein-Konvertase PC7...................................................................... 21 2.2.3 Die Substratspezifität der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin.................. 22 2.3 ZIELSETZUNG ................................................................................................... 24 3 MATERIALIEN ............................................................................................. 27 3.1 CHEMIKALIEN UND HILFSMITTEL ........................................................................ 27 3.1.1 Allgemeine Laborchemikalien ......................................................................... 27 3.1.2 Enzyme und Kitsysteme ................................................................................. 29 3.1.3 Antikörper ....................................................................................................... 29 3.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze ......................................................................... 30 3.2 MATERIALIEN ................................................................................................... 30 3.2.1 Laborgeräte .................................................................................................... 30 3.2.2 Materialien für die Molekular- und Zellbiologie ................................................ 32 3.2.2.1 Plasmide......................................................................................................... 32 3.2.2.2 Oligonukleotide............................................................................................... 33 3.2.2.3 Bakterienstämme............................................................................................ 33 3.2.2.4 Zell-Linien ....................................................................................................... 34 3.3 STAMMLÖSUNGEN, PUFFER UND ZELLKULTURMEDIEN ....................................... 34 4 METHODEN ................................................................................................. 41 4.1 ARBEITEN MIT ESCHERICHIA COLI ..................................................................... 41 4.1.1 Kultivierung von E. coli.................................................................................... 41 4.1.2 Herstellung transformationskompetenter E. coli .............................................. 41 4.1.3 Transformation von E. coli .............................................................................. 41 4.1.4 Lagerung von E. coli ....................................................................................... 42 4.2 ARBEITEN MIT NUKLEINSÄUREN ........................................................................ 42 4.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli.......................................................... 42 4.2.1.1 Plasmidschnellpräparation zur Analyse von E. coli-Transformanden .............. 42 4.2.1.2 Plasmidpräparation unter Verwendung von Silicagelmatrix-Säulen................. 43 4.2.1.3 Plasmidgroßpräparation.................................................................................. 43 4.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren ................................................................. 44 4.2.3 Reinigung und Fällung von Nukleinsäuren...................................................... 44 I INHALTSVERZEICHNIS 4.2.3.1 PCI-Extraktion .................................................................................................44 4.2.3.2 Fällung von DNA durch Alkohole.....................................................................45 4.2.3.3 Fällung von DNA durch Polyethylenglykol .......................................................46 4.2.3.4 Reinigung von PCR-Amplifikaten ....................................................................46 4.2.4 Elektrophorese zur Analyse und Isolierung von Nukleinsäuren .......................46 4.2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese.............................................................................46 4.2.4.2 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen .............................................47 4.2.5 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren ................................................47 4.2.5.1 Restriktionshydrolyse von Nukleinsäuren ........................................................47 4.2.5.2 Modifizierung von DNA-Enden mit T4-DNA-Polymerase .................................48 4.2.5.3 Dephosphorylierung von 5´-DNA-Enden..........................................................48 4.2.5.4 Phosphorylierung der 5'-Enden von PCR-Produkten .......................................48 4.2.5.5 Ligation von DNA-Molekülen ...........................................................................49 4.2.6 DNA-Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .....................49 4.2.6.1 PCR-Mutagenese............................................................................................50 4.3 ARBEITEN MIT EUKARYONTISCHEN ZELLEN.........................................................50 4.3.1 Kultivierung und Konservierung von Zellen......................................................50 4.3.1.1 Kultivierung eukaryontischer Zellen .................................................................50 4.3.1.2 Passagieren von Zellen ...................................................................................50 4.3.1.3 Kryokonservierung ..........................................................................................51 4.3.2 Zellzahlbestimmung ........................................................................................51 4.3.3 Transfektion adhärenter Zellen........................................................................52 4.3.4 Beschichtung von Zellkulturschalen mit Poly-L-Lysin.......................................53 4.4 BIOTINYLIERUNG VON ZELLOBERFLÄCHENPROTEINEN ........................................53 4.5 DEGLYKOSYLIERUNG ........................................................................................54 4.5.1 Membranpräparation zur Deglykosylierung von ADAM10................................54 4.5.2 Deglykosylierung von ADAM10 .......................................................................54 4.5.2.1 Deglykosylierung mit N-Glykosidase F ............................................................55 4.5.2.2 Deglykosylierung mit Endoglykosidase H ........................................................55 4.5.3 Chloroform-Methanol-Fällung von Proteinen ...................................................56 4.6 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD ...........................56 4.7 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN ................................................57 4.7.1 Nachweis membranständiger Proteine eukaryontischer Zellen........................57 4.7.2 Immunpräzipitation von ADAM10 ....................................................................57 4.7.3 Nachweis von APPsα im Zellkulturüberstand ..................................................58 4.7.4 Nachweis des SEAPs/APP119-Reporterproteins im Zellkulturüberstand...........59 4.7.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...........................................................59 4.7.5.1 Herstellung der Gele........................................................................................59 4.7.5.2 Vorbereitung der Proben .................................................................................60 4.7.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...........................................................60 4.7.6 Western-Blot-Analyse......................................................................................61 4.7.6.1 Elektro-Blot......................................................................................................61 4.7.6.2 Chemilumineszenz-vermittelter Proteinnachweis.............................................61 4.7.6.3 Radioaktiv-vermittelte Proteindetektion ...........................................................62 5 ERGEBNISSE...............................................................................................63 ENTWICKLUNG EINES VERFAHRENS ZUR REIHENUNTERSUCHUNG α-SEKRETASESTIMULIERENDER SUBSTANZEN ..........................................................................63 5.1.1 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein mit der cDNA der α-Sekretase ADAM10 in einen Expressionsvektor...........................................64 5.1.1.1 Amplifizierung einer kodierenden DNA-Sequenz für die sekretierte alkalische Phosphatase ...................................................................................64 5.1.1.2 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein aus SEAPs und APP119 ..........65 5.1 II INHALTSVERZEICHNIS 5.1.1.3 Klonierung eines Vektors für ein Reporterprotein und ADAM10...................... 65 5.1.2 Optimierung der Testbedingungen.................................................................. 66 5.1.2.1 Einfluss der Temperatur und der Reaktionsdauer ........................................... 68 5.1.2.2 Einfluss des pH-Werts .................................................................................... 70 5.1.2.3 Überprüfung der Linearität der enzymatischen Reaktion................................. 71 5.1.2.4 Inhibierung der endogenen alkalischen Phosphatase ..................................... 74 5.1.2.5 Die Freisetzung von APPs in HEK293-SEAPs/APP........................................ 76 5.1.3 Die Stimulierbarkeit des SEAPs/APP119-Reporterproteins............................... 77 5.1.4 Kinetik der PMA-Stimulierung ......................................................................... 79 5.2 PROTEOLYTISCHE PROZESSIERUNG VON ADAM10............................................ 80 5.2.1 Prozessierung von ADAM10 durch Proprotein-Konvertasen........................... 80 5.2.2 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 durch PC7 und Furin .................. 81 5.2.2.1 PCR-Mutagenese zur Beseitigung der Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle .... 81 5.2.2.2 Klonierung der cDNAs von PC7 und Furin in pIRES1hyg ............................... 82 5.2.2.3 Auswirkung der mutierten Spaltstelle und der Überexpression von PC7 und Furin auf die Prozessierung von ADAM10........................................ 83 5.2.3 Prozessierung von ADAM10 in Furin-defizienten LoVo-Zellen ........................ 87 5.2.4 Zusammenhang zwischen der Prozessierung von ADAM10 und der APPsα-Sekretion ............................................................................................ 88 5.2.5 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 im sekretorischen Weg ............... 90 5.3 PROTEOLYTISCHE PROZESSIERUNG VON TACE................................................. 94 5.3.1 Die Auswirkung der Inhibierung von Proprotein-Konvertasen auf die Prozessierung von TACE .................................................................... 94 5.3.2 Proteolytische Prozessierung von TACE durch PC7 und Furin ....................... 95 5.3.3 Proteolytische Prozessierung von TACE in der Abwesenheit von Furin.......... 97 6 DISKUSSION ............................................................................................... 99 ENTWICKLUNG EINES VERFAHRENS ZUR REIHENUNTERSUCHUNG α-SEKRETASESTIMULIERENDER SUBSTANZEN ......................................................................... 99 6.1.1 Etablierung und Optimierung des Testsystems............................................. 100 6.2 PROTEOLYTISCHE PROZESSIERUNG VON ADAM10.......................................... 101 6.1 6.3 6.4 PROTEOLYTISCHE PROZESSIERUNG VON TACE............................................... 109 AUSBLICK ...................................................................................................... 111 7 ANHANG .................................................................................................... 113 7.1 7.1.1 KLONIERUNGSSCHEMATA ............................................................................... 113 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein mit der cDNA der α-Sekretase ADAM10 in einen Expressionsvektor........................................ 113 7.1.1.1 Klonierung einer verkürzten alkalischen Phosphatase in pcDNA3 ................ 113 7.1.1.2 Klonierung eines Reporterproteins................................................................ 114 7.1.1.3 Klonierung des Reporterproteins und ADAM10 in einen Vektor .................... 115 7.1.2 Klonierung der kodierenden Sequenz für ADAM10∆RKKR in pcDNA3 ......... 116 7.2 PROTEINSEQUENZ DES SEAPS/APP119-FUSIONSPROTEINS .............................. 117 7.3 INTERNE BEZEICHNUNGEN DER HERGESTELLTEN PLASMIDE ............................. 117 8 ABKÜRZUNGEN ....................................................................................... 119 9 LITERATUR ............................................................................................... 123 III ZUSAMMENFASSUNG 1 1 ZUSAMMENFASSUNG In den Gehirnen von Alzheimer-Patienten werden sogenannte β-Amyloid-Plaques gefunden, deren Hauptbestandteile die neurotoxischen β-Amyloid-Peptide (Aβ) sind. Den ersten Schritt der Aβ-Entstehung stellt die proteolytische Prozessierung des membranständigen Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die β-Sekretase dar. Die darauffolgende enzymatische Aktivität der γ-Sekretase resultiert schließlich in der Freisetzung des Aβ-Peptids von der Zellmembran. Daneben wird APP im Verlauf des nicht-amyloidogenen Wegs innerhalb der Aβ-Sequenz durch die α-Sekretase prozessiert, wobei das neuroprotektive APPsα freigesetzt und die Aβ-Entstehung verhindert wird. Die Stimulierung der α-Sekretase ADAM10 könnte somit den nicht-amyloidogenen Weg begünstigen und eine übermäßige Produktion der Aβ-Peptide abwenden. Zum Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen konnte ein Testsystem entwickelt werden, dass auf der Fusion der 119 C-terminalen Aminosäurereste des Amyloid-Vorläuferproteins mit der als Reporterprotein fungierenden sekretierten alkalischen Phosphatase aus der menschlichen Plazenta beruht. Das erzeugte Fusionsprotein deckt sowohl die Sequenz des Aβ-Peptids als auch die Transmembran- und die zytoplasmatische Domäne des Amyloid-Vorläuferproteins ab. Wird es in adhäsiv wachsenden Zellen zur Expression gebracht, so kann es stellvertretend für das freigesetzte endogene APP durch seine alkalische Phosphataseaktivität photometrisch im Zellkulturüberstand quantifiziert werden. Durch die Untersuchung der Stimulierbarkeit des Fusionsproteins konnte sichergestellt werden, dass es sich wie endogenes APP verhält und somit zum Auffinden α-Sekretasestimulierender Substanzen geeignet ist. Die Koexpression des Reporterproteins zusammen mit der α-Sekretase ADAM10 ermöglicht es, mit diesem Testverfahren Substanzen, die aktivierend auf den nicht-amyloidogenen Weg des Amyloid- Vorläuferproteins wirken, schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit zu ermitteln. Die α-Sekretase ADAM10 wird als Zymogen synthetisiert und besitzt eine ProproteinKonvertasen-Erkennungssequenz (RKKR) zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne. Mit Hilfe des synthetischen Proprotein-Konvertasen-Inhibitors Decanoyl-RVKR-chloromethylketon konnte nachgewiesen werden, dass ProproteinKonvertasen an der Prozessierung des ADAM10-Zymogens beteiligt sind. Zudem wurde ADAM10 durch die Überexpression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in HEK293-Zellen in einem größeren Umfang prozessiert, so dass mehr reifes ADAM10 entstand, welches wiederum größere Mengen des neuroprotektiven APPsα von der Zellmembran freisetzte. Im Gegensatz dazu konnte mutiertes ADAM10 ohne Proprotein- ZUSAMMENFASSUNG 2 Konvertasen-Spaltstelle auch durch eine Überexpression von PC7 nicht mehr in die katalytisch aktive Form überführt werden, was eine verringerte α-Sekretaseaktivität zur Folge hatte. Damit konnte insbesondere die Bedeutung der Proprotein-Konvertase PC7 für die α-Sekretase-Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins aufgeklärt werden: PC7 leistet zwar einen Beitrag zur α-Sekretase-Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins, jedoch nicht durch eine direkte Prozessierung von APP sondern durch die Aktivierung der α-Sekretase ADAM10. PC7 fungiert demnach wie Furin als α-Sekretase-aktivierendes Enzym. Durch die Deglykosylierung von ADAM10 mit der N-Glykosidase F und der Endoglykosidase H konnte das zelluläre Kompartiment, in dem die Entfernung der Prodomäne erfolgt, näher bestimmt werden. Dem Deglykosylierungsmuster von ADAM10 zufolge wird die Prodomäne im trans-Golgi-Apparat oder in nachfolgenden Kompartimenten entfernt. Dies stimmt mit einer Beteiligung der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin an diesem Vorgang überein, da sie in genau diesen Zellkompartimenten katalytische Aktivität aufweisen. Diese Ergebnisse vertiefen das Verständnis der Regulationsmechanismen, denen die pathologisch bedeutsame Disintegrin-Metalloproteinase ADAM10 unterworfen ist und sollen dazu beitragen, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung zu entwickeln. Die Disintegrin-Metalloproteinase TACE (ADAM17) wird ebenfalls als inaktives Zymogen synthetisiert und besitzt wie ADAM10 sowohl eine α-Sekretaseaktivität als auch eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz (RVKR). Zudem erfolgt die proteolytische Entfernung der Prodomäne wie bei ADAM10 in einem späten Golgi-Kompartiment innerhalb des sekretorischen Wegs. Daher erscheint eine Beteiligung von ProproteinKonvertasen an der Prozessierung von TACE als sehr wahrscheinlich. Nach der Analyse von HEK293-Zellen, die mit dem Proprotein-Konvertasen-Inhibitor Decanoyl-RVKR-chloromethylketon inkubiert wurden, konnte die Mitwirkung von Proprotein-Konvertasen an der TACE-Prozessierung bestätigt werden. Zudem resultierte sowohl die Überexpression von PC7 als auch die von Furin in HEK293-Zellen in einer erhöhten Menge der prozessierten Form von endogenem TACE. Demzufolge wird TACE von beiden Proprotein-Konvertasen in die aktive Form überführt. Obwohl die ProproteinKonvertasen-Erkennungssequenzen von ADAM10 und TACE geringfügig voneinander abweichen, konnte bei ihrer Aktivierung durch Proprotein-Konvertasen kein wesentlicher Unterschied festgestellt werden. Auch in Furin-defizienten LoVo-Zellen konnte eine proteolytische Entfernung der Prodomänen von ADAM10 und TACE beobachtet werden. Sowohl ADAM10 als auch TACE können folglich in Abwesenheit von Furin prozessiert werden. Die Aktivierung der Disintegrin-Metalloproteinasen ADAM10 und TACE erfolgt somit in sehr ähnlicher Weise. EINLEITUNG 3 2 EINLEITUNG 2.1 Neurochemie der Alzheimer-Demenz V on allen Demenzformen ist die Alzheimer-Krankheit die häufigste (Citron, 2000). Sie ist gekennzeichnet durch einen allmählichen, jedoch stetig voranschreitenden Verlust an Neuronen und damit verbunden mit einem generellen Rückgang der kognitiven Fähigkeiten. Nach zunehmenden Gedächtnis- und Orientierungsstörungen leiden die Erkrankten unter einem wachsenden Verlust ihres Denk- und Urteilsvermögens, ihrer Sprache, verlieren schließlich ihre Persönlichkeit und sind vollständig auf die Hilfe Dritter angewiesen. Klassische neuropathologische Merkmale sind Proteinablagerungen in Form von neurofibrillären Bündeln, die sich erst spät im Krankheitsverlauf zeigen und von extrazellulären amyloiden Plaques (Selkoe, 1999, 2001). Amyloide Plaques, auch senile Plaques genannt, treten schon früh im Krankheitsverlauf auf und ihr massives Vorkommen im Hippocampus und der Großhirnrinde ist für die Alzheimer-Krankheit kennzeichnend. Sie bestehen vor allem aus den neurotoxischen β-Amyloidpeptiden (Aβ, Yankner, 1996). Diese können Nervenzellen auf mehrere Weisen schädigen: durch Störung der Calciumregulation (Luo et al., 1995, Wolozin et al., 1995), indem sie die Entstehung freier Radikale fördern (Behl et al., 1994, Harris et al., 1995) oder auch indem sie entzündliche Reaktionen auslösen, an denen Mikrogliazellen beteiligt sind (McGeer und McGeer, 1995, Weninger und Yankner, 2001). Bei den neurofibrillären Bündeln handelt es sich um intrazelluläre Aggregate aus dem hyperphosphorylierten Protein Tau, das normalerweise an Tubulin bindet und somit zu den Mikrotubuli assoziierten Proteinen gehört. Als Bestandteil des Zytoskeletts haben die Mikrotubuli die Funktion, die zelluläre Struktur und die innerzellulären Transportvorgänge aufrechtzuerhalten. Durch eine abnorme Phosphorylierung verliert das Tau-Protein jedoch seine Fähigkeit, die Mikrotubuli der Nervenzellen vor einem spontanen Zerfall zu schützen (Mandelkow und Mandelkow, 1998). Einschränkungen dieser wichtigen Funktionen führen daher kurzfristig zu Fehlfunktionen und langfristig zum Absterben der veränderten Zellen. Diese Vorgänge haben einen beträchtlichen Verlust an Nervenzellen in den betroffenen Gehirngebieten zur Folge, so im Hippocampus - einer Struktur für das Gedächtnis - und in der Großhirnrinde, der Hauptschaltstelle für Vernunft, Sprache, Lernen und andere wichtige Denkprozesse. Die betroffenen Gehirnregionen leiden aufgrund des Neuronenverlustes somit auch an einer Unterversorgung mit dem Neurotransmitter Acetylcholin. Eine Linderung und Hinauszögerung der Krankheit ist daher mit 4 EINLEITUNG Acetylcholinesterasehemmern wie Tacrin (Cognex) oder Donepezil (Acricept) möglich. Durch die Blockierung des Neurotransmitterabbaus erhöhen sie die Menge an Acetylcholin im Gehirn und helfen auf diese Weise, die Gehirnleistungen zu verstärken. Leider wirken diese Mittel aber nicht mehr im Spätstadium der Demenz, wenn schon zu viele Nervenzellen fehlen, wenn also kaum noch Acetylcholin produziert wird. Außerdem richten sich diese Medikamente nicht gegen die eigentlichen pathogenen Mechanismen und können daher das Fortschreiten der Krankheit nicht aufhalten. 2.1.1 Die zentrale Rolle des β -Amyloidpeptids Anhand der Aminosäuresequenz des β-Amyloidpeptids konnte in einer fötalen Hirn cDNABibliothek ein Klon identifiziert werden, der den kodierenden Bereich des Aβ-Peptids als Teil eines 695 Aminosäuren umfassenden Vorläuferproteins enthält (Kang et al., 1987, Dyrks et al., 1988). Nachfolgend wurden zwei weitere Isoformen des APP (APP: amyloid precursor protein) entdeckt, die zusätzliche Aminosäuren aufweisen und dementsprechend als APP751 und APP770 bezeichnet werden (Ponte et al., 1988, Kitaguchi et al., 1988). Beide besitzen zusätzlich eine Sequenz aus 56 Aminosäuren, die für eine KunitzSerinproteinasen-Inhibitordomäne kodiert, APP770 enthält außerdem noch eine OX-2Domäne (Abbildung 2.1 A). Alle drei Isoformen entstehen durch alternatives Spleißen bei der Transkription des APP-Gens und werden im Gehirn exprimiert. Allerdings weist von diesen drei Isoformen APP695 die höchste Expression in Neuronen auf (Goedert, 1987, LeBlanc et al., 1991). Das Amyloid-Vorläuferprotein ist ein Typ I-Transmembranprotein, das nach seiner Synthese den sekretorischen Weg zur Zelloberfläche durchläuft und von dort zu den Endosomen gelangt (Weidemann et al., 1989, Haass et al., 1992, De Strooper et al., 1993, Selkoe, 1999). Auf seinem Weg zur Zelloberfläche unterliegt es der Spaltung durch drei enzymatische Aktivitäten (Nitsch et al., 1994, Checler, 1995, Selkoe et al., 1996, Mills und Reiner, 1999, Nunan und Small, 2000). Dabei kann zwischen zwei Wegen beziehungsweise Möglichkeiten der Spaltung unterschieden werden (Abbildung 2.1 B). Der nicht-amyloidogene Weg führt nicht zur Aβ-Entstehung, wogegen es im amyloidogenen Weg zur Aβ-Entstehung und somit zur Plaque-Bildung und damit zur AlzheimerErkrankung kommt. Der nicht-amyloidogene Weg ist charakterisiert durch die enzymatische Aktivität der α-Sekretase, die das APP mitten in der β-Amyloidsequenz schneidet und damit die Bildung von Aβ verhindert (Esch et al., 1990, Anderson et al., 1991, Wang et al., 1991). Dabei wird das lösliche N-terminale Fragment von APP, das APPsα, freigesetzt. APPsα hat trophische Effekte auf neuronale Zellen in Kultur (Araki et al., 1991), stimuliert das EINLEITUNG 5 Neuritenwachstum (Small et al., 1994), reguliert die Synapsenbildung (Morimoto et al., 1998), stabilisiert das Calciumgleichgewicht (Mattson et al., 1993) und schützt die Neuronen des Hippocampus und der Großhirnrinde vor den toxischen Eigenschaften der Aβ-Peptide (Furukawa et al., 1996). Der amyloidogene Weg dagegen ist gekennzeichnet durch die enzymatische Aktivität der β-Sekretase, die den freien N-Terminus des AβPeptids generiert und damit den ersten entscheidenden Schritt in der Krankheitsentstehung ausführt (Haass et al., 1992, Shoji et al., 1992, Citron et al., 1995). A KPI OX2 APP770 KPI APP751 Aβ β N C APP695 ISEVKM DAEFRHDSGYEVHHQK LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA TVIVIT α β γ40 γ42 B Aβ β N p3 APPsα α α-Sekretase-Weg (nicht-amyloidogen) C APP Aβ β APPsβ γ40/42 β γ40/42 β-Sekretase-Weg (amyloidogen) __________________________________________________________________ Abbildung 2.1 A, Schematische Darstellung des Amyloid-Vorläuferproteins Die Sequenz des Aβ-Peptids ist unter Verwendung des Einbuchstaben-Codes für Aminosäuren herausprojiziert und die Spaltstellen der α-, β- und γ- Sekretase sind kenntlich gemacht. B, Prozessierung des APP auf zwei alternativen Wegen. Im Verlauf des nichtamyloidogenen Wegs wird APP durch die α-Sekretase innerhalb der Aβ-Region an Lysin-16 prozessiert, wobei das lösliche Fragment APPsα von der Zellmembran freigesetzt wird. Das in der Membran verbliebene C-terminale Fragment wird anschließend von der γ-Sekretase prozessiert, dabei entsteht das nicht-amyloidogene p3-Peptid. Im Aβ-bildenden Weg wird zunächst APPsβ durch eine über die β-Sekretase vermittelte Proteolyse des APP freigesetzt. Die nachfolgende Prozessierung durch die γ-Sekretase führt schließlich zur Entstehung des amyloidogenen Aβ-Peptids. Beide Spaltungsereignisse produzieren membrangebundene C-terminale Fragmente. Diese Fragmente unterscheiden sich in ihren N-Termini und werden C99 (von der β-Sekretase erzeugt) und C83 (von der α-Sekretase erzeugt) genannt, entsprechend der Anzahl an Aminosäuren die sie enthalten. Sowohl C99 als auch C83 können schließlich durch die enzymatische Aktivität der γ-Sekretase innerhalb der Transmembrandomäne 6 EINLEITUNG prozessiert werden, was zur Freisetzung des Aβ-Peptids im Fall von C99 (Anderson et al., 1992) und zur Freisetzung des p3-Peptids (Haass et al., 1993), einem kürzeren, nicht amyloidogenen Peptid, im Fall von C83 führt. Überwiegend spaltet die γ-Sekretase an einer von zwei möglichen Positionen: nach Rest 40 oder nach Rest 42 (bezogen auf C99), was zur Entstehung von Aβ40 beziehungsweise Aβ42 führt (Citron et al., 1996). Die besondere Struktur des β-Amyloids ist dafür verantwortlich, dass es leicht mit sich selbst interagiert und aggregiert. Aβ neigt zur Bildung von antiparallelen β-Faltblattstrukturen und erzeugt dadurch schnell unlösliche Polymere, die schwer wieder dissoziieren. Die biochemische Basis für diesen Vorgang liegt in der Interaktion hydrophober Aminosäuren beziehungsweise deren anhängenden Resten. Die Länge des β-Amyloids ist für das Aggregationsverhalten von Bedeutung, da die längere Version des Peptids zusätzlich zwei hydrophobe Aminosäuren enthält, die die Amyloidizität erhöhen (Citron et al., 1992, 1997, Cai et al., 1993, Jarret et al., 1993, Barelli et al., 1997). So findet man im Kern eines senilen Plaques ausschließlich Aβ42 (Roher et al., 1993, Gravina et al., 1995). Die genauen Mechanismen, durch die das in den senilen Plaques abgelagerte β-Amyloid die neuronale Degeneration verursacht, sind noch nicht aufgeklärt, jedoch scheinen mehrere Ereignisse daran beteiligt zu sein. Zum einen stört dieses Peptid den Calciumhaushalt von Zellen (Luo et al., 1995, Wolozin et al., 1995) und fördert außerdem die Entstehung freier Radikale (Behl et al., 1994, Harris et al., 1995), die wiederum wichtige Zellbestandteile angreifen, darunter Proteine und die DNA. Andererseits können Aβ-Peptide, in Abhängigkeit ihrer Konzentration, auch Apoptose oder Nekrose induzieren. Die auf diese Weise geschädigten Zellen setzen Cytokine frei und aktivieren Mikrogliazellen – die Immunzellen des Gehirns. Die folgenden Entzündungsprozesse verstärken schließlich die Anfangsschäden (McGeer und McGeer, 1995, Weninger und Yankner, 2001). Es wird somit erklärlich, warum die fortschreitende Ablagerung von β-Amyloid in senilen Plaques mit einer Minderung der Hirnleistung einhergeht. Das therapeutische Ziel ist daher eine Reduktion der Aβ-Produktion. Hierbei können drei Strategien verfolgt werden. Erstens eine Stimulierung der α-Sekretaseaktivität, um Substrat vom Aβ-bildenden amyloidogenen Weg abzuleiten, zweitens eine Inhibierung der β-Sekretase und schließlich eine Inhibierung der γ-Sekretase. Die erste Strategie stellt die größte Herausforderung dar, da sie die Stimulierung eines proteolytisch aktiven Enzyms erfordert, was allgemein schwieriger zu erreichen ist, als eine Inhibierung. Dennoch konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung von Neurotransmitter-Rezeptoren, welche an die Proteinkinase C-vermittelte Signalkaskade gekoppelt sind, den α-Sekreta- EINLEITUNG 7 se-Weg auf Kosten des β-Sekretase-Wegs stimuliert (Buxbaum et al., 1993, Hung et al., 1993). 2.1.2 Die Konkurrenz zwischen der α- und der β -Sekretase Das trans-Golgi-Netzwerk gilt als bedeutender Ort der β-Sekretaseaktivität, da hier der größte Teil der sekretierten Aβ-Peptide generiert wird (Xu et al., 1997). Im Gegensatz zu sekretiertem Aβ entsteht intrazelluläres Aβ im endoplasmatischen Retikulum und/oder im frühen Golgi-Apparat, was eine proteolytische Aktivität, sowohl von der β- als auch von der γ-Sekretase, in diesen Zellkompartimenten nahelegt (Cook et al., 1997, Hartmann et al., 1997, Wild-Bode et al., 1997). Neben diesem, im endoplasmatischen Retikulum und trans-Golgi-Netzwerk ablaufenden, amyloidogenen Weg, kann APP auch innerhalb der Aβ-Sequenz zwischen Lysin-16 und Leucin-17 von der α-Sekretase prozessiert werden (Esch et al., 1990). Dies erfolgt unabhängig von der Aminosäuresequenz der Spaltstelle. Eine α-helikale Struktur und eine definierte Entfernung der zu hydrolysierenden Peptidbindung (12 Aminosäuren von der Plasmamembran) gelten als einzige Anforderungen der α-Sekretase an die Spaltstelle (Maruyama et al., 1991, Sisodia, 1992). Die Bildung des neurotoxischen Aβ wird im Verlauf dieses nicht-amyloidogenen Wegs verhindert (Nitsch und Growdon, 1994, Checler, 1995). Das Verhältnis der APP-Prozessierung durch die α-Sekretase gegenüber der β-Sekretase legt die Menge des produzierten Aβ fest, daher ist die Regulation dieser beiden Wege entscheidend für die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Tatsächlich kann durch die Aktivierung der Proteinkinase C in Zellkulturen der α-Sekretase-Weg auf Kosten der β-Sekretase-Spaltung stimuliert werden (Caporaso et al., 1992, Buxbaum et al., 1993). Transgene Mäuse, die erzeugt wurden um große Mengen an humanem Aβ zu produzieren, weisen nach Behandlung mit PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat), einem Aktivator der Proteinkinase C, ebenfalls erniedrigte Mengen an Aβ auf (Savage et al., 1998). Daher könnte die Stimulierung des α-Sekretase-Wegs bei der Therapie der Alzheimer-Demenz von Nutzen sein. Im Gegensatz zur β-Sekretase, die nur konstitutiv aktiv ist, besitzt die α-Sekretaseaktivität sowohl eine konstitutive als auch eine regulierte Komponente. Während die konstitutive α-Sekretase-Spaltung auf der Zelloberfläche stattfindet (Skovronsky et al., 2000, Sisodia, 1992, Ikezu et al., 1998, Haas et al., 1992, Parvathy et al., 1999), erfolgt die Proteinkinase C-regulierte α-Sekretase-Spaltung im trans-Golgi-Netzwerk (Skovronsky et al., 2000, Kuentzel et al., 1993, De Strooper et al., 1993, Sambamurti et al., 1992, Tomita et al., 1998), also im gleichen Kompartiment wie die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase (Skovronsky et al., 2000). Unter unstimulierten Bedingungen unterliegt die β-Se- EINLEITUNG 8 kretase keiner begrenzten Verfügbarkeit des Substrats, jedoch wird die α-Sekretaseaktivität im trans-Golgi-Netzwerk nach Stimulierung der Proteinkinase C erhöht und infolgedessen vermehrt APPsα produziert. Dadurch wird das vorhandene APP umgesetzt und somit der β-Sekretase entzogen. Die Folge ist eine verringerte β-Spaltung und damit verbunden eine verminderte Produktion von Aβ-Peptiden (Skovronsky et al., 2000). Bisher konnten drei Enzyme mit α-Sekretaseaktivität identifiziert werden. Sie stammen alle drei aus der Familie der Disintegrin-Metalloproteinasen (ADAM, A Disintegrin And Metalloproteinase) und werden als ADAM9, ADAM10 und ADAM17 (TACE, Tumor necrosis factor-Alpha-Converting Enzyme) bezeichnet (Koike et al., 1999, Lammich et al., 1999, Buxbaum et al., 1998). 2.1.2.1 Disintegrin-Metalloproteinasen Anhand gemeinsamer Strukturmerkmale, Sequenzmotive und Faltungsmuster können etwa 30 Familien von Metalloproteinasen unterschieden werden, die sich in fünf elementare Gruppen einordnen lassen (Rawlings und Barret, 1995). Eine dieser Gruppen wird von den sogenannten Metzincinen gebildet, deren Mitglieder zu den Zink-abhängigen Metalloproteinasen gehören (Bode et al., 1993, Stöcker et al., 1995). Metzincine werden wiederum in vier Subgruppen unterteilt: die Astacine, die Serralysine, die Matrixine (Matrix-Metalloproteinasen) und die Reprolysine (Hooper, 1994). Zu den letzteren gehören die löslichen Metalloproteinasen aus Schlangengiften (SVMP, snake venom metalloproteinase) und die Disintegrin-Metalloproteinasen der ADAM-Familie (Bode et al., 1993, Wolfsberg und White, 1996). Ein besonderes Merkmal der Reprolysine ist ihre multifunktionelle Domänenstruktur. Alle 30 bisher bekannten Mitglieder der ADAM-Familie werden als lange Vorläuferproteine synthetisiert, die aus einer Prodomäne, einer Metalloproteinase- oder Metalloproteinaseähnlichen Domäne, einer Disintegrin-ähnlichen Domäne, einer cysteinreichen und einer EGF-ähnlichen Domäne, einer Transmembrandomäne und einer zytoplasmatischen Domäne bestehen. Wie alle Metzincine weisen auch sie eine dreidimensionale Struktur auf, die auf einem fünfsträngigen β-Faltblatt und drei α-Helices beruht (Stöcker et al., 1995). Aber nur etwa die Hälfte der 30 Disintegrin-Metalloproteinasen verfügt über das für die katalytische Aktivität notwendige konservierte Zinkbindungsmotiv HEXXHXXGXXH (Rawlings und Berret, 1995, Wolfsberg et al., 1995, Wolfsberg und White, 1996). Die übrigen Mitglieder der ADAM-Familie enthalten abweichende Aminosäuresequenzen in der Metalloproteinase-Domäne und sind somit vermutlich katalytisch inaktiv. Die Zinkbindung erfolgt mit Hilfe der drei Histidinreste (unterstrichen), die das Zink-Ion im katalytischen Zentrum EINLEITUNG 9 komplexieren. Die Carbonylgruppe des konservierten Glutamatrestes (fettgedruckt) katalysiert die Spaltung der Peptidbindung durch eine Erleichterung des nukleophilen Angriffs eines vom Zink-Ion gebundenen Wassermoleküls auf die Carbonylgruppe der Peptidbindung. Das Glycin (kursiv) erlaubt eine strukturell wichtige Umkehrschleife. C-terminal von dieser Konsensussequenz befindet sich ein sogenannter „Met-Turn“, der bei der Ausbildung der funktionellen Konformation des aktiven Zentrums beteiligt ist, indem er eine Rückfaltung des Peptidrückgrats ermöglicht und so die Zink-Liganden stabilisiert (Bode et al., 1993, Stöcker et al., 1995). Prodomäne Metalloprotease-Domäne Zn2+ Zn2+ OH2 Disintegrin-Domäne Cystein- reiche und EGF- ähnliche Domäne Zytoplasmatische Domäne __________________________________________________________________ Abbildung 2.2 Domänenstruktur der Disintegrin-Metalloproteinasen. Die Prodomäne besitzt vermutlich eine regulatorische Funktion: Sie hält die Metalloproteinase durch die Komplexierung des Zink-Ions in einem inaktiven Zustand, erst nach ihrer Abspaltung wird die vierte Koordinationsstelle des Zink-Ions für Wassermoleküle zugänglich. Die Proteinaseaktivität der ADAM-Proteine wird, wie bei vielen Mitgliedern der Metzincine, wahrscheinlich durch ein Cystein in der Prodomäne, über den sogenannten „CysteinSwitch“-Mechanismus (Van Wart und van Birkedahl-Hansen, 1990, Grams et al., 1993) reguliert (Loechel et al., 1998, 1999, Roghani et al., 1999). Hier komplexiert ein konservierter Cystein-Rest die vierte Koordinationsstelle des Zink-Ions im katalytischen Zentrum und verhindert damit die für die Proteolyse wichtige Anlagerung des Wassermoleküls an das Zink-Ion. Die Proteinase wird so in einem inaktiven Zustand gehalten. Viele ADAM-Proteine besitzen zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne die Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz RX(K/R)R. Durch 10 EINLEITUNG proteolytische Abspaltung der Prodomäne an dieser Stelle wird der inhibitorisch wirkende Cystein-Rest entfernt und das katalytische Zentrum wird für Wassermoleküle zugänglich, was eine Aktivierung der Proteinase bedeutet. So stellt die posttranslationale proteolytische Abspaltung der Prodomäne sowohl von ADAM9 (Roghani et al., 1999) als auch von ADAM15 (Lum et al., 1998) einen wichtigen Schritt in der Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität dar. Dieser Vorgang wird in der Zelle vermutlich durch eine oder mehrere Proprotein-Konvertasen im trans-Golgi-Netzwerk ausgeführt. Daneben scheint die Prodomäne aber auch für den Transport zur Zelloberfläche und die korrekte Faltung der ADAM-Proteine wichtig zu sein (Milla et al., 1999, Anders et al., 2001). Eine Funktion als intramolekulares Chaperon wird diskutiert. Disintegrin-Metalloproteinasen sind unter den Membranproteinen insofern außergewöhnlich, als sie sowohl eine proteolytische Domäne als auch eine Adhäsionsdomäne (Disintegrin-Domäne) besitzen. Es ist bekannt, dass Disintegrine aus Schlangengiften mit Integrinen wechselwirken (Huang et al., 1987, Gould et al., 1990), und man nimmt daher an, dass die Disintegrin-Domänen aus ADAM-Proteinen ebenfalls mit Integrinen oder anderen Zelloberflächenrezeptoren in Wechselwirkung treten können. Solche Interaktionen könnten nicht nur dazu dienen, ADAM-exprimierende Zellen in direkten Kontakt mit anderen Zellen oder Komponenten der extrazellulären Matrix zu bringen, sie könnten die ADAM-Proteine auch zum Reaktionsort dirigieren. Tatsächlich konnte eine Wechselwirkung von ADAM2 (Fertilin β) mit Integrinen bei der Befruchtung von Eizellen nachgewiesen werden (Myles et al., 1994, Almeida et al., 1995, Cho et al., 1998). ADAM2 selbst ist katalytisch inaktiv, es bildet jedoch Heterodimere mit dem katalytisch aktiven ADAM1 (Fertilin α), welches zusätzlich ein aus viralen Fusionsproteinen bekanntes Peptid in der cysteinreichen Domäne enthält (Wolfsberg et al., 1993, Blobel et al., 1992, Muga et al., 1994). Dieses bildet eine für die Fusion mit der Zielmembran wichtige hydrophobe α-Helix aus. Die Bindung der Disintegrin-Domäne von ADAM2 auf der Spermazelle an das Integrin α6β1 auf der Eizelle schafft somit die Voraussetzungen für den anschließenden Fusionsprozess. Bislang wurde bei zwei weiteren Mitgliedern der ADAM-Familie eine Interaktion mit Integrinen dokumentiert. Dabei handelt es sich um Maus-ADAM9 (Zhou et al., 2001) und um menschliches ADAM15 (Zhang et al., 1998), welches als einziges ADAM das in Schlangengift-Disintegrinen vorhandene Tripeptid RGD in seiner Disintegrin-Domäne aufweist. Dieses Tripeptid ist Bestandteil einer 13 bis 14 Aminosäuren umfassenden Schleife (Adler et al., 1991, Niewiarowski et al., 1994), die in die Bindungstasche eines Integrin-Heterodimers hineinzuragen vermag und so die Bindung vermittelt (Krätschmar et al., 1996). Alle anderen Mitglieder enthalten davon abweichende Sequenzen, in denen jedoch andere Aminosäurereste die Funktion der Integrinbindung übernehmen könnten. EINLEITUNG 11 Die Variationsbreite dieses Bereichs lässt zumindest vermuten, dass die verschiedenen ADAM-Proteine entweder mit verschiedenen Integrin-Rezeptoren interagieren, oder dass nicht alle proteinbindende Eigenschaften besitzen (Wolfsberg et al., 1995). Tatsächlich konnte bei ADAM9, das genau wie ADAM2 kein RGD-Tripeptid besitzt, eine Interaktion mit dem Integrin αvβ5 auf der Zelloberfläche von Myeloma-Zellen nachgewiesen werden (Zhou et al., 2001). Von struktureller Bedeutung sind vermutlich die cysteinreiche Domäne und der EGFähnliche Bereich. Sie stabilisieren wahrscheinlich die Proteinstruktur und positionieren die übrigen Domänen, um Interaktionen mit anderen Proteinen bestmöglich zu gewährleisten (Fox und Bjarnason, 1996). Weiterhin enthalten die cysteinreichen Domänen einiger ADAM-Proteine ein Fusionspeptid, das durch Ausbildung einer hydrophoben α-Helix zur Fusion von Zellmembranen führt (Blobel et al., 1992, Muga et al., 1994, Huovila et al., 1996). Auch ADAM12, welches bei der Fusion von Myoblasten zu Myotuben beteiligt ist, besitzt ein solches Fusionspeptid (Yagami-Hiromasa et al., 1995). Die zytoplasmatische Domäne besitzt wahrscheinlich eine regulatorische Funktion, da viele ADAM-Proteine dort Phosphorylierungsstellen oder potentielle SH3-Ligandenbindungsdomänen aufweisen (Pawson, 1995). Eine Bestätigung dessen stellt die Phosphorylierung von ADAM9 dar, die nach Behandlung mit dem Phorbolester PMA, einem synthetischen Aktivator der Proteinkinase C, nachweisbar ist (Roghani et al., 1999). Aufgrund ihrer besonderen Domänenstruktur sind ADAM-Proteine an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt. Neben der Fertilisation von Eizellen und der Zell-Adhäsion beziehungsweise -Fusion sind sie außerdem bei der Zelldifferenzierung (Rooke et al., 1996, Fambrough et al., 1996, Pan und Rubin, 1997) sowie der Spaltung membranständiger Zelloberflächenproteine von Bedeutung (Arribas et al., 1996, Black und White, 1998). Bei diesem als „Shedding“ bezeichneten Prozess gehören Rezeptoren, Cytokine und Adhäsionsmoleküle, die in den Extrazelluläraum freigesetzt werden, zu ihren Substraten. 2.1.2.2 Die α-Sekretase TACE Entzündliche Reaktionen können unter anderem durch die Freisetzung der löslichen Ektodomäne des Tumor Nekrose-Faktor-α (TNFα) ausgelöst werden. Es wurde daher versucht, das für die TNFα-Freisetzung verantwortliche Enzym zu finden. Aufgrund seiner Fähigkeit, den Tumor Nekrose-Faktor-α an der physiologischen Spaltstelle zu prozessieren (Moss et al., 1997, Black et al., 1997), wurde das identifizierte Enzym TACE genannt (TACE: Tumor necrosis faktor-Alpha-Converting Enzyme). Als Mitglied der EINLEITUNG 12 Disintegrin-Metalloproteinasen wird es auch als ADAM17 bezeichnet. Neben der Spaltung des Tumor Nekrose-Faktor-α ist TACE auch an der Freisetzung des Transformierenden Wachstums-Faktor-α (TGFα), des p75 Tumor Nekrose-Faktor-Rezeptors, des L-Selectins und des Amyloid-Vorläuferproteins beteiligt (Peschon et al., 1998, Buxbaum et al., 1998). Untersuchungen in TACE-defizienten Mäusen, die eine ganze Reihe von Entwicklungsdefekten aufweisen, bestätigen, dass TACE eine breite Substratspezifität besitzt und eine bedeutende Rolle in der Entwicklung von Säugern einnimmt (Peschon et al., 1998). Obwohl TACE die typische Domänenstruktur der Disintegrin-Metalloproteinasen aufweist, ist die Sequenzhomologie zu anderen Mitgliedern der ADAM-Familie gering. Das am nächsten verwandte Mitglied ist ADAM10 mit einer Aminosäuresequenzidentität von nur 29%. Die reife Form des Enzyms entsteht durch die proteolytische Abspaltung der Prodomäne an der Proprotein-Konvertasen-Konsensussequenz, die sich genau an der Grenze zur Metalloproteinase-Domäne befindet. Als starker Inhibitor der katalytischen Aktivität hat die Prodomäne die Funktion, TACE solange in einem inaktiven Zustand zu halten, bis eine Abspaltung und damit eine Aktivierung erfolgt (Schlöndorff et al., 2000). Die Dissoziation der Prodomäne kann durch die Thiol-modifizierende Quecksilberverbindung APMA vermittelt werden, wodurch die Vermutung gestützt wird, dass TACE über den postulierten „Cystein-Switch“-Mechanismus reguliert wird. Darüber hinaus scheint die Prodomäne auch für die korrekte Faltung des Enzyms notwendig zu sein und somit als intramolekulares Chaperon zu fungieren (Milla et al., 1999). Entfernt wird die Prodomäne im trans-Golgi-Apparat, übereinstimmend mit der naheliegenden Beteiligung von Proprotein-Konvertasen an diesem Prozess (Schlöndorff et al., 2000). Das reife Enzym kommt zwar auch auf der Zelloberfläche vor, ist aber vorwiegend in einem perinukleären Kompartiment vorzufinden, was darauf schließen lässt, dass die durch TACE vermittelte Prozessierung von Transmembranproteinen sowohl auf der Zelloberfläche als auch in intrazellulären Organellen erfolgen kann. Einen Hinweis darauf geben die Prozessierungen der Cytokine TNFα und TGFα (Merlos-Suarez et al., 1998, Solomon et al., 1997, Arribas und Massague, 1995, Arribas et al., 1996). Während die Spaltung des TNFα im sekretorischen Weg innerhalb der Zelle erfolgt, wird TGFα auf der Zelloberfläche in die lösliche Form überführt. Die Phosphorylierung von Enzymen durch Proteinkinasen ist ein weitverbreiteter Mechanismus zur Regulation von Enzymaktivitäten. Eine wertvolle Eigenschaft der Proteinkinase C ist dabei ihre Aktivierbarkeit durch Phorbolester, die in ihrer Struktur dem sekundären Botenstoff Diacylglycerin ähneln. So bindet die Proteinkinase C den Phorbolester PMA mit hoher Affinität und wird durch diese Bindung aktiviert. Durch die Behandlung von Zellkulturen mit PMA wird TACE stimuliert und infolgedessen die EINLEITUNG 13 enzymatische Aktivität erhöht (Black et al., 1997, Peschon et al., 1998, Buxbaum et al., 1998). Die Mechanismen der PMA-induzierten Stimulierung von TACE sind allerdings sehr vielschichtig und weitgehend unverstanden. So wird es infolge der PMA-Einwirkung zwar phosphoryliert (Black et al., 1997), doch konnte durch die Transfektion einer TACEMutante ohne zytoplasmatische Domäne die PMA-Stimulierbarkeit der enzymatischen Aktivität in TACE-defizienten Zellen wiederhergestellt werden. Eine Phosphorylierung wäre für die Stimulierung somit nicht erforderlich und insofern wäre die TACE-Aktivität keiner Regulation durch die Phosphorylierung seiner zytoplasmatischen Domäne unterworfen (Reddy et al., 2000). Neben einer erhöhten Spaltung von Zelloberflächenproteinen induziert die Behandlung von Zellen mit PMA aber auch die Internalisierung von auf der Zelloberfläche vorhandenem, reifen TACE (Doedens und Black, 2000). Dies wird anschließend abgebaut, ohne dass ein genereller Abbau von Zelloberflächenproteinen stattfindet. Auffälligerweise erfolgt die Reduzierung des reifen TACE auf der Zelloberfläche langsamer als die proteolytische Freisetzung seiner Substratproteine. L-Selectin wird zum Beispiel innerhalb weniger Minuten durch PMAinduziertes Shedding freigesetzt, während die Menge der reifen Proteinase erst nach etwa 90 min um die Hälfte reduziert ist. Diese allmähliche Verringerung von reifem TACE auf der Zelloberfläche könnte die Menge an freigesetzten Proteinen langsam beschränken und der Zelle so die „Auffüllung“ der Zelloberflächenproteine ermöglichen (Doedens und Black, 2000). In primären embryonalen Maus-Fibroblasten wird die Freisetzung von APPsα durch die Aktivierung der Proteinkinase C mit PMA um das drei- bis fünffache erhöht (Buxbaum et al., 1998). Dies wird durch Immunex compound 3, einem wirkungsvollen Inhibitor sowohl der ADAM-Proteine als auch der Matrixine, blockiert. Im Gegensatz dazu kann in Zellen, die aus TACE-knockout Mäusen isoliert wurden, die APPsα-Sekretion durch PMA nicht mehr erhöht werden. Dieser nahezu vollständige Verlust der PMA-Stimulierbarkeit TACEdefizienter Zellen deutet auf eine Funktion von TACE bei der regulierten APPsαFreisetzung hin. Allerdings ist die basale APPsα-Sekretion in diesen Zellen unverändert, was wiederum auf die Existenz von zumindest einer weiteren α-Sekretase hinweist. Bestätigt wird die beobachtete α-Sekretaseaktivität durch die in vitro-Spaltung eines synthetischen Dekapeptids, das die Aminosäuresequenz der α-Sekretase-Spaltstelle von APP umfasst und durch die rekombinante, katalytische Domäne von TACE spezifisch prozessiert wird (Buxbaum et al., 1998). Die konstitutive Komponente der α-Sekretaseaktivität von TACE wird bei dessen Überexpression in HEK293-Zellen erkennbar (Slack et al., 2001). In diesen Zellen ist die konstitutive APPsα-Spaltung stark erhöht, allerdings werden infolgedessen auch die Inhibierungskonstanten für die konstitutive und Carbachol-induzierte APPsα-Freisetzung EINLEITUNG 14 deutlich erniedrigt, so dass offenbar eine andere Proteinase als TACE den endogenen Vermittler der APPsα-Sekretion darstellt. Auch die in-situ Hybridisierungsmuster von TACE und APP, die sowohl bei sich entwickelnden und erwachsenen Mäusehirnen als auch in menschlichen Gehirnen nur teilweise eine Überlappung aufweisen, deuten eher darauf hin, dass TACE nicht die für die Alzheimer-Demenz relevante α-Sekretase ist (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). 2.1.2.3 Die α-Sekretase ADAM10 Identifiziert wurde ADAM10 zunächst als MBP-spaltendes (MBP: Myelin Basic Protein) Enzym in Myelinmembranen des Rinderhirns (Chantry et al., 1988, 1989). Die beobachtete Spaltung des MBPs stellte sich zwar als Artefakt heraus, doch konnte hier erstmals die proteolytische Aktivität von ADAM10 belegt werden (Howard und Glynn, 1995, Howard et al., 1996). Durch Spaltungsversuche mit dem aus Rindernieren gereinigten Enzym konnte schließlich die spezifische α-Sekretaseaktivität von ADAM10 in vitro nachgewiesen werden (Lammich et al., 1999). Als Substrat diente hierbei ein synthetisches, α-helikales Oktadekapeptid, das die Aminosäuresequenz der α-Sekretase-Spaltstelle von APP umfasst. Wie für die α-Sekretase gefordert, spaltet ADAM10 dieses Peptid zwischen den Aminosäuren Lysin-16 und Leucin-17 (Die angegebenen Positionen beziehen sich auf die Lage der Aminosäuren innerhalb des Aβ-Peptids.). Wird jedoch das Alanin in Position 21 gegen Glycin ausgetauscht und so die α-helikale Struktur des Peptids zerstört, so wird die Spaltung fast vollständig verhindert. Wie für eine α-Sekretase erwartet, besitzt ADAM10 sowohl eine konstitutive als auch eine regulierte Enzymaktivität (Lammich et al., 1999). Die konstitutive Komponente zeigt sich bei der Überexpression von ADAM10 in HEK293-Zellen, hier ist die APPsα-Bildung um etwa das Vierfache erhöht. Nach Stimulierung der Proteinkinase C mit dem Phorbolester PMA wird die regulierte Komponente erkennbar, da hier die APPsα-Bildung gegenüber der konstitutiven APPsα-Sekretion nochmals stark erhöht wird. Darüber hinaus wird die Sekretion von APPsα durch eine Punktmutation im Zinkbindungsmotiv (E384A) der katalytischen Domäne von überexprimiertem ADAM10 erheblich reduziert. Aufgrund der dominant negativen Wirkung dieser Mutante wird hierbei auch die endogene α-Sekretase weitgehend ausgeschaltet. Auch das Inhibierungsspektrum, sowohl von dem isolierten als auch dem überexprimierten Enzym, stimmt mit dem der α-Sekretase überein. Wie alle katalytisch aktiven Disintegrin-Metalloproteinasen wird auch ADAM10 als Zymogen mit einer potentiellen Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz (RKKR) zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne synthetisiert (Howard et al., EINLEITUNG 15 1996). In Übereinstimmung mit der erwarteten Lokalisierung der α-Sekretase (Kuentzel et al., 1993, Ikezu et al., 1998) ist ADAM10 im trans-Golgi-Netzwerk und auf der Zelloberfläche vorhanden (Lammich et al., 1999). Es besitzt ein weites Expressionsspektrum (Yavari et al., 1998), doch insbesondere die überlappende Expression von ADAM10 mit APP im Gehirn untermauert die Hypothese, dass ADAM10 die physiologisch relevante α-Sekretase mit APP als Substrat darstellt (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). Durch den Entzug von Cholesterin aus der Plasmamembran unter einen kritischen Grenzwert wird die Membranfluidität beträchtlich gesteigert, was zu einer vermehrten APPsα-Sekretion führt (Kojro et al., 2001). Dabei könnte die höhere Membranfluidität eine erhöhte laterale Bewegung von APP und der α-Sekretase innerhalb der Membran bewirken und so die proteolytische Prozessierung erleichtern. Gleichzeitig tritt nach Cholesterin-Abreicherung eine inhibierte Endozytose von APP auf, die zu einer Anhäufung von APP auf der Zelloberfläche und, infolgedessen, zu einer verstärkten α-Sekretase-Spaltung führt. Auch die Behandlung von peripheren und neuronalen Zellen mit Lovastatin, einem Inhibitor der Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase, resultiert in einer erhöhten α-Sekretaseaktivität. Diese Befunde veranschaulichen, dass die Abreicherung von Cholesterin den nichtamyloidogenen α-Sekretase-Weg begünstigt und damit die Konzentration der Aβ-Peptide limitiert. In APP-überexprimierenden Neuronen des Hippocampus konnte nach Cholesterin-Abreicherung ebenfalls eine verminderte Aβ-Produktion festgestellt werden (Simons et al., 1998). 2.1.2.4 Die β -Sekretase BACE Der erste Schritt der Aβ-Peptidentstehung ist die Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins durch die β-Sekretase. Fünf Gruppen entdeckten unabhängig voneinander ein Enzym, das viele der geforderten Merkmale erfüllt und somit einen Kandidaten für die β-Sekretase verkörpert (Vassar et al., 1999, Yan et al., 1999, Sinha et al., 1999, Hussain et al., 1999, Lin et al., 2000). Da es das APP an Asparagin-1 der Aβ-Sequenz genauso prozessiert wie an Glutamat-11, einer alternativen β-Spaltstelle, und zugleich ein Mitglied der PepsinFamilie von Aspartyl-Proteinasen darstellt, wurde es als BACE (Beta-site APP Cleaving Enzyme) oder Asp2 beziehungsweise memapsin2 (membrane-anchored aspartic protease of the pepsin family) bezeichnet. Die verwandte Transmembran-AspartylProteinase BACE2 (oder Asp1) besitzt zwar eine ähnliche Substratspezifität (Yan et al., 1999, Farzan et al., 2000), ist im Gehirn allerdings nicht hoch exprimiert (Bennet et al., 2000). BACE dagegen besitzt eine breite Gewebeverteilung mit einer hohen Expression EINLEITUNG 16 im Gehirn (Vassar et al., 1999). In humanen kortikalen Neuronen ist BACE darüber hinaus mit APP und ADAM10 kolokalisiert, was ebenfalls BACE als physiologisch relevante β-Sekretase favorisiert (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). TQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPR DTGS « N SP Pro (1-21) (22-45) DSGT « C Protease (46-460) zytoplasmatische Domäne (478-501) Transmembrandomäne (461-477) __________________________________________________________________ Abbildung 2.3 Schematische Darstellung der β -Sekretase BACE. Das BACE-Vorläuferprotein besitzt ein Signalpeptid (SP), eine Prodomäne (Pro), eine Proteinase-Domäne, eine Transmembrandomäne und eine zytoplasmatische Domäne. Die Sequenz der Prodomäne ist unter Verwendung des Einbuchstaben-Codes für Aminosäuren herausprojiziert und die Furin-Spaltstelle ist fettgedruckt. Die Aspartyl-Proteinase-Motive (DTGS und DSGT) des aktiven Zentrums werden durch Sternchen angezeigt. In den Klammern sind die Aminosäure-Reste jeder Domäne angegeben. Strukturell ist BACE durch eine N-terminale Prodomäne, eine katalytische Domäne, die zwei wichtige Aspartat-Reste enthält, eine Transmembrandomäne und eine kurze zytoplasmatische Domäne gekennzeichnet (Vassar et al., 1999). Die N-terminale Sequenzierung von gereinigtem BACE erwies, dass das reife Enzym mit Glutaminsäure46 beginnt. Dies deutet auf eine proteolytische Entfernung der Prodomäne hin (Bennett et al., 2000, Capell et al., 2000, Creemers et al., 2001, Benjannet et al., 2001, Shi et al., 2001). Viele Proteinasen, einschließlich der Proprotein-Konvertasen und vieler Metalloproteinasen, werden als inaktive Zymogene synthetisiert und erst nach Abspaltung der Prodomäne katalytisch aktiv. Unklar ist, ob die Prodomäne von BACE ebenfalls eine inhibitorische Funktion ausübt. Zwar verringerte sich die Substratspaltung bei in vitro Spaltexperimenten in Anwesenheit der Prodomäne um etwa 20%, doch auch Pro-BACE scheint schon im ER zumindest teilweise katalytisch aktiv zu sein (Benjannet et al., 2001). Grundsätzlich ist die Prodomäne für den effizienten Transport vom endoplasmatischen Retikulum zum trans-Golgi-Netzwerk notwendig (Huse et al., 2000), aber auch um die korrekte Faltung des Proteins zu erleichtern (Shi et al., 2001). Zwischen der Prodomäne und der katalytischen Domäne besitzt BACE eine potentielle Proprotein-KonvertasenErkennungssequenz (RLPR). Inhibitorstudien bestätigen, dass Pro-BACE im trans-GolgiApparat von zumindest einem Mitglied aus der Familie der Proprotein-Konvertasen prozessiert wird (Bennett et al., 2000, Benjannet et al., 2001). Ein Beitrag von Furin wird EINLEITUNG 17 bei der Untersuchung von Furin-defizienten LoVo-Zellen erkennbar, da hier eine Prozessierung von Pro-BACE nicht stattfindet, durch eine Transfektion mit Furin-cDNA jedoch wiederhergestellt werden kann (Bennett et al., 2000). Gleichzeitig kann ein Mitwirken von PC7 und PACE4 an der Reifung von BACE ausgeschlossen werden, da sie die einzigen in LoVo-Zellen exprimierten Proprotein-Konvertasen darstellen und den Verlust der Furin-Aktivität nicht kompensieren können. In vitro-Spaltversuche belegen zusätzlich, dass die Abspaltung der Prodomäne von Pro-BACE durch Furin am besten und deutlich weniger wirkungsvoll durch PC5A erfolgt (Benjannet et al., 2001). Im Einklang mit den Befunden in LoVo-Zellen wird Pro-BACE in vitro von PACE4 kaum und von PC7 nicht prozessiert. Hauptsächlich ist BACE im trans-Golgi-Netzwerk, an der Zelloberfläche und in den Endosomen vorzufinden (Vassar et al., 1999, Hussain et al., 1999, Lin et al., 2000, Capell et al., 2000, Huse et al., 2000). Bestimmt wird die intrazelluläre Lokalisierung von Motiven in der zytoplasmatischen Domäne. So scheint ein Dileucin-Motiv für die Reinternalisierung von an der Zelloberfläche befindlichem BACE in die Endosomen verantwortlich zu sein (Walter et al., 2001). Ein weiteres Motiv ist die Casein Kinase I-Phosphorylierungsstelle, die offenbar für den regulierten Transport des Enzyms aus frühen Endosomen zu späten endosomalen und/oder trans-Golgi-Kompartimenten ausschlaggebend ist und auf diese Weise BACE wieder dem sekretorischen Weg zuführt. Die Phosphorylierung findet ausnahmslos bei der vollkommen reifen Form statt, also nach Entfernung der Prodomäne und komplexer N-Glykosylierung. Ein kleiner Teil von BACE wird „gesheddet“ und so in eine lösliche Form überführt, die den sekretorischen Weg sehr schnell durchläuft und in den extrazellulären Raum freigesetzt wird. Gleichzeitig werden vermehrt Aβ-Peptide produziert und somit das amyloidogene Potential von BACE erhöht (Benjannet et al., 2001). Eine regulatorische Funktion nehmen hierbei die drei in der zytoplasmatischen Domäne vorhandenen Palmitoylierungsstellen ein, denn ausschließlich nicht-palmitoyliertes BACE wird „gesheddet“. Im Gegensatz dazu ist bei einer Palmitoylierung die Freisetzung von BACE unterbunden und dadurch die Aβ-Produktion reduziert. Folglich könnte dies einen Schutzmechanismus darstellen, um das amyloidogene Potential von BACE herabzusetzen. 2.2 Die Familie der Proprotein-Konvertasen Die Prozessierung von Vorläuferproteinen durch eine begrenzte Proteolyse ist ein wichtiger und weit verbreiteter Mechanismus bei der Erzeugung biologisch aktiver EINLEITUNG 18 Proteine und Peptide. Ausgeführt wird diese Funktion von einer Proteinasefamilie, die im sekretorischen Weg und auf der Zelloberfläche lokalisiert ist. Die Enzyme dieser Familie gehören zu den calciumabhängigen Serin-Endopeptidasen und sind sowohl mit der bakteriellen Proteinase Subtilisin als auch mit der Hefe-Proteinase Kexin verwandt. Sie werden daher als subtilisinähnliche Proprotein-Konvertasen oder einfach als ProproteinKonvertasen bezeichnet. Sieben Mitglieder dieser Familie konnten in Säugetieren identifiziert und charakterisiert werden, und zwar Furin/PACE, PC2, PC1/PC3, PACE4, PC4, PC5/PC6 und PC7/PC8/LPC (Steiner, 1998, Seidah und Chretien, 1999, Zhou et al., 1999). Sie alle besitzen ein N-terminales Prosegment, gefolgt von einer hoch konservierten katalytischen Domäne und einer konservierten P-Domäne. Einige Mitglieder verfügen zusätzlich über eine Transmembran- und eine zytoplasmatische Domäne. Die P-Domäne scheint eine regulatorische Funktion auszuüben, sie bestimmt das Maß der Calciumabhängigkeit und das pH-Wert-Optimum der jeweiligen Konvertase. Zusätzlich scheint sie für die strukturelle Stabilität notwendig zu sein. Weniger konserviert sind die zytoplasmatischen Domänen. Sie enthalten unter anderem Phosphorylierungsstellen und bestimmen die zelluläre Lokalisierung der betreffenden Konvertase. Furin D H S 794 AS PC2 D H S 637 AS PC1/PC3 D H S 753 AS PACE4 D H S 969 AS PC4 D H S 654 AS PC5/PC6A D H S 915 AS PC5/PC6B PC7 1877 AS D H S 785 AS Signalpeptid P-Domäne Prodomäne cysteinreiche-Domäne katalytische Domäne Transmembrandomäne __________________________________________________________________ Abbildung 2.4 Die Domänenstruktur der Proprotein-Konvertasen. Alle sieben Mitglieder haben ein konserviertes Signalpeptid, eine Prodomäne, eine katalytische Domäne und eine P-Domäne, unterscheiden sich jedoch in ihrer C-terminalen Domäne. Nur Furin, PC5/PC6B und PC7 besitzen eine Transmembrandomäne. In der katalytischen Domäne sind die Aminosäurereste der katalytischen Triade des aktiven Zentrums unter Verwendung des Einbuchstaben-Codes für Aminosäuren dargestellt (nach Nakayama et al., 1997). EINLEITUNG 19 Wie Subtilisin werden auch die Proprotein-Konvertasen durch eine autokatalytische Entfernung ihres Prosegments aktiviert (Nakayama, 1997). Die Autoaktivierung des Furins dient dabei als Modell für die anderen Proprotein-Konvertasen mit Ausnahme von PC2, das auf andere Weise aktiviert wird. In diesem Modell wird Furin als inaktives Vorläuferprotein mit einer Prodomäne synthetisiert, die für die korrekte Faltung im endoplasmatischen Retikulum erforderlich ist (Anderson et al., 1997). Sobald die native Struktur gebildet ist, erfolgt die autokatalytische Prozessierung der Prodomäne. Diese intramolekulare Spaltung des Prosegments ist die Grundvoraussetzung dafür, dass Furin das endoplasmatische Retikulum verlassen kann. Das Prosegment verbleibt jedoch nichtkovalent an das Furin gebunden und fungiert als potenter Autoinhibitor der katalytischen Aktivität. Erreicht die latente Form des Furins den trans-Golgi-Apparat wird das Prosegment durch eine zweite Spaltung innerhalb des Prosegments entfernt und die vollständige Aktivität hergestellt. Erleichtert wird die Dissoziation durch die saure (pH ≈ 6,5) und calciumreiche Umgebung des trans-Golgi-Apparats (Anderson et al., 1997). Proprotein-Konvertasen können anhand ihrer Expressionsmuster in drei Gruppen eingeteilt werden (Nakayama, 1997). Furin, PACE4, PC5/PC6 und PC7 gehören zu den ubiquitär exprimierten Konvertasen, sie werden in einer Reihe von Geweben und ZellLinien exprimiert. Im Gegensatz dazu werden PC2 und PC1/PC3 nur in neuroendokrinen Geweben, wie den pankreatischen Inseln, der Schilddrüse und vielen Hirnregionen exprimiert. Die Expression von PC4 beschränkt sich ausschließlich auf testikuläre spermatogene Zellen. Im Allgemeinen sind Proprotein-Konvertasen für die Prozessierung von verschiedenartigen Vorläuferproteinen verantwortlich, darunter Vorläufer von Hormonen, Wachstumsfaktoren, Matrix-Metalloproteinasen, Rezeptoren, viralen Glykoproteinen und bakteriellen Toxinen (Steiner, 1998, Seidah und Chretien, 1999, Zhou et al., 1999). Typischerweise erfolgt die Proteolyse an Sequenzen, die durch das Konsensusmotiv R X (K/R) R↓ gekennzeichnet sind. Obwohl APP nur einen basischen Rest in der Nähe der α-Sekretase-Spaltstelle besitzt, nämlich ein Lysin in Position -1, wurde die Möglichkeit untersucht, dass ProproteinKonvertasen bei der α-Sekretase-Spaltung von APP beteiligt sein könnten. Anlass hierfür war die Tatsache, dass Proprotein-Konvertasen im sekretorischen Weg und demzufolge im trans-Golgi-Netzwerk sowie auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, also genau an den Orten, an denen α-Sekretaseaktivität nachgewiesen wurde. Dazu wurden PK-Zellen (pig kidney) transient mit den cDNAs verschiedener Proprotein-Konvertasen infiziert und der Einfluss der Überexpression auf die Sekretion von APPsα ermittelt (De Strooper et al., 1995). Getestet wurden mit Ausnahme von PC7 alle weiteren Mitglieder der ProproteinKonvertasenfamilie. Eine Auswirkung auf die APP-Prozessierung zeigte keine der getesteten Proteinasen. EINLEITUNG 20 2.2.1 Die Proprotein-Konvertase Furin Furin ist die erste identifizierte und auch die am besten untersuchte ProproteinKonvertase. Der Name Furin leitet sich von dem dazugehörigen Gen FUR ab (Van de Ven et al., 1990). Dieses Gen ist unmittelbar oberhalb des FES/FSP-Proto-Onkogens (FUR: FES/FSP Upstream Region) lokalisiert und wurde aufgrund seiner Nähe zum menschlichen FES/FSP-Gen während dessen Untersuchung gefunden (Roebroek et al., 1986). Anhand von Sequenzhomologien konnte es als Säuger-Analogon der HefeEndopeptidase Kexin ermittelt werden (Van den Ouweland et al., 1990). Furin ist ein Typ I Transmembranprotein, das als glykosyliertes Vorläuferprotein von etwa 100 kDa synthetisiert und durch autokatalytische Spaltung in die reife 94 kDa-Form überführt wird. Das reife Enzym ist ausschließlich im sekretorischen Weg aktiv, so dass es sich zwischen dem trans-Golgi-Netzwerk, der Zelloberfläche und den Endosomen bewegt (Molloy et al., 1994, 1999, Teuchert et al., 1999). Die gegenwärtige intrazelluläre Lokalisierung wird dabei durch die in der zytoplasmatischen Domäne enthaltenen Motive bestimmt (Abbildung 2.5). So verfügt Furin über eine auf Tyrosin-basierende Sequenz (YKGL), eine Dileucin-ähnliche Sequenz und zwei Casein Kinase II-Phosphorylierungsstellen (Jones et al., 1995, Schäfer et al., 1995). Das auf Tyrosin basierende Motiv dient als endozytotische Signalsequenz und damit der Internalisierung der Konvertase von der Plasmamembran. Eine Dephosphorylierung der Casein Kinase II-Stellen durch Isoformen der Proteinphosphatase 2 fördert die Rückkehr des Furins von der Zelloberfläche zum trans-GolgiNetzwerk, wogegen die Phosphorylierung den Transport zur Zelloberfläche bewirkt (Dittie et al., 1997). Alternativ kann phosphoryliertes Furin an PACS-1 (Phosphofurin Acidic Cluster Sorting protein 1) binden und so im trans-Golgi-Netzwerk zurückgehalten werden. PACS-1 vermittelt hierbei die Assoziation des phophorylierten Furins mit einem ClathrinAdapter-Komplex über das Adapterprotein AP-1 (Molloy et al., 1999). P P RSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL 740 750 760 770 780 790 __________________________________________________________________ Abbildung 2.5 Aminosäuresequenz der zytoplasmatischen Domäne von humanem Furin. Diese aus 56 Aminosäuren bestehende Domäne enthält Sequenz-Motive, die die intrazelluläre Lokalisierung des Enzyms bestimmen. Die Internalisierungssignale sind einfach unterstrichen, die Sequenz, durch die Furin an der Zelloberfläche zurückgehalten wird, ist fettgedruckt und die saure Sequenz mit den Casein-Kinase II-Phosphorylierungsstellen, über die das Protein in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand in das transGolgi-Netzwerk, in die Lysosomen oder zur Zelloberfläche dirigiert wird, ist kursivgedruckt und doppelt unterstrichen. Die Casein Kinase II-Phosphorylierungsstellen werden durch ein P angezeigt. EINLEITUNG 21 Auf dem Weg zur Zelloberfläche kann Furin an einer Spaltstelle zwischen der P-Domäne und der Transmembrandomäne prozessiert und damit in eine lösliche, aber weiterhin katalytisch aktive Form überführt werden (Vidricaire et al., 1993, Vey et al., 1994). Bisher ist jedoch nicht bekannt, ob es sich hierbei um einen autokatalytischen Prozess handelt, oder ob andere Proteinasen daran beteiligt sind. 2.2.2 Die Proprotein-Konvertase PC7 PC7 stellt das zuletzt entdeckte Mitglied aus der Familie der Proprotein-Konvertasen dar (Seidah et al., 1996, Constam et al., 1996). Man bezeichnet es auch als LPC (Lymphoma Proprotein Convertase, Meerabux et al., 1996) oder PC8 (Bruzzaniti et al., 1996). Der Name PC8 ist heute allerdings nicht mehr gebräuchlich, da er eingeführt wurde, nachdem eine Form von PACE4 aufgrund eines Sequenzierungsfehlers irrtümlich als PC7 bezeichnet wurde. PC7 wird als glykosyliertes Zymogen von etwa 100 kDa synthetisiert und im endoplasmatischen Retikulum durch Autoproteolyse in das reife Enzym von etwa 90 kDa überführt. Obwohl sich PC7, wie Furin, zwischen dem trans-Golgi-Netzwerk und der Zelloberfläche aufhält, unterscheiden sich die zytoplasmatischen Domänen der beiden Proteinasen beträchtlich voneinander (Wouters et al., 1998). So enthält die zytoplasmatische Domäne des PC7 nicht das auf Tyrosin basierende Rückhol-Motiv YXXL und wird zudem nicht phosphoryliert (Van de Loo et al., 1997). Sie enthält allerdings zwei Dileucin-Motive, die für die Rückkehr des auf der Zelloberfläche vorhandenen PC7 in das trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein könnten (Abbildung 2.6). Weiterhin wird ein in der zytoplasmatischen Domäne vorhandenes Cystein reversibel palmitoyliert (Van de Loo et al., 2000). Hierdurch scheint aber eher die Stabilität, beziehungsweise die Halbwertszeit, als die intrazelluläre Lokalisierung reguliert zu werden. EV CLSQRSKAST HGCRRGCCPW PPQSQNSKEV GTALESMPLC SSKDLDGVDS EHGDCTTASS LLAPELLGEA DWSLSQNSKS DLDCPPHQPP DLKDGQIC ____________________________________________________________ Abbildung 2.6 Aminosäuresequenz der zytoplasmatischen Domäne von PC7 aus Ratte. Diese aus 100 Aminosäuren bestehende Domäne enthält zwei Palmitoylierungsstellen (fettgedruckt) und zwei Dileucin-Motive (unterstrichen). Sowohl Furin als auch PC7 sind im trans-Golgi-Netzwerk konzentriert und werden von dort zur Zelloberfläche und den Endosomen gelenkt. Darüber hinaus verfügen sie über eine vergleichbare Substratspezifität und ein ähnliches Expressionsmuster in den 22 EINLEITUNG verschiedenen Geweben (Steiner, 1998, Seidah und Chretien, 1999, Zhou et al., 1999). Dennoch lässt sich nicht vorhersagen, ob ein potentielles Vorläuferprotein, das die basische Erkennungssequenz enthält und damit die Anforderungen für eine Prozessierung erfüllt, von beiden Proteinasen oder nur einer beziehungsweise gar nicht prozessiert wird. Dies liegt unter anderem darin begründet, dass geringfügige, aber ausschlaggebende Unterschiede in der Lokalisierung bestehen können. PC7 und Furin besitzen sehr verschiedenartige zytoplasmatische Domänen und so ist es möglich, dass sie in unterschiedlichen Bereichen des trans-Golgi-Netzwerks auftreten. In diesem Fall würde die Prozessierung vom Aufenthaltsort des Vorläuferproteins abhängen, also davon, mit welcher Konvertase es in Kontakt treten kann. Durch eine Dichtegradientenzentrifugation mit verschiedenen Proteinen als Marker für definierte Zellkompartimente wurde die intrazelluläre Lokalisierung von PC7 und Furin untersucht. Tatsächlich scheint der größte Teil des Furins im trans-Golgi-Netzwerk vorhanden zu sein, während PC7 eher in den sekretorischen Vesikeln zu finden ist (Wouters et al., 1998). Ferner existiert PC7 ausschließlich als Transmembranprotein, während Furin teilweise „gesheddet“ und so in eine lösliche Form überführt wird. Aber auch die Unterschiede in der Substratspezifität können sich auf die Prozessierung von Vorläuferproteinen auswirken. Zum Beispiel werden die Pro-α-Untereinheiten der Integrine von Furin gespalten, von PC7 jedoch nicht (Lissitzky et al., 2000). Daneben kann die Prozessierung sicherlich auch vom Expressionsmuster und der Expressionsrate des jeweiligen Enzyms abhängen. Aufgrund der hohen Expressionsrate von PC7 im Hippocampus (Seidah et al., 1996), einer bei der Alzheimer-Demenz betroffenen Hirnregion, wurde die Möglichkeit eines Beitrags von PC7 an der α-Sekretase-Spaltung von APP untersucht (Lopez-Perez et al., 1999, 2001). Dabei stellte sich heraus, dass die APPsα-Sekretion durch die Überexpression von PC7 deutlich erhöht wird. Obwohl APP keine Proprotein-KonvertasenErkennungssequenz besitzt und eine direkte APP-Spaltung durch PC7 nicht gezeigt wurde, wird PC7 als mögliche α-Sekretase diskutiert. 2.2.3 Die Substratspezifität der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin Basierend auf der Kristallstruktur von Subtilisin konnte die dreidimensionale Struktur des katalytischen Zentrums von Furin modelliert werden (Siezen et al., 1991, Creemers et al., 1993). Bemerkenswert ist hier die große Anzahl an sauren Resten innerhalb der Substratbindungsregion, die eine entscheidende Funktion bei der spezifischen Wechselwirkung mit den basischen Abschnitten des Substrats ausüben und so die Substratspezifität bedingen. Darauf beruhend werden Substrate, die die Erkennungssequenz R -3X -2(R/K) -1R↓ aufweisen, am effektivsten prozessiert. Um die Substratspezifitäten der -4 EINLEITUNG 23 Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin genauer zu untersuchen wurde pro-Renin als Substrat mit Mutationen in den Positionen -1 bis -6 eingesetzt (van de Loo et al., 1997). Die pro-Renin-Mutanten wurden mit PC7 bzw. Furin koexprimiert und die Auswirkung auf die Überführung von pro-Renin in Renin ermittelt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2.1 zusammengestellt. Sequenz der Spaltstelle PC7 Furin DVRTKR teilweise √ DVFRKR - - RVRTKR √ √ RVFTQR - - RVRTQR - √ RVFTKR √ √ DVRTKK - teilweise DVFTKR - - DVRTQR - teilweise DRRRKR teilweise √ Tabelle 2.1 Prozessierung von Wildtyp-pro-Renin und der pro-Renin-Mutanten durch PC7 und Furin (nach van de Loo et al., 1997). Dargestellt sind die Sequenzen der proRenin-Spaltstelle. Basische Aminosäurereste sind fettgedruckt, die Sequenz des Wildtyps ist unterstrichen. Die vollständige Spaltung eines Substrats wird durch einen Haken symbolisiert. Substrate die Arginin-Reste in den Positionen -1 und -4, sowie einen basischen Rest in Position -2 besitzen werden von Furin mit der höchsten Effizienz prozessiert. Es können jedoch auch Substrate, denen ein basischer Rest in Position -2 fehlt, gespalten werden allerdings mit einer etwa zehnfach geringeren Effizienz. Hierdurch ergibt sich als minimales Furin-Spaltmotiv die Sequenz R X X R (Van de Loo et al., 1997, Munzer et al., 1997). Die Spaltung an monobasischen Sequenzen erfordert unbedingt einen basischen Rest in Position -4 oder -6. Dieser Rest muss entweder ein Arginin- oder ein Lysin-Rest sein und kann nicht durch einen Histidin-Rest ersetzt werden (Munzer et al., 1997). Ferner kann ein Arginin in Position -6 das Arginin in Position -4 ersetzen, jedoch ist dann ein basischer Rest in Position -2 unbedingt erforderlich. Bei einer Überexpression von Furin kann auch eine Spaltung von Substraten stattfinden, die ein Lysin in Position -1 besitzen. Auch hier ist jedoch ein basischer Rest in Position -2 notwendig. Wie Furin, so prozessiert auch PC7 Vorläuferproteine mit der Erkennungssequenz R X (K/R) R am effektivsten. Verglichen mit Furin ist die Substratspezifität ähnlich, jedoch nicht identisch (Van de Loo et al., 1997, Munzer et al., 1997). So ist PC7 nicht in der 24 EINLEITUNG Lage, an monobasischen Resten zu spalten, vielmehr ist ein basischer Rest in Position -2 essentiell. Fehlt er, findet keine Prozessierung statt. Zusätzlich benötigt PC7 unbedingt ein Arginin in Position -1, das selbst von Lysin nicht ersetzt werden kann. Allerdings kann, genau wie bei Furin, das Arginin in Position -4 durch ein Arginin in Position -6 ersetzt werden. 2.3 Zielsetzung Ein therapeutisches Ziel zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit ist eine reduzierte AβProduktion. Eine Strategie hierfür geht von der Stimulierung der α-Sekretaseaktivität aus, um so das Substrat APP vom Aβ-bildenden β-Sekretase Weg abzuleiten. Grundsätzlich kann dies durch die Aktivierung von Neurotransmitter-Rezeptoren, welche an die Proteinkinase C-vermittelte Signalkaskade gekoppelt sind, erfolgen (Nitsch et al., 1992, Buxbaum et al., 1993, Hung et al., 1993). Aber auch durch die Behandlung von Zellen mit Lovastatin resultiert, infolge einer erhöhten ADAM10-Expression, eine verstärkte α-Sekretaseaktivität (Kojro et al., 2001). Substanzen, die aktivierend auf die α-Sekretase ADAM10 wirken, könnten somit bei der Entwicklung von Pharmaka zur Behandlung der AlzheimerDemenz hilfreich sein. Erschwert wird das Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen insofern, als Auswirkungen auf die α-Sekretaseaktivität in der Regel durch das Spaltprodukt APPsα nachgewiesen werden und etablierte Methoden zu dessen Detektion, wie zum Beispiel Western-Blot-Analysen, umständlich, zeitaufwendig und teuer sind. Ein Ziel war es daher, ein Testverfahren zu etablieren, dass den Nachweis des freigesetzten APPs im Überstand von Zellkulturen schnell und zuverlässig ermöglicht. Zu diesem Zweck sollte ein Reportergen mit der cDNA der 119-C-terminalen Aminosäuren des Amyloid-Vorläuferproteins fusioniert und anschließend mit der cDNA der α-Sekretase ADAM10 in einem Expressionsvektor vereinigt werden. Im weiteren Verlauf sollten beide cDNAs in HEK293Zellen stabil zur Expression gebracht werden und das Testverfahren soweit optimiert werden, dass das proteolytisch freigesetzte Reporterprotein anstelle des endogenen APPsα photometrisch im Zellkulturüberstand nachgewiesen und quantifiziert werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Aktivierung der α-Sekretasen ADAM10 und TACE durch die Entfernung der Prodomäne zu untersuchen. Die α-Sekretase ADAM10 wird als Zymogen mit einer Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz (RKKR) zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne synthetisiert. Mit Hilfe eines synthetischen Proprotein-Konvertasen-Inhibitors sollte daher zunächst ermittelt werden, EINLEITUNG 25 ob Proprotein-Konvertasen an der Entfernung der Prodomäne von ADAM10 beteiligt sind. Durch die Überexpression von PC7 zusammen mit ADAM10 in HEK293-Zellen sollte insbesondere die Bedeutung von PC7 für die Prozessierung von ADAM10 und die Auswirkung auf die APPsα-Freisetzung aufgeklärt werden, da PC7 als mögliche α-Sekretase in Betracht gezogen wird, eine direkte APP-Spaltung aufgrund der Substratspezifität von PC7 jedoch sehr unwahrscheinlich erscheint. Furin sollte in diesem Zusammenhang ebenfalls untersucht werden, da es der Proprotein-Konvertase PC7 in bezug auf Funktion und Substratspezifität sehr ähnlich ist. Eine weitere Aufgabe war es, die Sequenzanforderungen der Proteinasen, die für die Abspaltung der Prodomäne von ADAM10 verantwortlich sind, durch eine PCR-Mutagenese der Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz zu untersuchen. Ferner sollte das zelluläre Kompartiment, in dem die Entfernung der Prodomäne erfolgt, durch eine Deglykosylierung von ADAM10 mit der N-Glykosidase F und der Endoglykosidase H näher bestimmt werden. Die Disintegrin-Metalloproteinase TACE wird ebenfalls als inaktives Zymogen synthetisiert und besitzt wie ADAM10 sowohl eine α-Sekretaseaktivität als auch eine ProproteinKonvertasen-Erkennungssequenz (RVKR). Zudem erfolgt die proteolytische Entfernung der Prodomäne in einem späten Golgi-Kompartiment innerhalb des sekretorischen Wegs, so dass eine Beteiligung von Proprotein-Konvertasen an diesem Vorgang als sehr wahrscheinlich erscheint. Da die Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenzen von ADAM10 und TACE geringfügig voneinander abweichen, sollte überprüft werden, ob TACE ebenfalls durch Proprotein-Konvertasen, insbesondere PC7 und Furin, prozessiert wird und ob hierbei Unterschiede zu ADAM10 bestehen. MATERIALIEN 27 3 MATERIALIEN 3.1 Chemikalien und Hilfsmittel 3.1.1 Allgemeine Laborchemikalien Acrylamid/ Bisacrylamid Roth, Karlsruhe Aceton Roth, Karlsruhe Agarose Sigma, Deisenhofen Ameisensäure AppliChem, Darmstadt Ampicillin (Natriumsalz) Roth, Karlsruhe APS (Ammoniumperoxodisulfat) BioRad, München Bactoagar AppliChem, Darmstadt Bromphenolblau Serva, Heidelberg BES Sigma, Deisenhofen BSA Roth, Karlsruhe BSA (fettsäurefrei) Sigma, Deisenhofen Butanol Roth, Karlsruhe CAPS Sigma, Deisenhofen Chloroform Roth, Karlsruhe Diethylether Roth, Karlsruhe DMSO (Dimethylsulfoxid) Merck, Darmstadt DNA-Marker MBI Fermentas, St. Leon-Rot dNTPs Sigma, Deisenhofen DTT (Dithiothreitol) Sigma, Deisenhofen EDTA Sigma, Deisenhofen EGTA Sigma, Deisenhofen Entwickler (für Hyperfilm ECL) Kodak, Rochester (USA) Essigsäure Merck, Darmstadt Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotin Pierce, St. Augustin Fixierer (für Hyperfilm ECL) Kodak, Rochester (USA) Glukose AppliChem, Darmstadt Glycin Roth, Karlsruhe MATERIALIEN 28 Glyzerin Roth, Karlsruhe HA-Peptid Boehringer, Mannheim HCl Merck, Darmstadt Hefeextrakt AppliChem, Darmstadt Hepes Sigma, Deisenhofen L-Homoarginin Sigma, Deisenhofen I-Block Tropix, Weiterstadt Isoamylalkohol Roth, Karlsruhe Isopropanol Roth, Karlsruhe KCl Merck, Darmstadt KH2PO4 Merck, Darmstadt β-Mercaptoethanol Fluka, Buchs (Schweiz) Methanol Roth, Karlsruhe MgCl2 Merck, Darmstadt NaCl Roth, Karlsruhe Na2HPO4 Merck, Darmstadt NaOH Merck, Darmstadt NaOAc Merck, Darmstadt 4-Nitrophenylphosphat Sigma, Deisenhofen Nonidet-P40 Calbiochem, Schwalbach Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Sigma, Deisenhofen Polyethylenglykol Roth, Karlsruhe Poly-L-Lysin Sigma, Deisenhofen Proteinaseinhibitoren-Tabletten complete mini Boehringer, Mannheim Protein A Sepharose CL-4B Pharmacia Biotech, Freiburg Rotiphenol Roth, Karlsruhe Saccharose Sigma, Deisenhofen SDS BioRad, München Trichloressigsäure AppliChem, Darmstadt TEMED (N,N,N`,N`,-Tetramethylethylenediamine) BioRad, München Tris AppliChem, Darmstadt Triton X-100 Serva, Heidelberg Trypton AppliChem, Darmstadt Tween 20 Serva, Heidelberg MATERIALIEN 29 3.1.2 Enzyme und Kitsysteme Bradford Protein Assay Kit Roth, Karlsruhe CIAP (Calf Intestine Alcalic Phosphatase) Pharmacia Biotech, Freiburg Endoglykosidase H Roche, Mannheim N-Glykosidase F Roche, Mannheim Lysozym Sigma, Deisenhofen Restriktionsenzyme New England Biolabs, Schwalbach Restriktionsenzyme Pharmacia Biotech, Freiburg Restriktionsenzyme Gibco BRL, Eggenstein Restriktionsenzyme MBI Fermentas, St. Leon-Rot RNase A Sigma, Deisenhofen T4-DNA-Ligase MBI Fermentas, St. Leon-Rot T4-DNA-Polymerase MBI Fermentas, St. Leon-Rot T4-Polynukleotidkinase Gibco, Life Technologies, Eggenstein Trypsin PAA, Linz (Österreich) Vent-Polymerase New England Biolabs, Schwalbach Plasmid Midi/Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden Nucleo Spin Kit 2 in 1 Extract Macherey-Nagel, Düren Nucleo Spin Kit Plasmid Macherey-Nagel, Düren QIAquick Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen GmbH, Hilden Western-Star Protein Detection Kit Tropix, Bedford, MA (USA) 3.1.3 Antikörper Primärantikörper anti-HA Maus-IgG (16B12, monoklonal) Babco, Richmond, CA (USA) anti-HA Kaninchen-IgG (Y-11, polyklonal) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg anti-APP Maus-IgG (6E10, monoklonal) Senetek, St. Louis (USA) anti-ADAM10 Kaninchen-IgG (polyklonal) Chemicon, Temecula, (USA) anti-TACE Kaninchen-IgG (polyklonal) Chemicon, Temecula, (USA) anti-PC7 Kaninchen-Antiserum Prof. Dr. W. Garten, Universität Marburg anti-Furin Kaninchen-Antiserum Prof. Dr. W. Garten, Universität Marburg MATERIALIEN 30 Sekundärantikörper Alkalische Phosphatase-gekoppelter anti-Maus-IgG aus Ziege Tropix, Bedford, MA (USA) Alkalische Phosphatase-gekoppelter anti-Kaninchen-IgG aus Ziege Tropix, Bedford, MA (USA) 35 Amersham, Freiburg S-markierter anti-Maus-IgG 3.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze Dulbecco‘s modified Eagle medium PAA, Linz (Österreich) Dulbecco‘s modified Eagle medium Sigma, Deisenhofen DMEM (ohne Phenolrot) Sigma, Deisenhofen Fötales Kälberserum PAA, Linz (Österreich) Geneticin (G418-Sulfat) PAA, Linz (Österreich) Glutamin (100x) PAA, Linz (Österreich) Hygromycin B PAA, Linz (Österreich) minimum essential medium (ME-Medium) Sigma, Deisenhofen Serum Plus Serum Supplement (Nu-Serum) JRH Biosciences, Andover (England) Penicillin/ Streptomycin (100x) PAA, Linz (Österreich) 3.2 Materialien 3.2.1 Laborgeräte Acryl-Halbmikroküvetten Sarstedt, Nürnbrecht Analysenwaage Mettler-Toledo GMBH, Gießen Bildplatte BAS-MP 2025 Fujifilm, Düsseldorf Bio-Imaging Analyzer BAS-1800 (Fuji) raytest, Straubenhardt Blot-Apparatur Biometra, Göttingen Brandel Cell Harvester Brandel, Gaithersburg (USA) CCD-Kamera raytest, Straubenhardt Doppelstrahlphotometer U-2000 Hitachi (Japan) Filterpapier (3-MM) Whatman, Springfield (Großbritannien) Flachbettgelapparatur für DNA Eigenbau Elektrophorese-Apparatur Biometra, Göttingen Gewebekulturschalen Sarstedt, Nürnbrecht Gewebekulturschalen Greiner, Kremsmünster (Österreich) MATERIALIEN 31 Glaspotter (Homogenisatoren) GLW, Würzburg Glaszentrifugenröhrchen DuPont, Bad Homburg Heizblock Bioblock Scientific, Illkirch Cedex (F) Hyperfilm-ECL Pharmacia Biotech, Freiburg Inkubationsschüttler Multitron Infors GmbH, Bottmingen (Schweiz) Kühlzentrifuge J2-21 Beckmann, München Kunststoffspritzen (10 und 50 ml) Braun, Melsungen Kunststoffzentrifugenröhrchen (15 und 50 ml) Sarstedt, Nürnbrecht Kryoröhrchen Nunc, Wiesbaden Mikrofilter (0,2 und 0,4 µm) Sarstedt, Nürnbrecht Phasenkontrast-Mikroskop CK 2 Olympus, Hamburg PCR-Reaktionsgefäße peq Lab, Erlangen Petrischalen Sarstedt, Nürnbrecht pH-Meter WTW, Weilheim Polystyrolküvetten Sarstedt, Nümbrecht PVDF-Membran Applied Biosystems, Foster City (USA) Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml) Eppendorf, Hamburg Scanner BAS-1800 Fujifilm, Düsseldorf Semi-Dry-Blotapparatur Biometra, Göttingen Spannungsquelle Power-All Serva, Heidelberg Sterilwerkbank Hera Safe HS 12 Heraeus, Hanau Speed-Vac Savant Instruments, Farmingdale, (USA) Tischzentrifuge (5415C) Eppendorf, Hamburg Tischkühlzentrifuge (5415R) Eppendorf, Hamburg Transilluminator 4000 Stratagene, Heidelberg Thermocycler Perkin-Elmer, Norwalk, CT (USA) Neubauer-Zählkammer Roth, Karlsruhe NuPAGE (4-12%) Fertiggele Novex, Frankfurt Überkopfrotierer Fröbel Labortechnik, Lindau Ultrazentrifuge L7-65 Beckman, München Vortexer Janke und Kunkel, Heitersheim Wasserbad BFL, Burgwedel Zellkulturbrutschrank Heraeus, Hanau Zentrifugenbecher (50 und 250 ml) Beckmann, München Zentrifugenrotoren JA14 und JA20 Beckmann, München MATERIALIEN 32 3.2.2 Materialien für die Molekular- und Zellbiologie 3.2.2.1 Plasmide pcDNA3-Vektor der Firma Invitrogen, Leek (Niederlande). Dieser eukaryontische Expressionsvektor trägt den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, der eine hohe transiente und stabile Expression von Genen in vielen eukaryontischen Zellen ermöglicht. Er trägt außerdem den SV40Origin, ein Polyadenylierungssignal und das Neomycin-Resistenzgen zur Selektion von Transformanden mit Geneticin (G418). pcDNA3-ADAM10-HA enthält die C-terminal HA-Epitop-markierte ADAM10-cDNA aus Rind und wurde von Herrn Dr. R. Postina, Institut für Biochemie, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, zur Verfügung gestellt. pcDNA3-bFur enhält das 2795 bp SmaI-Fragment der Rinder-Furin-cDNA in der EcoRV-Schnittstelle von pcDNA3 und wurde von Herrn Dr. Rolf Postina, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, zur Verfügung gestellt. pRC/CMV-rPC7 enthält die PC7-cDNA aus Ratte und wurde von Herrn Prof. Dr. Wolfgang Garten, Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg zur Verfügung gestellt. pIRES1hyg-Vektor der Firma Clontech Laboratories, Heidelberg. Dieser eukaryontische Expressionsvektor enthält die interne Ribosomen-Eintrittsstelle des Encephalomyocardits-Virus, die die Translation zweier offener Leserahmen auf einer mRNA ermöglicht. Nach Selektion mit Hygromycin B exprimieren daher nahezu alle überlebenden Kolonien das einklonierte Gen stabil. Die Expressionskassette enthält außerdem den Cytomegalovirus (CMV)Promotor, ein synthetisches Intron zur Stabilisierung der mRNA, das Hygromycin BPhosphotransferase-Gen und ein Polyadenylierungssignal. pSBC-2-SEAP enthält die cDNA für die sekretierte alkalische Phosphatase aus der menschlichen Plazenta und wurde von Frau Bettina Lingen, Max-Planck-Institut für Biophysik, Frankfurt, zur Verfügung gestellt. MATERIALIEN 33 pSG5new-bFur ist ein im Polylinker modifizierter pSG5-Vektor der Firma Stratagene, La Jolla (USA). Das Plasmid enthält die Furin-cDNA aus Rind in der SmaI-Schnittstelle und wurde von Herrn Prof. Dr. W. Garten, Institut für Virologie, Universität Marburg, zur Verfügung gestellt. 3.2.2.2 Oligonukleotide Die Sequenzen aller Oligonukleotide sind in 5´- → 3´-Orientierung aufgeführt. Die Oligonukleotide sind entschützt und entsalzt geliefert worden und wurden nicht weiter aufbereitet. PCR-Primer für SEAP SEAP-for: ATC GAT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GGG CCT ClaI SEAP-rev: TCA AGT GTA CAC CCC CGG GTG CGC GGC GTC GGT BsrGI PCR-Primer für APP751 APP-for: CGA GGA CTG TAC ACT CGA CCA GGT TCT GGG TTG BsrGI APP-rev: TCT AGA CTC GAG CTA GTT CTG CAT CTG CTC AAA GAA CT XbaI, XhoI PCR-Primer für ADAM10-Mutagenese AD∆FUR: ATG CGC AAG CAA CAA CTG TAG CTG AAA AAA ATA C AD_60170R: ACA GTC TGT GAA CTG CGG TTT AGG ATC AGA GGC FspI Fehlpaarungen der DNA-Basen sind unterstrichen, neu eingefügte Restriktionsschnittstellen zur Analyse der Klone sind fettgedruckt beziehungsweise sowohl fett- als auch kursivgedruckt und das dazugehörige Enzyme ist hinter der DNA-Sequenz angeführt. 3.2.2.3 Bakterienstämme Escherichia coli DH5α α: φ80δlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk– mk+), supE44, relA1, deoR, D(lacZYA-argFV169), F–, λ– ; von Clontech, Heidelberg. Escherichia coli JM109: e14-(McrA-), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK- mK+), supE44, relA1, D(lac-proAB), [F’ traD36 proAB lacIqZDM15] von Stratagene, La Jolla (USA). Beide Stämme dienten zur Transformation und Isolierung von Plasmid-DNA. MATERIALIEN 34 3.2.2.4 Zell-Linien HEK293: Amerikanische Zellsammlung, Nr. ATCC 1573-CRL LoVo: Amerikanische Zellsammlung, Nr. ATCC CCL 229 Humane Adenokarzinom-Zellen aus dem Darm. Diese kontinuierliche Zell-Linie wächst als Monoschicht mit einer epithelienähnlichen Morphologie und wurde von Herrn Prof. Dr. Wolfgang Garten, Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg zur Verfügung gestellt. HEK293-ADAM10-HA, Klon D3: Stabiler Einzelklon, der nach einer Calciumphosphat-vermittelten Transfektion von HEK293-Zellen mit pcDNA3-ADAM10-HA selektioniert und von Frau Dr. Sandra Gilbert, Institut für Biochemie, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, zur Verfügung gestellt wurde. 3.3 Stammlösungen, Puffer und Zellkulturmedien Antibiotika-Stammlösungen: 100 mg/ml Ampicillin, 250 mg/ml Geneticin (G418) 100 mg/ml Hygromycin B Lagerung bei -20°C Assay-Puffer: 200 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 pH 9,8 BBS: 50 mM BES 280 mM NaCl 1,5 mM Na2HPO4 pH 6,95, sterilfiltriert Lagerung bei 4°C MATERIALIEN 2 x Deglykosylierungspuffer: 35 50 mM Na2HPO4 1,5% (v/v) Nonidet-P40 0,25% (v/v) SDS pH 7,5 Dephosphorylierungspuffer: 50 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA pH 8,5 DMEM: DMEM (high modified: 4,5 g/l Glukose, 110 mg/ml Natriumpyruvat) ohne weitere Zusätze DNA-Probenauftragspuffer: Ethidiumbromid-Stammlösung: 50% (v/v) Glyzerin 0,2% (v/v) SDS 0,05% (w/v) Bromphenolblau 0,05% (w/v) Xylencyanol 10 mM EDTA 10 mg/ml Ethidiumbromid Lagerung lichtgeschützt bei 4°C Glycinlösung: 100 mM Glycin 10 µg HA-Epitoppeptid pH 2,5 glukosehaltiges LB-Medium: LB-Medium mit 20 mM Glukose I-Block-Puffer: 0,2% (w/v) I-Block 0,1% (v/v) Tween 20 in PBS MATERIALIEN 36 Imidazol-Lysispuffer: 20 mM Imidazol 100 mM KCl 2 mM MgCl2 10 mM EGTA 300 mM Saccharose 0,2% (w/v) Triton X-100 pH 6,8 (vor Gebrauch wurde eine Proteinaseinhibitor-Tablette zugefügt) Laufpuffer für Gelelektrophorese: 25 mM Tris 192 mM Glycin 0,1% (w/v) SDS LB-Agarplatten: LB-Medium mit 1,5% Bacto-Agar LB-Medium: 10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl pH 7,4, autoklaviert (121°C, 20 min) LB-Selektionsmedium: LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin Ligasepuffer: 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 10 mM DTT 1 mM ATP 25 µg/ml BSA pH 7,5 Lösung P1: 50 mM Tris-HCl 10 mM EDTA pH 8,0 Lösung P2: Lösung P3: 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS 3 M Kaliumacetat pH 4,8 MATERIALIEN PBS: 37 8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl 1,44 g/l Na2HPO4 0,24 g/l KH2PO4 pH 7,4, autoklaviert (121°C, 20 min) PCI: Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol, 25 : 24 : 1 (v/v/v) PEG/NaCl-Lösung: 13% (w/v) Polyethylenglykol 8000 1,6 M NaCl Poly-L-Lysinlösung: 0,1 mg Poly-L-Lysin in Wasser Proteinauftragspuffer (reduzierend): 62,5 mM Tris-HCl 20% (w/v) Glyzerin 3% (w/v) SDS 0,01% (w/v) Bromphenolblau 100 m DTT pH 6,8 Proteingrößenstandard: 98 kDa BSA "SeeBlue Pre-Stained Standard" 64 kDa Glutamat-Dehydrogenase 50 kDa Alkohol-Dehydrogenase 36 kDa Carbonyl-Anhydrase 30 kDa Myoglobin 16 kDa Lysozym 5 mM Hepes 1 mM EDTA Puffer A: pH 7, Lagerung bei 4°C (vor Gebrauch wurde eine Proteinaseinhibitor-Tablette zugefügt) Puffer B: 15 mM Hepes pH 7,4, Lagerung bei 4°C (vor Gebrauch wurde eine Proteinaseinhibitor-Tablette zugefügt) MATERIALIEN 38 RNaseA-Lösung: 10 mg/ml in 100 mM Natriumacetat pH 5,2 DNasen wurden durch eine 10-minütige Inkubation bei 100°C irreversibel denaturiert. SDS-Polyacrylamidgele: Sammelgel Trenngel 10% Trenngel 8% Acrylamid: 4% (w/v) 10% (w/v) 8% (w/v) N,N´-Methylenbis(acrylamid): 0,1% (w/v) 0,3% (w/v) 0,3% (w/v) Tris-HCl: 125 mM, pH 6,8 375 mM, pH 8,8 375 mM, pH 8,8 SDS: 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) APS: 0,05% (v/v) 0,05% (v/v) 0,05% (v/v) TEMED: 0,1% (v/v) 0,05% (v/v) 0,05% (v/v) Zur Polymerisation: STET-Puffer: 50 mM Tris-HCl 8% (w/v) Saccharose 5% (w/v) Triton X-100 50 mM EDTA pH 8,0 T4-Polynukleotidkinasepuffer: 70 mM Tris-HCl 0,1 M KCl 10 mM MgCl2 1 mM 2-Mercaptoethanol pH 7,6 T4-DNA-Polymerase-Puffer: 25 mM Tris-HCl 37,5 mM NaCl 7,5 mM MgCl2 2 mM DTT 1 mM ATP 0,5 mM dNTPs pH 7,5 TAE-Puffer: 40 mM Tris-HCl 20 mM Essigsäure 1 mM EDTA pH 8,4 MATERIALIEN TBE-Puffer: 39 89 mM Tris-HCl 89 mM Borsäure 2 mM EDTA pH 8,0 TBS: 20 mM Tris-HCl 150 mM NaCl pH 7,5, autoklaviert (121°C, 20 min) TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 7,5 Towbin-Puffer: 25 mM Tris-HCl 192 mM Glycin 20% (v/v) Methanol 0,05% (w/v) SDS pH 8,3 Transfektionsmedium: 2 mM Glutamin 100 U/ml Penicillin 100 mg/ml Streptomycin 10% (v/v) Serum Plus Serum Supplement in MEM Trypsin/EDTA-Lösung: 0,05% (w/v) Trypsin 0,54 mM EDTA in PBS Vent-PCR-Reaktionspuffer: 20 mM Tris-HCl 10 mM KCl 10 mM (NH4)2SO4 2 mM MgSO4 0,1% (v/v) Triton X-100 pH 8,8 MATERIALIEN 40 Zellkulturmedium: DMEM (high modified) 10% (v/v) fötales Kälberserum (FCS) 2 mM Glutamin 100 U/ml Penicillin 100 mg/ml Streptomycin METHODEN 41 4 METHODEN 4.1 Arbeiten mit Escherichia coli 4.1.1 Kultivierung von E. coli Die Kultivierung von E. coli-Stämmen erfolgte ausschließlich in LB-Medium (3.3), zur Selektion transformierter Zellen wurde zudem eine Ampicillinkonzentration von 100 µg/ml eingestellt. Transformanden wurden durch einen verdünnenden Ausstrich auf LBAgarplatten vereinzelt. Die Kultivierung der Bakterien für Plasmidschnellpräparationen (4.2.1.1) erfolgte auf LB-Agarplatten bei 37°C über Nacht, wohingegen die Kultivierung für Plasmidgroßpräparationen (4.2.1.3) in LB-Flüssigmedium unter Schütteln (120 rpm, Inkubationsschüttler) bei 37°C über Nacht erfolgte. 4.1.2 Herstellung transformationskompetenter E. coli 400 ml LB-Medium (3.3) wurden mit 1 ml einer E. coli-Kultur angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Das Wachstum der Bakterien konnte photometrisch durch Messungen bei einer Wellenlänge von 600 nm verfolgt werden. Erreichte die Zellsuspension eine optische Dichte von 0,4-0,6, so wurde das Wachstum durch Inkubation auf Eis gestoppt. Die Bakterien wurden für 15 min bei 1000 g und 4°C zentrifugiert und anschließend in 50 ml eiskaltem 50 mM CaCl2 suspendiert. Nach erneuter Inkubation für 15 min auf Eis erfolgte die Sedimentation der Zellen durch Zentrifugation (1000 g, 4°C, 15 min). Das Bakterienpellet wurde in 20 ml eiskaltem 50 mM CaCl2/10% (v/v) Glyzerin resuspendiert und für 4 h auf Eis inkubiert. Diese Bakteriensuspension wurde aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. 4.1.3 Transformation von E. coli Zur Transformation von E. coli wurden entweder Ligationsansätze (4.2.5.5) oder PlasmidDNA (4.2.1.3) verwendet. Dazu wurden 100 µl der transformationskompetenten Zellen (4.1.2) auf Eis aufgetaut, nach Zugabe der DNA (maximal ein Zehntel des Volumens der Bakteriensuspension) vorsichtig durchmischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Bei dem nachfolgenden Hitzeschock wurde die Bakteriensuspension für 90 s bei 42°C erhitzt und METHODEN 42 umgehend für 3 min auf Eis abgekühlt. Nach der Zugabe von 800 µl glukosehaltigem LBMedium (3.3) wurde der Ansatz für 1 h bei 37°C unter Schütteln (Inkubationsschüttler, 120 rpm) inkubiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten ausgestrichen. Die transformierten Bakterien wurden dann bei 37°C für 15 h im Brutschrank inkubiert. 4.1.4 Lagerung von E. coli Für die dauerhafte Lagerung von E. coli-Transformanden wurde der entsprechende Klon in 800 µl glukosehaltigem LB-Selektionsmedium (3.3) herangezogen (15 h, 37°C, 120 rpm, Inkubationsschüttler) und anschließend mit 200 µl sterilem Glyzerin versetzt. Die so auf 20% (v/v) Glyzerin eingestellte Bakteriensuspension wurde gut durchmischt und bei -80°C gelagert. Flüssigkulturen von Bakterien lassen sich im Kühlschrank bis zu 10 Tage und auf Agarplatten etwa 4 bis 6 Monate aufbewahren, ohne dass die Bakterien ihre Teilungsfähigkeit verlieren. 4.2 Arbeiten mit Nukleinsäuren 4.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 4.2.1.1 Plasmidschnellpräparation zur Analyse von E. coli-Transformanden Bei dieser Präparationsmethode wird zunächst die Bakterienzellwand durch Lysozym zerstört und anschließend die Zellmembran durch Hitzeeinwirkung aufgelöst. Mit Hilfe einer Impföse wurden die Bakterien von der Agarplatte in ein mit 350 µl STETPuffer (3.3) befülltes 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und durch Vortexen suspendiert. Nach Zugabe von 25 µl Lysozym (20 mg/ml in Wasser) und anschließender Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min erfolgte der Zellaufschluss durch Erhitzen für 50 s im kochenden Wasserbad. Der Zelldebris wurde nach Zentrifugation für 10 min bei 14000 rpm in der Tischzentrifuge mit einem sterilen Zahnstocher entfernt und die Plasmid-DNA durch Zugabe von 38 µl 3 M KOAc pH 4,8 und 400 µl Isopropanol aus der Lösung gefällt. Im Anschluss daran wurde die präzipitierte DNA durch Zentrifugation bei 14000 rpm für 15 min sedimentiert und, um das Pellet von Salzen zu befreien, mit 70% (v/v) Ethanol überschichtet und nochmals zentrifugiert. Das DNA-Präzipitat wurde bei Raumtemperatur getrocknet und in 60 µl sterilem Wasser aufgenommen. Für die analytische Restriktion wurde etwa ein Sechzigstel der Plasmid-DNA dieser DNA-Lösung verwendet. Vorhandene RNA konnte vorher durch den Verdau mit 1 µl RNaseA-Lösung (1mg/ml, DNase- frei) bei 37°C für 10 min entfernt werden. METHODEN 4.2.1.2 43 Plasmidpräparation unter Verwendung von Silicagelmatrix-Säulen Für Klonierungen, Transfektionen und Sequenzierungen wurde die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli bei Bedarf kleiner Mengen über käufliche Silicagelmatrix-Säulen ausgeführt (3.1.2). Die Durchführung der Präparation erfolgte hierbei nach Vorschrift des Herstellers (Qiagen oder Macherey-Nagel). 4.2.1.3 Plasmidgroßpräparation Unter Verwendung dieser Methode konnten größere Mengen (1-2 mg) sauberer PlasmidDNA für Transfektionen (4.3.3) und Klonierungen erhalten werden. Ausgehend von 400 ml einer Flüssigkultur wurden die Bakterien durch Zentrifugation (15 min, 4°C, 3000 g) pelletiert, in 8 ml Lösung P1 (3.3) aufgenommen und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 8 ml Lösung P2 (3.3) und sehr vorsichtigem Durchmischen des Ansatzes tritt während einer Inkubation für 7 min bei Raumtemperatur die alkalische Lyse der Bakterien ein. Nach der Neutralisation des Bakterienlysats mit 8 ml eiskalter Lösung P3 (3.3) und vorsichtigem Durchmischen wurde für 15 min auf Eis inkubiert. Da die genomische DNA im Gegensatz zur frei vorliegenden Plasmid-DNA mit der Bakterienzellwand verknüpft ist, konnte sie zusammen mit denaturierten Proteinen und Zelltrümmern durch Zentrifugation (40 min, 4°C, 27000 g) abgetrennt werden. Aus dem Überstand konnte dann die PlasmidDNA durch Zugabe von 17 ml Isopropanol (Volumenanteil 0,7) gefällt werden. Dazu wurde das Isopropanol mit der DNA-haltigen Lösung gut durchmischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die präzipitierten Nukleinsäuren wurden anschließend für 20 min bei 27000 g und 4°C zentrifugiert. Um Isopropanolreste zu entfernen, wurde das Pellet mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 3 ml Wasser aufgenommen. Nach Zugabe von 3,5 ml einer 7,5 M Ammoniumacetatlösung mit pH 4,8 und gutem Durchmischen wurde hochmolekulare RNA, die in Lösungen hoher Ionenstärke nicht löslich ist, durch eine Inkubation für 20 min auf Eis ausgesalzt. Die Abtrennung der RNA erfolgte durch Zentrifugation für 20 min bei 4°C und 14000 g. Aus dem Überstand konnte die Plasmid-DNA präzipitiert werden, indem nach Zugabe von 4 ml Isopropanol für 20 min auf Eis inkubiert und anschließend zentrifugiert wurde (siehe oben). Das Nukleinsäurepräzipitat wurde mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und schließlich in 500 µl Wasser gelöst. Der Abbau der restlichen, niedermolekularen RNA erfolgte durch Behandlung mit RNaseA. Dazu wurde mit 4 µl RNaseA-Lösung (10 mg/ml; DNase-frei) versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Für die folgende Fällung der DNA wurde der Ansatz mit 500 µl PEG/NaClLösung (3.3) gut durchmischt, für 20 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert (20 min, RT, METHODEN 44 7000 rpm, Tischzentrifuge). Das Pellet wurde einmal mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen, getrocknet und in Wasser aufgenommen. Fügt man einer proteinhaltigen, wässerigen Lösung Phenol zu, so werden die Proteine in der Interphase konzentriert. Zur Entfernung von Proteinen wurde die DNA-Lösung daher so lange mit PCI (3.3) extrahiert, bis nach Phasentrennung durch Zentrifugation (4 min, RT, 14000 rpm, Tischzentrifuge) keine Zwischenphase mehr sichtbar war. Reste von Phenol und Chloroform konnten durch zweimalige Extraktion mit wassergesättigtem Diethylether beseitigt werden. Nachdem restlicher Ether bei Raumtemperatur abgedampft war, konnte die Plasmid-DNA erneut mit Ethanol gefällt werden. Dazu wurden 50 µl P3 sowie 1500 µl 100% Ethanol zugegeben und über Nacht bei -20°C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Sedimentation der präzipitierten DNA durch eine Zentrifugation bei 14000 rpm für 20 min in der Tischzentrifuge. Zur Entfernung von Salzen wurde die DNA mit 1 ml 75% (v/v) Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 500 µl Wasser gelöst. Sowohl die Konzentration als auch die Reinheit der erhaltenen DNA wurden photometrisch bestimmt. Zusätzlich wurde die Identität der DNA durch Restriktionsanalysen verifiziert. 4.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren Die Konzentration der Nukleinsäuren in einer wässerigen Lösung konnte durch Absorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt werden. Dafür wurde die Nukleinsäurelösung in einer geeigneten Verdünnung in eine Quarzküvette gegeben. Der photometrischen Konzentrationsbestimmung einer Lösung liegt das LambertBeersche Gesetz zugrunde. Der Wert 1 der Extinktion bei 260 nm entspricht für doppelsträngige DNA einer Konzentration von 50 ng/µl, für einzelsträngige DNA einer Konzentration von 33 ng/µl und für einzelsträngige RNA einer Konzentration von 40 ng/µl. Die Ermittlung von Proteinverunreinigungen in der DNA-Lösung erfolgte durch Absorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 280 nm. Der Quotient der Extinktionen bei 260 nm und 280 nm (E260/E280) liegt für proteinfreie DNA-Lösungen bei 1,8 und für reine RNA-Lösungen bei 2. 4.2.3 Reinigung und Fällung von Nukleinsäuren 4.2.3.1 PCI-Extraktion Nukleinsäurelösungen konnten durch mehrere aufeinanderfolgende Phenolextraktionen und anschließende Fällung der Nukleinsäuren von vorhandenen Proteinverunreinigungen befreit werden. Dazu wurde die DNA-Lösung mit dem gleichen Volumen PCI (3.3) METHODEN 45 gemischt. Anwesende Proteine, überwiegend DNA-assoziierte, wurden dabei denaturiert und in der Interphase angereichert. Nach der Phasentrennung durch Zentrifugation für 2 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur in der Tischzentrifuge wurde die obere, DNAhaltige wässrige Phase abgenommen und nochmals mit PCI extrahiert. Dies wurde so oft wiederholt, bis nach der Zentrifugation keine Zwischenphase mehr zu sehen war. Reste von Phenol wurden anschließend durch zweimalige Extraktion mit wassergesättigtem Diethylether aus der wässrigen DNA-Lösung entfernt. Auch hier erfolgte die Phasentrennung durch eine Zentrifugation für 2 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur. Die Etherphase wurde verworfen und restlicher Ether bei Raumtemperatur unter der Sterilbank verdampft. Schließlich wurde die DNA-Lösung einer Fällung durch Alkohole unterworfen. 4.2.3.2 Fällung von DNA durch Alkohole Die Löslichkeit von Nukleinsäuren wird durch organische Lösungsmittel deutlich verringert. Diese Abnahme der Löslichkeit ist auf die Verminderung der dielektrischen Konstante des Mediums und auf Dehydratation zurückzuführen. Verkleinert sich die dielektrische Konstante des Lösungsmittels, so vergrößern sich die Anziehungskräfte zwischen den entgegengesetzt geladenen Oberflächenresten. Daraus folgt die Bildung von großen Aggregaten, die aus der Lösung ausfallen. Da sich die organischen Lösungsmittel auch in Wasser lösen müssen und so Wechselwirkungen mit Wasser eingehen, tritt zusätzlich eine Dehydratation der Proteine auf. Für die Fällung von DNA aus einer wäßrigen Lösung wurde entweder Isopropanol oder Ethanol verwendet. In beiden Fällen wurde der DNA-Lösung zunächst 0,1 Volumen 3 M Kaliumacetat pH 4,8 zugesetzt. Die Ethanol-Fällung erfolgte durch Zugabe des dreifachen Volumens an absolutem Ethanol und einer Inkubation des Gemisches für 1 h bei -20°C. Wurde das absolute Ethanol durch ein Volumenanteil Isopropanol ersetzt, konnte die Ausbeute an zu präzipitierender DNA erhöht und auf eine Abkühlung verzichtet werden. Präzipitiert wurde die DNA durch eine Zentrifugation für 15 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur (Tischzentrifuge). Zur Entfernung von Salzen erfolgte eine Waschung des DNA-Präzipitats mit 70% (v/v) Ethanol. Nach erneuter Zentrifugation für 5 min bei 14000 rpm und dem Trocknen unter der Sterilbank wurde die DNA in einem für die anschließende Verwendung zweckmäßigen Volumen an Wasser wieder in Lösung gebracht. METHODEN 46 4.2.3.3 Fällung von DNA durch Polyethylenglykol Hohe Salzkonzentrationen können bei der Fällung von DNA durch die Verwendung von Polyethylenglykol vermieden werden. Zur Fällung der DNA aus wäßrigen Lösungen wurde das gleiche Volumen einer PEG/NaCl-Lösung (3.3) hinzugefügt und für 20 min bei 0°C inkubiert. Das DNA-Präzipitat wurde dann durch eine Zentrifugation für 20 min bei 7000 rpm und Raumtemperatur in der Tischzentrifuge gewonnen, mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in Wasser gelöst. 4.2.3.4 Reinigung von PCR-Amplifikaten Die Reinigung von Amplifikaten aus PCR-Ansätzen erfolgte entweder über die gelelektrophoretische Trennung der amplifizierten DNA-Fragmente und anschließender Reinigung aus dem Agarosegel (4.2.4.2) oder mit Hilfe von Kitsystemen nach Angaben der Hersteller (Qiagen oder Macherey-Nagel). 4.2.4 Elektrophorese zur Analyse und Isolierung von Nukleinsäuren 4.2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese Zur Überprüfung von Restriktionen und zur präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten wurde die DNA auf 0,8 bis 1,2% (w/v) Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Als Elektrolytlösung diente TAE-Puffer (3.3). Die Agarose wurde in TAE-Puffer durch Kochen im Mikrowellenherd in Lösung gebracht und nach der Abkühlung auf unter 50°C und dem Hinzufügen von 4 µl Ethidiumbromidlösung (final 1 µg/ml) in die Gelkammer gegossen. Nach dem Erstarren wurden die Gele in einer Flachbettgelapparatur mit der Elektrolytlösung (TAE-Puffer) überschichtet. Die DNA-Proben wurden mit einem Fünftel Volumen DNA-Probenauftragspuffer (3.3) gemischt, in die Geltaschen gegeben und bei 70 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Interkalation von Ethidiumbromid in die Nukleinsäuren ermöglichte die Dokumentation durch Photographie im UV-Durchlicht bei 312 nm mit Hilfe einer Digitalkamera. Die verwendeten DNA-Größenstandards von MBI Fermentas enthielten folgende Fragmente (Angaben in Basenpaaren): 1 kb-Marker: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 100 bp-Marker: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 METHODEN 4.2.4.2 47 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen Zur Isolierung von DNA-Fragmenten für Klonierungen und zur Reinigung von PCRAmplifikaten wurde nach der elektrophoretischen Auftrennung der DNA das zu isolierende DNA-Fragment im UV-Durchlicht mit einem Skalpell aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Die Extraktion der wässrigen DNA-Lösung aus dem Gelstück erfolgte durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff in Gegenwart von Phenol. Dazu wurde das Gelstück grob zerkleinert, mit TE-gesättigtem Phenol versetzt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Auftauen und kräftigem Mischen erfolgte ein erneutes Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Anschließend wurde zur Phasentrennung zentrifugiert (10 min, RT, 14000 rpm, Tischzentrifuge) und die wässrige Phase einmal mit PCI (3.3) und zweimal mit wassergesättigtem Diethylether extrahiert. Die Phasentrennungen erfolgten hierbei stets durch Zentrifugation (2 min, RT, 14000 rpm, Tischzentrifuge). Nach dem Verdampfen des restlichen Ethers wurde die DNA mit Ethanol gefällt, mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 25 µl Wasser gelöst. Wurde für die Isolierung ein Kitsystem verwendet, so erfolgte die Durchführung nach Angaben des Herstellers. 4.2.5 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren Um optimale Reaktionsbedingungen bei der Durchführung der enzymatischen Modifikationen zu gewährleisten, wurden die Enzyme unter den vom Hersteller angegebenen Reaktionsbedingungen und in den mitgelieferten Puffern verwendet. Bei aufeinanderfolgenden, unterschiedlichen Modifikationen an den gleichen Nukleinsäuren, wurde zwischen den Reaktionen eine PCI-Extraktion (4.2.3.1) zur Entfernung des Puffers und des nicht mehr benötigten Enzyms der vorhergehenden Reaktion durchgeführt. Anschließend erfolgte eine Ethanol-Fällung der Nukleinsäuren (4.2.3.2), die nach einer Waschung mit 70% (v/v) Ethanol in dem idealen Reaktionspuffer für die nachfolgende Reaktion aufgenommen werden konnten. 4.2.5.1 Restriktionshydrolyse von Nukleinsäuren Angewandt wurde die Restriktionshydrolyse zur Überprüfung von Plasmid-DNA aus Schnell- und Großpräparationen, zur molekularen Klonierung von cDNAs sowie zur Kontrolle von PCR-Amplifikaten. Bei Verwendung der Restriktions-Endonukleasen wurde darauf geachtet, dass mindestens 2 U Enzymaktivität für je 1 µg Nukleinsäure eingesetzt wurde und dass das Volumen der glyzerinhaltigen Enzymlösung nicht ein Zehntel des Gesamtvolumens überschritt. METHODEN 48 4.2.5.2 Modifizierung von DNA-Enden mit T4-DNA-Polymerase Entstanden bei einer Restriktionshydrolyse DNA-Fragmente mit inkompatiblen, kohäsiven Enden, so wurde zum Auffüllen von 5´-überstehenden DNA-Enden und zum Abbau von 3´-überstehenden DNA-Enden die T4-DNA-Polymerase verwendet. Dazu wurde die DNA nach der PCI-Extraktion (4.2.3.1) und anschließender Ethanolfällung in 40 µl T4-DNAPolymerase-Reaktionspuffer (3.3) gelöst und mit 3 U T4-DNA-Polymerase pro µg DNA für 30 min bei 12°C inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde dann zur Isolierung der DNAFragmente auf ein präparatives Agarosegel aufgetragen (4.2.4.2), oder für eine weitere enzymatische Reaktion einer erneuten PCI-Extraktion unterworfen. 4.2.5.3 Dephosphorylierung von 5´-DNA-Enden Die kovalente Verknüpfung von DNA-Enden durch die DNA-Ligase erfordert phosphorylierte 5'-DNA-Enden. DNA-Moleküle, die am 5'-Ende dephosphoryliert sind, können somit nicht durch die Ligase mit 3'-Enden verknüpft werden. Dadurch kann bei einer Ligation verhindert werden, dass das 5'-Ende eines DNA-Moleküls mit dem 3'-Ende der gleichen DNA verknüpft wird. Zur Ligation wurden deshalb ausschließlich Klonierungsvektoren eingesetzt, die nach der Restriktionshydrolyse dephosphoryliert wurden. Die Hydrolyse der Phosphatgruppen an den 5'-Enden der DNA-Moleküle erfolgte durch die Behandlung mit einer alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm. Hierfür wurden 10 µg DNA in Dephosphorylierungspuffer (3.3) für 20 min bei 37°C und anschließend für 20 min bei 56°C mit 0,2 U alkalischer Phosphatase inkubiert. Nach erneuter Zugabe von 0,2 U alkalischer Phosphatase und einer wiederholten Inkubation des Ansatzes unter den oben beschriebenen Bedingungen ließ sich die Ausbeute an dephosphorylierten DNA-Enden erhöhen. Nach der Dephosphorylierung wurde die DNA-Lösung entweder mit PCI extrahiert und die DNA gefällt (4.2.3.1), oder der gesamte Reaktionsansatz auf ein präparatives Agarosegel zur Isolierung der DNA-Fragmente aufgetragen (4.2.4.2). 4.2.5.4 Phosphorylierung der 5'-Enden von PCR-Produkten Da die 5´-Enden synthetischer Oligonukleotide und daher auch die mit ihnen erzeugten PCR-Produkte keine Phosphatgruppen besitzen, erfolgt die Klonierung dieser PCRProdukte weniger wirkungsvoll. Zudem ist das Einfügen dieser PCR-Produkte in linearisierte und dephosphorylierte Vektoren nicht durchführbar. PCR-Amplifikate wurden daher mit der T4-Polynukleotidkinase behandelt, um die 5'-DNA-Enden vor der Ligation zu phosphorylieren. Durchgeführt wurde diese Reaktion in T4-Polynukleotidkinasepuffer (3.3) mit 1 mM ATP und 10 U T4-Polynukleotidkinase für 30 min bei 37°C in einem METHODEN 49 Gesamtvolumen von 25 µl. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch eine Inkubation bei 70°C für 10 min. 4.2.5.5 Ligation von DNA-Molekülen Das Einfügen einer cDNA in einen linearisierten Vektor wird durch die DNA-Ligase ermöglicht, die in der Lage ist, 5'-phosphorylierte und 3'-hydroxylierte DNA-Enden unter Bildung einer Phosphodiesterbindung miteinander zu verknüpfen. Für die Ligation wurden ausschließlich durch PCI-Extraktion (4.2.3.1) oder über Silicagelmatrices (4.2.1.2) aufgereinigte DNA-Fragmente eingesetzt. Die Reaktion erfolgte in Ligasepuffer (3.3) mit einer Vektorkonzentration von etwa 20 ng/µl und einem drei- bis zehnfachen molaren Überschuss des einzubauenden DNA-Fragments in einem Volumen von 15 µl. Bei der Ligation von glatten Enden („blunt ends“) wurden 20 U T4 DNA-Ligase eingesetzt und über Nacht bei 12°C inkubiert. Wurden kohäsive Enden („sticky ends“) verknüpft, so wurden 4 U T4 DNA-Ligase eingesetzt und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 16°C ligiert. Mit der Hälfte der Ligationsansätze erfolgte dann die Transformation kompetenter E. coli (4.1.3). 4.2.6 DNA-Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion bietet eine einfache Möglichkeit, um DNA-Segmente in vitro spezifisch zu vervielfältigen. Sie wird eingeleitet, indem man die als Matrize dienende, denaturierte DNA mit DNA-Polymerase und zwei Primern inkubiert. Während der multiplen Zyklen erfolgt dann die Synthese der komplementären Stränge. Die PCR-Ansätze enthielten 20 ng Plasmid-DNA als Matrize, 50 pmol von jedem Primer, 200 mM von jedem Nukleotid und 2 U der thermostabilen Vent-DNA-Polymerase. Ausgeführt wurde die Reaktion in Vent-PCR-Reaktionspuffer (3.3) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl. Jeder Reaktionsansatz wurde vor dem Reaktionsstart im Thermocycler mit Paraffinöl überschichtet, um den Flüssigkeitsverlust durch Verdampfen und die dadurch bedingten Konzentrationsveränderungen im PCR-Ansatz zu mindern. Der Thermocycler war so programmiert, dass die DNA zuerst für 3 min bei 95°C denaturiert und dann in 25 bis 30 Zyklen amplifiziert wurde. Der verwendete Programmzyklus war: Denaturierung: 1 min bei 95°C Anlagern der Primer: 2 min bei 60 bis 65°C Polymerisation: 2 min bei 72°C METHODEN 50 Abschließend erfolgte eine Inkubation für 10 min bei 72°C bevor die Reaktion schließlich durch eine Abkühlung auf 4°C gestoppt wurde. Alle aus Polymerase-Kettenreaktionen hervorgegangenen Sequenzen wurden nach der Klonierung durch DNA-Sequenzierung überprüft. 4.2.6.1 PCR-Mutagenese Das Einbringen von Mutationen in kodierende DNA-Sequenzen erfolgte unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion. Hierbei trugen die als Primer verwendeten Oligonukleotide die geänderten Sequenzen. Im Anhang (7.1) sind die verschiedenen Mutagenese-Schemata dargestellt. Alle mutierten Sequenzen wurden durch DNASequenzierung verifiziert. 4.3 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen 4.3.1 Kultivierung und Konservierung von Zellen 4.3.1.1 Kultivierung eukaryontischer Zellen Die Kultivierung adhärent wachsender Zellen erfolgte entweder mit DMEM (für HEK293Zellen) oder DMEM-F12 (für LoVo-Zellen) als Zellkulturmedium. Durch den Zusatz von 10% (v/v) fötalem Kälberserum sowie 2 mM Glutamin und Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 µg/ml) wurden die Medien vervollständigt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% wassergesättigter Luft in einem Zellkulturbrutschrank inkubiert. In Abhängigkeit des Zellwachstums wurden annähernd konfluente Kulturen etwa alle zwei bis vier Tage umgesetzt. Alle Arbeiten erfolgten in einer Sterilwerkbank der Sicherheitsstufe 2, nachdem die verwendeten Geräte vor dem Einbringen mit 80% (v/v) Ethanol desinfiziert worden waren. Daneben wurden alle Materialien und Lösungen, die mit den Zellen in Berührung kamen, durch geeignete Methoden sterilisiert. Dies erfolgte durch Autoklavieren (30 min, 121°C), Filtration (Porengröße 0,2 µm) oder trockene Hitze (4 h, 180°C, bei Glasmaterialien). 4.3.1.2 Passagieren von Zellen Zur Passage von adhärent wachsenden Zellen wurden diese von der Kunststoffoberfläche der Gewebekulturschalen abgelöst und nach dem Verdünnen auf neuen Kulturschalen ausgesät. Dazu wurde das verbrauchte Kulturmedium mit einer sterilen Pasteurpipette METHODEN 51 abgesaugt und der Zellrasen einmal mit 5 ml PBS (3.3) gewaschen. Da die Proteine, mit deren Hilfe sich die Zellen am Substrat anheften, durch Calcium- und Magnesium-Ionen stabilisiert werden, wurde Trypsin in Kombination mit EDTA eingesetzt. Das Trypsin hat dabei die Aufgabe, die Adhäsionsproteine zu spalten, während EDTA alle zweiwertigen Kationen bindet. Die abgelösten Zellen wurden dann mit 5 ml Kulturmedium verdünnt und bei 800 rpm für 5 min in der Tischzentrifuge sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen in 5 ml frischem DMEM-Komplettmedium resuspendiert und in geeigneten Verdünnungen auf neue Kulturschalen verteilt. 4.3.1.3 Kryokonservierung Zum Anlegen von Dauerkulturen wurden nur die Zellen eingefroren, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. Sie wurden vorher besonders sorgfältig auf Kontaminationen untersucht. Zum Einfrieren wurden die Zellen in einer Lösung suspendiert, die neben dem Kulturmedium einschließlich 10% (v/v) FCS noch 10% (v/v) DMSO als Gefrierschutzsubstanz enthielt. Die Gefrierschutzsubstanz hat dabei die Funktion, den Wassergehalt der Zellen zu reduzieren. DMSO ist ein kleines Molekül, das fettlöslich ist und deshalb durch Diffusion schnell in die Zelle gelangt. In Gegenwart von DMSO können sich keine Eiskristalle bilden, welche die Membranen der Zelle zerstören und damit die Lyse der Zellen herbeiführen würden. Zellsuspensionen (1 bis 6 · 106 Zellen/ml) wurden in 1,5 ml-Portionen in Kryoröhrchen bei -20°C eingefroren und anschließend für 16 h bei -80°C gelagert, bevor sie zur dauerhaften Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt wurden. Für die erneute Aussaat wurden die Zellen so schnell wie möglich aufgetaut. Die Zellsuspension wurde dann sofort mit dem 10-fachen Volumen des vorgewärmten Kulturmediums verdünnt und in Gewebekulturschalen ausgesät. Zellkulturen erholen sich in unterschiedlicher Weise vom Einfrieren in flüssigem Stickstoff, deshalb wurden die aufgetauten Kulturen noch einige Tage genau beobachtet, bevor sie für Experimente oder Transfektionen verwendet wurden. 4.3.2 Zellzahlbestimmung Wurden bei Experimenten mehrere Zellkulturschalen oder Zell-Linien eingesetzt, so wurde die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse durch die Aussaat gleicher Mengen an Zellen sichergestellt. Zur Bestimmung der Zellzahl einer fast konfluenten Kulturschale wurden die Zellen mit 3 ml Trypsin/EDTA-Lösung (3.3) von der Kunststoffoberfläche abgelöst, in ein mit 5 ml Zellkulturmedium befülltes 15 ml-Röhrchen überführt und zentrifugiert (800 rpm, 5 min, RT, Tisch-zentrifuge). Das Zellpellet wurde 52 METHODEN dann in 10 ml Zellkulturmedium suspendiert. Zum Auszählen wurden einige Mikroliter dieser Zellsuspension in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert. Die Grundfläche des Zählrasters dieser Kammer besteht aus einem großen Quadrat, das 16 mittlere Quadrate enthält, die wiederum in 16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Gezählt wurden alle Zellen innerhalb des Zählrasters unter einem Umkehrphasenkontrastmikroskop. Aus dem Ergebnis wurde das arithmetische Mittel für die Zellzahl innerhalb eines mittleren Quadrats gebildet und mit dem Faktor 104 multipliziert, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten. Den ermittelten Zellzahlen liegen jeweils Doppelbestimmungen zugrunde. 4.3.3 Transfektion adhärenter Zellen Die stabile Expression von Proteinen in HEK293-Zellen konnte durch die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion erreicht werden. Sie beruht auf der Aufnahme von DNA-Calciumphosphat-Aggregaten durch Endozytose. Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in einer geeigneten Verdünnung auf Gewebekulturschalen ausgesät, so dass sie sich am Tag der Transfektion in der logarithmischen Wachstumsphase befanden und noch genügend Platz für zwei weitere Tage Wachstum nach der Transfektion vorhanden war. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium mit einer sterilen Pasteurpipette entfernt und durch das Transfektionsmedium ersetzt. Das Transfektionsmedium für eine 10-cm-Kulturschale enthielt 10 µg Expressionsplasmid, das mit 750 µl Wasser, 250 µl 1 M CaCl2-Lösung und 1 ml BBSPuffer (3.3) vorsichtig durchmischt und für 3 min bei RT inkubiert worden war. Zur Vervollständigung des Transfektionsmediums folgte die Zugabe von 8 ml ME-Medium (3.1.4). Die Zellen wurden mit dem vervollständigten Transfektionsmedium vorsichtig überschichtet und für 4,5 h bei 37°C in einer Atmosphäre von 3% CO2 und 97% wassergesättigter Luft belassen. Anschließend wurde das Transfektionsmedium entfernt und die Zellen für 3 min mit 5 ml 10% (v/v) Glyzerin in PBS behandelt. Danach wurde der Zellrasen zweimal mit PBS (3.3) gewaschen und die Zellen in Zellkulturmedium (3.3) für zwei Tage weiterkultiviert. Für die stabile Proteinexpression wurde dem Zellkulturmedium 24 h nach der Transfektion die betreffende Selektionssubstanz hinzugefügt. Zur Selektion mit G418-Sulfat wurde das Medium in den ersten drei Wochen nach der Transfektion auf 1 mg G418/ml eingestellt. Die Selektion durch Hygromycin B erfolgte mit einer Konzentration von 600 µg/ml im Zellkulturmedium. METHODEN 53 4.3.4 Beschichtung von Zellkulturschalen mit Poly-L-Lysin Eine stärkere Anheftung von Zellen an eine Kulturschale kann durch eine Beschichtung mit Poly-L-Lysin erzielt werden. Hierdurch wird die Durchführung von Experimenten erleichtert, bei denen das Zellkulturmedium gewechselt und der Zellrasen gewaschen werden muss. Zur Beschichtung von 10-cm-Schalen wurden diese mit 4 ml Poly-LLysinlösung (3.3) befüllt und für 30 min bei Raumtemperatur unter der Sterilbank inkubiert. Die Lysinlösung wurde anschließend abgenommen und die Kulturschale zweimal mit jeweils 5 ml PBS (3.3) gewaschen. Beschichtete Kulturschalen konnten entweder umgehend verwendet oder unter der Sterilbank getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Beschichtung von 6-cm-Schalen erfolgte mit 3 ml Poly-L-Lysinlösung in gleicher Weise. 4.4 Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen Zum Nachweis von Zelloberflächenproteinen wurde das membranundurchlässige Biotinylierungsreagenz EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotin eingesetzt. Es vermittelt die Übertragung von Biotin auf primäre Amine und reagiert überwiegend mit der ε-Aminogruppe der Aminosäure Lysin sowie mit endständigen Aminogruppen von Proteinen. Für die Biotinylierungsreaktion wurden die Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten (4.3.4) 10-cm-Schalen ausgesät. Zunächst wurde der Zellrasen der nahezu konfluent bewachsenen Kulturschalen, nach dem Entfernen des Mediums, zweimal mit 5 ml kaltem PBS (3.3) gewaschen und dann mit 8 ml Biotinylierungslösung (0,4 mg/ml EZ-Link-SulfoNHS-LC-Biotin in kaltem PBS) überschichtet. Anschließend folgte die Inkubation der Zellen für 30 min bei 4°C in dieser Lösung. Zur Abreaktion des restlichen, nicht reagierten Biotinylierungsreagenz wurden die Zellen dreimal mit 10 ml TBS (3.3) gewaschen und mit 1 ml TBS unter Verwendung eines Zellschabers geerntet. Nach Zentrifugation für 3 min bei 3000 rpm (4°C, Tischzentrifuge) wurden die Zellen in 1 ml Imidazol-Lysispuffer (3.3) resuspendiert. Während einer Inkubation für 20 min auf Eis erfolgte die Lyse der Zellen. Nachdem Zelltrümmer und andere unlösliche Bestandteile durch eine Zentrifugation für 10 min bei 14000 rpm und 4°C entfernt worden waren, konnte der Überstand für die Immunpräzipitation mit dem monoklonalen anti-HA Maus-Antikörper 16B12 (4.7.2) eingesetzt werden. Biotinylierte Proteine wurden anschließend während einer Inkubation (10 min, RT, unter Schütteln) mit 100 µl Glycinlösung (3.3) von der Protein A-Sepharose und den Antikörpern getrennt. Dieser Schritt wurde nochmals wiederholt und die Eluate wurden nach der Zusammen-führung mit 2 bis 3 µl 3 M Tris-HCl pH 8,8 neutralisiert. Vier Fünftel der Probe wurden nun mit 100 µl Streptavidin-Sepharose versetzt und für 2 h bei 54 METHODEN 4°C unter Rotieren inkubiert. Nach Zentrifugation der Probe bei 2700 g und 4°C für 5 min, wurde die Streptavidin-Sepharose zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 80 µl 2 x SDS-Proteinauftragspuffer (3.3) versetzt. Die Elution der gebundenen biotinylierten Proteine erfolgte durch Inkubation für 5 min bei 100°C. Das verbliebene Fünftel wurde direkt mit 80 µl 2 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 min gekocht. Bis zum Auftragen auf ein 10% (v/v) SDS-Polyacrylamidgel (4.7.5) wurden die Proben bei -20°C gelagert. Zur Analyse wurden sie einem Western-Blot (4.7.6) und nachfolgender Detektion mit dem polyklonalen anti-HA Kaninchen-Antikörper (Y-11) als Zweitantikörper unterzogen (4.7.6.2). 4.5 Deglykosylierung 4.5.1 Membranpräparation zur Deglykosylierung von ADAM10 Die adhärenten Zellen einer Kulturschale wurden zweimal mit 5 ml PBS (3.3) gewaschen, bei Raumtemperatur mit 1 ml 1 mM EDTA in PBS unter Verwendung eines Zellschabers von der Oberfläche gelöst und in ein 2 ml-Reaktionsgefäß überführt. Nach der Zentrifugation für 5 min bei 3000 rpm (RT, Tischzentrifuge) wurde der Überstand dekantiert, das Zellpellet in 1 ml kaltem Puffer A (3.3) suspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nachdem die Zellen aufgetaut waren, wurden sie in einem Glashomogenisator durch zehnmaliges Auf- und Abbewegen des Pistills auf Eis homogenisiert und anschließend für 20 min bei 14000 rpm und 4°C in der Tischkühlzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand, der die zytosolischen Proteine enthielt, wurde verworfen. Das Membransediment wurde in 1 ml kaltem Puffer B (3.3) suspendiert und erneut homogenisiert. Durch die folgende Zentrifugation für 20 min bei 14000 rpm und 4°C in der Tischkühlzentrifuge wurde das Homogenat pelletiert. Die Membranen wurden schließlich in 100 µl 1% (w/v) SDS / 2% (v/v) β-Mercaptoethanol für 10 min bei 95°C im Heizblock inkubiert und dabei sowohl gelöst als auch denaturiert. 4.5.2 Deglykosylierung von ADAM10 Umfang und Geschwindigkeit der Deglykosylierung hängen in hohem Maße von den Inkubationsbedingungen ab. Durch die Denaturierung der Glykoproteine mit 1% (w/v) SDS lässt sich die Deglykosylierungsrate erhöhen. Bei Verwendung der Endoglykosidase H muss jedoch darauf geachtet werden, dass der SDS-Gehalt der Ansätze 0,02% (w/v) nicht übersteigt, da ansonsten eine Inaktivierung des Enzyms eintreten kann. METHODEN 55 β-Mercaptoethanol wurde den Proben zugesetzt, da es die Aktivität der Endoglykosidase H gegenüber Glykoproteinen mit inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken stark erhöht. Um zu verhindern, dass die N-Glykosidase F durch SDS gehemmt wird, ist die Zugabe eines zweiten Detergens notwendig, bevor N-Glykosidase F zugegeben wird. Dieses Detergens sollte in fünf bis zehnfachem Überschuss, bezogen auf die SDS-Konzentration, vorliegen. Zu diesem Zweck wurde den N-Glykosidase F-Ansätzen Nonidet-P40 hinzugefügt. Die N-Glykosidase F spaltet alle Typen asparagingebundener N-Glycanketten, vorausgesetzt, dass sowohl die Amino- als auch die Carboxylgruppe in peptidischer Bindung vorliegen und dass das Oligosaccharid eine bestimmte Mindestgröße aufweist. Die Reaktionsprodukte sind Ammoniak, Asparaginsäure (in der Peptidkette) und das komplette Oligosaccharid. Der Reaktionsmechanismus unterscheidet sich von dem der Endoglykosidase H, die im Gegensatz dazu die glykosidische Bindung zwischen den beiden N-Acetylglucosamin-Molekülen spaltet. Daneben unterscheiden sich die beiden Enzyme im pH-Optimum, denn im Gegensatz zur Endoglykosidase H, die bei pH 5-6 die höchste Aktivität besitzt, liegt das pH-Optimum der N-Glykosidase F bei pH 7-9. Aufgrund dieser Unterschiede mussten die Deglykosylierungen in verschiedenen Puffern durchgeführt werden, um für die jeweilige Glykosidase optimale Reaktionsbedingungen sicherzustellen. 4.5.2.1 Deglykosylierung mit N-Glykosidase F In ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß wurden 50 µl des zweifach konzentrierten Deglykosylierungspuffers (3.3, pH 7,5) und 40 µl Wasser vorgelegt. Danach wurden dem Ansatz 5 µl der in 1% (w/v) SDS / 2% (v/v) β-Mercaptoethanol gelösten Membranen und 5 µl (5 U) N-Glykosidase F zugefügt. Die Reaktion verlief in einem Gesamtvolumen von 100 µl für 15 h bei 37°C im Wasserbad. Um den gesamten Ansatz auf ein NuPAGE (4-12%) Gradientengel auftragen zu können, musste eine Aufkonzentrierung der Proteinprobe durch eine Chloroform-Methanol-Fällung (4.5.3) erfolgen. 4.5.2.2 Deglykosylierung mit Endoglykosidase H Diese Reaktion erfolgte in 50 mM NaOAc-Puffer bei einer SDS-Konzentration von 0,02% (w/v). Dazu wurden zunächst 83 µl Wasser mit 5 µl 1 M NaOAc pH 5,2 versetzt und gut durchmischt. Es folgte die Zugabe von 2 µl der in 1% (w/v) SDS / 2% (v/v) β-Mercaptoethanol gelösten Membranen und von 10 µl (10 mU) Endoglykosidase H. Zur Deglyko- 56 METHODEN sylierung wurde der Ansatz (Gesamtvolumen 100 µl) für 15 h bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Auch hier musste eine Aufkonzentrierung durch eine Chloroform-MethanolFällung (4.5.3) durchgeführt werden, um die Probe vollständig auf ein NuPAGE (4-12%) Fertiggel auftragen zu können. 4.5.3 Chloroform-Methanol-Fällung von Proteinen Diese Methode diente zur Aufkonzentrierung der Deglykosylierungsansätze. Gleichzeitig wurden Lipide, Detergenzien und Salze, die bei der anschließenden SDS-PAGE stören würden, abgetrennt. Zu 100 µl des Deglykosylierungsansatzes wurden 400 µl Methanol hinzugegeben und gut durchmischt. Es folgte die Zugabe von 100 µl Chloroform und, nach kräftigem Durchmischen, die Zugabe von 300 µl Wasser. Zur Phasentrennung wurden die Ansätze nach dem Durchmischen für 2 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Proteine präzipitierten dabei an der Phasengrenze. Der Überstand wurde verworfen und die im Reaktionsgefäß verbliebene Lösung mit 400 µl Methanol versetzt. Nach kräftigem Durchmischen der Probe wurde erneut für 2 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Proteine wurden hierbei pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet unter der Sterilbank getrocknet. Das trockene Proteinpellet wurde in 20 µl SDSProbenpuffer (3.3) für 10 min bei 95°C in erhitzt und so in Lösung gebracht. Die Proben der Deglykosylierungsansätze wurden anschließend einer Western-Blot-Analyse (4.7.6) unterzogen. Die dazu notwendige Gelelektrophorese (4.7.5) erfolgte mit einem 4-12% Fertiggel (NuPAGE) in MOPS-Puffer, um eine optimale Auftrennung der Proteine im Bereich von 50-90 kDa zu erzielen. Die angelegte Spannung betrug konstant 100 V. 4.6 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Zur Ermittlung von Proteinkonzentrationen wurde der Bradford-Protein-Assay-Kit (3.1.2) verwen-det. Die Proteinproben wurden dafür auf 50% (v/v) Ameisensäure in einem Volumen von 100 µl eingestellt. Parallel dazu wurden 50% (v/v) Ameisensäure als Nullwert und die Standards mit 2, 4, 6, 8 und 10 µg/100 µl BSA ebenfalls in 50% (v/v) Ameisensäure angesetzt. Anschließend wurden sowohl die Proben als auch die Standards mit 900 µl Bradford-Färbereagenz (1:5 verdünnt) vermischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Gemessen wurde zunächst die Absorption der Standards in Acryl-Halbmikroküvetten bei einer Wellenlänge von 595 nm gegen die Nullprobe. Nach der Messung der Proteinproben konnte durch Vergleich mit der Eichgeraden die Protein- METHODEN 57 konzentration ermittelt werden. Den gewonnenen Ergebnissen liegen jeweils Dreifachbestimmungen zugrunde. 4.7 Immunologischer Nachweis von Proteinen 4.7.1 Nachweis membranständiger Proteine eukaryontischer Zellen Die Zellen einer nahezu konfluent bewachsenen Kulturschale wurden einmal mit 5 ml PBS (3.3) gewaschen, mit Hilfe eines Zellschabers in 5 ml PBS geerntet und in ein 15 mlRöhrchen überführt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 rpm und Raumtemperatur wurden die Zellen sedimentiert. Nachdem sie in 1 ml Puffer A (3.3) suspendiert und in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt worden waren, erfolgte die Lyse durch zweimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Bei der nachfolgenden Zentrifugation (10 min, 14000 rpm, 4°C, Tischzentrifuge) sedimentierten die Membranen einschließlich der membranständigen Proteine und anderer, unlöslicher Bestandteile. Der Überstand enthielt lösliche Proteine und wurde verworfen. Das Pellet wurde einmal mit 1 ml Puffer A gewaschen und anschließend in 400 µl SDS-Probenpuffer (3.3) für 10 min gekocht. Bis zur Durchführung der Western-Blot-Analyse (4.7.6) wurde die Proteinprobe bei -20°C gelagert. 4.7.2 Immunpräzipitation von ADAM10 Die Zellen einer 10-cm-Schale wurden in 5 ml PBS mit einem Zellschaber von der Kulturschale gelöst, in ein 15 ml-Reaktionsgefäß überführt und durch Zentrifugation für 3 min bei 1500 rpm (RT, Tischzentrifuge) pelletiert. Zur Entfernung des restlichen Kulturmediums wurden die Zellen zweimal durch Resuspension in PBS und anschließender Zentrifugation (s.o.) gewaschen und in 1 ml Imidazol-Lysispuffer (3.3) mit 1 mg/ml proteinasefreiem BSA und Proteinaseinhibitoren (complete mini) aufgenommen. Die Lyse der Zellen erfolgte für 1 h unter Rotieren bei 4°C. Anschließend wurde der Zelldebris durch eine Zentrifugation für 15 min bei 14000 rpm (4°C, Tischzentrifuge) sedimentiert. Zum Entfernen von Proteinen, die unspezifisch an Protein A-Sepharose binden, wurde der Überstand mit 100 µl 10% (w/v) Protein A-Sepharose für 1 h bei 4°C unter ständigem Rotieren inkubiert. Die verwendete Protein A-Sepharose wurde einen Tag zuvor in Imidazol-Lysispuffer (3.3) mit 1 mg/ml proteinasefreiem BSA und Proteinaseinhibitoren vorgequollen. Nach Sedimentation der Protein A-Sepharose durch eine Zentrifugation für 4 min bei 4000 rpm und 4°C erfolgte die Präzipitation der ADAM10Proteine aus dem Überstand mit 100 µl 10% Protein A-Sepharose und 10 µg 16B12 anti- 58 METHODEN HA Maus-IgG für 15 h bei 4°C unter Rotieren. Die Protein A-Sepharose wurde anschließend sechsmal mit je 1 ml Imidazol-Lysispuffer gewaschen, wobei der Lysispuffer in den ersten drei Waschschritten 1 mg/ml proteinasefreies BSA enthielt. Durch eine Zentrifugation für 4 min bei 4000 rpm (4°C, Tischzentrifuge) wurde die Protein ASepharose nach jeder Waschung sedimentiert. Nach dem letzten Waschschritt erfolgte die Elution der Proteine durch Kochen der Protein A-Sepharose für 10 min in Proteinauftragspuffer (3.3). Die Proben wurden anschließend zum Pelletieren der Sepharose kurz bei 14000 rpm zentrifugiert und bei -20°C bis zur SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (4.7.5) gelagert. 4.7.3 Nachweis von APPsα α im Zellkulturüberstand Zur Analyse der APPsα-Freisetzung transfizierter HEK293-Zellen wurden am Tag vor dem Experiment 4 000 000 Zellen jeder Zell-Linie auf Poly-L-Lysin-beschichteten (4.3.4) 10-cm-Kulturschalen ausgesät und im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden die nahezu konfluenten Zellen zunächst zweimal mit je 5 ml DMEM ohne Zusätze gewaschen und mit 5 ml DMEM ohne FCS, jedoch mit 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 10 µg/ml fettsäurefreiem BSA als Zusätze überschichtet. Die Sekretion von APPsα ins Zellkulturmedium erfolgte während einer Inkubation der Zellen für 4 h im Brutschrank. Danach wurde das Zellkulturmedium zum Entfernen eventuell vorhandener Zellen für 10 min bei 3000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und bis zur nachfolgenden Proteinfällung auf Eis gelagert. Zur Kontrolle der für die Proteinsekretion eingesetzten Anzahl an Zellen wurde eine Proteinbestimmung des Zell-Lysats jeder Kulturschale durchgeführt. Zur Zell-Lyse wurden die Zellen mit 1 ml 50% (v/v) Ameisensäure versetzt, von der Kulturschale gelöst und in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Bis zur Durchführung der Proteinbestimmung nach Bradford (4.6) wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20°C gelagert. Die Proteinfällung aus dem Zellkulturüberstand diente der Aufkonzentrierung und erfolgte mit Trichloressigsäure (TCA) als Fällungsreagenz. Zu 1500 µl des Zellkulturmediums wurden 170 µl kalter 100% (w/v) Trichloressigsäure (6,1 M) hinzugegeben, durch fünfmaliges Invertieren des 2 ml-Reaktionsgefäßes vermischt und für 4 min bei 14000 rpm (4°C, Tischkühlzentrifuge) zentrifugiert, um die ausgefällten Proteine zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und der Vorgang im gleichen Reaktionsgefäß mit dem restlichen Zellkulturmedium zweimal wiederholt. Zum Entfernen der Trichloressigsäure wurde das Proteinpellet zweimal mit -20°C-kaltem Aceton gewaschen. Dies erfolgte durch die Zugabe von jeweils 500 µl Aceton zum Pellet und fünfmaliges Invertieren. Nach der METHODEN 59 Zentrifugation für 4 min bei 14000 rpm (4°C, Tischkühlzentrifuge) und dem Trocknen wurde das Proteinpräzipitat in 50 µl SDS-Proteinauftragspuffer (3.3) aufgenommen, für 10 min im Heizblock gekocht und mit 2 bis 3 µl Tris-HCl pH 8,8 neutralisiert. Bis zum Auftrag auf ein SDS-Polyacrylamidgel (4.7.5) wurden die Proben bei -20°C gelagert. 4.7.4 Nachweis des SEAPs/APP119-Reporterproteins im Zellkulturüberstand Der Nachweis des SEAPs/APP119-Reporterproteins erfolgte durch dessen katalytische Aktivität im Zellkulturüberstand von HEK293-SEAPs/APP- und HEK293-ADAM10SEAPs/APP-Zellen. Als Kontrolle diente der Kulturüberstand untransfizierter HEK293Zellen. 500 000 Zellen wurden auf Poly-L-Lysin-beschichteten 6-cm-Kulturschalen ausgesät und über Nacht in 4 ml Zellkulturmedium ohne Phenolrot kultiviert. Am nächsten Tag wurde das Medium abgenommen, in ein 15 ml-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation (1500 rpm, 5 min) von eventuell vorhandenen Zellen befreit. 3 ml des Zellkulturüberstands wurden in ein frisches 15 ml-Röhrchen überführt und durch die Zugabe von 75 µl 1M TrisHCl auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Vor der Durchführung der Enzymreaktion erfolgte eine Hitzeinaktivierung der endogenen alkalischen Phosphatase durch Erhitzen des Kulturüberstands für 15 min bei 56°C. Anschließend erfolgte die enzymatische Reaktion mit 500 µl des Zellkulturüberstands und 30 µl 0,8% (w/v) der 4-Nitrophenylphosphat-Substratlösung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß bei einer Temperatur von 37°C. Gestoppt wurde die Reaktion durch die Überführung der Proben auf Eis und die unmittelbare Zugabe von 500 µl 5 M NaOH. Als Referenz dienten 500 µl des Zellkulturüberstands, denen zuerst 500 µl 5 M NaOH auf Eis zugefügt wurden, um eine Reaktion des Reporterproteins mit dem Substrat 4-Nitrophenylphosphat zu vermeiden. Zur Vervollständigung der Referenz erfolgte dann die Zugabe des Substrats, ebenfalls auf Eis. Die Messung der Absorptionzunahme durch das entstandene 4-Nitrophenol erfolgte bei einer Wellenlänge von 389,5 nm. Alle Messwerte wurden durch eine Dreifachbestimmung erfasst. 4.7.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 4.7.5.1 Herstellung der Gele Polyacrylamidgele lassen sich durch radikalische Polymerisation mit definierter Porengröße herstellen. Die Polymerisation der Monomere wird mit APS (3.1.1) gestartet, dabei dient TEMED (3.1.1) als Katalysator. Es entstehen Polyacrylamidketten, die durch Bisacrylamid quervernetzt sind. METHODEN 60 Vor dem Aufbau wurden die Glasplatten mit Ethanol gereinigt. Anschließend wurde ein Gemisch aus Acrylamid, Bisacrylamid (3.1.1) und Trenngelpuffer für zirka 15 min im Wasserstrahlvakuum entgast, um den gelösten Sauerstoff zu entfernen, da dieser die Polymerisation stören würde. Nach Zugabe von SDS, TEMED und APS wurde das Trenngel bis 1 cm unter den oberen Rand der Kammern pipettiert. Dann wurde es mit wassergesättigtem Butanol überschichtet, um eine gerade Oberfläche zu erhalten und das Acrylamid vor Oxidation durch Luftsauerstoff zu schützen. Nach zirka 30 min war das Gel auspolymerisiert und das Butanol konnte durch Dekantieren und mehrmaligem Spülen mit dest. Wasser entfernt werden. Wasserreste wurden mit Filterpapier von der Geloberfläche abgesaugt. Analog dazu wurde das Sammelgel hergestellt. Nach der Zugabe des Polymerisationsstarters wurde es in die Apparatur gefüllt und die Taschenschablonen eingesetzt. Nach weiteren 30 min war das Gel vollständig polymerisiert. 4.7.5.2 Vorbereitung der Proben Die Proteinproben wurden mit reduzierendem SDS-Probenauftragspuffer (3.3) versetzt und für 10 min im Heizblock bei 100°C inkubiert. Vor dem Auftragen wurden die Proben nochmals durchmischt und 1 min bei 14000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert, um nicht gelöste Membranbestandteile abzutrennen. Auf ein Minigel (Trenngel: 5,5 x 8,5 cm) wurden etwa 30 bis 50 µg Protein pro Geltasche aufgetragen. 4.7.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Proteine wurden durch das im Probenpuffer enthaltene anionische Detergens SDS und das Reduktionsmittel DTT vollständig denaturiert und erhielten durch diese Behandlung eine einheitliche Oberflächenladung. Beim Anlegen einer Spannung wanderten die Proteine somit als Polyanionen in Richtung der Anode. Im großporigen Sammelgel wurden die Proben zu scharfen Banden konzentriert, die erst beim Eintritt in das Trenngel, das eine stärkere Quervernetzung aufwies, in die einzelnen Proteinbanden aufgetrennt wurden. Dies erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 10 mA im Sammelgel und 20 mA im Trenngel. Die Elektrophorese war beendet, wenn die durch Bromphenolblau gefärbte Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte. Der immunologische Nachweis der betreffenden Proteine erfolgte anschließend durch eine Western-Blot-Analyse (4.7.6). METHODEN 61 4.7.6 Western-Blot-Analyse 4.7.6.1 Elektro-Blot Mit dieser Transfermethode wurden Proteine nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (4.7.5) auf eine PVDF-Membran übertragen und konnten dann durch immunologische Methoden nachgewiesen werden. Sechs Whatman 3MM-Filterpapiere und eine PVDF-Membran wurden auf die Größe des zu blottenden Gels zurechtgeschnitten. Die Membran wurde für 5 min in Methanol und anschließend zusammen mit den Filterpapieren für 15 min in Towbin-Puffer (3.3) geschwenkt. Nun wurde die Blot-Apparatur zusammengebaut. Auf die Anode der Apparatur wurden nacheinander drei Filterpapiere, die PVDF-Membran, das Polyacrylamidgel und die restlichen Filterpapiere gelegt. Luftblasen, die sich zwischen den Schichten befanden, wurden durch Rollen mit einer Glaspipette beseitigt. Der Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran erfolgte dann für 2 h bei einer konstanten Stromstärke von 200 mA. 4.7.6.2 Chemilumineszenz-vermittelter Proteinnachweis Nach dem Transfer der Proteine wurde die PVDF-Membran zur Sättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur in 5 ml I-Block-Puffer (3.3) geschwenkt. Nach einmaligem Waschen der Blotmembran für 5 min mit I-Block-Puffer erfolgte die Erstantikörper-Reaktion während einer Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln in I-Block-Puffer. Dabei dienten die folgenden Antikörper, in den angegebenen Verdünnungen, als Primärantikörper: anti-HA Kaninchen-IgG (Y-11, polyklonal) gegen ADAM10-HA 1:2000 verdünnt anti-APP Maus-IgG (6E10, monoklonal) gegen APPsα 1.2000 verdünnt anti-ADAM10 Kaninchen-IgG (polyklonal) gegen endogenes ADAM10 1:2500 verdünnt anti-TACE Kaninchen-IgG (polyklonal) gegen endogenes TACE 1:2500 verdünnt anti-PC7 Kaninchen-Antiserum gegen endogenes PC7 1:1000 verdünnt anti-Furin Kaninchen-Antiserum gegen endogenes Furin 1:1000 verdünnt Nach mehreren Waschungen über 1 h in 5 ml I-Block-Puffer folgte die ZweitantikörperReaktion. Die PVDF-Membran wurde dazu mit dem alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Maus IgG- beziehungsweise anti-Kaninchen IgG-Zweitantikörper (1:8000 verdünnt) für 1 h bei Raumtemperatur in 8 ml I-Block-Puffer geschwenkt. Die Membran wurde dann für 1 h mit I-Block-Puffer unter mehrmaligem Pufferwechsel gewaschen und anschließend fünfmal für 2 min in Assay-Puffer (3.3) geschwenkt. Dann wurde die Membran auf eine METHODEN 62 Kunststoffolie gelegt, mit Whatman-Papier getrocknet und vollständig mit dem Substrat CDP-Star bedeckt. Nach einer Inkubation für 5 min wurde die PVDF-Membran mit Whatman-Papier trockengetupft. Die Aufnahme der Lichtemission des umgesetzten Substrats erfolgte mit Hilfe des DIANA II-Chemilumineszenz-Detektionssystems (raytest) unter Verwendung einer CCD-Kamera. Die quantitative Auswertung wurde schließlich mit dem Programm Aida Version 2.0 (raytest) durchgeführt. 4.7.6.3 Radioaktiv-vermittelte Proteindetektion Die radioaktiv-vermittelte Proteindetektion wurde alternativ zur Chemilumineszenzvermittelten Proteindetektion angewandt. Als Zweitantikörper diente hier ein mit dem Schwefelisotop 35 S-markierter anti-Maus IgG-Antikörper, der 1:300 in 5 ml I-Block-Puffer (3.3) verdünnt und für 1 h mit der PVDF-Membran inkubiert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit 5 ml I-Block-Puffer wurde die Membran getrocknet und zur Aufnahme der Radioaktivität auf eine Autoradiographieplatte gelegt. Die Auswertung erfolgte mit dem Bio-Imaging Analyzer unter Verwendung des Programms Aida Version 2.0. ERGEBNISSE 63 5 ERGEBNISSE 5.1 Entwicklung eines Verfahrens zur Reihenuntersuchung α-Sekretase-stimulierender Substanzen Aus dem Amyloid-Vorläuferprotein entsteht durch eine zweifache Spaltung das β-AmyloidPeptid, welches durch seine Hydrophobizität leicht aggregiert und in Gehirnen von Alzheimer-Patienten den Hauptbestandteil der β-Amyloid-Plaques bildet. Die Prozessierung des APP durch die α-Sekretase erfolgt dagegen innerhalb der β-Amyloidregion, wodurch die Bildung der Aβ-Peptide verhindert wird. Eine Strategie zur Verringerung der Aβ-Produktion ist daher die Stimulierung des nicht-amyloidogenen α-Sekretase-Wegs. Die Aktivität der physiologisch relevanten α-Sekretase ADAM10 kann durch die Aktivierung der Proteinkinase C oder die Stimulierung muskarinischer Rezeptoren erheblich gesteigert werden. Die Suche nach weiteren Substanzen, die aktivierend auf die α-Sekretase ADAM10 wirken, stellt somit einen wesentlichen Beitrag zur Verringerung der AβProduktion dar. Auswirkungen auf die α-Sekretaseaktivität werden in der Regel durch das Spaltprodukt APPsα nachgewiesen. Dies erschwert das Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen insofern, als etablierte Methoden zur Detektion von APPsα, wie zum Beispiel WesternBlot-Analysen, umständlich, zeitaufwendig und teuer sind. Eine schnelle und einfache Untersuchung vieler Substanzen ist somit nicht realisierbar. Um zeitnah möglichst viele Substanzen zu analysieren, ist daher ein Verfahren notwendig, mit dessen Hilfe das freigesetzte APPs einfach, schnell, zuverlässig, sensitiv und preisgünstig bestimmt werden kann. Zur Entwicklung eines solchen Testverfahrens soll ein Reporterprotein mit der extrazellulären Domäne des Amyloid-Vorläuferproteins fusioniert werden, um das freigesetzte APPs im Überstand von Zellkulturen nachweisen zu können. Ein geeignetes Reporterprotein stellt die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) aus der menschlichen Plazenta dar. Sie soll mit den 119 Aminosäuren des C-terminalen Endes des Amyloid-Vorläuferproteins vereinigt werden. Um die gemessenen Effekte leichter auf die α-Sekretase ADAM10 zurückführen zu können und die Sensitivität des Verfahrens zu erhöhen, wird das erzeugte Fusionsprotein (SEAPs/APP119) anschließend mit ADAM10 auf einem Expressionsvektor vereinigt. Nachdem die cDNAs in HEK293-Zellen stabil zur Expression gebracht wurden, soll das freigesetzte SEAPs/APP119 schließlich, stellvertretend für das freigesetzte endogene APPs, durch eine Enzymreaktion der sekretierten ERGEBNISSE 64 alkalischen Phosphatase im Zellkulturüberstand spektroskopisch nachgewiesen und quantifiziert werden. 5.1.1 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein mit der cDNA der α-Sekretase ADAM10 in einen Expressionsvektor 5.1.1.1 Amplifizierung einer kodierenden DNA-Sequenz für die sekretierte alkalische Phosphatase Der Wildtyp der sekretierten alkalischen Phosphatase aus Plazenta ist über eine der letzten 24 Aminosäuren durch einen GPI-Anker mit der Plasmamembran verbunden. Um die Freisetzung des Fusionsproteins aus der sekretierten alkalischen Phosphatase und APP119 von der Zellmembran zu gewährleisten, muss dieser beseitigt werden. Daher wurde eine um 24 Codons verkürzte cDNA der alkalischen Phosphatase ohne GPIAnkersequenz amplifiziert. Die Verkürzung der Enzym-cDNA ergab sich durch die bei der PCR verwendeten Primer. Außerdem wurde noch eine BsrGI-Schnittstelle am 3‘-Ende des PCR-Produkts eingefügt. Als Matrizen-DNA dienten 10 ng des Plasmids pSBC-2SEAP. Die PCR erfolgte abweichend von den in Kapitell 4.2.6 beschriebenen Bedingungen. Der Thermocycler wurde so programmiert, dass die DNA zuerst für 5 min bei 95°C denaturiert und dann in 27 Zyklen amplifiziert wurde. Der hier verwendete Programmzyklus war: Denaturierung: 1 min bei 95°C Anlagerung der Primer: 2 min bei 74°C Polymerisation: 1,5 min bei 72°C Abschließend erfolgte eine Inkubation für 8 min bei 72°C bevor die Reaktion schließlich durch eine Abkühlung auf 4°C gestoppt wurde. Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe des Qiaquick PCR Purification kits gereinigt, phosphoryliert und in den mit dem Restriktionsenzym EcoRV-geschnittenen und dephosphorylierten pcDNA3-Vektor eingesetzt (Klonierungsschema 7.1.1.1). Nach der Transformation von E. coli mit diesem Ligationsansatz wurden die aus den erhaltenen Klonen isolierten Plasmide durch analytische Restriktionen mit den Enzymen EcoRI, EcoRV und PvuII untersucht. Ein als positiv bestätigter Klon wurde für eine Plasmidgroßpräparation verwendet. Die Sequenz der klonierten SEAPs wurde vollständig durch DNA-Sequenzierungen überprüft. ERGEBNISSE 5.1.1.2 65 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein aus SEAPs und APP119 Die cDNA von APP119 in pcDNA3 wurde von Herrn Dr. Rolf Postina (Johannes GutenbergUniversität Mainz) zur Verfügung gestellt. In diesen Vektor soll die cDNA der verkürzten alkalischen Phosphatase eingefügt und dabei mit der cDNA von APP119 fusioniert werden (Klonierungsschema 7.1.1.2). Da dieser Vektor außerdem die cDNA des grünfluoreszierenden Proteins enthält, muss diese vor der Ligation des Vektors mit der SEAPs-cDNA entfernt werden. Mit den Restriktionsendonukleasen XcmI, HindIII und BsrGI konnte die cDNA des grün-fluoreszierenden Proteins zerstört und aus dem Vektor herausgeschnitten werden. Nach der Auftrennung des Restriktionsansatzes in einem Agarosegel wurde das 5726 bp-Fragment des APP119-enthaltenden Vektors isoliert. Durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen HindIII und BsrGI konnte die cDNA der verkürzten SEAP ohne Stopp-Codon aus dem Plasmid pcDNA3-SEAPs geschnitten werden. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der beiden entstandenen DNAFragmente konnte das 1588 bp-Fragment der cDNA aus dem Agarosegel isoliert werden. Anschließend erfolgte die Ligation der kohäsiven DNA-Enden des SEAPs-Fragments mit den komplementären DNA-Enden des APP119-enthaltenden Vektors. Das entstandene Plasmid enthält die fusionierten cDNAs der verkürzten sekretierten alkalischen Phosphatase und des APP119 und wird als pcDNA3-SEAPs/APP119 bezeichnet. Die korrekte Insertion der SEAPs-cDNA und die Integrität der Klonierungsstellen wurde durch Restriktionsanalysen mit den Enzymen EcoRI, HindIII und BsrGI sichergestellt. Im Anschluss daran wurde die Sequenz der fusionierten SEAPs/APP119-cDNA durch DNASequenzierungen vollständig überprüft. 5.1.1.3 Klonierung eines Vektors für das Reporterprotein SEAPs/APP119 und ADAM10 Um die Proteinase ADAM10 und das SEAPs/APP119-Fusionsprotein im gleichen Verhältnis zueinander exprimieren zu können, wurde die cDNA von HA-Epitop-markiertem ADAM10 in das SEAPs/APP119-Plasmid kloniert (Klonierungsschema 7.1.1.3). Die cDNA von ADAM10 wurde mit den Restriktionsenzymen NruI und Tth111I aus dem pcDNA3ADAM10-HA-Vektor geschnitten. Die beiden entstehenden Fragmente wurden anschließend durch eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das 4429 bpADAM10-HA-Fragment aus dem Gel isoliert. Die durch eine PCI-Extraktion gereinigte ADAM10-cDNA wurde dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen und in den mit NruI verdauten und dephosphorylierten pcDNA3-SEAP-APP119Vektor einkloniert. Zur Amplifizierung der bei der Ligation entstandenen Plasmide wurden sie in E. coli vermehrt und danach durch eine Plasmidschnellpräparation isoliert. Die ERGEBNISSE 66 Insertion der ADAM10-cDNA konnte durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym HindIII bestätigt werden. 5.1.2 Optimierung der Testbedingungen Zunächst wurden die cDNAs von ADAM10-HA und dem Reporterprotein SEAPs/APP119 durch eine Calciumphosphat-vermittelte Transfektion von HEK293-Zellen mit dem Plasmid pcDNA3-ADAM10-HA-SEAPs/APP119 zur Expression gebracht. Nach Selektion mit G418 wurde ein Mischklon hochgezogen. Die daraus resultierende Zell-Linie exprimiert sowohl ADAM10-HA als auch SEAPs/APP119 stabil und wird als HEK293ADAM10-SEAPs/APP bezeichnet. Ferner wurde als Kontrolle das Fusionsprotein SEAPs/APP119 ohne ADAM10 in HEK293-Zellen stabil zur Expression gebracht. Diese Zell-Linie erhielt die Bezeichnung HEK293-SEAPs/APP. Der Nachweis der stabilen Expression des SEAPs/APP-Reporterproteins erfolgte durch eine Western-Blot-Analyse der Zell-Lysate und der Zellkulturüberstände (Abbildung 5.1). 1 SEAPs/APP119 2 3 98 kDa SEAPs/APPs __________________________________________________________________ Abbildung 5.1 Western-Blot-Analyse des stabil exprimierten SEAPs/APP119-Reporterproteins. Die Proteinproben wurden in einem 8% (w/v) Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach der Inkubation der Membran mit dem anti-APP Antikörper 6E10 erfolgte der Nachweis des Primärantikörpers durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Maus Antikörpers und des WesternStar Detektionssystems. Spur 1, Zell-Lysat von HEK293-SEAPs/APP-Zellen, Spur 2, ZellLysat von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen, Spur 3, Zellkulturüberstand von HEK293ADAM10-SEAPs/APP-Zellen. Die Proteine der Zell-Lysate und die aus dem Zellkulturmedium gefällten Proteine wurden dazu elektrophoretisch in einem 8% (w/v) Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran wurde diese mit dem APPsα-spezifischen ERGEBNISSE 67 anti-APP-Primärantikörper 6E10 inkubiert. Der Nachweis des Erstantikörpers erfolgte durch einen alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Maus-IgG und dem Detektionssystem Western-Star (Tropix). Nach der Aufnahme des emittierten Lichts mit einer Digitalkamera wurden auf dem Western-Blot zwei Banden mit unterschiedlichen Molekulargewichten sichtbar. Zum Einen ist das unprozessierte, aus 627 Aminosäuren bestehende, SEAPs/APP119 mit einem Molekulargewicht von etwa 98 kDa zu erkennen, zum Anderen kann das ins Zellkulturmedium freigesetzte, aus 544 Aminosäuren bestehende, SEAPs/APP119-Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 88 kDa identifiziert werden. Dies bestätigt, dass das Fusionsprotein stabil exprimiert und durch eine α-Sekretase-Spaltung ins Medium freigesetzt wird. Eine Freisetzung des Reporterproteins durch andere Proteinasen während des Tests kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Anschließend musste sichergestellt werden, dass die verkürzte sekretierte alkalische Phosphatase (SEAPs) auch als Bestandteil des Fusionsproteins enzymatisch aktiv ist. Als Substrat diente hierbei das schwach-gelbliche 4-Nitrophenylphosphat (NPP), dessen Phosphatgruppe von der alkalischen Phosphatase durch Hydrolyse entfernt wird. Das entstehende Reaktionsprodukt 4-Nitrophenol besitzt eine intensive Gelbfärbung. Die Absorptionszunahme durch die intensivere Färbung verhält sich proportional zur SEAPAktivität und kann photometrisch bestimmt werden. Da die Absorptionsmessung im Zellkulturüberstand erfolgen soll und das im Zellkulturmedium vorhandene Phenolrot die Absorption des Reaktionsprodukts 4-Nitrophenol überlagern würde, muss die Kultivierung der Zellen für den Test in Zellkulturmedium ohne Phenolrot erfolgen. Zur Ermittlung des Absorptionsmaximums wurde ein Absorptionsspektrum von 4-Nitrophenol in Zellkulturmedium ohne Phenolrot aufgenommen. Hieraus ergab sich, dass die maximale Absorption des 4-Nitrophenols unter diesen Bedingungen bei einer Wellenlänge von 389,5 nm liegt. Die katalytische Aktivität des SEAPs/APP119-Reporterproteins wurde im Zellkulturüberstand von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen nachgewiesen, als Kontrolle diente der Kulturüberstand untransfizierter HEK293-Zellen. Die Zellen wurden über Nacht in Medium ohne Phenolrot kultiviert. Am nächsten Tag wurde dieses abgenommen, in ein 15 ml-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation (1500 rpm, 5 min) von eventuell vorhandenen Zellen befreit. 500 µl des Zellkulturüberstands wurden in ein 1,5 mlReaktionsgefäß überführt und mit 50 µl der 0,4% (w/v) NPP-Substratlösung versetzt, um die Reaktion zu starten. Der Reaktionsansatz wurde dann bei 30°C inkubiert bis eine deutliche Gelbfärbung zu erkennen war. Gestoppt werden konnte die Reaktion durch die Zugabe von NaOH. Die photometrische Vermessung der Proben ergab eine deutlich höhere Absorption in den Zellkulturüberständen der HEK293-Zellen, die mit dem ERGEBNISSE 68 Reporterprotein transfiziert waren. Damit konnte die Freisetzung des SEAPs/APP119Fusionsprotein ins Zellkulturmedium bestätigt und die katalytische Aktivität der alkalischen Phosphatase als Bestandteil des Reporterproteins bewiesen werden. 5.1.2.1 Einfluss der Temperatur und der Reaktionsdauer Die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen wird stark von der Temperatur beeinflusst. Einerseits nimmt die Aktivität mit der Temperatur zu, andererseits denaturieren Enzyme bei zu hohen Temperaturen. Durch die Optimierung dieser Parameter bei der Reaktion der alkalischen Phosphatase mit 4-Nitrophenylphosphat soll eine schnelle Durchführung des Tests bei hoher Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sichergestellt werden. Für die Ermittlung der geeigneten Reaktionsdauer wurden HEK293-ADAM10- SEAPs/APP-Zellen auf einer 10-cm-Kulturschale über Nacht in Zellkulturmedium ohne Phenolrot kultiviert. Die Phosphatester-Spaltung durch die SEAPs erfolgte mit je 500 µl des Zellkulturüberstands und 30 µl 0,8% (w/v) NPP bei einer konstanten Temperatur von 37°C. Gestoppt wurden die Reaktionen durch die Überführung der Proben auf Eis und die unmittelbare Zugabe von 500 µl 5 M NaOH zu jedem Ansatz. Anschließend konnte die Absorption bei einer Wellenlänge von 389,5 nm gemessen werden (Abbildung 5.2). 0,7 Absorption [389,5 nm] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 Reaktionszeit [min] __________________________________________________________________ Abbildung 5.2 Bestimmung der optimalen Reaktionsdauer. Die Reaktionsansätze wurden für 5 bis 20 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) des Substrats 4-Nitrophenylphosphat inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion mit 500 µl 5 M NaOH auf Eis erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. Alle Daten sind mit Standardabweichung angegeben. ERGEBNISSE 69 Als Referenz dienten 500 µl des Zellkulturüberstands, denen zuerst NaOH auf Eis zugefügt wurden, um eine Reaktion der SEAPs mit dem Substrat 4-Nitrophenylphosphat zu vermeiden. Zur Vervollständigung der Referenz erfolgte dann die Zugabe von 4-Nitrophenylphosphat, ebenfalls auf Eis. Jedem Messwert liegt grundsätzlich eine Dreifachbestimmung zugrunde. Aus den Ergebnissen der Absorptionsmessung ist ersichtlich, dass die Messwerte bei kurzen Inkubationszeiten sehr niedrige Absorptionen aufweisen, was die Empfindlichkeit des SEAPs/APPs-Nachweises einschränkt. Wird die Dauer der enzymatischen Reaktion verlängert, so wird mehr Substrat umgesetzt und die Absorption in den Proben erhöht. Gleichzeitig wird die Empfindlichkeit des Tests gesteigert. Bis zu einer Inkubationsdauer von 15 min nimmt die Absorption in den Proben deutlich zu, danach ist die Absorptionszunahme etwas geringer. Um eine möglichst schnelle Durchführung des Enzymtests mit einer hohen Empfindlichkeit sicherzustellen, wurde daher für die weiteren Untersuchungen eine Inkubationsdauer von 15 min gewählt. Die Bestimmung der geeigneten Reaktionstemperatur erfolgte analog zur Ermittlung der Reaktionsdauer. Hier wurden die Reaktionsansätze für 15 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion erfolgte der Nachweis der alkalischen Phosphataseaktivität durch die Messung der Absorption (Abbildung 5.3). 0,7 Absorption [389,5 nm] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Temperatur [°C] __________________________________________________________________ Abbildung 5.3 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Bestandteil des Reporterproteins. Jeweils 500 µl des SEAPs/APPshaltigen Zellkulturüberstands einer 10-cm-Kulturschale wurden für 15 min bei 30 bis 40°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis gestoppt und die Absorptionszunahme durch das entstandene 4-Nitrophenol bei einer Wellenlänge von 389,5 nm gemessen. Alle Daten sind mit Standardabweichung angegeben. ERGEBNISSE 70 Eine deutliche Steigung der alkalischen Phosphataseaktivität ist im Temperaturbereich bis 37°C zu verzeichnen, ab dieser Temperatur steigt die Aktivität nur noch unwesentlich an. Nachfolgend wurden alle Reaktionen der sekretierten alkalischen Phosphatase bei 37°C für 15 min durchgeführt. 5.1.2.2 Einfluss des pH-Werts Die meisten Enzyme sind nur in einem schmalen pH-Bereich aktiv, da im aktiven Zentrum vieler Enzyme ionisierbare Aminosäuren sitzen, deren Ladungszustand sich mit dem pHWert ändert. Zudem ändert sich die Konformation der Enzyme mit dem pH-Wert. Das pHOptimum der sekretierten alkalischen Phosphatase liegt bei pH10, jedoch kann unter den Versuchsbedingungen die Hintergrundaktivität durch endogene alkalische Phosphatasen sehr hoch sein. Um das pH-Optimum für die enzymatische Reaktion der sekretierten alkalischen Phosphatase mit NPP als Substrat im Zellkulturmedium zu ermitteln, wurden die Kulturüberstände von HEK293- und HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen vor dem Start der enzymatischen Reaktion auf pH-Werte zwischen 2 und 10 eingestellt. Dies erfolgte jeweils mit 25 µl der angegebenen Puffer pro ml des Zellkulturmediums. pH Puffer pH Puffer 2,0 1 M Citrat 7,0 1 M Tris-HCl 3,0 1 M Citrat 8,0 1 M Tris-HCl 4,0 1 M Citrat 9,0 1 M Tris-HCl 5,0 1 M Acetat 10,0 1 M Caps In den Zellkulturüberständen von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen ist bei pH-Werten unter 4 keine alkalische Phosphataseaktivität zu verzeichnen (Abbildung 5.4). Erst bei pH5 steigt die Absorption in den Proben mit der sekretierten alkalischen Phosphatase an, erreicht bei pH7 die größte Steigung und nimmt dann langsamer zu bis bei pH10 schließlich das Maximum der alkalischen Phosphataseaktivität erreicht ist. Demgegenüber steigt die Absorption der Zellkulturüberstände von HEK293-Zellen bis zu pH8 sehr langsam an. Ab pH8 nimmt die Absorption allerdings ebenfalls stark zu und erreicht ebenfalls bei pH10 den Höchstwert. Da die sekretierte alkalische Phosphatase bereits bei pH8 eine sehr hohe Aktivität bei einem merklich geringeren Hintergrund als bei pH10 aufweist, wurden fortan alle weiteren Messungen bei pH8 durchgeführt. ERGEBNISSE 71 Absorption [389,5 nm] 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 -0,25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH- Wert __________________________________________________________________ Abbildung 5.4 Messung der SEAPs-Aktivität bei verschiedenen pH-Werten des Zellkulturüberstands. Jeweils 500 µl des auf den jeweiligen pH-Wert eingestellten Zellkulturüberstands einer 10-cm-Kulturschale wurden für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. Alle Messwerte sind mit Standardabweichung angegeben. Die Messwerte für HEK293-ADAM10SEAPs/APP-Zellen werden durch schwarze Kreise dargestellt, die für HEK293-Zellen durch Rauten. 5.1.2.3 Überprüfung der Linearität der enzymatischen Reaktion Um mit diesem Test vergleichbare und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, muss ein linearer Zusammenhang zwischen der Menge der alkalischen Phosphatase und der Menge des umgesetzten Substrats bestehen. Durch die Messung der alkalischen Phosphataseaktivität in verschiedenen Verdünnungen des Zellkulturüberstands von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen wurde untersucht, ob dieser erforderliche lineare Zusammenhang gegeben ist. Dazu wurde eine 10-cm-Kulturschale dieser Zellen über Nacht mit Zellkulturmedium ohne Phenolrot kultiviert. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen des Zellkulturüberstands mit Medium ohne Phenolrot hergestellt und die Enzymreaktion durch die Zugabe des Substrats gestartet. Nach Beendigung der Reaktion ERGEBNISSE 72 erfolgte die Messung der Absorption als Maß der alkalischen Phosphataseaktivität. Durch die Auftragung der Absorption gegen die Verdünnung des eingesetzten Zellkulturüberstands wird der lineare Zusammenhang zwischen der enzymatischen Reaktion und der Konzentration der sekretierten alkalischen Phosphatase im Kulturüberstand veranschaulicht (Abbildung 5.5). Absorption [389,5 nm] 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05 0 20 40 60 80 100 120 Menge des Zellkulturüberstands [µ µl] __________________________________________________________________ Abbildung 5.5 Linearität der alkalischen Phosphatase-Reaktion bei niedrigen Enzymkonzentrationen. 1, 2,5, 5, 10, 20, 40, 60 und 100 µl des auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberstands von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen wurden auf 500 µl aufgefüllt und für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. Alle Messwerte sind mit Standardabweichung angegeben. Um die Untersuchung auf höhere Konzentrationen der alkalischen Phosphatase auszuweiten wurde die Enzymreaktion mit weniger stark verdünnten Zellkulturüberständen durchgeführt. Nachdem die Reaktion beendet war, erfolgte die Messung der Absorptionen. Sie wurden anschließend gegen die jeweils eingesetzte Menge des Zellkulturüberstands aufgetragen. Daraus geht hervor, dass die enzymatische Reaktion auch in Bereichen höherer Enzymkonzentration linear verläuft (Abbildung 5.6). ERGEBNISSE 73 0,9 Absorption [389,5 nm] 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 50 100 150 200 250 300 350 Menge des Zellkulturüberstands [µ µl] __________________________________________________________________ Abbildung 5.6 Linearität der alkalischen Phosphatase-Reaktion bei höheren Enzymkonzentrationen. 50, 100, 150, 200, 250, 300 und 350 µl des auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberstands von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen wurden auf 500 µl aufgefüllt und für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) des Substrats 4-Nitrophenylphosphat inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. Alle Messwerte sind mit Standardabweichung angegeben. Daneben muss ebenso eine Linearität zwischen der Zellzahl und der enzymatischen Reaktion bestehen. Um die Abhängigkeit der alkalischen Phosphataseaktivität von der Zellzahl zu untersuchen, wurden verschiedene Zellzahlen auf Poly-L-Lysin-beschichteten 6-cm-Kulturschalen ausgesät und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag erfolgte die Inkubation der Zellen für 4 h in Zellkulturmedium ohne Phenolrot. Anschließend wurden jeweils 500 µl des Zellkulturüberstands für die enzymatische Reaktion der alkalischen Phosphatase mit NPP eingesetzt (Abbildung 5.7). ERGEBNISSE 74 Absorption [389,5 nm] 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0 1e+5 2e+5 3e+5 4e+5 5e+5 6e+5 7e+5 Zellanzahl __________________________________________________________________ Abbildung 5.7 Linearität der alkalischen Phosphatase-Reaktion in Abhängigkeit von der Zellzahl. 100 000, 200 000, 300 000, 400 000, 500 000 und 600 000 HEK293-ADAM10SEAPs/APP-Zellen wurden auf Poly-L-Lysin-beschichteten 6-cm-Kulturschalen ausgesät und über Nacht kultiviert. Die alkalische Phosphatase-Reaktion erfolgte mit je 500 µl des auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberstands. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Absorption jedes Ansatzes bei 389,5 nm gemessen. Alle Daten sind mit Standardabweichung dargestellt. Durch die Auftragung der Zellzahl gegen die Absorption der jeweiligen Probe wird der proportionale Zusammenhang zwischen der enzymatischen Reaktion und der Anzahl der eingesetzten Zellen veranschaulicht. Die alkalische Phosphatase-Reaktion verläuft somit auch in Bezug auf die Zellzahl linear. Als optimal für die Durchführung des Tests erwies sich die Aussaat von 500 000 Zellen auf 6-cm-Kulturschalen. Die Zellen wurden über Nacht kultiviert und waren am folgenden Tag nahezu konfluent, so dass eine hohe Empfindlichkeit und eine gute Reproduzierbarkeit der Experimente gegeben war. Um die angegebenen Zellzahlen zu bestätigen wurde nachfolgend Proteinbestimmungen mit den Zellen jeder Kulturschale durchgeführt. 5.1.2.4 Inhibierung der endogenen alkalischen Phosphatase Um die Hintergrundaktivität zu minimieren und störende Einflüsse durch die endogene alkalische Phosphataseaktivität einzuschränken, soll diese durch die Verwendung des Inhibitors L-Homoarginin oder durch einen Hitzeinaktivierungsschritt unterdrückt werden. Ein Aliquot von 500 µl des Zellkulturüberstands von HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen ERGEBNISSE 75 wurde für 15 min bei 56°C im Wasserbad erhitzt und anschließend für 5 min auf Eis abgekühlt. Parallel dazu wurde je ein Aliquot von 500 µl des Zellkulturüberstands mit 10 mM L-Homoarginin für 15 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert und danach für 5 min auf Eis abgekühlt. Die Messung der alkalischen Phosphataseaktivität erfolgte im Anschluss daran (Abbildung 5.8). Alle Werte wurden durch eine Dreifachmessung erfasst. 0,40 HEK293 HEK293-ADAM10-SEAPs Absorption [389,5 nm] 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 un H g om oa rg in in L- tiv ie r lle tr o na k K on ru ng H om oa rg in in L- H itz ei H itz ei n ak K tiv ie on tr o lle 0,00 __________________________________________________________________ Abbildung 5.8 Inhibierung der endogenen alkalischen Phosphatase durch Hitze und L-Homoarginin. Vor der Durchführung der Enzymreaktion erfolgte eine Inkubation der auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberstände von HEK293 und HEK293-ADAM10-SEAPs/APPZellen für 15 min bei 56°C oder in Gegenwart von 10 mM L-Homoarginin bei 37°C. Anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Reaktion für 15 min bei 37°C durchgeführt und die Absorption des Reaktionsprodukts 4-Nitrophenol bei 389,5 nm gemessen. Alle Daten sind mit Standardabweichung angegeben. L-Homoarginin unterdrückte die endogene alkalische Phosphataseaktivität in allen untersuchten Zell-Linien nur schwach. Dagegen konnte durch die Hitzeinaktivierung die endogene alkalische Phosphataseaktivität nahezu vollständig gehemmt werden, ohne die Aktivität der sekretierten alkalischen Phosphatase des Fusionsproteins merklich zu beeinträchtigen. Im Folgenden wurde daher die endogene alkalische Phosphataseaktivität der Proben vor jeder Messung durch eine Hitzeinaktivierung (15 min bei 56°C) unterdrückt. ERGEBNISSE 76 5.1.2.5 Die Freisetzung von APPs in HEK293-SEAPs/APP- und HEK293-ADAM10SEAPs/APP-Zellen Eine erhöhte Expression der α-Sekretase ADAM10 ist sowohl mit einer erhöhten konstitutiven als auch einer erhöhten stimulierten Freisetzung von APPsα verbunden. Durch die Überexpression von ADAM10 zusammen mit dem Reporterprotein sollte daher die Empfindlichkeit des Testverfahrens gesteigert werden können. Vor allem Substanzen, die auf der Proteinebene eine Stimulierung von ADAM10 bewirken, sollten hiermit entscheidend besser identifiziert werden können. Um zu überprüfen, ob eine Überexpression von ADAM10 auch zu einer erhöhten Freisetzung des Reporterproteins führt, wurden die Zellkulturüberstände von HEK293-SEAPs/APP- und HEK293-ADAM10-SEAPs/APPZellen auf ihre alkalische Phosphataseaktivität hin untersucht (Abbildung 5.9). Absorption [389,5 nm] 0,5 HEK293-SEAPs/APP HEK293-ADAM10-SEAPs/APP 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 __________________________________________________________________ Abbildung 5.9 Freisetzung des Reporterproteins in HEK293-SEAPs/APP- und HEK293ADAM10-SEAPs/APP-Zellen. Die Zellkulturüberstände der untersuchten Zellen wurden vor der Durchführung der alkalischen Phosphatase-Reaktion auf pH8,0 eingestellt und einer Hitzeinaktivierung unterzogen. Im Anschluss daran erfolgte die enzymatische Reaktion bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat. Nach 15 min wurde sie durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis gestoppt. Die Messung der Absorptionszunahme erfolgte bei einer Wellenlänge von 389,5 nm. Alle Messwerte wurden durch eine Dreifachbestimmung erfasst und sind mit Standardabweichung dargestellt. Der Vergleich zeigt, dass die Zellen, die ADAM10 überexprimieren, wie erwartet eine deutlich höhere Sekretion des Reporterproteins besitzen, als die Zellen, die nur das SEAPs-Fusionsprotein exprimieren. Der Grund hierfür liegt wahrscheinlich in dem erhöhten Enzym-Substrat-Verhältnis der HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen, könnte ERGEBNISSE 77 jedoch auch auf Unterschiede in der Expression des Fusionsproteins zurückzuführen sein, da auch eine höhere Expression des Fusionsproteins mit einer erhöhten, konstitutiven Freisetzung verbunden ist. 5.1.3 Die Stimulierbarkeit des SEAPs/APP119-Reporterproteins Die APPs-Freisetzung lässt sich in Zellen mit muskarinischen M1-Rezeptoren durch Carbachol stimulieren und deutlich erhöhen (Nitsch et al., 1992). Zudem kann die APPsFreisetzung auch durch die Aktivierung der Proteinkinase C mit dem Phorbolester PMA erhöht werden. In dem folgenden Experiment soll gezeigt werden, dass sich das SEAPs/APP119-Fusionsprotein genauso wie das native APP verhält und den gleichen Stoffwechselweg durchläuft. Eine durch Carbachol beziehungsweise PMA hervorgerufene vermehrte Freisetzung von SEAPs/APP119 wäre ein Hinweis auf einen gemeinsamen Stoffwechselweg von APP und SEAPs/APP119. Zu diesem Zweck wurden HEK293-, HEK293-SEAPs/APP- und HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen zunächst mit 0,1 mM und 1 mM Carbachol für 4 h inkubiert. Anschließend wurde die alkalische Phosphataseaktivität im Zellkulturüberstand bestimmt (Abbildung 5.10). 0,7 HEK293 HEK293-ADAM10-SEAPs Absorption [389,5 nm] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 + 0,1 mM Carbachol + 0,1 mM Carbachol __________________________________________________________________ Abbildung 5.10 Einfluss von Carbachol auf die Freisetzung des SEAPs/APP119-Reporterproteins. Bevor die Enzymreaktion durchgeführt wurde, erfolgte eine Hitzeinaktivierung der endogenen alkalischen Phosphatase in den auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberständen für 15 min bei 56°C. Anschließend folgte die alkalische Phosphatase-Reaktion für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat als Substrat. Nachdem die Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis gestoppt worden war, erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. ERGEBNISSE 78 Gegenüber den nicht-stimulierten Zellen stieg die SEAPs/APP119-Freisetzung bei den Carbachol-behandelten Zellen um etwa 25% an. Analog zur Untersuchung der Carbachol-Stimulierbarkeit des Reporterproteins erfolgte die Ermittlung des Einflusses von PMA auf die SEAPs/APP119-Freisetzung. In diesem Experiment wurden HEK293-, HEK293-SEAPs/APP- und HEK293-ADAM10-SEAPs/APPZellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten 6-cm-Schalen für 4 h mit 1 µM PMA stimuliert. Im Anschluss daran erfolgte die Messung der alkalischen Phosphatase im Zellkulturüberstand (Abbildung 5.11). 0,16 HEK293-SEAPs/APP HEK293-ADAM10-SEAPs/APP Absorption [389,5 nm] 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 - + PMA - + PMA __________________________________________________________________ Abbildung 5.11 Stimulierung der SEAPs/APP119-Freisetzung durch PMA. Vor der Durchführung der Enzymreaktion erfolgte eine Hitzeinaktivierung der auf pH8,0 eingestellten Zellkulturüberstände für 15 min bei 56°C. Anschließend wurde die alkalische PhosphataseReaktion für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat durchgeführt. Nach dem Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis erfolgte die Messung der Absorption bei 389,5 nm. Die Aktivierung der Proteinkinase C mit PMA resultierte in einer erhöhten SEAPs/APP119Sekretion. Bei HEK293-SEAPs/APP-Zellen stieg die Freisetzung um etwa das Vierfache, bei HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen um etwa das Zweieinhalbfache an. Aus den Untersuchungen der Carbachol- und PMA-Stimulierung ist ersichtlich, dass die Freisetzung des SEAPs/APP119-Reporterproteins sowohl durch Carbachol als auch durch PMA induziert werden kann. Die Stimulierbarkeit des Fusionsprotein verhält sich somit in bezug auf die eingesetzten Stimulanzien wie die des endogenen APP. ERGEBNISSE 79 5.1.4 Kinetik der PMA-Stimulierung Mit Hilfe dieses Testsystems sollen die Auswirkungen der PMA-Stimulierung auf die α-Sekretase-Spaltung zeitlich aufgelöst und so der Verlauf der APPs-Freisetzung nach Aktivierung der Proteinkinase C untersucht werden. Gleichzeitig sollen Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests überprüft werden. Für dieses Experiment wurden je 300 000 HEK293-ADAM10-SEAPs/APP-Zellen auf PolyL-Lysin-beschichteten 6-cm-Kulturschalen für verschiedene Zeitspannen mit 1 µM PMA inkubiert. Als Kontrolle diente eine Kulturschale, der kein PMA hinzugefügt wurde. Anschließend wurde die alkalische Phosphataseaktivität im Überstand der Zellen photometrisch quantifiziert. Die Auftragung der Absorption gegen die Dauer der PMAEinwirkung ist in Abbildung 5.12 dargestellt. Innerhalb der ersten 60 min ist ein starker, linearer Anstieg der Aktivität zu verzeichnen. Nach etwa 60 min erreicht die SEAPsFreisetzung etwa die Hälfte des Maximalwerts. Nach diesem Zeitpunkt verläuft die Steigung flacher und nähert sich nach 240 min einem Grenzwert. 0,14 Absorption [389,5 nm] 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0 50 100 150 200 250 300 Zeit der PMA- Einwirkung [min] __________________________________________________________________ Abbildung 5.12 Kinetik der PMA-Stimulieung. Die Zellkulturüberstände der PMAbehandelten Zellen wurden vor der Durchführung der alkalischen Phosphatase-Reaktion auf pH8,0 eingestellt und einer Hitzeinaktivierung unterzogen. Im Anschluss daran erfolgte die enzymatische Reaktion für 15 min bei 37°C mit 30 µl 0,8% (w/v) 4-Nitrophenylphosphat als Substrat. Durch die Zugabe von 500 µl 5 M NaOH auf Eis wurde die Reaktion gestoppt. Die Messung der Absorptionzunahme durch das entstandene 4-Nitrophenol erfolgte bei einer Wellenlänge von 389,5 nm. Alle Messwerte wurden durch eine Dreifachbestimmung erfasst und sind mit Standardabweichung dargestellt. 80 ERGEBNISSE 5.2 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 Die Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin sind an der Prozessierung vieler Vorläuferproteine beteiligt, die eine RX(K/R)R Konsensussequenz besitzen. Außerdem sind sie im trans-Golgi-Apparat, in sekretorischen Vesikeln und an der Zelloberfläche aktiv, so dass sie in den gleichen Kompartimenten lokalisiert sind, in denen α-Sekretaseaktivität nachgewiesen wurde. Tatsächlich konnte eine Beteiligung von PC7 an der nichtamyloidogenen α-Sekretase-Prozessierung von APP dokumentiert werden (Lopez-Perez et al., 1999). PC7 wird daher als potentielle α-Sekretase in Betracht gezogen. Unwahrscheinlich ist jedoch eine direkte Spaltung von APP durch PC7 oder andere Mitglieder der Proprotein-Konvertasen, da APP an der α-Sekretase-Spaltstelle und auch in unmittelbarer Nähe keine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz aufweist. Eine solche Sequenz ist für die Prozessierung von Vorläuferproteinen durch Proprotein-Konvertasen jedoch unbedingt erforderlich. Die Disintegrin-Metalloproteinase ADAM10 wird als Zymogen synthetisiert und besitzt sowohl α-Sekretaseaktivität als auch eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz (RKKR) zwischen der Prodomäne und der katalytischen Domäne. Durch N-terminale Sequenzierung von gereinigtem ADAM10 aus Rindernieren konnte belegt werden, dass diese Sequenz als Spaltstelle dient, um die reife, katalytisch aktive Form von ADAM10 zu erzeugen (Lammich et al., 1999). Eine Funktion von PC7 als pro-ADAM10prozessierender und damit pro-α-Sekretase-aktivierender Konvertase erscheint daher wahrscheinlicher als eine direkte Spaltung des APP durch PC7. Es war deswegen erforderlich, die Prozessierung von ADAM10 in bezug auf eine mögliche Beteiligung von PC7 an diesem Vorgang zu untersuchen. Für die Proprotein-Konvertase Furin konnte ein Mitwirken an der α-Sekretase-Spaltung des APP in früheren Studien zwar nicht festgestellt werden, doch aufgrund der Ähnlichkeit zu PC7, vor allem in Hinblick auf die Substratspezifität, wurde Furin in die Untersuchung einbezogen. 5.2.1 Prozessierung von ADAM10 durch Proprotein-Konvertasen Der synthetische Inhibitor Decanoyl-RVKR-chloromethylketon (Dec-RVKR-cmk) eröffnet die Möglichkeit, Proprotein-Konvertasen in Zellkulturen selektiv zu hemmen. Durch seine hydrophobe Alkylgruppe ist er in der Lage, in Zellen einzudringen und dort mit intrazellulären Proteinen in Wechselwirkung zu treten. Da er die AminosäureErkennungssequenz von Proprotein-Konvertasen enthält, kann er kovalent an die Substratbindungsstelle binden und so die katalytische Aktivität blockieren (Garten et al., 1989). Damit stellt diese Substanz ein wertvolles Werkzeug dar, um die Möglichkeit einer Prozessierung von endogenem ADAM10 durch Proprotein-Konvertasen zu überprüfen. Im ERGEBNISSE 81 Falle einer Beteiligung von Proprotein-Konvertasen sollte die Erzeugung von reifem ADAM10 in der Gegenwart des Inhibitors merklich unterdrückt werden. Um den Einfluss von Dec-RVKR-cmk auf die Reifung von ADAM10 zu ermitteln, wurden untransfizierte HEK293-Zellen für 48 h in der Anwesenheit von 30 µM des Inhibitors inkubiert. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Aufgrund der Instabilität von DecRVKR-cmk im Zellkulturüberstand war alle 6 bis 8 h ein Wechsel des Zellkulturmediums und eine erneute Zugabe des Inhibitors erforderlich. Zur Analyse der Auswirkung auf die Prodomänen-Abspaltung von ADAM10 wurden die Zell-Lysate anschließend dem Western-Blot-Verfahren unterzogen. Hieraus geht hervor, dass endogenes ADAM10 in untransfizierten HEK293-Zellen hauptsächlich in der reifen Form existiert und die Bildung des reifen Enzyms in der Gegenwart des Inhibitors deutlich verringert wird (Abbildung 5.13). Die Vermutung, dass Proprotein-Konvertasen an der Prozessierung von ADAM10 partizipieren, wird durch dieses Ergebnis bestätigt. HEK293 Pro-ADAM10 98 kDa ADAM10 64 kDa Inhibitor - + __________________________________________________________________ Abbildung 5.13 Einfluss des Proprotein-Konvertasen-Inhibitors Decanoyl-RVKRchloromethylketon auf die proteolytische Prozessierung von endogenem ADAM10. Die Zellkulturüberstände von HEK293-Zellen wurden für 48 h auf eine Konzentration von 30 µM des Inhibitors eingestellt. Alle 6-8 h erfolgte ein Wechsel des Zellkulturmediums und eine erneute Zugabe des Inhibitors. Die Auftrennung der Zell-Lysate erfolgte in einem 10% (w/v) Polyacrylamidgel. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran und der Inkubation mit dem Antikörper anti-ADAM10 erfolgte der Nachweis der Primärantikörper durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatase-gekoppelten antiKaninchen Antikörpers und des Western-Star Detektionssystems. 5.2.2 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 durch PC7 und Furin 5.2.2.1 PCR-Mutagenese zur Beseitigung der Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle Um die Sequenzanforderungen der Proteinasen, die für die Abspaltung der Prodomäne von ADAM10 verantwortlich sind, zu untersuchen, wurde die Proprotein-KonvertasenKonsensussequenz (RKKR) zwischen der Prodomäne und der katalytischen Domäne ERGEBNISSE 82 durch die Aminosäuresequenz NAQA substituiert (Klonierungsschema 7.1.2). Durch diese Mutation wird diese potentielle Spaltstelle zerstört und damit für Proprotein-Konvertasen unbrauchbar. Die PCR-Mutagenese zur Eliminierung der Erkennungssequenz wurde mit einem mutierten Oligonukleotid als Forward-Primer, einem Reverse-Primer und der cDNA von ADAM10-HA als Matrize durchgeführt. Den dafür benötigten Vektor mit der cDNA von HAEpitop-markiertem ADAM10 aus Rind (pcDNA3-ADAM10-HA) stellte Herr Dr. Rolf Postina (Universität Mainz) zur Verfügung. Für die Integration der mutierten ADAM10-Sequenz wurde das Plasmid pcDNA3ADAM10-HA parallel zur PCR-Mutagenese mit dem Restriktionsenzym Eco81I verdaut und nachfolgend mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um glatte DNA-Enden zu erzeugen. Durch die anschließende Restriktionshydrolyse mit dem Enzym EcoRI (erzeugt überhängende DNA-Enden) wurde ein ADAM10-DNA-Fragment aus dem Vektor herausgeschnitten. Nach dem Auftrennen des Restriktionsansatzes auf einem 1%igen Agarosegel erfolgte die Isolierung der Vektor-DNA, die somit von der herausgeschnittenen DNA abgetrennt werden konnte. Das dabei entfernte ADAM10-DNA-Fragment konnte dann durch eine Ligation der Vektor-DNA mit dem ebenfalls EcoRI-behandelten PCRAmplifikat in pcDNA3-ADAM10-HA ersetzt werden. Das entstandene Plasmid enthält HAEpitop-markiertes Rinder-ADAM10 mit einer mutierten Proprotein-Konvertasen- Erkennungssequenz (RKKR → NAQA) und wird als pcDNA3-ADAM10∆RKKR-HA bezeichnet. Neben dem Sequenzaustausch wurde durch das mutierte Oligonukleotid auch eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle für die Endonuklease FspI eingefügt, mit deren Hilfe ein Screening nach dem mutierten Klon möglich war. Als Kontrolle auf die korrekte Insertion der durch die PCR-generierte ADAM10-Sequenz erfolgte ein Restriktionsverdau mit den Enzymen HindIII, PstI und FspI. Zusätzlich wurde die Nukleotidsequenz dieser Mutante durch eine DNA-Sequenzierung überprüft. 5.2.2.2 Klonierung der cDNAs von PC7 und Furin in den Expressionsvektor pIRES1hyg Die cDNAs der Proprotein-Konvertasen PC7 aus Ratte im Vektor pRc/CMV und Furin aus Rind im Vektor pSG5new-bFur wurden von Herrn Prof. Dr. Wolfgang Garten (Universität Marburg) zur Verfügung gestellt. Die cDNA von Furin wurde von Herrn Dr. Rolf Postina (Universität Mainz) in den Vektor pcDNA3 (pcDNA3-bFur) umkloniert und zur Verfügung gestellt. Mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und XbaI konnte die PC7-cDNA vollständig aus dem Plasmid pRc/CMV herausgeschnitten werden. Der Restriktionsansatz wurde ERGEBNISSE 83 dann in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, so dass nach der Isolierung aus dem Agarosegel ein 3500 bp-großes Fragment der PC7-cDNA erhalten werden konnte. Dieses wurde mit dem Enzym T4 DNA-Polymerase behandelt, um glatte DNA-Enden zu erzeugen. Zur Integration der cDNA in den pIRES1hyg-Vektor wurde dieser mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und danach ebenfalls mit T4 DNA-Polymerase behandelt. Nach der Dephosphorylierung der Vektor-DNA erfolgte die Ligation mit der PC7-cDNA. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pIRES1hyg-rPC7. Die für die Expression benötigte Orientierung der eingefügten cDNA wurde durch Restriktionsanalysen mit den Enzymen StuI und Bsp68I sichergestellt. Die cDNA von Furin konnte durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen HindIII und XhoI aus dem Vektor pcDNA3-bFur herausgeschnitten werden. Nach der Separation der DNA-Fragmente des Restriktionsansatzes in einem 1%igen Agarosegel und der Isolierung des 2881 bp-Fragments der Furin-cDNA erfolgte die Auffüllung überstehender DNA-Enden durch die T4 DNA-Polymerase. Zum Einfügen in den pIRES1hyg-Vektor wurde die Vektor-DNA mit dem Enzym BamHI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase behandelt und dephosphoryliert. Aus der Ligation mit der Furin-cDNA resultierte das Plasmid pIRES1hyg-Furin. Die korrekte Insertion wurde durch eine analytische Restriktion mit BamHI verifiziert. 5.2.2.3 Auswirkung der mutierten Spaltstelle und der Überexpression von PC7 und Furin auf die Prozessierung von ADAM10 Um die Auswirkung der mutierten Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle in ADAM10 auf die proteolytische Entfernung der Prodomäne zu untersuchen, wurde die cDNA von ADAM10∆RKKR-HA Verwendung des durch Plasmids eine Calciumphosphat-vermittelte pcDNA3-ADAM10∆RKKR-HA in Transfektion HEK293-Zellen unter zur Expression gebracht. Für eine stabile Expression wurden die transfizierten Zellen mit G418 selektioniert. Um die Bedeutung der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin bei der Prozessierung von ADAM10 aufzuklären, wurden HEK293-, HEK293-ADAM10-HA- (Klon D3) und HEK293-ADAM10∆RKKR-HA-Zellen mit den cDNAs von PC7, Furin und dem ursprünglichen pIRES1hyg-Vektor als Kontrolle transfiziert. Da diese Zell-Linien bereits mit G418 auf eine stabile Expression von ADAM10 selektioniert worden waren, erfolgte für die stabile Expression von PC7 und Furin eine zweite Selektion der Zellen mit Hygromycin B. Aus den überlebenden Zellen der Hygromycin B-resistenten Mischklone mit den Bezeichnungen HEK293, HEK293-PC7, HEK293-ADAM10, HEK293-ADAM10PC7, HEK293-ADAM10-Furin, HEK293-ADAM10∆RKKR, HEK293-ADAM10∆RKKR-PC7 ERGEBNISSE 84 wurden Zell-Lysate präpariert, die durch Western-Blot-Analysen auf die Expression von PC7 und Furin untersucht wurden (Abbildung 5.14). __________________________________________________________________ Abbildung 5.14 Expression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in stabil transfizierten Zellen. Die Zell-Lysate der transfizierten Zellen wurden in einem 10% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. A, Immunologischer Nachweis von PC7 mit anti-PC7 Antiserum und B, immunologischer Nachweis von Furin mit anti-Furin Antiserum. Der Chemilumineszenzvermittelte Nachweis der Primärantikörper erfolgte jeweils mit einem alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper und dem Western-Star Detektionssystems von Tropix. Die Auswirkungen der Überexpression von PC7 und Furin sowie der Effekt der mutierten Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle auf die proteolytische Prozessierung von ADAM10 wurden ebenfalls durch Western-Blot-Analysen der Zell-Lysate ermittelt (Abbildung 5.15). In den Proben der HEK293- und HEK293-PC7-Kontrollzellen sind keine Banden sichtbar, da mit dem für die Detektion verwendeten anti-HA Antikörper Y-11 nur HA-Epitopmarkiertes ADAM10 nachgewiesen werden kann. Zwei spezifische Banden auf der Höhe der Molekulargewichtsstandards von ca. 90 und 64 kDa sind jedoch in den Zell-Lysaten von HEK293-ADAM10, HEK293-ADAM10-PC7 und HEK293-ADAM10-Furin erkennbar. Die obere der beiden Banden entspricht dem unprozessierten ADAM10 mit Prodomäne, die untere der prozessierten Form, also dem reifen Enzym. Auffällig sind die fehlenden Banden des reifen Enzyms und das Auftreten diffuser Banden in den Zellen, die das mutierte ADAM10 ohne der Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz exprimieren. ERGEBNISSE 85 __________________________________________________________________ Abbildung 5.15 Proteolytische Prozessierung von ADAM10. A, Western-Blot-Analyse der Zell-Lysate. Nach dem Auftrennen in einem 10% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel und dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran erfolgte der immunologische Nachweis des HA-Epitop-markierten ADAM10 mit dem anti-HA Antikörper Y-11. Der Nachweis des Primärantikörpers erfolgte mit einem alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper und dem Western-Star Detektionssystem von Tropix. B, Balkendiagramm zur quantitativen Auswertung der ADAM10-Prozessierung. Die Werte wurden durch die densitometrische Analyse der Proteinbanden des Western-Blots unter Verwendung der Software Aida 2.0 erhalten. Unprozessiertes ADAM10 ist in jeder Zell-Linie auf 100% festgelegt. Die prozessierte Form von ADAM10 ist jeweils als Verhältnis zur unprozessierten Form in Prozent angegeben. Alle Werte entsprechen dem arithmetischen Mittel aus drei unabhängigen Experimenten und sind mit Standardabweichug dargestellt. Die densitometrische Auswertung des Western-Blots offenbart erhöhte Mengen (etwa 180%) der reifen Form von ADAM10 in HEK293-ADAM10-PC7-Zellen und in HEK293ADAM10-Furin-Zellen im Vergleich zu den HEK293-ADAM10-Kontrollzellen (Abbildung 5.15). Die Koexpression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin zusammen mit ADAM10 bewirkt somit eine Zunahme der Prodomänen-Abspaltung bei ADAM10. Im Gegensatz dazu ist die reife Form von ADAM10 in HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen nicht nachweisbar, was ein Beleg dafür ist, dass die RKKR-Erkennungssequenz für die korrekte Prozessierung des Zymogens essentiell ist. Sowohl in HEK293-ADAM10∆RKKR- ERGEBNISSE 86 als auch in HEK293-ADAM10∆RKKR-PC7-Zellen können zwar schwache, diffuse Banden entdeckt werden, sie weisen allerdings ein höheres Molekulargewicht, als die prozessierte Form der Wildtyp-Proteinase, auf. Diese Banden sind daher auf verkürzte Formen des mutierten Enzyms zurückzuführen, die jedoch nicht die reife Form des Enzyms darstellen. Der Übergang der unreifen Form von ADAM10∆RKKR zum reifen Enzym ist somit vollständig blockiert, selbst bei einer Überexpression von PC7. In Western-Blot-Studien lässt die obere Bande der Proform von ADAM10∆RKKR ein etwas höheres Molekulargewicht als die Proform der Wildtyp-Proteinase erkennen. Diese Änderung des Laufverhaltens bei der Gelelektrophorese ist sehr wahrscheinlich auf die Entfernung der vier basischen Aminosäurereste zurückzuführen. Um sicherzustellen, dass die ADAM10∆RKKR-Mutante den sekretorischen Weg korrekt durchläuft und die Zelloberfläche erreicht, wurden die Zelloberflächenproteine von HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen Immunpräzipitation der mit Biotin HA-Epitop-markierten markiert. Mutante Anschließend erfolgte ADAM10∆RKKR-HA die unter Verwendung des anti-HA-spezifischen Antikörpers 16B12. Nach der Elution der Proteine von der Protein A-Sepharose konnten die biotinylierten Proteine mit StreptavidinSepharose isoliert und mit Hilfe des Western-Blot-Verfahrens analysiert werden (Abbildung 5.16). 1 2 3 Pro-ADAM10 98 kDa ADAM10 64 kDa __________________________________________________________________ Abbildung 5.16 Zelloberflächenlokalisierung der ADAM10∆ ∆RKKR-Mutante. Die Zelloberflächenproteine von HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen wurden zunächst mit Biotin markiert und anschließend lysiert. HA-Epitop-markiertes ADAM10∆RKKR konnte mit Hilfe des antiHA Antikörpers 16B12 immunpräzipitiert werden. Nach der Elution von der Protein ASepharose konnten die biotinylierten Proteine mit Streptavidin-Sepharose isoliert und vier Fünftel der Probe nachfolgend in einem 10% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt werden (Spur 3). Ein Fünftel wurde direkt nach der Elution von der Protein A-Sepharose auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen (Spur 2). Die aufgetrennten Proteine wurden auf eine PVDF-Membran überführt und mit dem anti-HA Antikörper Y-11, gefolgt von einem alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG-Antikörper, inkubiert. Die Detektion des Zweitantikörpers erfolgte mit dem Western-Star Detektionssystem von Tropix. Spur 1: Protein A-Sepharose-Eluat von HEK293-ADAM10-Zellen als Kontrolle Spur 2: Protein A-Sepharose-Eluat von HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen Spur 3: Streptavidin-Sepharose-Eluat von HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen ERGEBNISSE 87 Hierdurch kann sowohl die Proform als auch die verkürzten Formen des mutierten ADAM10 auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Die Oberflächenlokalisierung dieser Mutante lässt vermuten, dass sie den sekretorischen Weg in der gleichen Weise wie die Wildtyp-Proteinase durchläuft und die veränderte Prozessierung somit nicht auf eine falsche Lokalisierung des Proteins zurückzuführen ist. 5.2.3 Prozessierung von ADAM10 in Furin-defizienten LoVo-Zellen Die humane Karzinom-Zell-Linie LoVo ist durch jeweils eine Mutation in den beiden Allelen des Furin-Gens gekennzeichnet und exprimiert nur die Proprotein-Konvertasen PACE4 und PC7 funktionell, jedoch kein funktionsfähiges, katalytisch-aktives Furin (Seidah et al., 1994, Seidah et al., 1996 und Takahashi et al., 1993). Sie ermöglicht somit die Untersuchung der proteolytischen Prozessierung von endogenem ADAM10 in der Abwesenheit von katalytisch-aktivem Furin. Durch die Western-Blot-Analyse des Zell-Lysats dieser Zellen konnten die Auswirkungen der Furin-Defizienz auf die Entfernung der Prodomäne von ADAM10 sichtbar gemacht werden (Abbildung 5.17). Die Detektion des endogenen ADAM10 der LoVo-Zellen erfolgte mit dem Erstantikörper anti-ADAM10. Sowohl die reife, prozessierte Form als auch die unprozessierte Form von ADAM10 sind im Zell-Lysat nachweisbar. Dies bedeutet, dass Furin für die proteolytische Entfernung der Prodomäne nicht unbedingt erforderlich ist und durch PC7 ersetzt werden kann. Ein Beitrag von PACE4 zur Reifung von ADAM10 kann mit diesem experimentellen Ansatz jedoch nicht ausgeschlossen werden. LoVo Pro-ADAM10 ADAM10 98 kDa 64 kDa __________________________________________________________________ Abbildung 5.17 Western-Blot-Analyse des endogenen ADAM10 in LoVo-Zellen. Die Auftrennung des Zell-Lysats erfolgte in einem 10% (w/v) Polyacrylamidgel. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran und der Inkubation mit dem anti-ADAM10 Antikörper erfolgte der Nachweis des Primärantikörpers durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG-Antikörpers und des Western-Star Detektionssystems. ERGEBNISSE 88 5.2.4 Zusammenhang zwischen der Prozessierung von ADAM10 und der APPsα-Sekretion Durch die Überexpression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in HEK293ADAM10-Zellen wird die Menge der reifen Form von ADAM10 deutlich erhöht, wogegen die Mutation der Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle in ADAM10 die Entstehung des reifen Enzyms vollständig verhindert. Um die Auswirkungen der veränderten ADAM10Prozessierungen auf die Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins zu ermitteln, wurde das freigesetzte APPsα in den Zellkulturüberständen der in Kapitel 5.2.2.3 beschriebenen Zell-Linien durch eine Western-Blot-Analyse detektiert und anschließend densitometrisch quantifiziert (Abbildung 5.18). Hierfür wurden gleiche Zellzahlen jeder Zell-Linie ausgesät und über Nacht kultiviert. Die Sekretion von Zellproteinen in das Kulturmedium wurde am nächsten Tag über einen Zeitraum von 4 h verfolgt. In HEK293-Zellen bewirkte die Überexpression von PC7 eine um etwa 50% erhöhte Sekretion von APPsα gegenüber den untransfizierten Kontrollzellen (Abbildung 5.18, Balken 1 und 2). HEK293-ADAM10-PC7- und HEK293-ADAM10-Furin-Zellen, die sowohl ADAM10 als auch PC7 beziehungsweise Furin, überexprimieren und im Vergleich zu HEK293-ADAM10-Zellen, die nur ADAM10 überexprimieren, größere Mengen an prozessiertem ADAM10 aufweisen, sekretierten etwa doppelt soviel APPsα (Balken 4 und 5) wie die HEK293-ADAM10-Zellen (Balken 3), in denen die ADAM10-Prozessierung unverändert ist. Diese Befunde dokumentieren, dass eine erhöhte Menge an prozessiertem ADAM10 eine gesteigerte APPsα-Sekretion bewirkt. Darüber hinaus sekretierten HEK293-ADAM10-PC7-Zellen (Balken 4) ungefähr dreimal mehr APPsα als HEK293-PC7-Zellen (Balken 2), was eindeutig belegt, dass PC7 seinen α-Sekretaseverstärkenden Effekt durch die Prozessierung von ADAM10 vermittelt. Daneben war in HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen - diese Zellen exprimieren mutiertes ADAM10 ohne Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle - die α-Sekretaseaktivität deutlich geringer (Balken 6) als in Wildtyp-ADAM10-überexprimierenden Zellen (Balken 3). Dass diese Zellen größere Mengen an APPsα freisetzen als untransfizierte HEK293-Zellen ist vermutlich auf die noch vorhandene katalytische Aktivität der verkürzten Formen von ADAM10, die einzig in diesen Zellen zu finden sind, zurückzuführen. Im Gegensatz zu HEK293-ADAM10-Zellen resultierte in HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen die Überexpression von PC7 jedoch nur in einer geringfügigen Zunahme der APPsα-Sekretion (Balken 7). Dieser Effekt ist unbedeutend im Vergleich zu dem von PC7 auf Wildtyp-ADAM10 und reflektiert nur die Auswirkung der PC7-Überexpression auf das in den Zellen vorhandene endogene ADAM10. Damit belegt dieses Ergebnis, dass die α-Sekretaseaktivität von mutiertem ADAM10 ohne Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle durch PC7 nicht mehr erhöht werden kann. ERGEBNISSE __________________________________________________________________ Abbildung 5.18 Darstellung der APPsα α-Sekretion von PC7- oder Furin-überexprimierenden Zellen in der Western-Blot-Analyse (A) und im Balkendiagramm (B). A, Die stabil transfizierten Zellen wurden für 4 h in Zellkulturmedium inkubiert, das anstelle des FCS fettsäurefreies BSA enthielt. In diesem Zeitraum erfolgte die Sekretion der Zellproteine, die anschließend aus dem Zellkulturüberstand gefällt und in einem 8% (w/v) SDSPolyacrylamidgel aufgetrennt wurden. Nach dem Transfer auf eine PVDF-Membran und der 35 Inkubation mit dem anti-APP Antikörper 6E10 gefolgt von einem S-markierten anti-Maus IgG-Antikörper wurde die Radioaktivität der Membran mit einer Autoradiographieplatte aufgenommen. Die Detektion der radioaktiv-markierten Proteinbanden erfolgte mit dem BioImaging Analyzer BAS-1800 (Fuji), der die quantitative Auswertung der Signale mit dem Programm Aida Version 2.0 ermöglichte. Dargestellt ist ein repräsentativer Western-Blot aus drei unabhängigen Experimenten. B, Balkendiagramm zur Darstellung der quantitativen Auswertung der APPsα-Sekretion. Die APPsα-Sekretion von HEK293-Zellen ist mit 100% festgelegt, die Ergebnisse sind als Prozentsatz der APPsα-Sekretion dieser Kontrollzellen dargestellt. Alle Werte entsprechen dem arithmetischen Mittel aus drei unabhängigen Experimenten und sind mit der jeweiligen Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz zwischen HEK293-Kontrollzellen und HEK293-PC7-Zellen, zwischen HEK293ADAM10- und HEK293-ADAM10-PC7-Zellen und zwischen HEK293-ADAM10∆RKKR- und HEK293-ADAM10∆RKKR-PC7-Zellen wurde mit dem „Student’s unpaired t test“ ermittelt (∗P < 0,05, ∗∗P < 0,001). 89 ERGEBNISSE 90 5.2.5 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 im sekretorischen Weg Asparagin-gekoppelte Glykoproteine werden im endoplasmatischen Retikulum gebildet und im Golgi-Apparat weiter prozessiert. Die Modifikation der Kohlenhydrateinheiten findet in jedem der Kompartimente des Golgi-Apparats statt, die jeweils einen anderen Satz von Glykoprotein-prozessierenden Enzymen enthalten. Während ein Glykoprotein den GolgiKomplex vom cis- über das mediale- zum trans-Kompartiment durchwandert, werden Mannose-Reste abgespaltet, N-Ace-tylglucosamin-, Galactose-, Fucose- und SialinsäureReste angefügt. Durch das Anfügen der Sialinsäure-Reste im trans-Golgi-Apparat wird die terminale Glykosylierung abgeschlossen. Sowohl mannosereiche als auch komplex-glykosylierte Proteine sind sensitiv gegen den Abbau durch die N-Glykosidase F. Dagegen spaltet die Endoglykosidase H (Endo H) vorwiegend an mannosereichen N-Glycanen. Diese werden jedoch nach dem Anfügen der Sialinsäure im trans-Golgi-Kompartiment resistent gegen den Abbau durch Endo H. Glykoproteine, die von der Endoglykosidase H nicht deglykosyliert werden, haben somit das mediale-Golgi-Kompartiment bereits durchlaufen und sind im trans-Golgi- Kompartiment sialylisiert worden. Der Ort der Prodomänen-Abspaltung von ADAM10 kann daher durch Deglykosylierungen mit diesen beiden Enzymen näher bestimmt werden. Die Versuche zur Deglykosylierung von ADAM10 wurden zunächst an den Lysaten von HEK293-ADAM10-Zellen (Klon D3) einer fast konfluenten 10-cm-Kulturschale durchgeführt, die mit 40 µl 1% (w/v) SDS/2% (v/v) Mercaptoethanol bei 95°C im Heizblock denaturiert und dann für die Deglykosylierungsreaktion auf 0,1% (v/v) SDS verdünnt wurden. Mit Hilfe der jeweiligen Puffer für die N-Glykosidase F und die Endoglykosidase H (siehe 3.3), die zur Deglykosylierung von ADAM10 eingesetzt wurden, konnten die optimalen Reaktionsbedingungen für beide Enzyme sichergestellt werden. Die Reaktion verlief in einem Gesamtvolumen von 100 µl über Nacht bei 37°C im Wasserbad mit 5 U der N-Glykosidase F oder 10 mU der Endoglykosidase H. 30 µl jedes Ansatzes wurden am nächsten Tag mit 5 µl 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und in einem 8% (w/v) Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf eine PVDF-Membran erfolgte der immunologische Nachweis von ADAM10 mit dem anti-HA Antikörper Y-11. Aufgrund der geringen Menge des in den Ansätzen vorhandenen ADAM10 waren auf dem Western-Blot nur sehr schwache Banden zu erkennen, die im Vergleich zu den Banden der als Kontrolle dienenden, unbehandelten Lysate keine Veränderungen im Molekulargewicht aufwiesen. Die Deglykosylierung fand vermutlich aufgrund der hohen SDS-Konzentration und der hohen Gesamtproteinmenge in den Proben nicht statt. Die Konzentration an SDS stellt bei der Deglykosylierung von Proteinen ein Problem dar, da dieses Detergens einerseits notwendig ist, um die Proteine der Proben zu denaturieren und so einen effektiven Reaktionsverlauf zu gewährleisten, andererseits besteht die Gefahr, dass die ERGEBNISSE 91 zur Deglykosylierung eingesetzten Enzyme ebenfalls denaturiert werden. Die zur Denaturierung der Proteinprobe eingestellte SDS-Konzentration von 1% (w/v) muss daher soweit verdünnt werden, dass die Aktivität der Enzyme nicht gefährdet wird, jedoch muss für den immunologischen Nachweis eine ausreichende Menge des zu untersuchenden Proteins im Ansatz vorhanden sein. Zusätzlich kann die Deglykosylierung des zu untersuchenden Proteins durch eine hohe Gesamtproteinmenge beeinträchtigt werden. Für den folgenden Versuch wurde ADAM10 daher durch eine Immunpräzipitation aus HEK293-ADAM10-Zellen präpariert. Das an die Protein A-Sepharose gebundene Enzym konnte mit 40 µl 1% (w/v) SDS/ 2% (v/v) Mercaptoethanol bei 95°C im Heizblock eluiert und dabei gleichzeitig denaturiert werden. Die Deglykosylierungsreaktion erfolgte mit den auf 0,02% (w/v) SDS verdünnten Proben in einem Gesamtvolumen von 100 µl über Nacht bei 37°C in der Anwesenheit von 5 U der N-Glykosidase F oder 10 mU der Endoglykosidase H. Am darauffolgenden Tag wurden 30 µl jedes Ansatzes mit 5 µl 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und durch eine Gelelektrophorese aufgetrennt. Da nur geringfügige Änderungen im Molekulargewicht zu erwarten waren, die in einem 8% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel nur unzureichend aufgelöst werden können, erfolgte die Gelelektrophorese mit einem NuPAGE (4-12%) Gradientengel. Auch hier waren nach der Western-Blot-Analyse nur relativ schwache Banden der prozessierten und unprozessierten Form von ADAM10 detektierbar, was darin begründet war, dass die Proben verdünnt werden mussten und außerdem nicht vollständig auf das Gel aufgetragen wurden. Zwar wiesen hier die Banden des unreifen Enzyms sowohl in den NGlykosidase F- als auch in den Endoglykosidase H-behandelten Proben erniedrigte Molekulargewichte auf, jedoch schien dies durch das ungewöhnliche Laufverhalten der Deglykosylierungsansätze verursacht worden zu sein. So war die Erniedrigung der Molekulargewichte in der Mitte des Gels am stärksten ausgeprägt und beschränkte sich ausnahmslos auf die Banden der unprozessierten Form. Dagegen konnte bei den Banden des prozessierten Proteins weder bei den N-Glykosidase F- noch bei den Endoglykosidase H-behandelten Proben eine Veränderung des Molekulargewichts im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt werden. Um ausschließen zu können, dass die fehlgeschlagenen Deglykosylierungs-Versuche auf störende Substanzen aus dem bei der Immunpräzipitation verwendeten ImidazolLysispuffer zurückzuführen sind, erfolgte zum Erlangen der Proteinprobe für die nachfolgenden Deglykosylierungen eine Membranpräparation von HEK293-ADAM10Zellen. Die nach der Deglykosylierungsreaktion durchgeführte Chloroform-MethanolFällung diente zur Aufkonzentrierung der Proteinproben und zur Abtrennung der Deglykosylierungspuffer, deren Bestandteile - zum Beispiel das Detergens Nonidet-P40 - ERGEBNISSE 92 bei der anschließenden Gelelektrophorese stören könnten. Das Ergebnis der WesternBlot-Analyse dieser Ansätze ist in Abbildung 5.19 dargestellt. kDa le ol r t l G on K N i os k y se a d F gl o d En si o yk se da H 97 64 51 39 28 19 __________________________________________________________________ Abbildung 5.19 Western-Blot-Analyse der Deglykosylierungsansätze von ADAM10. Die aufkonzentrierten Proteine der Deglykosylierungsansätze wurden in einem NuPAGE (4-12%) Gradientengel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran überführt. Nach der Inkubation mit dem anti-HA Antikörper Y-11 erfolgte der Nachweis des Primärantikörpers durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatasegekoppelten anti-Kaninchen IgG-Antikörpers und des Western-Star Detektionssystems von Tropix. In der Membranproteinprobe, die mit der N-Glykosidase F behandelt wurde, ist eine Erniedrigung der Molekulargewichte im Vergleich zur Kontrolle, sowohl von der unprozessierten als auch der prozessierten Form von ADAM10, zu verzeichnen. Die Probe des Endoglykosidase H-behandelten Ansatzes weist eine deutliche Molekulargewichtsänderung der unprozessierten Form auf, die mit der Änderung in der N-Glykosidase F-behandelten Probe übereinstimmt. Dagegen ist bei der Bande der prozessierten Form nur eine unwesentliche Verringerung des Molekulargewichts erkennbar. Die Abnahme der Molekulargewichte in dem N-Glykosidase F-behandelten Ansatz ist auf die enzymatische Entfernung der Oligosaccharide durch die N-Glykosidase F zurückzuführen. Diese Glykosidase spaltet sowohl mannosereiche als auch komplex-glykosylierte Proteine und entfernt daher die N-Glycane der reifen und der unreifen Form von ADAM10, was mit einer Verringerung der Molekulargewichte verbunden ist. Dagegen spaltet die ERGEBNISSE 93 Endoglykosidase H vorwiegend an mannosereichen Kohlenhydrat-Seiten-ketten, die nach dem Anfügen der Sialinsäure im trans-Golgi-Kompartiment resistent gegen den Abbau durch Endo H werden. Das nur unwesentlich erniedrigte Molekulargewicht der prozessierten Form von ADAM10 deutet darauf hin, dass keine Deglykosylierung durch Endo H erfolgt ist. Die reife Form von ADAM10 hat somit das mediale-GolgiKompartiment bereits durchlaufen und ist im trans-Golgi-Kompartiment sialylisiert worden. Die Ergebnisse der Deglykosylierungsexperimente favorisieren somit eine ProdomänenAbspaltung im trans-Golgi-Apparat oder einem späteren Kompartiment und schließen eine Prozessierung im cis- und medialen-Golgi-Kompartiment aus. ERGEBNISSE 94 5.3 Proteolytische Prozessierung von TACE Die Disintegrin-Metalloproteinase TACE wird ebenfalls als inaktives Zymogen synthetisiert. Erst durch die Entfernung der Prodomäne wird die katalytisch aktive Form der Proteinase erhalten. Die dafür notwendige proteolytische Abspaltung der Domäne findet innerhalb des sekretorischen Wegs in einem späten Golgi-Kompartiment statt. Dies und das Vorhandensein einer potentiellen Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz (RVKR) zwischen der Prodomäne und der katalytischen Domäne deuten auf eine Beteiligung von Proprotein-Konvertasen bei diesem Vorgang hin. Daher sollte untersucht werden, ob Proprotein-Konvertasen durch die Prozessierung von TACE einen Beitrag zur Entfaltung der proteolytischen Eigenschaften leisten. 5.3.1 Die Auswirkung der Inhibierung von Proprotein-Konvertasen auf die Prozessierung von TACE Mit Hilfe des Proprotein-Konvertasen-Inhibitors Dec-RVKR-cmk sollte die Bedeutung dieser Proteine bei der proteolytischen Entfernung der Prodomäne von TACE aufgeklärt werden. Bei einer Beteiligung von Mitgliedern dieser Konvertasen-Familie an der proteolytischen Aktivierung des TACE-Zymogens sollte dieser Inhibitor die Erzeugung des reifen Enzyms signifikant unterdrücken. Zur Untersuchung des Einflusses von Dec-RVKR-cmk auf die TACE-Prozessierung wurden, wie bei der Untersuchung der Auswirkung von Dec-RVKR-cmk auf die Prozessierung von ADAM10, untransfizierte HEK293-Zellen für 48 h mit dem Inhibitor behandelt. Anschließend wurden die Zell-Lysate mit dem Western-Blot-Verfahren analysiert. Der immunologische Nachweis von TACE erfolgte mit dem Antikörper antiTACE gegen das in den HEK293-Zellen vorhandene endogene Enzym. Hierbei wird das unprozessierte Zymogen mit einem Molekulargewicht von etwa 120 kDa sowie das prozessierte und katalytisch aktive Enzym ohne Prodomäne mit einem Molekulargewicht von etwa 100 kDa sichtbar (Abbildung 5.20). Die Zell-Lysate von Zellen die mit dem Proprotein-Konvertasen-Inhibitor inkubiert wurden, weisen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen deutlich verringerte Mengen an prozessiertem TACE auf. Dies stimmt mit der erwarteten Inhibitorwirkung bei einer Beteiligung von Proprotein-Konvertasen an der TACE-Prozessierung überein und belegt damit, dass diesen Konvertasen bei der Entfernung der Prodomäne von TACE eine wesentliche Bedeutung zukommt. ERGEBNISSE 95 HEK293 Pro-TACE 98 kDa TACE Inhibitor - + __________________________________________________________________ Abbildung 5.20 Einfluss des Proprotein-Konvertasen-Inhibitors Decanoyl-RVKR-chloromethylketon auf die proteolytische Prozessierung von endogenem TACE in HEK293-Zellen. Die Auftrennung der Zell-Lysate erfolgte in einem 8% (w/v) SDSPolyacrylamidgel. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran und der Inkubation mit dem Antikörper anti-TACE erfolgte der Nachweis der Primärantikörper durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen Antikörpers und des Western-Star Detektionssystems. 5.3.2 Proteolytische Prozessierung von TACE durch PC7 und Furin Als katalytisch aktives Mitglied der Disintegrin-Metalloproteinasen besitzt TACE, wie auch ADAM10, eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz. Da die Aktivierung der α-Sekretase ADAM10 durch die Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin erfolgt und TACE ebenfalls eine α-Sekretaseaktivität besitzt, sollte untersucht werden, ob die Überführung des TACE-Zymogens in die katalytisch aktive Form auch durch diese beiden Konvertasen vermittelt wird. Zu diesem Zweck sollte die Auswirkung der Überexpression von PC7 und Furin auf die Entfernung der Prodomäne von endogenem TACE aufgeklärt werden. Unter Verwendung der Calciumphosphat-vermittelten Transfektion mit den Plasmiden pIRES1hyg-PC7 oder pIRES1hyg-Furin wurden die cDNAs von PC7 oder Furin in HEK293-Zellen zur Expression gebracht. Durch eine Selektion mit Hygromycin B als Zusatz im Zellkulturmedium konnte die stabile Expression dieser Proprotein-Konvertasen erreicht werden. Die resultierenden Zell-Linien erhielten die Bezeichnungen HEK293-PC7 und HEK293-Furin. Die Western-Blot-Analyse der Zell-Lysate zeigt nach der Detektion des endogenen TACE mit dem Antikörper anti-TACE die spezifischen Banden der unreifen 120 kDa-Form und der reifen 100 kDa-Form des Proteins (Abbildung 5.21 A). Zur Ermittlung der Effekte der Konvertasenüberexpression erfolgte eine densitometrische Auswertung der Proteinbanden. In Abbildung 5.21 B ist das Ergebnis dieser Quantifizierung in Form eines Balkendiagramms dargestellt. Hieraus geht hervor, dass erhöhte Mengen der prozessierten Form von TACE sowohl in den PC7- als auch in den Furin-überexprimierenden HEK293- ERGEBNISSE 96 Zellen vorzufinden sind. TACE wird demnach sowohl von PC7 als auch von Furin prozessiert, wobei HEK293-Furin-Zellen größere Mengen des reifen Enzyms aufweisen, H 93 29 3- 2 EK HE K A 7 PC 93 2 K HE Fu rin als HEK-PC7-Zellen. Pro-TACE 98 kDa TACE B Verhältnis von reifem TACE zur Pro-Form [%] 300 250 200 150 100 50 0 HEK293pIRES HEK293PC7 HEK293Furin __________________________________________________________________ Abbildung 5.21 Proteolytische Prozessierung von endogenem TACE in PC7- oder Furin-überexprimierenden HEK293-Zellen. A, Western-Blot-Analyse der Zell-Lysate. Nach dem Auftrennen in einem 8% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel und dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran erfolgte der immunologische Nachweis des endogenen TACE mit dem anti-TACE Antikörper. Der Nachweis des Primärantikörpers erfolgte mit einem alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper und dem WesternStar Detektionssystem von Tropix. B, Balkendiagramm zur quantitativen Auswertung der TACE-Prozessierung. Die Werte wurden durch die densitometrische Analyse der Proteinbanden des Western-Blots unter Verwendung der Software Aida 2.0 erhalten. Unprozessiertes TACE ist in jeder Zell-Linie auf 100% festgelegt. Die prozessierte Form von TACE ist jeweils als Verhältnis zur unprozessierten Form in Prozent angegeben. Alle Werte entsprechen dem arithmetischen Mittel aus drei unabhängigen Experimenten und sind mit der jeweiligen Standardabweichug dargestellt. ERGEBNISSE 97 5.3.3 Proteolytische Prozessierung von TACE in der Abwesenheit von Furin Aufgrund der größeren Mengen an prozessiertem TACE in HEK293-Furin-Zellen im Vergleich zu HEK293-PC7-Zellen ist es vorstellbar, dass Furin bei der Aktivierung von TACE eine größere Bedeutung zukommt als PC7. Da die Zell-Linie LoVo kein katalytisch aktives Furin exprimiert, ermöglicht sie die Untersuchung der TACE-Prozessierung in dessen Abwesenheit. Zu diesem Zweck wurden die Zell-Lysate von LoVo-Zellen einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Der immunologische Nachweis des endogenen TACE erfolgte dabei mit Hilfe des Antikörpers anti-TACE. Der in Abbildung 5.22 gezeigte Western-Blot lässt sowohl die unreife als auch die reife Form von TACE erkennen, was bedeutet, dass die Prodomäne von TACE trotz der FurinDefizienz proteolytisch entfernt wird. Da TACE demzufolge auch ohne das Mitwirken von Furin prozessiert wird, ist die Anwesenheit von Furin bei der Reifung von TACE nicht unbedingt erforderlich. Die Prozessierung von TACE wird in LoVo-Zellen daher vermutlich durch die Proprotein-Konvertase PC7 ausgeführt. Da in diesen Zellen jedoch auch die Proprotein-Konvertase PACE4 zugegen ist, könnte auch sie zur Reifung von TACE beitragen. LoVo Pro-TACE TACE 98 kDa __________________________________________________________________ Abbildung 5.22 Western-Blot-Analyse des endogenen TACE in LoVo-Zellen. Die Auftrennung des Zell-Lysats erfolgte in einem 8% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran und der Inkubation mit dem Antikörper antiTACE erfolgte der Nachweis des Primärantikörpers durch Chemilumineszenz mit Hilfe eines alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG-Antikörpers und des Western-Star Detektionssystems. DISKUSSION 99 6 DISKUSSION 6.1 Entwicklung eines Verfahrens zur Reihenuntersuchung α-Sekretase-stimulierender Substanzen Die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins unterliegt im Verlauf des nichtamyloidogenen α-Sekretase-Wegs einer Regulation durch Aktivatoren der Proteinkinase C-gekoppelten Signalkaskade (Caporaso et al., 1992, Buxbaum et al., 1993). Daneben lässt sich die APPsα-Freisetzung durch Agonisten muskarinischer Acetylcholinrezeptoren, wie beispielsweise Carbachol, erhöhen (Nitsch et al., 1992). Durch die Stimulierung der α-Sekretase ADAM10 könnte somit ein Ungleichgewicht zwischen der αund der β-Sekretase zu Gunsten der nicht-amyloidogenen Prozessierung des AmyloidVorläuferproteins erreicht werden. Eine Reihe von Befunden deuten auf einen Zusammenhang zwischen dem Cholesteringehalt der Zellmembranen von Neuronen und der Alzheimer-Krankheit hin (Dartigues und Letenneur, 2000). So wird infolge einer Cholesterin-Abreicherung aus der Zellmembran von Neuronen des Hippocampus die Entstehung der Aβ-Peptide reduziert (Simons et al., 1998). Auch die Behandlung von Zellen mit Lovastatin, einem Inhibitor der Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase, resultiert höchstwahrscheinlich infolge einer erhöhten ADAM10-Expression in einer verstärkten α-Sekretaseaktivität (Kojro et al., 2001). Eine übermäßige Produktion der AβPeptide ließe sich auf diesem Weg vermeiden. Substanzen, die aktivierend auf die αSekretase ADAM10 wirken, könnten somit zu der Entwicklung von Pharmazeutika zur Behandlung der Alzheimer-Demenz beitragen. Das hier entwickelte Testsystem zum Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen beruht auf der Fusion der 119 C-terminalen Aminosäuren des Amyloid-Vorläuferproteins mit der als Reporterprotein fungierenden sekretierten alkalischen Phosphatase (SEAP) aus der menschlichen Plazenta. Dieses Fusionsprotein deckt den C-terminalen Bereich des APP einschließlich der Transmembrandomäne und der Sequenz des Aβ-Peptids ab. Durch die Koexpression dieses Reporterproteins zusammen mit der α-Sekretase ADAM10, ist es mit diesem Testverfahren daher möglich, ADAM10-stimulierende Substanzen schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit zu ermitteln. DISKUSSION 100 6.1.1 Etablierung und Optimierung des Testsystems Das Reporterprotein wird nach der stabilen Transfektion von HEK293-Zellen exprimiert und durch eine α-Sekretase-Spaltung in das Zellkulturmedium sezerniert. Die sekretierte alkalische Phosphatase ist als Bestandteil des SEAPs/APP119-Fusionsproteins katalytisch aktiv, wobei ein linearer Zusammenhang zwischen der enzymatischen Reaktion und der Menge der alkalischen Phosphatase, die als Komponente des Reporterproteins in den Zellkulturüberstand freigesetzt wurde, besteht. Ein linearer Zusammenhang ist hier unbedingt erforderlich, um Auswirkungen auf die α-Sekretase-Spaltung exakt quantifizieren zu können. Daneben besteht ebenfalls ein linearer Zusammenhang zwischen der Anzahl der eingesetzten Zellen und der enzymatischen Reaktion des Fusionsproteins im Zellkulturüberstand. Die Aussaat von 500 000 Zellen auf 6-cmKulturschalen erwies sich bei der Etablierung des Tests als optimal. Die Zellen wurden über Nacht kultiviert und waren am nächsten Tag nahezu konfluent, so dass eine hohe Empfindlichkeit und eine gute Reproduzierbarkeit der Experimente gegeben war. Die Überprüfung der enzymatischen Reaktion der alkalischen Phosphatase bei verschiedenen pH-Werten ergab ein Aktivitätsmaximum bei pH10. Da die alkalische Phosphatase bereits bei pH8 eine sehr hohe Aktivität bei einem merklich geringeren Hintergrund durch endogene alkalische Phosphatasen als bei pH10 aufweist, wurden alle weiteren Messungen bei pH8 durchgeführt. Im weiteren Verlauf der Testoptimierung konnte jedoch die endogene alkalische Phosphataseaktivität durch eine Hitzeinaktivierung fast vollständig gehemmt werden, ohne die Aktivität der sekretierten alkalischen Phosphatase des Fusionsproteins merklich zu beeinträchtigen. Hierdurch konnte die Hintergrundaktivität erheblich reduziert werden. Unter diesen Bedingungen kann die Durchführung der Enzymreaktion bei pH10 die Empfindlichkeit des Tests voraussichtlich weiter heraufsetzen. Die Freisetzung des SEAPs/APP119-Fusionsproteins erfolgt konstitutiv und kann durch die Stimulierung muskarinischer Rezeptoren mit Carbachol oder durch die Aktivierung der Proteinkinase C mit PMA erhöht werden. In gleicher Weise erfolgt die Freisetzung des endogenen Amyloid-Vorläuferproteins von der Zellmembran. Daher eignet sich das erzeugte Reporterprotein zur Analyse unbekannter Substanzen auf ihre Fähigkeit, die Sekretion des Amyloid-Vorläuferproteins zu stimulieren. Mit diesem Verfahren kann jedoch nicht unterschieden werden, ob das nachgewiesene SEAPs/APP119 durch eine αoder β-Sekretase-Spaltung ins Zellkulturmedium freigesetzt worden ist. Im Fall einer stimulierten Sekretion durch eine getestete Substanz muss die α-Sekretase-Spaltung des Reporterproteins aus diesem Grund anschließend durch andere Methoden verifiziert werden. Da jedoch bei der Verwendung von Reporterproteinen die erhaltenen Befunde DISKUSSION 101 ohnehin am endogenen Protein überprüft werden müssen, stellt dieser Aspekt keinen Nachteil des Testsystems dar. Eine andere Möglichkeit zur Verifizierung der α-Sekretase-Spaltung stellt die Mutagenese der β-Sekretase-Spaltstelle des Reporterproteins dar. Durch das Einfügen einer Punktmutation an der β-Sekretase-Spaltstelle (KMDA in KVDA) könnte die Prozessierung des Fusionsproteins durch die β-Sekretase fast vollständig unterdrückt werden (Vassar et al., 1999). Bei der Analyse der Zellkulturüberstände wäre durch die Messung der Absorption des umgesetzten Substrats nur noch das α-Sekretase-gespaltene Reporterprotein nachweisbar. Andererseits könnten mit einer solchen Mutante eventuell vorhandene Auswirkungen auf die β-Sekretase-Spaltung nicht mehr erfasst werden. 6.2 Proteolytische Prozessierung von ADAM10 Das Amyloid-Vorläuferprotein durchläuft nach seiner Synthese den sekretorischen Weg zur Zelloberfläche, wobei es durch die α-, β- und γ-Sekretasen prozessiert werden kann (Reiner und Mills, 1999, Nunan und Small, 2000). Der größte Teil der neurotoxischen AβPeptide wird im trans-Golgi-Netzwerk generiert (Xu et al., 1997), das somit einen elementaren Ort der β-Sekretaseaktivität darstellt. Daneben wird APP im Verlauf des nicht-amyloidogenen Wegs innerhalb der Aβ-Sequenz durch die α-Sekretase prozessiert (Esch et al., 1990), wobei die Aβ-Bildung verhindert wird (Nitsch und Growdon, 1994, Checler, 1995). Die Aktivität der α-Sekretase besitzt sowohl eine konstitutive als auch eine regulierte Komponente. Durch die Untersuchung der zellulären Lokalisierung der α-Sekretaseaktivität konnte eine räumliche Trennung der beiden Komponenten entdeckt werden. So findet die konstitutive α-Sekretase-Spaltung an der Zelloberfläche statt (Parvathy et al., 1999), während die regulierte im trans-Golgi Netzwerk erfolgt (Skovronsky et al., 2000). Enzyme die innerhalb des trans-Golgi-Apparats lokalisiert sind besitzen somit eine entscheidende Bedeutung für die Prozessierung des AmyloidVorläuferproteins. In diesem Zusammenhang wurden die Mitglieder der ProproteinKonvertasen-Familie als mögliche Kandidaten für die APP-Prozessierung in Betracht gezogen, da viele von ihnen im sekretorischen Weg, insbesondere in den Kompartimenten des Golgi-Apparats, an der Spaltung von Vorläuferproteinen beteiligt sind (DeStrooper et al., 1995, Lopez-Perez et al., 1999). Nach der transienten Überexpression der Proprotein-Konvertasen Furin, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4 und PC5/PC6 in PK-Zellen konnte jedoch kein Effekt auf die APPsαProduktion festgestellt werden (DeStrooper et al., 1995). Demgegenüber konnte nach der DISKUSSION 102 stabilen Überexpression von PC7 in HEK293-Zellen ein Beitrag dieser ProproteinKonvertase am konstitutiven α-Sekretase-Weg entdeckt werden. Infolge der Überexpression wurde die APPsα-Sekretion erhöht und gleichzeitig wurde die Bildung von Aβ40 und Aβ42 verringert (Lopez-Perez et al., 1999). Durch die Inhibierung mit dem überexprimierten Proprotein-Konvertasen-Inhibitor α1-PDX (Anderson et al., 1993, Benjannet et al., 1997, Jean et al., 1998) konnten beide Effekte umgekehrt werden (Lopez-Perez et al., 1999). Eine direkte Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins durch PC7 wurde jedoch nicht untersucht und daher ist eine α-Sekretaseaktivität von PC7 nicht erwiesen. Aufgrund der fehlenden Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz an der α-Sekretase-Spaltstelle ist eine direkte Prozessierung von APP durch PC7 sehr unwahrscheinlich. Da auch keine Untersuchungen zur Prozessierung der α-Sekretasen ADAM10 und TACE durch PC7 durchgeführt wurden, blieb der Zusammenhang zwischen der Überexpression von PC7 und der erhöhten APPsα-Sekretion unklar. Dennoch wurde die Proprotein-Konvertase PC7 als mögliche α-Sekretase in Betracht gezogen (LopezPerez et al., 1999, 2001, Nunan und Small, 2000). Die Disintegrin-Metalloproteinase ADAM10 besitzt sowohl eine konstitutive als auch eine regulierte α-Sekretaseaktivität und eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz zwischen der Prodomäne und der katalytischen Domäne (Lammich et al., 1999). Dass die Abspaltung der Prodomäne an dieser Sequenz erfolgt, konnte durch eine N-terminale Sequenzierung von aus Rindernieren gereinigtem ADAM10 bestätigt werden. Um die Bedeutung von Proprotein-Konvertasen bei der α-Sekretase-Spaltung des AmyloidVorläuferproteins aufzuklären wurde die Möglichkeit, dass PC7 und Furin als proADAM10-prozessierende und damit als pro-α-Sekretase-aktivierende Konvertasen fungieren, untersucht. Zunächst konnte mit Hilfe des synthetischen Inhibitors Decanoyl-RVKR-chloromethylketon gezeigt werden, dass Proprotein-Konvertasen an der Prozessierung des ADAM10Zymogens beteiligt sind. Dieser Inhibitor ist in der Lage, Proprotein-Konvertasen in Zellkulturen selektiv zu hemmen (Garten et al., 1989). Durch die Inkubation von HEK293Zellen mit diesem Inhibitor konnte dessen Auswirkung auf die Prozessierung von ADAM10 ermittelt werden. Hierbei zeigte sich, dass endogenes ADAM10 in unbehandelten HEK293-Zellen überwiegend in der prozessierten Form vorliegt und dass, infolge der Inhibierung der Proprotein-Konvertasen, die proteolytische Prozessierung von ADAM10 deutlich verringert wird, was ein Mitwirken von Proprotein-Konvertasen bei der Entfernung der Prodomäne von ADAM10 bestätigt. Um die Sequenzanforderungen bei der Entfernung der Prodomäne zu ermitteln, wurde die Aminosäuresequenz der mutmaßlichen Spaltstelle (RKKR) infolge einer Mutagenese durch die Sequenz NAQA substituiert. Da Proprotein-Konvertasen an Sequenzen des DISKUSSION 103 Typs R X (R/K) R spalten (Steiner et al., 1998) ist nach der Mutation dieser Sequenz eine Spaltung durch Proprotein-Konvertasen, insbesondere durch PC7 und Furin, nicht mehr möglich (van de Loo et al., 1997, Munzer et al., 1997). Bei einer Beteiligung von Proprotein-Konvertasen an der ADAM10-Spaltung kann eine Überführung des ADAM10∆RKKR-Zymogens in die reife Form somit nicht mehr stattfinden. Die Bedeutung der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin bei der ADAM10Prozessierung konnte durch deren Überexpression in HEK293-Zellen aufgeklärt werden. Hierfür wurde der pIRES1hyg-Vektor verwendet. Dieser eukaryontische Expressionsvektor ist so beschaffen, dass bei der Transkription sowohl das einklonierte Gen als auch das Hygromycin B-Resistenzgen auf eine mRNA übertragen werden. Die enthaltene interne Ribosomen-Eintrittstelle zwischen den beiden Genen ermöglicht schließlich die Translation beider Gene dieser mRNA. Nach Selektion mit Hygromycin B exprimieren daher nahezu alle überlebenden Zellen das einklonierte Gen stabil. Durch die Verwendung dieses Expressionsvektors konnte daher eine deutliche Überexpression der untersuchten Proprotein-Konvertasen in den stabil transfizierten HEK293- und HEK293ADAM10-Zellen erreicht und damit eine merkliche Auswirkung auf die Proteolyse ihrer Substratproteine sichergestellt werden. Die Ergebnisse der Überexpression von PC7 und Furin in HEK293- und HEK293ADAM10-Zellen belegen eindeutig, dass sowohl PC7 als auch Furin an der ADAM10Reifung mitwirken, indem sie die Prodomäne an der vorhergesagten ProproteinKonvertasen-Spaltstelle proteolytisch entfernen und so zur Entfaltung der katalytischen Aktivität von ADAM10 beitragen. Durch die Überexpression von PC7, beziehungsweise Furin, wird ADAM10 in einem größeren Umfang prozessiert, so dass mehr reifes ADAM10 entsteht, welches wiederum größere Mengen des neuroprotektiven APPsα von der Zellmembran freisetzt. Im Gegensatz dazu ist die Reifung von mutiertem ADAM10 ohne Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle vollständig blockiert. Dies bestätigt zum Einen, dass diese Spaltstelle für die Reifung absolut notwendig ist, zum Anderen, dass ProproteinKonvertasen bei der Reifung von ADAM10 eine wesentliche Bedeutung zukommt und schließlich, dass eine blockierte Reifung mit einer verringerten α-Sekretaseaktivität verbunden ist. Da die α-Sekretaseaktivität in den HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen höher war als in untransfizierten HEK293-Zellen, aber niedriger als in HEK293-ADAM10-Zellen, ist die Beseitigung der Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle offenbar nicht ausreichend, um die α-Sekretaseaktivität von überexprimiertem ADAM10∆RKKR vollständig zu hemmen. Die Aktivierung von ADAM10 wird, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, durch die Abspaltung der Prodomäne erreicht. Nach Dissoziation der Prodomäne von der reifen Proteinase wird das katalytische Zentrum für Substrate zugänglich. Im Fall der ADAM10∆RKKR-Mutante scheint ADAM10 an anderen, in der Prodomäne vorhandenen, 104 DISKUSSION Spaltstellen prozessiert zu werden, was die im Western-Blot sichtbaren verkürzten Formen von ADAM10∆RKKR belegen. Diese verkürzten Formen besitzen ein etwas höheres Molekulargewicht als die reife Wildtyp-Proteinase und es ist wahrscheinlich, dass die teilweise vorhandene α-Sekretaseaktivität dieser ADAM10-Mutante auf diese verkürzten Formen zurückzuführen ist. In HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen führt überexprimiertes PC7 nicht zu einer erhöhten Prozessierung des ADAM10-Zymogens und damit auch nicht zu einer größeren Menge an katalytisch aktivem Enzym. Damit übereinstimmend ist die α-Sekretaseaktivität in diesen Zellen, verglichen mit den Zellen, die die Wildtyp-Proteinase exprimieren, nur unwesentlich erhöht. Da diese Erhöhung der APPsα-Freisetzung in der gleichen Größenordnung liegt wie die APPsα-Freisetzung in HEK-PC7-Zellen, ist sie sehr wahrscheinlich auf das in den ADAM10∆RKKR-Zellen vorhandene, endogene ADAM10 zurückzuführen. Weiterhin zeigt dieses Experiment, dass die Überexpression von PC7 nicht zu einem verstärkten Auftreten der verkürzten Formen von ADAM10∆RKKR führt. Dies legt nahe, dass diese verkürzten Formen nicht durch Proprotein-Konvertasen erzeugt werden. Aufgrund der Aminosäuresequenz an der α-Sekretase-Spaltstelle (-6E -5V -4H -3H -2Q -1K ↓) ist eine direkte Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins durch PC7 oder Furin sehr unwahrscheinlich, da es weder an noch in der Nähe der α-Sekretase-Spaltstelle eine entsprechende Erkennungssequenz aufweist. Zwar ist an der Spaltstelle ein Lysin in der Position -1 vorhanden, doch weder in Position -4 noch in Position -6 ist ein Arginin oder Lysin vorhanden. Dies wäre jedoch erforderlich, da die in den Positionen -3 und -4 auftretenden Histidin-Reste das fehlende Arginin nicht ersetzen können (van de Loo et al., 1997 und Munzer et al., 1997). Vorläuferproteine, denen genau wie dem AmyloidVorläuferprotein ein basischer Rest in Position -2 fehlt, können zwar von Furin gespalten werden, allerdings mit einer etwa zehnfach geringeren Effizienz und nur dann, wenn auch ein Arginin in Position -4 vorhanden ist, was beim APP nicht der Fall ist. Ferner kann eine Spaltung von Substraten, die wie das APP ein Lysin in Position -1 besitzen, nur dann durch Furin erfolgen, wenn gleichzeitig ein basischer Rest in Position -2 vorhanden ist. Dieser fehlt jedoch im Motiv der α-Sekretase-Spaltstelle des Amyloid-Vorläuferproteins. Eine Spaltung durch PC7 kann somit ebenfalls ausgeschlossen werden, da PC7 nicht in der Lage ist, an monobasischen Resten zu spalten. Darüber hinaus benötigt PC7 unbedingt ein Arginin in Position -1, das selbst von Lysin nicht ersetzt werden kann. Die Sequenz der α-Sekretase-Spaltstelle im Amyloid-Vorläuferprotein stellt somit weder für PC7 noch für Furin eine Erkennungssequenz beziehungsweise Spaltstelle dar. Demgegenüber wird die α-Sekretase ADAM10 als Zymogen mit einer ProproteinKonvertasen-Erkennungssequenz zwischen der Prodomäne und katalytischen Domäne DISKUSSION 105 synthetisiert. Außerdem weisen HEK293-ADAM10-PC7-Zellen infolge der Überexpression von PC7 deutlich erhöhte Mengen der reifen, katalytisch aktiven Form von ADAM10 auf und sekretieren als Konsequenz davon erhöhte Mengen an APPsα. Bei HEK293-Zellen, die nur das endogene ADAM10 besitzen, jedoch vergleichbare Mengen an PC7 überexprimieren, ist die APPsα-Sekretion demzufolge weniger stark erhöht, als in HEK293-ADAM10-PC7-Zellen. Daneben ist die Überführung des ADAM10-Zymogens in die reife Form in HEK293-ADAM10∆RKKR-Zellen vollständig blockiert und dementsprechend resultiert die Überexpression von PC7 in diesen Zellen nicht in einer erhöhten Menge an reifem ADAM10. Daher folgt aus der Überexpression von PC7 in HEK293ADAM10∆RKKR-Zellen im Vergleich zu HEK293-ADAM10-PC7-Zellen nur eine unwesentliche Erhöhung der APPsα-Freisetzung, die nur die Auswirkung des PC7 auf das endogene ADAM10 widerspiegelt. Diese Befunde verdeutlichen damit eine Funktion von PC7 als α-Sekretase-aktivierender Konvertase und schließen eine direkte Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins durch PC7 aus. Hierdurch wird die Bedeutung von PC7 bei der α-Sekretase-Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins klar: PC7 fungiert nicht selbst als α-Sekretase, sondern trägt vielmehr durch die Aktivierung der α-Sekretase ADAM10 zu einer erhöhten α-Sekretase-Prozessierung bei. Sowohl PC7 als auch ADAM10 partizipieren in Furin-defizienten LoVo-Zellen am konstitutiven α-Sekretase-Weg (Lopez-Perez et al., 2001). In Übereinstimmung mit diesem Befund findet in LoVo-Zellen eine proteolytische Prozessierung des endogenen ADAM10 statt. Hierdurch wird außerdem verdeutlicht, dass Furin für die Prozessierung von ADAM10 nicht unbedingt erforderlich ist und durch das in LoVo-Zellen vorhandene PC7 ersetzt werden kann. Da in LoVo-Zellen jedoch auch die Proprotein-Konvertase PACE4 exprimiert wird, kann eine Prozessierung von ADAM10 durch diese nicht ausgeschlossen werden. Verglichen mit der proteolytischen Entfernung der Prodomäne von endogenem ADAM10 in untransfizierten HEK293-Zellen findet dies in LoVo-Zellen in geringeren Maße statt, was möglicherweise auf das fehlende Furin zurückzuführen ist. Aufgrund ihrer inhibitorischen Wirkung stellt die Entfernung der Prodomäne einen wichtigen Schritt für die Aktivierung des ADAM10-Zymogens dar. Die inhibitorische Funktion konnte durch die Koexpression der Prodomäne als unabhängiges Polypeptid zusammen mit Wildtyp-ADAM10 beobachtet werden (Anders et al., 2001). Zusätzlich scheint sie die korrekte Faltung von ADAM10 zu vermitteln und somit als intramolekulares Chaperon zu fungieren. So besitzt eine Deletions-Mutante von ADAM10, die ohne Prodomäne exprimiert wird, keine katalytische Aktivität, jedoch konnte durch eine Koexpression der separierten Prodomäne in trans die katalytische Aktivität des Prodomänen-deletierten ADAM10 wiederhergestellt werden (Anders et al., 2001). DISKUSSION 106 Eine Funktion der Prodomäne ist es daher, ADAM10 bis zur Aktivierung durch PC7 oder Furin in einem inaktiven Zustand zu halten. Durch die Deglykosylierung von ADAM10 konnte das zelluläre Kompartiment, in dem die Entfernung der Prodomäne erfolgt, näher bestimmt werden. Dabei wurden die unterschiedlichen Eigenschaften der beiden eingesetzten Glykosidasen ausgenutzt. So bleiben asparagingebundene Glycane gegenüber einer Deglykosylierung durch die N-Glykosidase F sensitiv, werden jedoch nach ihrer Modifikation im trans-Golgi-Kompartiment resistent gegenüber einer Deglykosylierung durch die Endoglykosidase H. Um einen effektiven Reaktionsverlauf sicherzustellen mussten die Proteinproben zunächst mit SDS denaturiert und anschließend soweit verdünnt werden, dass die eingesetzten Enzyme während der Deglykosylierungsreaktion nicht denaturieren. Mit Hilfe der Chloroform-Methanol-Fällung konnten die Proben anschließend wieder aufkonzentriert werden, so dass für den immunologischen Nachweis eine ausreichende Menge des untersuchten Proteins auf das Polyacrylamidgel aufgetragen werden konnte. Gleichzeitig wurden störende Bestandteile der Deglykosylierungspuffer aus den Ansätzen entfernt. Andernfalls würden Pufferzusätze, wie zum Beispiel das Detergens Nonidet-P40, den Verlauf der Gelelektrophorese stark beeinträchtigen. Infolge der Deglykosylierung wird das Molekulargewicht von ADAM10 nur geringfügig verringert. In einem 8% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel konnten diese Änderungen im Molekulargewicht daher nicht aufgelöst werden. Erst durch die Verwendung eines NuPAGE (4-12%) Gradientengels werden die vorhandenen Unterschiede in den Molekulargewichten sichtbar. Dem Deglykosylierungsmuster von ADAM10 zufolge wird die Prodomäne im trans-GolgiApparat oder in nachfolgenden Kompartimenten entfernt. Dieses Ergebnis stimmt mit einer Beteiligung der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin an diesem Vorgang überein, da sie in genau diesen Zellkompartimenten katalytisch aktiv sind. ADAM10 wird weit verbreitet in neuronalen und nicht-neuronalen Geweben exprimiert (Yavari et al., 1998). Ähnlich wie ADAM10 kommen PC7 und Furin ubiquitär in den Geweben vor und auch im Gehirn sind sie weit verbreitet (Seidah et al., 1994 und 1996). Dort können die höchsten Expressionsraten von PC7 im Bereich des Hippocampus entdeckt werden, also dem Bereich, der in frühen Phasen der Alzheimer-Krankheit betroffen ist. Furin ist ebenfalls im Hippocampus nachweisbar, besitzt jedoch die höchste Expression im Plexus Chorioidei (Day et al., 1992), einem Adergeflecht, dass als Teil der Blut-Hirn-Schranke eine Barriere zwischen dem Blut und der Gehirnflüssigkeit (Liquor cerebrospinalis) bildet. Diese Expressionsmuster deuten somit auf eine physiologische Funktion von PC7 und Furin als ADAM10-aktivierende Enzyme hin. Die Bedeutung der redundanten ADAM10-Prozessierung ist unklar, jedoch ist die Prozessierung eines Vorläuferproteins durch mehrere Proprotein-Konvertasen nicht ungewöhnlich. Im Hinblick DISKUSSION 107 auf die wichtigen biologischen Funktionen vieler Substrate der Proprotein-Konvertasen wäre es möglich, dass eine ausreichende Prozessierung bestimmter Vorläuferproteine durch redundante Enzymaktivitäten sichergestellt wird (Seidah et al., 1994). Dies würde auch erklären, warum die meisten Gewebe sowohl Furin als auch PC7 exprimieren. Darüber hinaus könnte eine Regulation der Vorläuferprotein-Prozessierung auch durch eine regulierte Genexpression der entsprechenden Proprotein-Konvertasen erfolgen. So werden sowohl die Transkription als auch die Translation der mRNAs von PC1/PC3 und von PC2 in neuroendokrinen Zellen durch Glukose beziehungsweise durch second Messenger reguliert, gewöhnlich parallel zu den Änderungen in der ProhormonExpression (Mania-Farnell et al., 1996, Dong et al., 1997). Auch die Stimulierung von adrenokortikalen Y1-Zellen mit ACTH führt zu einer Erhöhung der PC5-mRNA-Menge, die wahrscheinlich durch den second Messenger cAMP vermittelt wird und keine Änderungen der mRNA-Mengen von endogenem Furin und PC2 zur Folge hat (Lusson et al., 1993). Die Expression des FUR-Gens wird durch drei alternative Promotoren geregelt. Zwei von ihnen sind sogenannte „housekeeping“-Promotoren (GC-reich) für eine konstitutive Genexpression, während der Dritte einen regulierbaren Promotor (mit TATA-Box) darstellt. Der TATA-Box-enthaltende Promotor kann durch den Transkriptionsfaktor C/EBPb, jedoch nicht durch die Transkriptionsfaktoren C/EBPa und C/EBPd, transaktiviert werden. Durch die alternative Nutzung dieser Promotoren könnte eine Regulation der exprimierten Furin-Menge erfolgen (Ayoubi et al., 1994). Dies wird als Ursache für die unterschiedliche Expression des Furins und die hohen Expressionsraten in einigen Geweben in Betracht gezogen (Van de Ven et al., 1993). Ein ähnlicher Mechanismus für die Regulation der PC7-Expression ist vorstellbar. Diese Befunde veranschaulichen, dass eine gezielte Erhöhung der Genexpression einer bestimmten Proprotein-Konvertase durch entsprechende Stimulanzien möglich ist. Die β-Sekretase BACE wird, wie ADAM10, als Vorläuferprotein mit einer Prodomäne und einer Furin-Erkennungssequenz (RLPR) an der Grenze zur katalytischen Domäne synthetisiert. Diese wird durch eine Proprotein-Konvertase entfernt, nachdem BACE das endoplasmatische Retikulum verlassen hat (Capell et al., 2000). Im Gegensatz zu ADAM10 erfolgt die Prozessierung von BACE im trans-Golgi-Apparat durch Furin jedoch nicht durch PC7 (Bennet et al., 2000, Benjannet et al., 2001, Creemers et al., 2000). Darauf beruhend lässt sich das in Abbildung 6.1 dargestellte hypothetische Modell der Aktivierung von ADAM10 und BACE mit den Auswirkungen auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins ableiten. Da BACE nur durch Furin, nicht aber durch PC7 aktiviert werden kann (Bennet et al., 2000, Benjannet et al., 2001, Creemers et al., 2000), und eine Aktivierung von ADAM10 sowohl durch PC7 als auch durch Furin erfolgt, könnte die Konkurrenz zwischen der DISKUSSION 108 β-Sekretase BACE und der α-Sekretase ADAM10 im Hinblick auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins durch eine gezielte Erhöhung der PC7-Genexprssion und/oder durch eine Inhibierung von Furin, und folglich der β-Sekretase BACE, möglicherweise zum nicht-amyloidogenen Weg verschoben werden. Die Entstehung der neurotoxischen Aβ-Peptide könnte auf diesem Weg reduziert werden, was bei der Behandlung der Alzheimer-Demenz von Nutzen wäre. __________________________________________________________________ Abbildung 6.1 Model zur Regulation der APP-Prozessierung durch die proteolytische Aktivierung der α-Sekretase ADAM10 und der β -Sekretase BACE. Die Prodomäne von ADAM10 erleichtert die korrekte Faltung und hält das Enzym in einem inaktiven Zustand. Erst nach der Entfernung der Prodomäne durch die Proprotein-Konvertasen Furin oder PC7 wird die katalytisch aktive Protease erhalten. Im Gegensatz dazu wird die Prodomäne von BACE ausschließlich durch Furin und nicht durch PC7 entfernt. DISKUSSION 109 6.3 Proteolytische Prozessierung von TACE Ein essentieller Schritt zur Erzeugung von katalytisch aktivem TACE ist die proteolytische Entfernung der Prodomäne. Sie besitzt eine starke inhibitorische Wirkung (Milla et al., 1999), die vermutlich durch die Komplexierung des Zink-Ions im aktiven Zentrum des Enzyms über einen Cystein-Rest in der Prodomäne vermittelt wird. Unterstützt wird diese Hypothese durch die Beobachtung, dass die Quecksilberverbindung APMA die Dissoziation des Komplexes effizient vermittelt. Daneben kann eine Inhibierung der katalytischen Aktivität von TACE mit Peptiden, die aus der Sequenz der Cystein-SwitchRegion der Prodomäne abgeleitet wurden, erreicht werden (Roghani et al., 1999). Doch die Prodomäne von TACE fungiert nicht nur als Autoinhibitor der katalytischen Aktivität, sie scheint auch die Faltung des Enzyms zu erleichtern und somit Eigenschaften eines intramolekularen Chaperons zu besitzen (Milla et al., 1999). TACE besitzt genau wie ADAM10 eine α-Sekretaseaktivität und eine ProproteinKonvertasen-Erkennungssequenz (RVKR). Zudem erfolgt die proteolytische Entfernung der Prodomäne, wie bei ADAM10, in einem späten Golgi-Kompartiment innerhalb des sekretorischen Wegs (Schlöndorff et al., 2000). Eine Beteiligung von ProproteinKonvertasen bei der Prozessierung von TACE ist daher sehr wahrscheinlich. In der Sequenz der Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle bestehen jedoch Unterschiede zwischen den α-Sekretasen ADAM10 (RKKR) und TACE (RVKR). Aufgrund der weitreichenden Substratspezifität der Proprotein-Konvertasen und ihrer überlappenden Expression in verschiedenen Geweben ist es möglich, dass mehr als eine Konvertase an der Endoproteolyse eines bestimmten Substrats beteiligt ist. Ebenso ist es möglich, dass ein Substrat, dessen Spaltstelle die Sequenzanforderungen für eine Proteolyse durch mehrere Proprotein-Konvertasen erfüllt, nur von einer bestimmten Konvertase, beziehungsweise nicht von allen in Frage kommenden Konvertasen, prozessiert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Prozessierung der Pro-α-Untereinheit der Integrine (Lissitzky et al., 2000). Dies könnte darin begründet sein, dass das trans-Golgi Netzwerk möglicherweise in verschiedene funktionelle Mikrokompartimente untergliedert ist, oder dass die Prozessierung in post-Golgi-Vesikeln erfolgt. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten Unterschiede in der Lokalisierung der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in post-Golgi-vesikulären Kompartimenten beobachtet werden (Wouters et al., 1998). Da die Prozessierung durch Proprotein-Konvertasen von der Sequenz der Spaltstelle und der intrazellulären Lokalisierung abhängt, könnte es Unterschiede in der Entfernung der Prodomäne und somit in der Aktivierung von ADAM10 und TACE geben. Daher wurde die Bedeutung von Proprotein-Konvertasen, insbesondere von PC7 und Furin, bei der Entfaltung der katalytischen Aktivität von TACE aufgeklärt. 110 DISKUSSION Nach der Inkubation von HEK293-Zellen mit dem Proprotein-Konvertasen-Inhibitor DecRVKR-cmk konnte infolge der Inhibierung der Proprotein-Konvertasen eine deutliche Abnahme der Prodomänen-Abspaltung von TACE beobachtet werden. Dieses Ergebnis entspricht der erwarteten Inhibitor-Wirkung bei einer Beteiligung von ProproteinKonvertasen an der TACE-Prozessierung. Zudem resultiert sowohl die Überexpression von PC7 als auch die von Furin in HEK293-Zellen in einer erhöhten Menge der prozessierten Form von endogenem TACE. Demzufolge wird TACE von beiden Proprotein-Konvertasen in die aktive Form überführt. Allerdings weisen HEK293-FurinZellen größere Mengen des reifen Enzyms auf als HEK-PC7-Zellen. Ein Grund hierfür könnten Unterschiede in den Expressionsraten von Furin und PC7 sein. Da PC7 und Furin jedoch mit unterschiedlichen Antikörpern nachgewiesen werden müssen, ist ein quantitativer Vergleich ihrer Expression nicht möglich. Ferner könnte die Ursache auch in der intrazellulären Lokalisierung liegen, da eine gemeinsame Lokalisierung von TACE und Furin in definierten Zellkompartimenten möglicherweise eher besteht als zwischen TACE und PC7. Schließlich wäre es ebenfalls möglich, dass TACE ein besseres Substrat für Furin als für PC7 darstellt und deswegen größere Mengen an prozessiertem TACE in HEK293-Furin-Zellen vorliegen. Jedoch auch in Furin-defizienten LoVo-Zellen findet eine proteolytische Entfernung der TACE-Prodomäne statt. TACE kann folglich auch in Abwesenheit von Furin prozessiert werden. Vermutlich wird die fehlende Furin-Aktivität hier durch die Proprotein-Konvertase PC7 kompensiert, doch auch die in LoVo-Zellen exprimierte Proprotein-Konvertase PACE4 könnte zur Reifung von TACE beitragen. Obwohl in der Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz der Disintegrin-Metalloproteinasen ADAM10 und TACE ein geringer Unterschied besteht, konnte bei der Untersuchung ihrer Aktivierung kein wesentlicher Unterschied festgestellt werden. So erfolgt die Entfernung der Prodomäne von ADAM10 genau wie die Entfernung der Prodomäne von TACE im trans-Golgi-Apparat durch eine von Proprotein-Konvertasen vermittelte proteolytische Prozessierung. Daneben können beide Disintegrin-Metalloproteinasen sowohl durch PC7 als auch durch Furin aktiviert werden. Hierbei scheint TACE weniger effektiv durch PC7 prozessiert zu werden, jedoch könnte dieser Befund auch auf andere Ursachen zurückzuführen sein. Die Aktivierung dieser beiden Enzyme erfolgt somit in sehr ähnlicher Weise. In Furin-defizienten LoVo-Zellen konnte nach der Überexpression von TACE weder eine konstitutive noch eine PMA-stimulierte α-Sekretaseaktivität nachgewiesen werden (Lopez-Perez et al., 2001), was nach Meinung der Autoren auf eine blockierte Prozessierung des TACE-Zymogens infolge der fehlenden Furin-Aktivität zurückzuführen sein könnte. Im Widerspruch dazu besitzt TACE in HEK293-Zellen sowohl eine konstitutive als auch eine PMA-stimulierbare α-Sekretaseaktivität (Slack et al., 2001, Buxbaum et al., DISKUSSION 111 1998) und wird in LoVo-Zellen proteolytisch prozessiert, so dass auch in dieser Zell-Linie eine beträchtliche Menge von endogenem TACE in der reifen, katalytisch aktiven Form vorliegt. Demzufolge sollte die konstitutive und die regulierte α-Sekretaseaktivität von TACE auch in LoVo-Zellen nachweisbar sein. Da das TACE-Zymogen von Furin sehr effektiv in die reife Form überführt wird und das fehlende Furin in LoVo-Zellen durch PC7 kompensiert werden muss, könnte eine Überexpression von TACE möglicherweise dazu führen, dass die Furin-Defizienz nicht länger durch PC7 ausgeglichen werden kann. Dies würde das Verhältnis von Pro-TACE zur prozessierten Form zugunsten des katalytisch inaktiven Zymogens verändern und somit in einer deutlich erhöhten Menge von Pro-TACE resultieren. Die konstitutive und die PMA-stimulierbare α-Sekretaseaktivität wäre in diesem Fall unter Umständen nicht mehr nachweisbar. Durch eine in situ-Hybridisierung konnte in erwachsenen menschlichen Gehirnen und in den Gehirnen erwachsener Mäuse eine Koexpression von ADAM10, BACE und APP entdeckt werden, wogegen die Expressionsmuster von BACE2 und TACE nur teilweise mit dem von APP überlappten (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). Dies deutet darauf hin, dass ADAM10 und nicht TACE die physiologisch relevante α-Sekretase darstellt. Für die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins haben die Ergebnisse der TACEAktivierung somit wohl nur eine untergeordnete Bedeutung, doch sie tragen entscheidend dazu bei, die Mechanismen, durch die die Freisetzung von Zelloberflächenproteinen reguliert wird, aufzuklären und besser zu verstehen. 6.4 Ausblick Die bedeutende Funktion von Furin bei der proteolytischen Reifung vieler ProproteinSubstrate, einschließlich der Aktivierung einiger pathogener Moleküle, wie z.B. viraler Glykoproteine und bakterieller Toxine, hat diese Endoproteinase zu einem Ziel für die Entwicklung von starken und selektiven Inhibitoren gemacht. Im Gegensatz zur Aktivierung der α-Sekretase ADAM10, die durch die Proprotein-Konvertasen Furin und PC7 vermittelt wird, erfolgt die Prodomänen-Abspaltung der β-Sekretase BACE ausschließlich durch Furin, nicht aber durch PC7. Eine selektive Inhibierung von Furin könnte daher die Prozessierung von BACE hemmen und so möglicherweise die Aktivität von BACE verringern. Gleichzeitig sollte infolge der eingeschränkten BACE-Reifung eine deutliche Reduzierung der Aβ-Peptid-Produktion erzielt werden können. Da Furin für die Aktivierung von ADAM10 in der Gegenwart von PC7 nicht unbedingt erforderlich ist, sollte der nicht-amyloidogene Weg dabei nicht, oder nur geringfügig, betroffen werden. 112 DISKUSSION Eine selektive Inhibierung von Furin ist mit Hilfe des α1-PDX-Inhibitors möglich (Benjannet et al., 1997, Jean et al., 1998, Jean et al., 2000). Dieser Furin-spezifische Inhibitor entstand durch eine zweifache Mutation von menschlichem α1-Antitrypsin (α1AT), einem aus 394 Aminosäuren bestehenden Protein, das einen physiologischen Inhibitor der neutrophilen Elastase darstellt (Kurachi et al., 1981). Eine natürlich vorkommende Mutante von α1-AT weist eine Punktmutation im reaktiven Zentrum auf (AIPM358 substituiert durch AIPR358). Hierdurch wird die Spezifität dieses Inhibitors verändert, der nun nicht mehr die neutrophile Elastase hemmt, sondern als Thrombinspezifischer Inhibitor fungiert und als α1-AT-Pittsburgh bezeichnet wird (Owen et al., 1983). Übereinstimmend mit der entscheidenden Bedeutung von Arginin-Resten in den Positionen -1 und -4 der Spaltstelle von Substraten, die durch Furin prozessiert werden, resultiert eine zweite Punktmutation in α1-AT-Pittsburgh in einer Sequenz, die der minimalen Furin-Erkennungssequenz entspricht (RIPR358). Diese Mutante stellt einen potenten Inhibitor für Furin dar und wird als α1-AT-Portland (α1-PDX) bezeichnet. Im Vergleich zu anderen Furin-Inhibitoren ist α1-PDX bei geringen Konzentrationen hochselektiv für Furin und zeigt in Zellkulturexperimenten keine erkennbare Toxizität. Die Verwendung dieses Inhibitors für therapeutische Zwecke erfordert eine indirekte Inhibierung von BACE durch das rekombinante, extrazellulär verabreichte Protein. Tatsächlich wird extrazellulär verabreichtes α1-PDX von menschlichen Astrocyten (U-373 MG) durch Furin aufgenommen und vermittelt anschließend dessen Abbau. Das Ausbleiben der α1-PDX-Aufnahme in LoVo-Zellen, die kein funktionelles Furin exprimieren, deutet darauf hin, dass dieser Inhibitor auf der Zelloberfläche an Furin bindet. Dabei werden offenbar SDS-stabile Komplexe gebildet, die nach Aufnahme intrazellulär abgebaut werden (Jean et al., 2000). Durch die Überexpression von Furin, nicht aber durch die Überexpression von PC7 oder PC5/PC6B, kann die α1-PDXAufnahme in LoVo-Zellen wiederhergestellt werden. Daher könnte die gezielte Manipulation der Furin-Menge durch α1-PDX indirekt zu einer Inhibierung der β-Sekretase BACE und damit zu einer verringerten Aβ-Entstehung führen. Dies könnte entweder allein durch α1-PDX oder durch die Kombination mit anderen therapeutisch wirksamen Substanzen erfolgen. Um diese Möglichkeit einer indirekten BACE-Inhibierung zu überprüfen, muss nach der Reinigung des rekombinanten α1-PDX die Auswirkung verschiedener Inhibitor-Konzentrationen auf die Reifung von ADAM10 und BACE, sowie die resultierenden Effekte auf die Produktion der Aβ-Peptide und der APPsα-Freisetzung in Zellkulturexperimenten untersucht werden. ANHANG 113 7 ANHANG 7.1 Klonierungsschemata 7.1.1 Klonierung einer cDNA für ein Reporterprotein mit der cDNA der α-Sekretase ADAM10 in einen Expressionsvektor 7.1.1.1 Klonierung einer verkürzten alkalischen Phosphatase in den Expressionsvektor pcDNA3 PCR-Amplifikat SEAPs 1534 bp BsrG I Eco RV Vektor 5446 bp SEAPs 1534 bp-Fragment Ligation ANHANG 114 7.1.1.2 Klonierung eines Reporterproteins aus der verkürzten alkalischen Phosphatase und APP119 Hind III BsrG I Hind III BsrG I Xcm I Vektor 5726 bp-Fragment SEAPs 1588 bp-Fragment Ligation ANHANG 7.1.1.3 115 Klonierung des Reporterproteins SEAPs/APP119 und ADAM10 in einen Vektor Nru I Nru I Tth 111 I Vektor 7314 bp ADAM10-HA 4429 bp-Fragment Ligation ANHANG 116 7.1.2 Klonierung der kodierenden Sequenz für die ADAM10∆RKKR-Mutante in den Expressionsvektor pcDNA3 PCR-Amplifikat ADAM10∆RKKR 1041 bp Fsp I Eco RI ∗ Eco81 I T4-DNAPolymerase Eco RI Eco RI Vektor 7686 bp ADAM10∆RKKR 295 bp-Fragment Ligation ∗ ANHANG 117 7.2 Proteinsequenz des SEAPs/APP119-Fusionsproteins MLLLLLLLGL RLQLSLGIIP VEEENPDFWN REAAEALGAA KKLQPAQTAA KNLIIFLGDG MGVSTVTAAR ILKGQKKDKL GPEIPLAMDR FPYVALSKTY NVDKHVPDSG ATATAYLCGV KGNFQTIGLS AAARFNQCNT TRGNEVISVM NRAKKAGKSV GVVTTTRVQH ASPAGTYAHT VNRNWYSDAD VPASARQEGC QDIATQLISN MDIDVILGGG RKYMFRMGTP DPEYPDDYSQ GGTRLDGKNL VQEWLAKRQG ARYVWNRTEL MQASLDPSVT HLMGLFEPGD MKYEIHRDST LDPSLMEMTE AALRLLSRNP RGFFLFVEGG RIDHGHHESR AYRALTETIM FDDAIERAGQ LTSEEDTLSL VTADHSHVFS FGGYPLRGSS IFGLAPGKAR DRKAYTVLLY GNGPGYVLKD GARPDVTESE SGSPEYRQQS AVPLDEETHA GEDVAVFARG PQAHLVHGVQ EQTFIAHVMA FAACLEPYTA CDLAPPAGTT DAAHPGVYTR PGSGLTNIKT EEISEVKMDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE ↑β-Sekretase ↑α-Sekretase DVGSNKGAII GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT ↑ ↑γ-Sekretase PEERHLSKMQ QNGYENPTYK FFEQMQN Die Proteinsequenz wird vom Vektor pcDNA3-SEAPs/APP119 codiert. Die Teilsequenz des APP im Fusionsprotein ist fett gedruckt, die Spaltstellen der Sekretasen sind durch Pfeile angeführt und die Transmembrandomäne des APP ist unterstrichen. 7.3 Interne Bezeichnungen der hergestellten und verwendeten Plasmide pcDNA3-ADAM10-HA.................................................................................. 116.1 pcDNA3-APP119........................................................................................... 131b.1 pcDNA3-SEAPs........................................................................................... 135.1 pcDNA3-SEAPs/APP119............................................................................ 136.1 pcDNA3-SEAPs/APP119-ADAM10-HA......................................................... 137.11 pcDNA3-bFur............................................................................................... 148.1 pcDNA3-ADAM10∆RKKR-HA..................................................................... 160.4 pIRES1hyg-PC7.......................................................................................... pA3.2 pIRES1hyg-Furin......................................................................................... pA5.7 ABKÜRZUNGEN 119 8 ABKÜRZUNGEN A Adenin Aβ β-Amyloidpeptid ADAM A disintegrin and Metalloproteinase (Disintegrin-Metalloproteinase) APMA 4-aminophenylmercuric acetate (4-Aminophenylquecksilberacetat) APP amyloid precursor protein (Amyloid-Vorläuferprotein) APPsα α-Sekretase- gespaltenes, lösliches APP APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure(n) ATP Adenosintriphosphat BACE β-site APP cleaving enzyme BBS BES buffered saline (BES-gepufferte Kochsalzlösung) Bp Basenpaar BES N,N,-Bis-(2-hydroxyehyl)-aminoethansulfonsäure BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) C Cytosin CAPS 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) CIAP calf intestine alcalic phosphatase (alkalische Phosphatase aus Kälberdarm) cm Zentimeter CMV Cytomegalovirus Da Dalton dec-RVKR-cmk Decanoyl-RVKR-chloromethylketon DMEM Dulbecco’s modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleotid-Triphosphat DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N,N,N‘,N‘-tetraacetat EGF epidermal growth factor (epidermaler Wachstumsfaktor) EGTA 1,2-Bis-(2-aminoethoxyethan)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat Endo H Endoglykosidase H ABKÜRZUNGEN 120 ER endoplasmatisches Retikulum FCS fetal calf serum (fötales Kälberserum) G Guanin g Gramm g Erdbeschleunigung GPI Glykosylphosphatidylinositol h Stunde HA Hämagglutinin HEK human embryonic kidney Hepes 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-ethansulfonsäure IgG Immunglobulin G K Lysin k Kilo kb Kilobasenpaar kDa Kilodalton l Liter LPC lymphoma proprotein convertase µ mikro m milli M mol/l mA Milliampere MBP myelin basic protein MEM minimum essential medium min Minute n nano NPP 4-Nitrophenylphosphat PACE paired aminoacid cleaving enzyme PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) PC proprotein convertase (Proprotein-Konvertase) PCI Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PEG Polyethylenglykol pH potentia hydrogenii (negativer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration) PKC Proteinkinase C PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat ABKÜRZUNGEN PNGase F Peptid-N-Glykosidase F Pro Prodomäne PVDF Polyvinylidendifluorid R Arginin mRNA messenger RNA (Boten RNA) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RNase Ribonuklease rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur s Sekunde(n) SEAP sekretierte alkalische Phosphatase SEAPs verkürzte sekretierte alkalische Phosphatase SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SP Signalpeptid STET Saccharose-Tris-EDTA-Triton X-100 SV40 Simian-Virus 40 SVMP snake venom metalloproteinase (Schlangengift-Metalloproteinase) T Thymin TAE Tris-Acetat-EDTA TACE TNFα-converting enzyme (TNFα-konvertierendes Enzym) TBS tris buffered saline (Tris- gepufferte Kochsalzlösung) TCA trichloroacetic acid (Trichloressigsäure) TE Tris-EDTA TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin TGFα transforming growth factor-α (Transformierender Wachstums-Faktor-α) TNFα tumor necrosis factor-α (Tumor Nekrose-Faktor-α) Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan U unit (Einheit) UV Ultraviolett V Valin V Volt v/v volume per volume (Volumen pro Volumen) w/v weigth per volume (Gewicht pro Volumen) 121 LITERATUR 123 9 LITERATUR Adler, M., Lazarus, R. A., Dennis, M. S. und Wagner, G. (1991) Solution Structure of Kistrin, a Potent Platelet Aggregation Inhibitor and GP IIb-IIIa Antagonist. Science 253, 445-448. Almeida, E. A. C., Huovila, A.-P. J., Sutherland, A. E., Stephens, L. E., Calarco, P. G., Shaw, L. M., Mercurio, A. M., Sonnenberg, A., Primakoff, P., Myles, D. G. und White, J. M. (1995) Mouse Egg Integrin α6β1 Functions as a Sperm Receptor. Cell 81, 10951104. Anders, A., Gilbert, S., Garten, W., Postina, R. und Fahrenholz, F. (27. Juni 2001) Regulation of the ADAM10 α-secretase activity by ist prodomain and proprotein convertases. FASEB J., 10.1096/fj.00-0007.fje. Anderson, J. P., Esch, F. S., Keim, P. S., Sambamurti, K., Lieberburg, I. und Robakis, N. K. (1991) Exact cleavage site of Alzheimer amyloid precursor in neuronal PC-12 cells. Neurosci. Lett. 128, 126-128. Anderson, J. P., Chen, Y., Kim, K. S. und Robakis, N. K. (1992) An alternative secretase cleavage produces soluble Alzheimer amyloid precursor protein containing a potentially amyloidogenic sequence. J. Neurochem. 59, 2328-1231. Anderson, E. D., Thomas, L., Hayflick, J. S. und Thomas, G. (1993) Inhibition of HIV-1 gp160-dependent membrane fusion by a furin-directed alpha 1-antitrypsin variant. J. Biol. Chem. 268, 24887-24891. Anderson, E. D., VanSlyke, J. K., Thulin, C. D., Jean, F. und Thomas, G. (1997) Activation of the furin endoprotease is a multiple-step process: requirements for acidification and internal propeptide cleavage. EMBO J. 16, 1508-1518. Araki, W., Kitaguchi, N., Tokushima, Y., Ishii, K., Aratake, H., Shimohama, S., Nakamura, S. und Kimura, J. (1991) Trophic effect of beta-amyloid precursor protein on cerebral cortical neurons in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 265-271. LITERATUR 124 Arribas, J. und Massague, J. (1995) Transforming growth factor-alpha and beta-amyloid precursor protein share a secretory mechanism. J. Cell Biol. 128, 433-441. Arribas, J., Coodly, L., Vollmer, P., Kishimoto, T. K., Rose-John, S. und Massagué, J. (1996) Diverse Cell Surface Protein Ectodomains Are Shed by a System Sensitive to Metalloprotease Inhibitors. J. Biol. Chem. 271, 11376-11382. Ayoubi, T. A., Creemers, J. W., Roebroek, A. J. und Van de Ven, W. J. (1994) Expression of the dibasic proprotein processing enzyme furin is directed by multiple promoters. J. Biol. Chem. 269, 9298-9303. Baker, D., Shiau, A. K. und Agard, D. A. (1993) The role of pro regions in protein folding. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 966-970. Barelli, H., Lebeau, A., Vizzavona, J., Delaere, P., Chevallier, N., Drouot, C., Marambaud, P., Ancolio, K., Buxbaum, J. D., Khorkova, O., Heroux, J., Sahasrabudhe, S., Martinez, J., Warter, J. M., Mohr, M. und Checler, F. (1997) Characterization of new polyclonal antibodies specific for 40 and 42 amino acid-long amyloid beta peptides: their use to examine the cell biology of presenilins and the immunohistochemistry of sporadic Alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy cases. Mol. Med. 3, 695-707. Behl, C., Davis, J. B., Lesley, R. und Schubert, D. (1994) Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity. Cell 77, 817-827. Benjannet, S., Savaria, D., Laslop, A., Munzer, J. S., Chretien, M., Marcinkiewicz, M. und Seidah, N. G. (1997) α1-antitrypsin Portland inhibits processing of precursors mediated by proprotein convertases primarily within the constitutive secretory pathway. J. Biol. Chem. 272, 26210-26218. Benjannet, S., Elagoz, A., Wickham, L., Mamarbachi, M., Munzer, J. S., Basak, A., Lazure, C., Cromlish, J. A., Sisodia, S., Checler, F., Chretien, M. und Seidah, N. G. (2001) Post-translational processing of β-secretase (BACE) and its ectodomain shedding: the pro- and transmembrane/cytosolic domains affect its cellular activity and amyloid Aβ production. J. Biol. Chem. 276, 10879-10887. LITERATUR 125 Bennett, B. D., Denis, P., Haniu, M., Teplow, D. B., Kahn, S., Louis, J.-C., Citron, M. und Vassar, R. (2000) A furin-like convertase mediates propeptide cleavage of BACE, the Alzheimer's β–secretase. J. Biol. Chem. 275, 37712-37717. Black, R. A., Rauch, C. T., Kozlosky, C. J., Peschon, J. J., Slack, J. L., Wolfson, M. F., Castner, B. J., Stocking, K. L., Reddy, P., Srinivasan, S., Nelson, N., Bolani, N., Schooley, K. A., Gerhart, M., Davies, R., Fitzner, J. N., Johnson, R. S., Paxton, R. J., March, C. J. und Cerretti, D. P. (1997) A metalloproteinase disintegrin that releases tumor-necrosis factor-α from cells. Nature 385, 729733. Black, R. A. und White, J. M. (1998) ADAMs: focus on the protease domain. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 654-659. Blobel, C. P., Wolfsberg, T. G., Turck, C. W., Myles, D. G., Primakoff, P. und White, J. M. (1992) A potential fusion peptide and an integrin ligand domain in a protein active in sperm-egg fusion. Nature 356, 248-252. Bode, W., Gomis-Ruth, F. X. und Stockler, W. (1993) Astacins, serralysins, snake venom and matrix metalloproteinases exhibit identical zinc-binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the 'metzincins'. FEBS Lett. 331, 134-140. Bruzzaniti, A., Goodge, K., Jay, P., Taviaux, S. A., Lam, M. H., Berta, P., Martin, T. J., Moseley, J. M. und Gillespie, M. T. (1996) PC8 [corrected], a new member of the convertase family. Biochem. J. 314, 727-731. Buxbaum, J. D., Koo, E. H. und Greengard, P. (1993) Protein phosphorylation inhibits production of Alzheimer amyloid beta/A4 peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9195-9198. Buxbaum, J. D., Liu, K.-N., Luo, Y., Slack, J. L., Stocking, K. L., Peschon, J. J., Johnson, R. S., Castner, B. J., Cerretti, D. P. und Black, R. A. (1998) Evidence that tumor necrosis factor α converting enzyme is involved in regulated α-secretase cleavage of the Alzheimer amyloid protein precursor. J. Biol. Chem. 273, 27765-27767. Cai, X. D., Golde, T. E. und Younkin, S. G. (1993) Release of excess amyloid beta protein from a mutant amyloid beta protein precursor. Science 259, 514-516. LITERATUR 126 Capell, A., Steiner, H., Willem, M., Kaiser, H., Meyer, C., Walter, J., Lammich, S., Multhaup, G. und Haass, C. (2000) Maturation and pro-peptide cleavage of betasecretase. J. Biol. Chem. 275, 30849-30854. Caporaso, G. L., Gandy, S. E., Buxbaum, J. D., Ramabhadran, T. V. und Greengard, P. (1992) Protein phosphorylation regulates secretion of Alzheimer beta/A4 amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3055-3059. Chantry, A., Earl, C., Groome, N. und Glynn, P. (1988) Metalloendoprotease cleavage of 18.2- and 14.1-kilodalton basic proteins dissociating from rodent myelin membranes generates 10.0- and 5.9-kilodalton C-terminal fragments. J. Neurochem. 50, 688-694. Chantry, A., Gregson, N. A. und Glynn, P. (1989) A novel metalloproteinase associated with brain myelin membranes. Isolation and characterization. J. Biol. Chem. 264, 21603-21607. Checler, F. (1995) Processing of the beta-amyloid precursor protein and its regulation in Alzheimer's disease. J. Neurochem. 65, 1431-1444. Cho, C., O'Dell Bunch, D., Faure, J.-E., Goulding, E. H., Eddy, E. M., Primakoff, P. und Myles, D. G. (1998) Fertilization Defects in Sperm from Mice Lacking Fertilin β. Science 281, 1857-1859. Citron, M., Oltersdorf, T., Haass, C., McConlogue, L., Hung, A. Y., Seubert, P., VigoPelfrey, C., Lieberburg, I. und Selkoe, D. J. (1992) Mutation of the beta-amyloid precursor protein in familial Alzheimer's disease increases beta-protein production. Nature 360, 672-674. Citron, M., Teplow, D. B. und Selkoe, D. J. (1995) Generation of amyloid beta protein from its precursor is sequence specific. Neuron 14, 661-670. Citron, M., Diehl, T. S., Gordon, G., Biere, A. L., Seubert, P. und Selkoe, D. J. (1996) Evidence that the 42- and 40-amino acid forms of amyloid beta protein are generated from the beta-amyloid precursor protein by different protease activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13170-13175. LITERATUR 127 Citron, M., Westaway, D., Xia, W., Carlson, G., Diehl, T., Levesque, G., Johnson-Wood, K., Lee, M., Seubert, P., Davis, A., Kholodenko, D., Motter, R., Sherrington, R., Perry, B., Yao, H., Strome, R., Lieberburg, I., Rommens, J., Kim, S., Schenk, D., Fraser, P., St. George Hyslop, P. und Selkoe, D. J. (1997) Mutant presenilins of Alzheimer's disease increase production of 42-residue amyloid beta-protein in both transfected cells and transgenic mice. Nat. Med. 3, 67-72. Citron, M. (2000) Secretases as targets for the treatment of Alzheimer`s disease. Molecular medicine Today 6, 392-397. Constam, D. B., Calfon, M. und Robertson, E. J. (1996) SPC4, SPC6, and the novel protease SPC7 are coexpressed with bone morphogenetic proteins at distinct sites during embryogenesis. J. Cell Biol. 134, 181-191. Cook, D. G., Forman, M. S., Sung, J. C., Leight, S., Kolson, D. L., Iwatsubo, T., Lee, V. M. und Doms, R. W. (1997) Alzheimer's A beta(1-42) is generated in the endoplasmic reticulum/intermediate compartment of NT2N cells. Nat. Med. 3, 1021-1023. Creemers, J. W. M., Siezen, R. J., Roebroek, A. J., Ayoubi, T. A., Huylebroeck, D. und Van de Ven, W. J. (1993) Modulation of furin-mediated proprotein processing activity by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 268, 21826-21834. Creemers, J. W. M., Dominguez, D. I., Plets, E., Serneels, L., Taylor, N. A., Multhaup, G., Craessaerts, K., Annaert, W. und De Strooper, B. (2000) Processing of β-secretase (Bace) by furin and other members of the proprotein convertase family. J. Biol. Chem. 276, 4211-4217. Dartigues, J. F. und Letenneur, L. (2000) Genetic epidemiology of Alzheimer's disease. Curr. Opin. Neurol. 13, 385-389. Day, R., Schäfer, M. K.-H., Cullinan, W. E., Watson, S. J., Chretien, M. und Seidah, N. G. (1993) Region specific expression of furin mRNA in the rat brain. Neurosci. Lett. 149, 27-30. De Strooper, B., Umans, L., Van Leuven, F. und Van Den Berghe, H. (1993) Study of the synthesis and secretion of normal and artificial mutants of murine amyloid precursor LITERATUR 128 protein (APP): cleavage of APP occurs in a late compartment of the default secretion pathway. J. Cell Biol. 121, 295-304. De Strooper, B., Creemers, J. W. M., Moechars, D., Huylebroeck, D., Van de Ven, W. J. M., Van Leuven, F. und Van de Berghe, H. (1995) Amyloid precursor protein is not processed by furin, PACE 4, PC1/3, PC2, PC4, und PC5/6 of the furin family of proprotein processing enzymes. Biochim. Biophys. Acta 1246, 185-188. Dittie, A. S., Thomas, L., Thomas, G. und Tooze, S.A. (1997) Interaction of furin in immature secretory granules from neuroendocrine cells with the AP-1 adaptor complex is modulated by casein kinase II phosphorylation. EMBO J. 16, 4859-4870. Doedens, J. R. und Black, R. A. (2000) Stimulation-induced Down-regulation of Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme. J. Biol. Chem. 275, 14598-14607. Dong, W., Seidel, B., Marcinkiewicz, M., Chretien, M., Seidah, N. G. und Day, R. (1997) Cellular localization of the prohormone convertases in the hypothalamic paraventricular and supraoptic nuclei: selective regulation of PC1 in corticotrophinreleasing hormone parvocellular neurons mediated by glucocorticoids. J. Neurosci. 17, 563-575. Dyrks, T., Weidemann, A., Multhaup, G., Salbaum, J. M., Lemaire, H. G., Kang, J., MullerHill, B., Masters, C. L. und Beyreuther, K. (1988) Identification, transmembrane orientation and biogenesis of the amyloid A4 precursor of Alzheimer`s disease. EMBO J. 7, 949-957. Esch, F. S., Keim, P. S., Beattie, E. C., Blacher, R. W., Culwell, A. R., Oltersdorf, T., McClure, D. und Ward, P. J. (1990) Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive processing of its precursor. Science 248, 1122-1124. Fambrough, D., Pan, D., Rubin, G. M. und Goodman, C. S. (1996) The cell surface metalloprotease/disintegrin Kuzbanian is required for axonal extension in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13233-13238. Farzan, M., Schnitzler, C. E., Vasilieva, N., Leung, D. und Choe, H. (2000) BACE2, a beta -secretase homolog, cleaves at the beta site and within the amyloid-beta region of the amyloid-beta precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9712-9717. LITERATUR 129 Fox, J. W. und Bjarnason, J. B. (1996) The reprolysins: a family of metalloproteinases defined by snake venom and mammalian metalloproteinases, Zinc Metalloproteinases in Health And Disease 1-21, Hersg. Hooper, N. M., Taylor & Francis London. Furukawa, K., Barger, S.W., Blalock, E.M. und Mattson, M.P. (1996) Activation of K+ channels and suppression of neuronal activity by secreted beta-amyloid-precursor protein. Nature 379, 74-78. Garten, W., Stieneke, A., Shaw, E., Wikstrom, P. und Klenk, H.-D. (1989) Inhibition of proteolytic activation of influenza virus hemagglutinin by specific peptidyl chloroalkyl ketones. Virology 172, 25-31. Goedert, M. (1987) Neuronal localization of amyloid beta protein precursor mRNA in normal human brain and in Alzheimer's disease. EMBO J. 6, 3627-3632. Gould, R. J., Polokoff, M. A. und Friedman, P. A. (1990). Disintegrins: A family of integrin inhibitory proteins from viper venoms. Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 195, 168-171. Grams, F., Huber, R., Kress, L. F., Moroder, L. und Bode, W. (1993) Activation of snake venom metalloproteinases by a cysteine switch-like mechanism. FEBS Lett. 335, 7680. Gravina, S. A., Ho, L., Eckman, C. B., Long, K. E., Otvos, L. Jr., Younkin, L. H., Suzuki, N. und Younkin, S. G. (1995) Amyloid beta protein (A beta) in Alzheimer's disease brain. Biochemical and immunocytochemical analysis with antibodies specific for forms ending at A beta 40 or A beta 42(43). J. Biol. Chem. 270, 7013-7016. Gray, G. E., Mann, R. S., Mitsiadis, E., Henrique, D., Carcangiu, M.-L., Banks, A., Leiman, J., Ward, D., Ish-Horowitz, D. und Artavanis-Tsakonas, S. (1999) Human Ligands of the Notch Receptor. Am. J. Pathol. 154, 785-794. Haass, C. und Selkoe, D. J. (1993) Cellular processing of β-amyloid precursor protein and the genesis of amyloid β–peptide. Cell 75, 1039-1042. Haass, C., Koo, E. H., Mellon, A., Hung, A. Y. und Selkoe, D. J. (1992) Targeting of cellsurface beta-amyloid precursor protein to lysosomes: alternative processing into amyloid-bearing fragments. Nature 357, 500-503. LITERATUR 130 Harris, M. E., Carney, J. M., Cole, P. S., Hensley, K., Howard, B. J., Martin, L., Bummer, P., Wang, Y., Pedigo, N. W. Jrs. und Butterfield, D.A. (1995) beta-Amyloid peptidederived, oxygen-dependent free radicals inhibit glutamate uptake in cultured astrocytes: implications for Alzheimer's disease. Neuroreport. 6, 1875-1879. Hartmann, T., Bieger, S. C., Bruhl, B., Tienari, P. J., Ida, N., Allsop, D., Roberts, G. W., Masters, C. L., Dotti, C. G., Unsicker, K. und Beyreuther, K. (1997) Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nat. Med. 3, 1016-1020. Hooper, N. M. (1994) Families of zinc metalloproteases. FEBS Lett. 354, 1-6. Howard, L. und Glynn, P. (1995) Membrane-Associated Metalloproteinase Recognized by Characteristic Cleavage of Myelin Basic Protein: Assay and Isolation. Methods Enzymol. 248, 388-395. Howard, L., Lu, X., Mitchell, S., Griffiths, S. und Glynn, P. (1996) Molecular cloning of MADM: a catalytically active mammalian disintegrin-metalloprotease expressed in various cell types. Biochemistry 317, 45-50. Huang, T. F., Holt, J. C., Lukasiewicz, H. und Niewiarowski, S. (1987) Trigramin. A low molecular weight peptide inhibiting fibrinogen interaction with platelet receptors expressed on glycoprotein IIb-IIIa complex. J. Biol. Chem. 262, 16157-16163. Hung, A. Y., Haass, C., Nitsch, R. M., Qiu, W. Q., Citron, M., Wurtman, R. J., Growdon, J. H. und Selkoe, D. J. (1993) Activation of protein kinase C inhibits cellular production of the amyloid beta-protein. J. Biol. Chem. 268, 22959-22962. Huovila, A.-P. J., Almeida, E. A. C. und White J. M. (1996) ADAMs and cell fusion. Curr. Opin. Cell Biol. 8, 692-699. Huse, J. T., Pijak, D. S., Leslie, G. J., Lee, V. M. und Doms, R. W. (2000) Maturation and endosomal targeting of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme. The Alzheimer's disease beta-secretase. J. Biol. Chem. 275, 33729-33737. Hussain, I., Powell, D., Howlett, D. R., Tew, D. G., Meek, T. D., Chapman, C., Gloger, I. S., Murphy, K. E., Southan, C. D., Ryan, D. M., Smith, T. S., Simmons, D. L., LITERATUR 131 Walsh, F. S., Dingwall, C. und Christie, G. (1999) Identification of a novel aspartic protease (Asp 2) as beta-secretase. Mol. Cell Neurosci. 14, 419-427. Ikezu, T., Trapp, B. D., Song, K. S., Schlegel, A., Lisanti, M. P. und Okamoto, T. (1998) Caveolae, plasma membrane microdomains for alpha-secretase-mediated processing of the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 273, 10485-10495. Jarrett, J. T., Berger, E. P. und Lansbury, P. T. Jr. (1993) The carboxy terminus of the beta amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochemistry 32, 4693-4697. Jean, F., Stella, K., Thomas, L., Liu, G., Xiang, Y., Reason, A. H. und Thomas, G. (1998) α1-Antitrypsin Portland, a bioengineered serpin highly selective for furin: application as an antipathogenic agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7293-7298. Jean, F., Thomas, .L, Molloy, S. S., Liu, G., Jarvis, M. A., Nelson, J. A. und Thomas, G. (2000) A protein-based therapeutic for human cytomegalovirus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2864-2869. Jones, B. G., Thomas, L., Molloy, S. S., Thulin, C. D., Fry, M. D., Walsh, K. A. und Thomas, G. (1995) Intracellular trafficking of furin is modulated by the phosphorylation state of a casein kinase II site in its cytoplasmic tail. EMBO J. 14, 5869-5883. Kang, J., Lemaire, H. G., Unterbeck, A., Salbaum, J. M., Masters, C. L., Grzeschik, K. H., Multhaup, G., Beyreuther, K. und Muller-Hill, B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature 325, 733-736. Kitaguchi, N., Takahashi, Y., Tokushima, Y., Shiojiri, S. und Ito, H. (1988) Novel precursor of Alzheimer`s disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature 331, 530-532. Koike, H., Tomioka, S., Sorimachi, H., Saido, T. C., Maruyama, K., Okuyama, A., Fujisawa-Sehara, A., Ohno, S., Suzuki, K. und Ishiura, S. (1999) Membraneanchored metalloprotease MDC9 has an alpha-secretase activity responsible for processing the amyloid precursor protein. Biochem. J. 343, 371-375. LITERATUR 132 Kojro, E., Gimpl, G., Lammich, S., Marz, W. und Fahrenholz, F. (2001) Low cholesterol stimulates the nonamyloidogenic pathway by its effect on the alpha -secretase ADAM 10. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5815-5820. Krätzschmar, J., Lum, L. und Blobel, C. P. (1996) Metargidin, a Membrane-anchored Metalloprotease-disintegrin Protein with an RGD Integrin Binding Sequenze. J. Biol. Chem. 271, 4593-4596. Kuentzel, S. L., Ali, S. M., Altman, R. A., Greenberg, B. D. und Raub, T. J. (1993) The Alzheimer beta-amyloid protein precursor/protease nexin-II is cleaved by secretase in a trans-Golgi secretory compartment in human neuroglioma cells. Biochem. J. 295, 367-378. Kurachi, K., Chandra, T., Degen, S. J., White, T. T., Marchioro, T. L., Woo, S. L. und Davie, E. W. (1981) Cloning and sequence of cDNA coding for alpha 1-antitrypsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6826-6830. Lammich, S., Kojro, E., Postina, R., Gilbert, S., Pfeiffer, R., Jasionowski, M., Haass, C. und Fahrenholz, F. (1999) Constitutive and regulated α-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by a disintegrin metalloprotease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3922-3927. LeBlanc, A. C., Chen, H. Y., Autilio-Gambetti, L. und Gambetti, P. (1991) Differential APP gene expression in rat cerebral cortex, meninges, and primary astroglial, microglial and neuronal cultures. FEBS Lett. 292, 171-178. Lin, X., Koelsch, G., Wu, S., Downs, D., Dashti, A. und Tang, J. (2000) Human aspartic protease memapsin 2 cleaves the beta-secretase site of beta-amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1456-1460. Lissitzky, J. C., Luis, J., Munzer, J. S., Benjannet, S., Parat , F., Chretien, M., Marvaldi, J. und Seidah, N. G. (2000) Endoproteolytic processing of integrin pro-alpha subunits involves the redundant function of furin and proprotein convertase (PC) 5A, but not paired basic amino acid converting enzyme (PACE) 4, PC5B or PC7. Biochem. J. 346, 133-138. LITERATUR 133 Loechel, F., Gilpin, B. J., Engvall, E., Albrechtsen, R. und Wewer, U. M. (1998) Human ADAM 12 (Meltrin α) Is an Active Metalloprotease. J. Biol. Chem. 273, 1699316997. Loechel, F., Overgaard, M. T., Oxvig, C., Albrechtsen, R. und Wewer, U. M. (1999) Regulation of human ADAM 12 protease by the prodomain. J. Biol. Chem. 274, 13427-13433. Lopez-Perez, E., Seidah, N. G. und Checler, F. (1999) Proprotein convertase activity contributes to the processing of the Alzheimer's beta-amyloid precursor protein in human cells: evidence for a role of the prohormone convertase PC7 in the constitutive alpha-secretase pathway. J. Neurochem. 73, 2056-2062. Lopez-Perez, E., Zhang, Y., Frank, S. J., Creemers, J., Seidah, N. G. und Checler, F. (2001) Constitutive alpha-secretase cleavage of the beta-amyloid precursor protein in the furin-deficient LoVo cell line: involvement of the pro-hormone convertase 7 and the disintegrin metalloprotease ADAM10. J. Neurochem. 76, 1532-1539. Lum, L., Reid, M. S. und Blobel, C. P. (1998) Intracellular maturation of the mouse metalloprotease disintegrin MDC15. J. Biol. Chem. 273, 26236-26247. Luo, Y. Q., Hirashima, N., Li, Y. H., Alkon, D. L., Sunderland, T., Etcheberrigaray, R. und Wolozin, B. (1995) Physiological levels of beta-amyloid increase tyrosine phosphorylation and cytosolic calcium. Brain Res. 681, 65-74. Lusson, J., Vieau, D., Hamelin, J., Day, R., Chretien, M. und Seidah, N. G. (1993) cDNA structure of the mouse and rat subtilisin/kexin-like PC5: a candidate proprotein convertase expressed in endocrine and nonendocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6691-6695. Mandelkow, E. M. und Mandelkow, E. (1998) Tau in Alzheimer's disease. Trends Cell Biol. 8, 425-427. Mania-Farnell, B. L., Botros, I., Day, R. und Davis, T. P. (1996) Differential modulation of prohormone convertase mRNA by second messenger activators in two cholecystokinin-producing cell lines. Peptides 17, 47-54. LITERATUR 134 Marcinkiewicz, M. und Seidah, N. G. (2000) Coordinated expression of beta-amyloid precursor protein and the putative beta-secretase BACE and alpha-secretase ADAM10 in mouse and human brain. J. Neurochem. 75, 2133-2143. Maruyama, K., Kametani, F., Usami, M., Yamao-Harigaya, W. und Tanaka, K. (1991) "Secretase," Alzheimer amyloid protein precursor secreting enzyme is not sequence-specific. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1670-1676. Mattson, M.P., Cheng, B., Culwell, A.R., Esch, F.S., Lieberburg, I. und Rydel, R.E. (1993) Evidence for excitoprotective and intraneuronal calcium-regulating roles for secreted forms of the beta amyloid precursor protein. Neuron 10, 243-254. McGeer, P. .L und McGeer, E. G. (1995) The inflammatory response system of brain: implications for therapy of Alzheimer and other neurodegenerative diseases. Brain Res. Brain Res. Rev. 21, 195-218. Meerabux, J., Yaspo, M. .L, Roebroek, A. J., Van de Ven, W. J., Lister, T. A. und Young, B. D. (1996) A new member of the proprotein convertase gene family (LPC) is located at a chromosome translocation breakpoint in lymphomas. Cancer Res. 56, 448-451. Merlos-Suárez, A., Fernández-Larrea, J., Reddy, P., Baselga, J. und Arribas, A. (1998) Pro-tumor necrosis factor-α processing activity is tightly controlled by a component that does not affect Notch processing. J. Biol. Chem. 273, 24955-24962. Milla, M. E., Leesnitzer, M. A., Moss, M. L., Clay, W. C., Carter, H. L., Miller, A. B., Su, J.L., Lambert, M. H., Willard, D. H., Sheeley, D. M., Kost, T. A., Burkhart, W., Moyer, M., Blackburn, R. K., Pahel, G. L., Mitchell, J. L., Hoffman, C. R. und Becherer, J. D. (1999) Specific sequence elements are required for the expression of functional tumor necrosis factor-α-converting enzyme (TACE). J. Biol. Chem. 274, 3056330570. Mills, J. und Reiner, P. B. (1999) Regulation of amyloid precursor protein cleavage. J. Neurochem. 72, 443-460. LITERATUR 135 Molloy, S. S., Thomas, L., VanSlyke, J. K., Stenberg, P. E. und Thomas, G. (1994) Intracellular trafficking and activation of the furin proprotein convertase: localization to the TGN and recycling from the cell surface. EMBO J. 13, 18-33. Molloy, S. S., Anderson, E. D., Jean, F. und Thomas, G. (1999) Bi-cycling the furin pathway: from TGN localization to pathogen activation and embryogenesis. Trends Cell Biol. 9, 28-35. Morimoto, T., Ohsawa, I., Takamura, C., Ishiguro, M. und Kohsaka, S. (1998) Involvement of amyloid precursor protein in functional synapse formation in cultured hippocampal neurons. J. Neurosci Res. 51, 185-195. Moss, M. L., Jin, S.-L. C., Milla, M. E., Burkhart, W., Carter, H. L., Chen, W.-J., Clay, W. C., Didsbury, J. R., Hassler, D., Hoffman, C. R., Kost, T. A., Lambert, M. H., Leesnitzer, M. A., McCauley, P., McGeehan, G., Mitchell, J., Moyer, M., Pahel, G., Rocquel, W., Overton, L. K., Schoenen, F., Seaton, T., Su, J.-L., Warner, J., Willard, D. und Becherer, J. D. (1997) Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumor-necrosis factor-α. Nature 385, 733-736. Muga, A., Neugebauer, W., Hirama, T. und Surewicz, W. K. (1994) Membrane Interaction and Conformational Properties of the Putative Fusion Peptide of PH-30, a Protein Active in Sperm-Egg Fusion. Biochemistry 33, 4444-4448. Munzer, J. S., Basak, A., Zhong, M., Mamarbachi, A., Hamelin, J., Savaria, D., Lazure, C., Benjannet, S., Chretien, M. und Seidah, N. G. (1997) In vitro characterization of the novel proprotein convertase PC7. J. Biol. Chem. 272, 19672-19681. Myles, D. G., Kimmel, L. H., Blobel, C. P., White, J. M. und Primakoff, P. (1994) Identification of a binding site in the disintegrin domain of fertilin required for sperm-egg fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4195-4198. Nakayama, K. (1997) Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins. Biochem. J. 327, 625-635. Niewiarowski, S., McLane, M. A., Kloczewiak, M. und Stewart, G. J. (1994) Disintegrins and other naturally occurring antagonists of platelet fibrinogen receptors. Semin. Hematol. 31, 289-300. LITERATUR 136 Nitsch, R. M., Slack, B. E., Wurtman, R. J. und Growdon, J. H. (1992) Release of Alzheimer amyloid precursor derivatives stimulated by activation of muscarinic acetylcholine receptors. Science 258, 304-307. Nitsch, R. M., Slack, B. E., Farber, S. A., Schulz, J. G., Deng, M., Kim, C., Borghesani, P. R., Korver, W., Wurtman, R. J. und Growdon, J. H. (1994) Regulation of proteolytic processing of the amyloid beta-protein precursor of Alzheimer's disease in transfected cell lines and in brain slices. J. Neural. Transm. Suppl. 44, 21-27. Nitsch, R. M. und Growdon, J. H. (1994) Role of neurotransmission in the regulation of amyloid beta-protein precursor processing. Biochem. Pharmacol. 47, 1275-1284. Nunan, J. und Small, D. H. (2000) Regulation of APP cleavage by α-, β- and γSecretases. FEBS Lett. 483, 6-10. Owen, M. C., Brennan, S. O., Lewis, J. H. und Carrell, R. W. (1983) Mutation of antitrypsin to antithrombin. alpha 1-antitrypsin Pittsburgh (358 Met leads to Arg), a fatal bleeding disorder. N. Engl. J. Med. 309, 694-698. Pan, D. und Rubin, G. M. (1997) Kuzbanian Controls Proteolytic Processing of Notch and Mediates Lateral Inhibition during Drosophila and Vertebrate Neurogenesis. Cell 90, 271-280. Parvathy, S., Hussain, I., Karran, E. H., Turner, A. J. und Hooper, N. M. (1999) Cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by alpha-secretase occurs at the surface of neuronal cells. Biochemistry 38, 9728-9734. Peschon, J. J., Slack, J. L., Reddy, P., Stocking, K. L., Sunnarborg, S. W., Lee, D. C., Russell, W. E., Castner, B. J., Johnson, R. S., Fitzner, J. N., Boyce, R. W., Nelson, N., Kozlosky, C. J., Wolfson, M. F., Rauch, C. T., Cerretti, D. P., Paxton, R. J., March, C. J. und Black, R. A. (1998) An Essential Role for Ectodomain Shedding in mammalian Development. Science 282, 1281-1284. Ponte, P., Gonzalez-DeWhitt, P., Schilling, J., Miller, J., Hsu, D., Greenberg, B., Davis, K., Wallace, W., Lieberburg, I., Fuller, F. und Cordell, B. (1988) A new A4 amyloid mRNA contains a domain homologous to serine protease inhibitors. Nature 331, 525-527. LITERATUR 137 Pawson, T. (1995) Protein modules and signalling networks. Nature 373, 573-580. Rawlings, N. D. und Barrett, A. J. (1995) Evolutionary Families of Metallopeptidases. Meth. Enzymol. 248, 183-228. Reddy, P., Slack, J. L., Davis, R., Cerretti, D. P., Kozlosky, C. J., Blanton, R. A., Shows, D., Pescon, J. J. und Black, R. A. (2000) Functional Analysis of the Domain Structure of Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme. J. Biol. Chem. 275, 14608-14614. Roebroek, A. J., Schalken, J. A., Bussemakers, M. J., van Heerikhuizen, H., Onnekink, C., Debruyne, F. M., Bloemers, H. P. und Van de Ven, W. J. (1986) Characterization of human c-fes/fps reveals a new transcription unit (fur) in the immediately upstream region of the proto-oncogene. Mol. Biol. Rep. 11, 117-125. Roghani, M., Becherer, J. D., Moss, M. L., Atherton, R. E., Erdjument-Bromage, H., Arribas, J., Blackburn, R. K., Weskamp, G., Tempst, P. und Blobel, C. P. (1999) Metalloprotease-Disintegrin MDC9: intracellular maturation and catalytic activity. J. Biol. Chem. 274, 3531-3540. Roher, A. E., Lowenson, J. D., Clarke, S., Woods, A. S., Cotter, R. J., Gowing, E. und Ball, M. J. (1993) beta-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: implications for the pathology of Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10836-10840. Rooke, J., Pan, D., Xu, T. und Rubin, G. M. (1996) KUZ, a conserved metalloproteasedisintegrin protein with two roles in Drosophila neurogenesis. Science 273, 12271231. Sambamurti, K., Shioi, J., Anderson, J. P., Pappolla, M. A. und Robakis, N. K. (1992) Evidence for intracellular cleavage of the Alzheimer's amyloid precursor in PC12 cells. J. Neurosci. Res. 33, 319-329. Savage, M. J., Trusko, S. P., Howland, D. S., Pinsker, L. R., Mistretta, S., Reaume, A. G., Greenberg, B. D., Siman, R. und Scott, R. W. (1998) Turnover of amyloid betaprotein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester. J. Neurosci. 18, 1743-1752. LITERATUR 138 Schäfer, W., Stroh, A., Berghöfer, S., Seiler, J., Vey, M., Kruse, M. L., Kern, H. F., Klenk, H.-D. und Garten, W. (1995) Two independent targeting signals in the cytoplasmatic domain determine trans-Golgi network localization and endosomal trafficking of the proprotein convertase furin. EMBO J. 14, 2424-2435. Schlöndorff, J., Becherer, J. D. und Blobel, C. P. (2000) Intracellular maturation and localization of the tumour necrosis factor alpha convertase (TACE). Biochem. J. 347, 131-138. Seidah, N. G., Chretien, M. und Day, R. (1994) The family of subtilisin/kexin like proprotein and pro-hormone convertases: divergent or shared functions. Biochimie 76, 197-209. Seidah, N. G., Hamelin, H., Mamarbachi, M., Dong, W., Tadros, H., Mbikay, M., Chretien, M. und Day, R. (1996) cDNA structure, tissue distribution, and chromosomal localization of rat PC7, a novel mammalian proprotein convertase closest to yeast kexin-like proteinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3388-3393. Seidah, N. G. und Chretien, M. (1999) Proprotein and prohormone convertases: a family of subtilases generating diverse bioactive polypeptides. Brain Res. 848, 45-62. Selkoe, D. J. (1996) Amyloid β-protein and the genetics of Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 271, 18295-18298. Selkoe, D. J. (1999) Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature 399, 23-31. Selkoe, D. J. (2001) Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol. Rev. 81, 741-766. Shi, X. P., Chen, E., Yin, K. C., Na, S., Garsky, V. M., Lai, M. T., Li, Y. M., Platchek, M., Register, R. B., Sardana, M. K., Tang, M. J., Thiebeau, J., Wood, T., Shafer, J. A. und Gardell, S. J. (2001) The pro domain of beta-secretase does not confer strict zymogen-like properties but does assist proper folding of the protease domain. J. Biol. Chem. 276, 10366-10373. LITERATUR 139 Shoji, M., Golde, T. E., Ghiso, J., Cheung, T. T., Estus, S., Shaffer, L. M., Cai, X. D., McKay, D. M., Tintner, R., Frangione, B. et al. (1992) Production of the Alzheimer amyloid beta protein by normal proteolytic processing. Science 258, 126-129. Siezen, R. J., de Vos, W. M., Leunissen, J. A. und Dijkstra, B. W. (1991) Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases. Protein Eng. 4, 719-737. Simons, M., Keller, P., De Strooper, B., Beyreuther, K., Dotti, C. G. und Simons, K. (1998) Cholesterol depletion inhibits the generation of beta-amyloid in hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6460-6464. Sinha, S., Anderson, J. P., Barbour, R., Basi, G. S., Caccavello, R., Davis, D., Doan, M., Dovey, H. F., Frigon, N., Hong, J., Jacobson-Croak, K., Jewett, N., Keim, P., Knops, J., Lieberburg, I., Power, M., Tan, H., Tatsuno, G., Tung, J., Schenk, D., Seubert, P., Suomensaari, S. M., Wang, S., Walker, D., Zhao, J., McConlogue, L. und John, V. (1999) Purification and cloning of amyloid precursor protein betasecretase from human brain. Nature 402, 537-540. Sisodia, S. S. (1992) ß-Amyloid precursor protein cleavage by a membrane-bound protease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6075-6079. Skovronsky, D. M., Moore, D. B., Milla, M. E., Doms, R. W. und Lee, V. M.-Y. (2000) Protein Kinase C-dependent α-secretase competes with β-secretase for cleavage of amyloid-β precursor protein in the trans-Golgi network. J. Biol. Chem. 275, 2568-2575. Slack, B. E., Ma, L. K. und Seah, C. C. (2001) Constitutive shedding of the amyloid precursor protein ectodomain is up-regulated by tumour necrosis factor-alpha converting enzyme. Biochem. J. 357, 787-794. Small, D.H., Nurcombe, V., Reed, G., Clarris, H., Moir, R., Beyreuther, K. und Masters, C.L. (1994) A heparin-binding domain in the amyloid protein precursor of Alzheimer's disease is involved in the regulation of neurite outgrowth. J. Neurosci. 14, 2117-2127. LITERATUR 140 Solomon, K. A., Covington, M. B., DeCicco, C. P. und Newton, R. C. (1997) The fate of pro-TNF-alpha following inhibition of metalloprotease-dependent processing to soluble TNF-alpha in human monocytes. J. Immunol. 159, 4524-4531. Steiner, D. F. (1998) The proprotein convertases. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 31-39. Stöcker, W., Grams, F., Baumann, U., Reinemer, P., Gomis-Ruth, F. X., McKay, D. B. und Bode, W. (1995) The metzincins-topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases. Protein Sci. 4, 823-840. Takahashi, S., Kasai, K., Hatsuzawa, K., Kitamura, N., Misumi, Y., Ikehara, Y., Murakami, K. und Nakayama, K. (1993) A mutation of furin causes the lack of precursorprocessing activity in human colon carcinoma LoVo cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15, 1019-1026. Teuchert, M., Berghofer, S., Klenk, H. D. und Garten, W. (1999) Recycling of furin from the plasma membrane. Functional importance of the cytoplasmic tail sorting signals and interaction with the AP-2 adaptor medium chain subunit. J. Biol. Chem. 274, 36781-36789. Teuchert, M., Schafer, W., Berghofer, S., Hoflack, B., Klenk, H. D., Garten, W. (1999) Sorting of furin at the trans-Golgi network. Interaction of the cytoplasmic tail sorting signals with AP-1 Golgi-specific assembly proteins. J. Biol. Chem. 274, 8199-8207. Tomita, S., Kirino, Y. und Suzuki, T. (1998) Cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein (APP) by secretases occurs after O-glycosylation of APP in the protein secretory pathway. Identification of intracellular compartments in which APP cleavage occurs without using toxic agents that interfere with protein metabolism. J. Biol. Chem. 273, 6277-6284. van de Loo, J. W., Creemers, J. W., Bright, N. A., Young, B. D., Roebroek, A. J. und Van de Ven, W. J. (1997) Biosynthesis, distinct post-translational modifications, and functional characterization of lymphoma proprotein convertase. J. Biol. Chem. 272, 27116-27123. LITERATUR 141 van de Loo, J. W., Teuchert, M., Pauli, I., Plets, E., Van de Ven, W. J. und Creemers, J. W. (2000) Dynamic palmitoylation of lymphoma proprotein convertase prolongs its half-life, but is not essential for trans-Golgi network localization. Biochem. J. 352, 827-833. van den Ouweland, A. M., van Duijnhoven, H. L., Keizer, G. D., Dorssers, C. und Van de Ven, W. J. (1990) Structural homology between the human fur gene product and the subtilisin-like protease encoded by yeast KEX2. Nucleic Acids Res. 18, 664. van de Ven, W. J., Voorberg, J., Fontijn, R., Pannekoek, H., van den Ouweland, A. M., van Duijnhoven, H. .L, Roebroek, A. J. und Siezen, R. J. (1990) Furin is a subtilisin-like proprotein processing enzyme in higher eukaryotes. Mol. Biol. Rep. 14, 265-275. Van de Ven, W. J., Roebroek, A. J. und Van Duijnhoven, H. L. (1993) Structure and function of eukaryotic proprotein processing enzymes of the subtilisin family of serine proteases. Crit. Rev. Oncog. 4, 115-136. Van Wart, H. E. und Birkedal-Hansen, H. (1990) The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5578-5582. Vassar, R., Bennett, B. D., Babu-Khan, S., Kahn, S., Mendiaz, E. A., Denis, P., Teplow, D. B., Ross, S., Amarante, P., Loeloff, R., Luo, Y., Fisher, S., Fuller, J., Edenson, S., Lile, J., Jarosinski, M. A., Biere, A. L., Curran, E., Burgess, T., Louis, J. C., Collins, F., Treanor, J., Rogers, G. und Citron, M. (1999) Beta-secretase cleavage of Alzheimer`s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science 286, 735-741. Vey, M., Schafer, W., Berghofer, S., Klenk, H. D. und Garten, W. (1994) Maturation of the trans-Golgi network protease furin: compartmentalization of propeptide removal, substrate cleavage, and COOH-terminal truncation. J. Cell Biol. 127, 1829-1842. Vidricaire, G., Denault, J. B. und Leduc, R. (1993) Characterization of a secreted form of human furin endoprotease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 1011-1018. LITERATUR 142 Walter, J., Fluhrer, R., Hartung, B., Willem, M., Kaether, C., Capell, A., Lammich, S., Multhaup, G. und Haass, C. (2001) Phosphorylation regulates intracellular trafficking of beta-secretase. J. Biol. Chem. 276, 14634-14641. Wang, R., Meschia, J. F., Cotter, R. J. und Sisodia, S. S. (1991) Secretion of the beta/A4 amyloid precursor protein. Identification of a cleavage site in cultured mammalian cells. J. Biol. Chem. 266, 16960-16964. Weidemann, A., Konig, G., Bunke, D., Fischer, P., Salbaum, J. M., Masters, C. L. und Beyreuther, K. (1989) Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer's disease A4 amyloid protein. Cell 57, 115-126. Weninger, S. C. und Yankner, B.A. (2001) Inflammation and Alzheimer disease: the good, the bad, and the ugly. Nat. Med. 7, 527-528. Wild-Bode, C., Yamazaki, T., Capell, A., Leimer, U., Steiner, H., Ihara, Y. und Haass, C. (1997) Intracellular generation and accumulation of amyloid beta-peptide terminating at amino acid 42. J. Biol. Chem. 272, 16085-16088. Wolfsberg, T. G., Bazan, J. F., Blobel, C. P., Myles, D. G., Primakoff, P. und White, J. M. (1993) The precursor region of a protein active in sperm-egg fusion contains a metalloprotease and a disintegrin domain: Structural, functional, and evolutionary implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10783-10787. Wolfsberg, T. G., Primakoff, P., Myles, D. G. und White, J. M. (1995) ADAM, a Novel Family of Membrane Proteins Containing A Disintegrin And Metalloprotease Domain: Multipotential Functions in Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. J. Cell Biol. 131, 275-278. Wolfsberg, T. G. und White, J. M. (1996) ADAMs in Fertilization and Development. Dev. Biol. 180, 389-401. Wolozin, B., Hirashima, N., Luo, Y., Li, Y. H., Alkon, D. L., Etcheberrigaray, R. und Sunderland, T. (1995) Transforming growth factor beta induces a beta-responsive calcium fluxes in neurons. Neuroreport 6, 1429-1433. LITERATUR 143 Wouters, S., Leruth, M., Decroly, E., Vandenbranden, M., Creemers, J. W. M., van de Loo, J.-W. H. P., Ruysschaert, J.-M. und Courtoy, P. J. (1998) Furin and proprotein convertase 7 (PC7)/lymphoma PC endogenously expressed in rat liver can be resolved into distinct post-Golgi compartments. Biochem. J. 336, 311-316. Xu, H., Sweeney, D., Wang, R., Thinakaran, G., Lo, A. C., Sisodia, S. S., Greengard, P. und Gandy, S. (1997) Generation of Alzheimer beta-amyloid protein in the transGolgi network in the apparent absence of vesicle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3748-3752. Yagami-Hiromasa, T., Sato, T., Kurisaki, T., Kamijo, K., Nabeshima, Y.-I. und FujisawaSehara (1995) A metalloprotease-disintegrin participating in myoblast fusion. Nature 377, 652-656. Yan, R., Bienkowski, M. J., Shuck, M. E., Miao, H., Tory, M. C., Pauley, A. M., Brashier, J. R., Stratman, N. C., Mathews, W. R., Buhl, A. E., Carter, D. B., Tomasselli, A. G., Parodi, L. A., Heinrikson, R. L. und Gurney, M. E. (1999) Membrane-anchored aspartyl protease with Alzheimer's disease beta-secretase activity. Nature 402, 533-537. Yankner, B. A. (1996) Mechanisms of neuronal degeneration in Alzheimer's disease. Neuron 16, 921-932. Yavari, R., Adida, C., Bray-Ward, P., Brines, M. und Xu, T. (1998) Human metalloprotease-disintegrin Kuzbanian regulates sympathoadrenal cell fate in development and neoplasia. Hum. Mol. Genet. 7, 1161-1167. Zhang, X. P., Kamata, T., Yokoyama, K., Puzon-McLaughlin, W. und Takada, Y. (1998) Specific interaction of the recombinant disintegrin-like domain of MDC-15 (metargidin, ADAM-15) with integrin αvβ3. J. Biol. Chem. 273, 7345-7350. Zhang, Y., Jiang, J., Black, R. A., Baumann, G. und Frank, S. J. (2000) Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme (TACE) Is a Growth Hormone Binding Protein (GHBP) Sheddase: The Metalloprotease TACE/ ADAM-17 Is Critical for (PMAInduced) GH-Receptor Proteolysis and GHBP Generation. Endocrinology 141, 4342-4348. LITERATUR 144 Zhou, A., Webb, G., Zhu, X. und Steiner, D. F. (1999) Proteolytic processing in the secretory pathway. J. Biol. Chem. 274, 20745-20748. Zhou, M., Graham, R., Russel, l G. und Croucher, P. I. (2001) MDC-9 (ADAM-9/Meltrin gamma) functions as an adhesion molecule by binding the alpha(v)beta(5) integrin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280, 574-580. Wissenschaftliche Veröffentlichung Anders, A., Gilbert, S., Garten, W., Postina, R. und Fahrenholz, F. (2001) Regulation of the α-secretase ADAM10 by its prodomain and proprotein convertases. FASEB J. 10.1096/fj.010007fje. Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt und dass ich noch keinen Promotionsversuch unternommen habe. Mainz, den 10.10.2001 Andreas Anders
