Untersuchung der molekularen Mechanismen einer EGFR
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin I Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. G. Adler Untersuchung der molekularen Mechanismen einer EGFR- Blockade induzierten Wachstumshemmung im Pankreaskarzinom Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Stefan Börsig aus Schwäbisch Hall im Jahr 2009 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: PD Dr. Volker Ellenrieder 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Marko Kornmann Tag der Promotion: 24.06.2010 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... III 1. Einleitung .......................................................................................................... 1 1.1 Das Pankreaskarzinom ................................................................................. 1 1.2 Kanzerogenese ............................................................................................. 2 1.3 Von der intraepithelialen Neoplasie zum invasiven Karzinom ....................... 4 1.4 Wachstumsfaktoren und Rezeptoren im Pankreaskarzinom ........................ 7 1.5 Die Familie der ErbB Rezeptortyrosinkinasen .............................................. 7 1.6 Die EGF-Signalkaskade als neuer Therapieansatz beim Pankreaskarzinom 9 1.7 Cetuximab ................................................................................................... 11 1.8 Ziele dieser Arbeit ....................................................................................... 13 2. Material und Methoden .................................................................................. 14 2.1 Zellkultur ..................................................................................................... 14 2.2 Transfektion der Zelllinien ........................................................................... 17 2.3 Proteinanalysen .......................................................................................... 19 2.4 DNA-Pulldown Assay .................................................................................. 26 2.5 Thymidin-Proliferationsassay ...................................................................... 27 2.6 Luciferase-Reportergenassay ..................................................................... 27 2.7 RNA-Analyse .............................................................................................. 28 3. Ergebnisse ...................................................................................................... 33 3.1 Untersuchungen zur Wirkung des EGFR-Antikörpers Cetuximab auf Pankreaskarzinomzelllinien .............................................................................. 33 3.2 Expression von NFATc2 in Pankreaskarzinomzelllinien ............................. 36 3.3 Regulation von NFATc2 durch die EGFR-Erk Kaskade .............................. 37 3.4 Knockdown von NFATc2 hemmt EGF/FCS induziertes Wachstum ............ 49 3.5 Identifikation von NFATc2 Targetgenen der Zellzykluskontrolle ................. 52 Inhaltsverzeichnis II 4. Diskussion ...................................................................................................... 54 4.1 Die EGF-Rezeptor Signalkaskade als therapeutischen Ansatz bei der Behandlung des Pankreaskarzinoms................................................................ 54 4.2 Interpretation der Ergebnisse zur Regulation von NFATc2 durch die EGFRezeptor Signalkaskade im Pankreaskarzinom ................................................ 58 4.3 Interpretation der Ergebnisse zur Rolle von NFATc2 bei der Zellzyklusregulation im Pankreaskarzinom ....................................................... 61 4.4 Bedeutung und Ausblick ............................................................................. 63 5. Zusammenfassung ......................................................................................... 65 6. Literaturverzeichnis ....................................................................................... 67 Danksagung ........................................................................................................ 78 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis μCi Mikrocurie µg Mikrogramm µL Mikroliter µM Mikromolar Abl Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene ADCC antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity Akt v-akt murine thymoma viral oncogene homologue APS Ammoniumperoxodisulfat BAD BCL2-associated agonist of cell death BCL-2 B-cell lymphoma 2 BRCA2 breast cancer 2 BSA Bovines Serumalbumin BTE basic transcription element C Celsius c.a. konstitutiv aktiv CASP9 Caspase 9 CDK Cyclinabhängige Kinasen cDNA complementary DNA CML chronische myeloische Leukämie CsA Cyclosporin A DEPC Diethylenpyrocarbonat DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium d.n. dominant negativ dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DNA Desoxyribonukleinsäure DPC4 deleted in pancreatic cancer locus 4 DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EGF(R) Epidermaler Wachstumsfaktor(rezeptor) III Abkürzungsverzeichnis EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure Erk Extrazellulär regulierte Kinase FCS Fötales Kälberserum for vorwärts FTI Farnesyltransferaseinhibitor GAP GTPase-activating protein GDP Guanosindiphosphat GRB2 growth factor receptor binding protein 2 GTP Guanosintriphosphat HB-EGF Heparin-binding EGF-like growth factor HCl Salzsäure HEPES Hydroxyethyl-Piperazinethan-Sulfonsäure HER-2/neu human epidermal growth factor receptor 2 H2PO4 Dihydrogenphosphat HRP Peroxidase aus Meerrettich Ig Immunglobulin IKK Inhibitorische kappa B Kinase INK4 CDK4 Inhibitor Jak Janus-Kinase kb Kilobasen KCl Kaliumcyanid KLF Kruppel-like transcription factors Luc Luciferase M Mol/Liter mA Milliampere MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MAPKK Mitogen-aktivierte Proteinkinase Kinase MEK MAP/ ERK Kinase mM Millimolar mRNA Messenger Ribonukleinsäure mTOR mammalian target of Rapamycin IV Abkürzungsverzeichnis NaCl Natriumchlorid NaF Natriumfluorid Na2HPO4 Dinatriumphosphat NaOH Natronlauge Na4P2O7 Tetranatriumdiphosphat NFAT nuclear factor of activated T-cells NFκB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells ng Nanogramm nm Nanometer PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PanIN Pankreatische Intraepitheliale Neoplasie PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction PDGF(R) platelet-derived growth factor (receptor) pErk phosphoryliertes Erk PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase Raf Rat fibrosarcoma Ras Rat sarcoma Rb Retinoblastoma Protein rev revers RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA Interferenz-Methode RNAsin Rnase-Inhibitor rpm Umdrehungen pro Minute RSV Rous-Sarkom-Virus RT Reverse Transkriptase SDS Natriumdodecylsulfat SHc Src homology 2 domain containing siRNA Small interfering RNA Smad Signalling mother against decapentaplegic peptide V Abkürzungsverzeichnis SOS son of sevenless Sp1 signal protein 1 STAT signal transducers and activators of transcription TBS tris buffered saline TBST tris buffered saline mit Tween TCA Trichloressigsäure TCF transcription factor TEMED Tetramethylethylenediamine TGF transforming growth factor TonEBP tonicity-responsive enhancer binding protein Tris Trishydroxymethanomethan Tween Polyoxyetylenesorbitan U Einheiten U/min Umdrehungen pro Minute VEGFR vascular/endothelial growth factor Rezeptor v/v Volumen/Volumen w/v Gewicht/Volumen w/w Gewicht/Gewicht VI Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Das Pankreaskarzinom Im Vergleich zum Mamma-, Prostata- oder Bronchialkarzinom nimmt das Pankreaskarzinom mit etwa 3% einen eher geringen Anteil an den jährlichen malignen Neuerkrankungen ein. Trotz dieser im Vergleich zu anderen malignen Erkrankungen niedrigen Inzidenz ist das Pankreaskarzinom für 6,1% der Krebstodesfälle in Deutschland verantwortlich. Somit ist das Pankreaskarzinom die vierthäufigste Krebstodesursache bei der Frau und die fünfthäufigste Krebstodesursache beim Mann. Die ausgesprochen hohe Aggressivität, schnelles Tumorwachstum und somit oft mangelnde therapeutische Möglichkeiten beim Pankreaskarzinom führen zu einer sehr ungünstigen 5-Jahres Überlebensrate von 4% bei Frauen und 5% bei Männern (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., 2006). Nicht selten wird die Diagnose des Pankreaskarzinoms erst in einem weit fortgeschrittenen Tumorstadium gestellt, da Frühsymptome oft fehlen oder sehr unspezifisch sind. So finden sich sehr häufig bei Diagnosestellung bereits Lymphknotenmetastasen oder Tumorabsiedelungen in andere Organe wie beispielsweise in die Nieren, die Leber oder die Lunge. Ebenfalls typisch für das Pankreaskarzinom ist eine Ausbreitung entlang der umgebenden Nervenscheiden (Takahashi, 1997). Das Pankreaskarzinom verfügt über eine ausgesprochen hohe Strahlen- und Chemoresistenz, so dass als einzige therapeutische Möglichkeit die vollständige Resektion des Tumors bleibt. Aufgrund der häufig erst späten Diagnosestellung ist dieses Verfahren als eine kurative Tumortherapie bei vielen Patienten nicht mehr möglich, da bei etwa 80% der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung schon Metastasen aufgetreten sind (Yeo, 2002). So bleiben nicht selten nur palliative Eingriffe als Mittel einer chirurgischen Intervention beim Pankreaskarzinom. Einleitung 2 Die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten für eine Erkrankung, bei welcher die Mortalität derzeit noch annährend deren Inzidenz erreicht, ist von dringender Notwendigkeit. Voraussetzung hierfür ist ein immer tiefgreifenderes Verständnis der genetischen und epigenetischen Ereignisse bei der Karzinogenese sowie eine immer genauere Kenntnis der regulativen Vorgänge auf molekularer Ebene in Karzinomen und insbesondere beim Pankreaskarzinom. Neue Erkenntnisse in diesem Bereich könnten nicht nur zu einem erweiterten Therapiespektrum beitragen, sondern ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Methoden zur Frühdiagnostik des Pankreaskarzinoms spielen und sind deshalb Gegenstand aktueller Untersuchungen. 1.2 Kanzerogenese In gesundem Gewebe besteht eine exakte Regulation von Zellproliferation und Zelltod. Krebszellen können sich dieser Regulation entziehen. Es kommt zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen Proliferation und programmiertem Zelltod hin zu einer übermäßigen, unkontrollierten Zellproliferation und damit zu der Entwicklung eines Tumors. Krebszellen unterscheiden sich jedoch auch über ihr Proliferationsverhalten hinaus von gesunden Zellen. Sie zeigen ein anderes Differenzierungsverhalten und unterscheiden sich auch funktionell oft deutlich von gesunden Zellen, was zu einer weiteren Progression der malignen Erkrankung beispielsweise durch Invasion und Metastasierung führen kann. Onkogene und Tumorsuppressorgene spielen eine wichtige Rolle bei der Ursache dieser Veränderungen. Onkogene entstehen durch Mutation aus so genannten Protoonkogenen, welche eine wichtige Rolle für die Funktion von gesunden Zellen im menschlichen Körper spielen. Sie werden nach ihren Genprodukten eingeteilt, für die sie kodieren. Diese können unter anderem Transkriptionsfaktoren (z.B. Wachstumsfaktorrezeptoren (z. B. Wachstumsfaktoren c-Myc), EGF-Rezeptor), (z. B. PDGF), transmembranäre membranassoziierte Einleitung 3 Tyrosinkinasen (z. B. Abl-Tyrosinkinase), membranassoziierte G-Proteine (k-Ras) oder Apoptosefaktoren sein. Durch Punktmutation oder chromosomale Translokation eines Protoonkogens kann es zur Bildung eines Onkogens kommen. Dies ist jedoch ein seltenes Ereignis, da Protoonkogene durch Mutation normalerweise ihre Funktion verlieren, was den Funktionsverlust der Zelle und Apoptoseinduktion zur Folge hat. Protoonkogene können durch Mutation jedoch aber auch an Funktion gewinnen (Gain of function mutation) und so je nach Typ des entstandenen Onkogens beispielsweise zu einer konstitutiven Aktivierung von Signaltransduktionswegen und zu einer gesteigerten Zellproliferation führen. Tumorsuppressorgene regulieren normalerweise den Zellzyklus. Für die Zellproliferation ist der Übergang von der G1-Phase in die S-Phase des Zellzyklus von entscheidender Bedeutung. In der S-Phase wird die DNA der Zelle repliziert, was nach Überprüfung der Replikation in der G2-Phase schließlich zur Zellteilung in der M-Phase führt. Für die Regulation des Übergangs von der G1-Phase in die S-Phase ist Cyclin D1 von entscheidender Bedeutung, Cyclin D1 bindet an die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen (CDKs) CDK4 und CDK6 und reguliert dadurch deren enzymatische Aktivität. Die Cyclin D1/CDK4 bzw. Cyclin D1/CDK6 Komplexe können nun das Wachstumssuppressorprotein Rb (Retinoblastoma Protein) phosphorylieren. Diese Phosphorylierung führt zur Freisetzung des im hypophosphorylierten Zustand durch Rb-Protein gebundenen Transkriptionsfaktors E2F. E2F bindet nun zusammen mit weiteren Faktoren an Promotorregionen der DNA und stimuliert so die Produktion von Faktoren, welche für eine weitere Progression des Zellzyklus in der G1-Phase und der S-Phase von entscheidender Bedeutung sind. Eine weitere wichtige Rolle bei der Regulation der CDKs spielen die Inhibitorproteine p15, p16, p18 und p19. Diese hemmen die CDK-abhängige Phosphorylierung des Rb-Proteins und führen somit zu einer Hemmung der Zellzyklusprogression. Durch Auftreten einer Mutation in einem Tumorsuppressorgen kann es zu einem Funktionsverlust des Genproduktes kommen (loss of function mutation). So führt beispielsweise eine Mutation des Tumorsuppressorgens mts1 zu einem Funktionsverlust von p16 und somit, durch Verlust der Hemmung der Cyclin D/CDK Komplexe, zu einer gesteigerten Einleitung 4 Phosphorylierung des Rb-Proteins und damit zu einer Störung der Zellzykluskontrolle und unkontrollierter Proliferation (Caldas et al., 1994) (Schutte et al., 1997). Das Rb-Protein selbst wird durch ein Tumorsuppressorgen kodiert. Kommt es zu einem Verlust dieses Gens, so führt dies ebenfalls zu unkontrollierter Zellproliferation. Ein weiteres wichtiges Tumorsuppressorgen ist p53. Beim vermehrten Auftreten von Schäden an der DNA kommt es zu einem Anstieg der Konzentration des p53 Proteins, einem Protein, welches als Wachstumsfaktor unter anderem zu einer gesteigerten Synthese des p21 Proteins führt. p21 bindet an CDK2 und CDK4 und verhindert die oben beschriebene Zellzyklusprogression. Für den Verlust der Funktion eines Tumorsuppressorgens reicht die Inaktivierung eines Allels durch Mutation im Genom normalerweise nicht aus, da diese Mutationen rezessiv wirken. Erst der Verlust des zweiten Allels führt zu einem Funktionsverlust (Loss of Heterozygosity) (Knudson, 1971). Dies führt dazu, dass Träger mit der Mutation nur eines Allels eines Tumorsuppressorgens klinisch inapparent sind, jedoch ein erhöhtes Risiko für eine Krebsentstehung haben. Der Funktionsverlust eines Tumorsuppressorgens oder die Entstehung eines Onkogens hat nicht zwangsläufig die Entstehung einer Krebserkrankung zur Folge. Vielmehr führt in der überwiegenden Zahl der Fälle erst die Summe mehrerer unterschiedliche Veränderungen im Genom zu einer malignen Neoplasie. Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte ein Tumorprogressionsmodel für das duktale Pankreaskarzinom erstellt werden. 1.3 Von der intraepithelialen Neoplasie zum invasiven Karzinom Es wird angenommen, dass die Entstehung eines invasiven Pankreaskarzinoms über mehrere Vorläuferläsionen, ähnlich der Adeno-Karzinom-Sequenz beim Kolorektalen Karzinom, abläuft. Diese Vorläuferläsionen lassen sich anhand ihrer zytologischen und histologischen Veränderungen in die Stadien PanIN1 bis PanIN3 einteilen (Abbildung 1). Wobei das Stadium PanIN3 einem Carcinoma in Einleitung 5 situ entspricht (Hruban et al., 2000). Es gibt viele Hinweise, dass sich Pankreaskarzinome tatsächlich aus PanIN Vorstufen entwickeln können. So werden PanIN Läsionen beim Vorliegen einer Pankreaskarzinomerkrankung häufiger als im gesunden Pankreasgewebe gefunden (Cubilla und Fitzgerald, 1976). Darüber hinaus konnte bei einigen Patienten mit PanIN Läsionen gezeigt werden, dass sich nach einiger Zeit aus diesen Läsionen invasive Karzinome entwickelt haben (Brat et al., 1998). Neben diesen histopathologischen Beobachtungen tragen genomische Analysen von Karzinomen und PanIN Läsionen einen großen Teil zu der Theorie einer Entwicklung von PanIN Läsionen zu einem invasiven Karzinom bei. So konnte eine aktivierende Punktmutation im Kodon 12 des k-Ras Gens sowohl in allen PanIN Stufen als auch in invasiven Pankreaskarzinomen nachgewiesen werden. Eine Mutation des k-Ras Gens kann in 75-90% aller Pankreaskarzinome nachgewiesen werden (Almoguera et al., 1988). Neben dieser typischen Alteration kann darüber hinaus die Überexpression weiterer wichtiger Onkogene, wie beispielsweise NFATc2, gezeigt werden (Ellenrieder, unveröffentlichte Befunde). Zusätzlich lassen sich in PanIN Läsionen auch Mutationen von Tumorsuppressorgenen nachweisen. So tritt eine Mutation von p16 bereits im PanIN Stadium 2 und 3 auf. Diese Mutation ist ebenfalls bei 95% der invasiven Karzinome nachweisbar (Hruban, 1998) (Caldas, 1994). Sowohl im PanIN3 Stadium als auch im invasiven Karzinom lassen sich inaktivierende Mutationen der Tumorsuppressorgene p53 und Smad4 (DPC4) nachweisen. 50% aller Pankreaskarzinome zeigen eine Mutation im p53 Gen, ungefähr 50% aller Pankreaskarzinome eine Inaktivierung von Smad 4 (Rozenblum et al., 1997)(Hahn et al., 1996). Smad 4 spielt eine wichtige Rolle bei der TGFβ vermittelten Wachstumshemmung in gesunden Zellen. Inaktivierenden Mutationen von Tumorsuppressorgenen oder aktivierende Mutationen von Protoonkogenen in einer Zelle haben weitreichende Folgen auf vielen Ebenen der Zellfunktion. So kann die Onkogenmutation eines Wachstumsfaktorrezeptors beispielsweise zu einer konstitutiven Aktivierung einer Signalkaskade führen. Oft kommt es dann zu einer Überexpression bestimmter Regulatorproteine, andere Proteine wiederum werden weniger exprimiert. Dadurch Einleitung 6 kann tief in andere Regulationsmechanismen der Zelle eingegriffen werden, mit weitreichenden Folgen für das Wachstums- und Differenzierungsverhalten. Abbildung 1: Tumorprogressionsmodel des duktalen Pankreaskarzinoms. Dargestellt sind die stadienabhängigen, histomorphologischen und genetischen Veränderungen bei der Entstehung des duktalen Pankreaskarzinoms aus Vorläuferläsionen (PanINs, Pankreatische Intraepitheliale Neoplasien). Normales Gangepithel verändert sich über veschiedene histologisch definierte Vorstufen zu einem infiltrierenden Karzinom. Eine Überexpression von HER-2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) und eine Punktmutation im K-ras (Rat sarcoma) Gen tritt relativ früh auf, während es in einem mittleren Stadium zu eine Inaktivierung des p16 Gens und erst in einem relativ späten Stadium zu einer Inaktivierung von p53, DPC4 (deleted in pancreatic cancer locus 4) und BRCA2 (breast cancer 2) kommt. (Hruban et al., 2000, S. 2970), ergänzt um NFAT1 (NFATc2, nuclear factor of activated T-cells) Einleitung 7 1.4 Wachstumsfaktoren und Rezeptoren im Pankreaskarzinom Wachstumsfaktoren werden von verschiedensten Zelltypen synthetisiert und können spezifisch Rezeptoren an der Zelloberfläche binden und diese aktivieren. Die Aktivierung eines Rezeptors führt wiederum zu der Aktivierung verschiedener intrazellulärer, an der Signaltransduktion beteiligter Proteine. Diese Proteine interagieren ihrerseits mit unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, was je nach den zugrunde liegenden Signalkaskaden zur Expression verschiedener Genmuster führt. Wachstumsfaktoren spielen so eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gewebshomöostase in gesunden Geweben. In Karzinomen kann es zu einer Überexpression von Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktorrezeptoren kommen. Folge dieser Überexpression kann dann die Störung einer Vielzahl von Zellfunktionen zur Folge haben. Je nach Wachstumsfaktor- oder Rezeptortyp kann eine gesteigerte Zellproliferation, Zellinvasion, Metastasierung oder Angiogenese Folge dieser Dysregulation von Signalkaskaden sein. Es sind inzwischen eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Rezeptoren bekannt, welche eine Rolle bei der Progression des Pankreaskarzinoms spielen können. Insbesondere Mitglieder aus der Familie der ErbB Rezeptortyrosinkinasen sind heute ins Zentrum des Interesses gerückt. 1.5 Die Familie der ErbB Rezeptortyrosinkinasen Der EGF-Rezeptor (EGFR, ErbB-1, HER-1) besteht aus einer extrazellulären Ligandenbindungsdomäne, einer transmembranären Domäne und einer intrazellulären Tyrosinkinasedomäne. Er gehört zu der Familie der ErbB Rezeptor Tyrosinkinasen. Weitere Mitglieder dieser Familie sind ErbB-2 (HER-2), ErbB-3 und ErbB-4. ErbB-3 unterscheidet sich von den übrigen Mitgliedern dieser Familie durch seine fehlende Tyrosinkinasefunktion. Einleitung 8 ErbB Rezeptoren werden durch Homodimerisierung mit einem identischen Rezeptor oder durch Heterodimerisierung mit einem anderen Mitglied der Rezeptorenfamilie aktiviert. Sowohl die Bindung eines spezifischen Liganden als auch eine durch Überexpression bedingte erhöhte Rezeptorendichte kann zu einer solchen Dimerisierung führen (Lemmon et al., 1994). Es gibt eine Vielzahl von Liganden, welche an den EGF- Rezeptor (EGFR) binden können. Neben EGF können auch TGFα, Amphiregulin, HB-EGF, Betacellulin und Epiregulin zu einer Rezeptordimerisierung führen. HB-EGF, Betaregulin und Epiregulin können sowohl EGFR als auch ErbB-4 binden (Klapper et al., 2000) (Olayioye et al., 2000). Obwohl bisher kein direkter Ligand für ErbB2 bekannt ist, ist seine Rolle für die Signaltransduktion über die ErbB-Familie keineswegs von untergeordneter Bedeutung. ErbB-2 ist vielmehr ein wichtiger Co-Rezeptor für ErbB-Liganden. Heterodimere innerhalb der ErbB-Familie werden bevorzugt mit ErbB-2 gebildet. Diese Heterodimere haben eine hohe Ligandenaffinität und eine hohe Signaltransduktionsaktivität (Sliwkowski et al., 1994) (Karunagaran et al., 1996) (Klapper et al., 1997) (Klapper et al., 2000). Die Vielzahl der möglichen Heterodimere und Homodimere, die innerhalb der ErbFamilie gebildet werden können, führt zu einer Vielfalt an Signalwegen, die reguliert werden können, denn nicht jede ErbB-Kombination in einem Dimer führt zu einer identischen Aktivierung von Signalwegen. Folge der Dimerisierung von ErbB-Rezeptoren ist eine Autophosphorylierung von Tyrosin-Resten an der intrazellulären Rezeptordomäne, welche hierdurch Bindestellen für Mediatoren intrazellulärer Signalkaskaden darstellen können (Schlessinger et al., 1992). Diese Mediatoren werden durch die Tyrosinkinase phosphoryliert und damit die Signalkaskade aktiviert. Eine der Hauptsignalkaskaden, die durch die ErbB-Familie aktiviert werden kann, ist der Ras-Raf-MEK-Erk Signalweg (Alroy et al., 1997). SHc GRB2 verbinden SOS mit dem aktivierten Rezeptor. SOS kann dann inaktives Ras-GDP in aktives Ras-GTP konvertieren (Gale et al., 1993). Über die weitere Aktivierung der Ras-Raf-MEKERK Signalkaskade werden schließlich eine Reihe von Transkriptionsfaktoren aktiviert, die letztendlich zu einer Stimulation der Zellproliferation führen können. Einleitung 9 Ein weiterer bedeutsamer Signalweg, welcher durch Mitglieder der ErbB-Familie aktiviert werden kann, ist die PI3-Kinase-Akt-Signalkaskade. Akt kann nach Aktivierung über die PI3-Kinase ebenfalls die Zellproliferation stimulieren. Darüber hinaus kann Akt durch Phosphorylierung von Mitgliedern der BCL-2 Familie und Caspase 9 zu einem anti-apoptotischen Effekt in der Zelle führen (Datta et al., 1997) (Cardone et al., 1998). Es gibt viele Hinweise darauf, dass Mitglieder der ErbB-Familie eine wichtige Rolle bei Malignomen spielen können. So wird EGFR in vielen epithelialen Tumoren überexprimiert. Eine Überexpression von ErbB-2 wird häufig in Mamma-, Ovarialund Magenkarzinomen beobachtet (Salomon et al., 1995). Im Pankreaskarzinom konnte sowohl für EGFR, ErbB-2 als auch ErbB-3 eine Überexpression gezeigt werden. Eine Amplifikation und Überexpression von ErbB2 ist jedoch ein vergleichsweise seltenes Ereignis im Pankreaskarzinom (Korc et al., 1992) (Yamanaka et al., 1993) (Friess et al., 1995). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in den meisten untersuchten Pankreaskarzinomen nicht nur der EGF-Rezeptor, sondern gleichzeitig auch EGF und/oder TGFα überexprimiert werden. So ist es nicht unwahrscheinlich, dass autokrine oder parakrine Stimulation bei der Progression im Pankreaskarzinom eine bedeutende Rolle spielt. So konnte beispielsweise nachgewiesen werden, dass Patienten mit Karzinomen, welche über eine Co-Expression von EGF-Rezeptor und TGFα, EGF oder Amphiregulin verfügen, eine schlechtere Prognose haben (Salomon et al., 1995). Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass eine Überexpression von EGF und EGF-Rezeptor mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert ist. 1.6 Die EGF-Signalkaskade als neuer Therapieansatz beim Pankreaskarzinom Neben den etablierten Therapieverfahren chirurgische Intervention, Strahlentherapie und Chemotherapie hat ein neuer Therapieansatz in der Onkologie in den letzten Jahren stetig an Bedeutung gewonnen. „Targeted Einleitung 10 Therapy“ ist der Überbegriff einer Vielzahl neuer Behandlungsmöglichkeiten bei der Therapie maligner Erkrankungen. Ziel hierbei ist der gezielte Eingriff in Regulationsmechanismen und Signaltransduktionswege der Tumorzellen durch spezifische Interaktion mit einem molekularen Ziel, beispielsweise einer Kinase oder eines Rezeptors an der Zelloberfläche. Basis für die Entwicklung neuer Substanzen auf diesem Gebiet ist die genaue Kenntnis der Regulationsmechanismen innerhalb einer Tumorzelle. So sind solche molekularen Ziele von besonderem Interesse, von denen bekannt ist, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Tumorproliferation oder Tumorprogression spielen können. Am Beispiel der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) mit dem small molecule Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib (Gleevec®) konnte gezeigt werden, wie effektiv eine solche Therapie sein kann. Imatinib blockiert spezifisch die Abl-Tyrosinkinase aus dem bcr-Abl Fusionsprotein. Das Tumorwachstum ist in diesem Fall von dieser durch die Mutation konstitutiv- aktiven Kinase abhängig. Dies kann den enormen Effekt von Imatinib bei der Therapie der CML erklären. Die Entwicklung neuer Substanzen im Rahmen einer Targeted Therapy beim Pankreaskarzinom oder anderer epithelialer Tumoren stellt sich als ungleich schwieriger dar. verschiedensten Die Variabilität Ebenen der der möglichen Zellregulation unter Veränderungen den auf unterschiedlichen Karzinomarten ist groß. Selbst unter Pankreaskarzinomen gibt es deutliche Unterschiede bezüglich beispielsweise Rezeptorexpression oder Signaltransduktion der Tumorzellen. Aufgrund seiner häufigen Überexpression in epithelialen Tumoren ist der EGF-Rezeptor und seine abhängigen Signalkaskaden in das Zentrum des Interesses bei der Entwicklung neuer Substanzen für eine Targeted Therapy gerückt (Abbildung 2). Einleitung 11 Abbildung 2: Ansätze für eine Targeted Therapy beim Pankreaskarzinom durch Inhibition des EGFR-Signalling (Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor) mithilfe von Antikörpern, Tyrosinkinaseinhibitoren, Farnesyltransferaseinhibitoren (FTIs) und siRNA (Small interfering RNA) (Ghaneh et al., 2007, S.1136) 1.7 Cetuximab Eine besonders viel versprechende Substanz auf dem Gebiet der Targeted Therapy des Pankreaskarzinoms ist der monoklonale Antikörper Cetuximab (Erbitux™, IMC-225, Fa. Merck, Darmstadt). Cetuximab verhindert über die Bindung des extrazellulären Anteils des EGF-Rezeptors eine Liganden-vermittelte Rezeptoraktivierung und die damit verbundene Aktivierung nachgeschalteter Einleitung 12 Signaltransduktionskaskaden, wie beispielsweise der Ras-Raf-MEK-Erk-Kaskade. Cetuximab ist bereits heute ein Bestandteil der Therapie des Kolorektalkarzinoms in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Irinotecan bei therapierefraktären, metastasierten Karzinomen, die den EGF-Rezeptor exprimieren. Auch bei der Behandlung von Patienten mit lokal fortgeschrittenem Plattenepithelkarzinom im Kopf und Halsbereich wird Cetuximab in Kombination mit Strahlentherapie erfolgreich angewendet (Bonner et al., 2006). Eine Anwendung von Cetuximab bei der Therapie des Pankreaskarzinoms ist bisher nur im Rahmen einiger klinischer Studien erfolgt. Diese lieferten jedoch zum Teil viel versprechende Ergebnisse. So war in einer Phase II Studie eine Kombination von Cetuximab mit Gemcitabine einer Monotherapie mit Gemcitabine hinsichtlich 1-Jahres Überlebensrate beim fortgeschrittenen Pankreaskarzinom überlegen (Xiong et al., 2004). In einer folgenden Phase III Studie konnte jedoch kein signifikanter Vorteil einer Kombination von Gemcitabine und Cetuximab im Vergleich zu einer Monotherapie mit Gemcitabine hinsichtlich Gesamt- Überleben und progressionsfreies Überleben gezeigt werden (Philip et al., 2007). Diese Studienergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit von Cetuximab beim Pankreaskarzinom noch nicht eindeutig belegt ist. Auch ist bisher über die Wirkung von Cetuximab auf molekularer Ebene in Pankreaskarzinomzellen nur wenig bekannt. Ein tieferes Verständnis über die intrazellulären Vorgänge bei einer Therapie mit Cetuximab könnte jedoch zu einer effektiveren Behandlung des Pankreaskarzinoms, beispielsweise durch die Entwicklung neuer Kombinationstherapien beitragen. Gegenstand dieser Arbeit soll deshalb die Untersuchung des Effekts von Cetuximab auf die intrazelluläre Signaltransduktion und Genexpression sein. Einleitung 1.8 Ziele dieser Arbeit Welchen Einfluss hat Cetuximab auf Pankreaskarzinomzellen in vitro? Welche Transkriptionsfaktoren werden durch Cetuximab beeinflusst? Wie werden diese Transkriptionsfaktoren reguliert? Welche Gene werden durch Cetuximab beeinflusst? 13 Material und Methoden 14 2. Material und Methoden 2.1 Zellkultur Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die verwendeten Zelllinien, deren Kultivierungsmedium, Abstammung und Herkunft. Das Kultivierungsmedium DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) wurde jeweils mit 10% FCS (Fötales Kälberserum) und Normocin™ (50 mg/500 ml Medium) angereichert. Die Zellen wurden bei einer Temperatur von 37°C und einer Atmosphäre mit einem Anteil von 5% CO2 inkubiert. Waren die Zellen konfluent gewachsen, wurden die Zellen nach Entfernung des Nährmediums mit 1x PBS-Puffer gewaschen und mit 1 ml Trypsin/EDTA mobilisiert und vereinzelt. Anschließend wurden die Zellen bei 1000 rpm pelletiert. Die erneute Aussaat erfolgte abhängig von der Wachstumsgeschwindigkeit im Verhältnis 1:3 bis 1:10. Zur Ermittlung der Zellzahl pro ml Medium wurde eine Neubauer-Zählkammer verwendet. Tabelle 1: Verwendete Zelllinien Name Abstammung Kultivierungsmedium Herkunft 8988t Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) Deutsche Sammlung (Lebermetastase) von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig 8988s Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) Deutsche Sammlung (Lebermetastase) von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig S-028 Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) T. Iwamura (Lebermetastase) Department of Surgery I, Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan Material und Methoden 15 Fortsetzung Tabelle 1: Verwendete Zelllinien Name Abstammung Kultivierungsmedium Herkunft S-007 Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) T. Iwamura (Lebermetastase) Department of Surgery I, Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan IMIM-PC1 Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) F.X. Real, Institute (Lebermetastase) Municipale de Investigacion Medica, Barcelona, Spanien IMIM-PC2 Humanes Adenokarzinom DMEM (10% FCS) F.X. Real, Institute (Lebermetastase) Municipale de Investigacion Medica, Barcelona, Spanien Panc-1 Humane Pankreaskarzinomzelllinie DMEM (10% FCS) European Collection of Animal Cell Cultures, ECACC, Salisbury, Großbritannien Zellkultur-Materialien: Gewebekulturflaschen 650 ml, mit Filter Fa. Greiner, Frickenhausen Gewebekulturflaschen 250 ml, mit Filter Fa. Greiner, Frickenhausen Petrischalen 100 mm Fa. Greiner, Frickenhausen 24-well Kulturplatten Fa. Becton Dickinson, Heidelberg 12-well Kulturplatten Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Eppendorf Reaktionsgefäße Fa. Eppendorf, Hamburg Zellschaber Fa. Costar, Bodenheim Zellkultur-Geräte: Lamin Air HBB 2448 Bench Fa. Heraeus Instruments, Material und Methoden 16 Langenselbold WTB Brutschrank Fa. Binder, Tuttlingen Zellkultur-Reagenzien: DMEM Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA Normocin™ Fa. Amaxa, Köln FCS Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA Trypsin-EDTA (1x) 1x PBS-Puffer : Fa. Biochrom AG, Berlin 140 mM NaCl 3 mM KCl 10 mM Na2HPO4 2 mM H2PO4 mit HCl auf pH 7,4 einstellen Tabelle 2 gibt einen Überblick über die in verschiedenen Versuchen zur Stimulation bzw. Inhibition der Zellen verwendeten Substanzen: Tabelle 2: Substanzen zur Stimulation und Inhibition Name Anwendung Hersteller Cetuximab (Erbitux ®) 250 µg/ml Fa. Merck, Darmstadt Uo126 0,5 µM Fa. Sigma Aldrich, St. Louis, USA FCS 100 µl/ml Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA Cyclosporin A (CsA) 1 µM Fa. Sigma Aldrich, St. Louis, USA EGF 25 ng/ml Fa. Sigma Aldrich, St. Louis, USA Material und Methoden 17 2.2 Transfektion der Zelllinien Zur Transfektion wurden DNA-Konstrukte und small interfering RNA (siRNA) verwendet. Durch transiente Transfektion von DNA kommt es in eukaryoten Zellen zu einer vorübergehenden Expression des transfizierten Konstruktes. Das Ziel der siRNA Transfektion ist die Reduzierung der Expression spezifischer Zielgene durch RNA-Interferenz. Nach Einbringen der 21-28 Nukleotide langen, doppelsträngigen siRNA wird diese in einen Proteinkomplex RISC (RNA-induced silencing complex) eingebaut. Dieser Komplex bindet nun an die Ziel-mRNA und führt zu deren Abbau durch Ribonuclease H. Folge ist eine Reduktion des spezifischen Genproduktes. Zur Vorbereitung der Transfektion wurden am Vortag jeweils 60.000 Zellen pro well (24-well-Platte) bzw. 1.000.000 Zellen (100 mm Schale) ausgesät. 8988t und IMIM-PC1 Pankreaskarzinomzellen wurden zur transienten Transfektion von DNA Konstrukten mit TransfastTM Reagenz (Fa. Promega, Mannheim) behandelt. Zur transienten Transfektion mit small interfering RNA (siRNA) wurden 8988t Zellen und IMIM-PC1 Zellen mit TransMessenger TM (Fa. QIAGEN, Hilden) transfiziert. Zur Steigerung der Transfektionseffizienz wurde die Transfektion der siRNA nach 24h erneut durchgeführt. Die Transfektion wurde nach den Protokollen der Hersteller durchgeführt. Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten DNA-Konstrukte Name Beschreibung Herkunft 6 x BTE Reportergen: Luciferase Joanna Kaczynski Mayo Clinic, MN, USA pSp1-Luc Reportergen: Luciferase Sakai Toshiyuki Material und Methoden pNFκB- Reportergen: Luciferase Luc pNFAT- Fa. Stratagene, Cedar Creek, USA Reportergen: Luciferase Luc p53-Luc 18 Fa. Stratagene, Cedar Creek, USA Reportergen: Luciferase Fa. Stratagene, Cedar Creek, USA 3TP-Lux Promotorabschnitt: -730-CAGA-Box des Jeffrey L. Wrana PAI-1-Promotors Reportergen: Luciferase pGAS-Luc Reportergen: Luciferase Fa. Stratagene, Cedar Creek, USA TOPflash RSV Promotorabschnitt: TCF-Bindungselement Fa. Upstate, Reportergen: Luciferase Charlottesville, USA Rous-Sarkom-Virus Promotor R. Urrutia, Reportergen: Luciferase GI-Research Unit, Mayo Clinic, MI, USA NFAT NFAT-Expressionskonstrukt Anjana Rao, Boston, USA pSG5-v- konstitutiv aktiver EGF-Rezeptor Martin Privalsky konstitutiv-aktives Ras Christoph Weber ErbB Ras V12 bzw. Christoph Block MEK c.a. konstitutiv-aktives MEK Christoph Weber Ras N17 dominant-negatives Ras Christoph Weber Erk d.n. dominant-negatives Erk Christoph Weber Tabelle 4: Übersicht über die verwendeten siRNA Oligonukleotide Name Sequenz (Sense) Hersteller siRNA 5’-CCUCGCCAAUAAUGUCACCtt-3’ Fa. Ambion, Austin, TX, NFATc2#1 USA Material und Methoden siRNA 19 5’-GCUGAUGAGCGGAUCCUUAtt-3’ NFATc2#2 siRNA USA 5’-CCAUUAAACAGGAGCAGAAtt-3’ NFATc2#3 Kontrolle Fa. Ambion, Austin, TX, Fa. Ambion, Austin, TX, USA Silencer® Negative Control Fa. Ambion, Austin, TX, USA 2.3 Proteinanalysen 2.3.1 Herstellung von Gesamtzelllysaten Zur Proteinextraktion wurden die Zellen zunächst, nach Entfernung des Nährmediums, mit kaltem 1x PBS gewaschen. Es folgte die Zugabe des Zelllysepuffers (250 µl im 6-well/ 1 ml im 100mm-Dish) mit anschließender Inkubation über 30 min auf Eis. Im Anschluss wurden die Zellen im Lysepuffer mithilfe eines Zellschabers mobilisiert und in 1,5 ml Eppendorf Gefäße überführt. Die Zellen wurden durch mehrmaliges Aufziehen durch eine Kanüle aufgeschlossen. Unlösliche Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 4 °C und 14000 rpm abgetrennt und der proteinhaltige Überstand bei -80 °C gelagert. Zelllysepuffer (500 ml): 25 ml 1M HEPES pH 7.5 15 ml 5M NaCl 2,5 ml 200 mM EGTA 100 ml 50 % Glycerol 5 ml Triton100 2,1 g NaF 2,23 g Na4P2O7 x 10H2O Material und Methoden 20 Vor Anwendung wurden Complete Proteaseinhibitor Tabletten (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) zugeben (1 Tablette/10 ml). 1x PBS: siehe 2.1 2.3.2 Extraktion zytoplasmatischer und nukleärer Proteine Zunächst wurde das Nährmedium entfernt und die Zellen in kaltem 1x PBS gewaschen. Anschließend wurde erneut 1x PBS (1 ml) zugegeben und die Zellen darin mithilfe eines Zellschabers mobilisiert und in Eppendorf Gefäße überführt. Die Zellen wurden über 2 min bei 1600 rpm und 4°C pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 200 µl Puffer A resuspendiert. Nach Inkubation über 15 min im Kühlraum auf Eis wurden die Zellen durch Aspiration mit einer Kanüle lysiert. Nach Zentrifugation bei 6800 rpm wurde der Überstand (zytoplasmatische Proteine) abgenommen und nach Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff bei -80 °C gelagert. Das Pellet wurde in 50 µl Puffer B aufgenommen und über 60 min auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Nach Zentrifugation über 20 min bei 14.000 rpm wurde der Überstand (nukleäre Proteine) abgenommen und nach Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff bei -80 °C gelagert. Puffer A: 10 mM HEPES pH 7,9 10 mM KCL 0,1 mM EDTA 0,1 mM EGTA 0,1 mM DTT Material und Methoden Puffer B : 21 20 mM HEPES pH 7,9 0,4 M NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1 mM DTT Vor der Anwendung von Puffer A und Puffer B wurden jeweils Complete Proteaseinhibitor Tabletten (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) zugeben (1 Tablette/10 ml). 1x PBS: siehe 2.1 2.3.3 Quantifizierung von Proteinen Die Proteinkonzentration der gewonnenen Proben wurde photometrisch nach Bradford (Bradford, 1976) bestimmt. Hierfür wurde die BIO-RAD Protein Assay Reagenz (Fa. BIO-RAD, Hercules, USA) verwendet. In dieser Reagenz ist Coomassie brilliant blue G-250 enthalten. Bei Bindung von Proteinen an diesen Farbstoff ändert sich dessen Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm. Anhand der Zunahme der Absorption kann somit die Proteinkonzentration mithilfe einer Eichgeraden ermittelt werden. Zunächst wurde die BIO-RAD Protein Assay Reagenz 1:5 mit H2O verdünnt. Zu jeweils 500 μl dieser Reagenz wurden nun verschiedenen Mengen an Rinderserumalbumin (BSA, 2-12 μg/ml) (Fa. Serva, Heidelberg) zugegeben, um somit eine Eichgerade zu erstellen. In einem weiteren Ansatz wurde zur verdünnten Reagenz 1-5 μl der zu bestimmenden Proteinlösung zugegeben. Material und Methoden 22 Die Bestimmung der Absorption wurde mithilfe eines automatischen UVSpektrometers (LKB Biochrom 4060, Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) durchgeführt. 2.3.4 Western Blot Analyse 2.3.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Auftrennung der Proteine anhand ihres Molekulargewichtes erfolgte durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Lämmli (1976). Zunächst wurden die Proteine mit 5x Lämmli-Puffer versetzt und über 5 min bei 95 °C denaturiert. Anschließend wurden die Proteine in die Spuren des Sammelgels aufgetragen. Hier kommt es während der Elektrophorese zunächst zu einer Konzentration der Proteine. Die eigentliche Auftrennung der Proteine erfolgt anschließend im Trenngel. Um die analysierten Proteine später anhand ihrer Größe zuordnen zu können, wurde eine weitere Spur mit 5 µl eines Molekulargewichtsmarkers beladen (BenchMark prestained Protein ladder, Fa. Invitrogen, Carlsbad, USA). Die Laufzeit in den Gelelektrophoresekammern (Fa. Bio-Rad, Hercules, USA) betrug 1h bei 30 mA. Trenngel 7,5%: 2,0 ml Acrylamid (Acrylamid:N,N’-Methylenbisacrylamid; 29:1) 1,3 ml Trenngelpuffer 50 µl 10 % SDS (w/v) 25 µl 10 % APS (w/v) 2,5 µl TEMED 5,4 ml H2O Material und Methoden Sammelgel: 140 µl 23 Acrylamid (Acrylamid:N,N’-Methylenbisacrylamid; 29:1) 325 µl Sammelgelpuffer 12,5 µl 10% SDS (w/v) 6,25 µl 10% APS (w/v) 1,25 µl TEMED add 5 ml H2O Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/HCl pH 8,8 Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 5 Lämmli-Puffer: 225 mM Tris/HCl pH 6,8 50% Glycerin (v/v) 5% SDS (w/v) 0,02% Bromphenolblau (w/v) 100 mM DTT 1 SDSLaufpuffer: 0,1% SDS (w/v) 25 mM Tris 200 mM Glycin Material und Methoden 24 2.3.4.2 Proteintransfer Die im Gel aufgetrennten Proteine wurden mithilfe des Tank-Blotter Systems „Criterion“ (Fa. BioRad, Hercules, USA) auf die Protein-bindende Oberfläche einer Nitrocellulose-Membran (Fa. Schleicher & Schüll, Dussel) transferiert. Für den Transfer wurde Towbins-Puffer verwendet. In diesem wurden zunächst sowohl die Polyacrylamidgele als auch die Nitrocellulose-Membranen für kurze Zeit eingelegt. Anschließend wurden die Gele und Membranen zwischen, ebenfalls zuvor in Towbins-Puffer eingelegte Whatman-Papiere (Fa. Schleicher & Schuell, Dussel), gelegt. Gele und Membranen wurden hierbei so angeordnet, dass die negativ geladenen Proteine in Richtung des Stromflusses (von der Kathode zur Anode) auf die Nitrocellulose-Membran übertragen wurden. Der Proteintransfer wurde bei 400 mA und 4 °C über Nacht durchgeführt. Towbins-Puffer (1l): 200 ml 5 Salt 200 ml Methanol 500 µl 20 % SDS (w/v) add 1l H2O 250 mM Tris 5 Salt: 2M Glycin 2.3.4.3 Immunodetektion Zunächst wurden unspezifische Proteinbindungsstellen auf der NitrocelluloseMembran durch Inkubation mit Blockingpuffer über 1h bei Raumtemperatur blockiert. Es folgte die Inkubation mit dem jeweiligen spezifischen Material und Methoden 25 Primärantikörper, welcher in Blockingpuffer verdünnt wurde (siehe Tabelle 5). Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Membranen 3x über 5 min mit 1x TBST-Puffer gewaschen und über 1h bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper (siehe Tabelle 5) inkubiert. Nun wurden die Membranen erneut 3x über 5 min in 1x TBST-Puffer gewaschen. Dann wurde eine Chemolumineszenz-Substrat-Lösung (Lumi-Light Western Blotting Substrate, Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) zugegeben und über 5 min inkubiert. Die an den Sekundärantikörper gekoppelte „horseradish“ Peroxidase (HRP) konnte nun das zugegebene Substrat in einer Chemolumineszenzreaktion umsetzten. Somit konnten die durch Antikörper gebundenen Proteine durch Chemolumineszenz auf einem Röntgenfilm (Cronex, Fa. AGFA, München) sichtbar gemacht werden. Tabelle 5: Übersicht über die verwendeten Antikörper Primärantikörper Hersteller (Verdünnung) Sekundärantikörper Hersteller (Verdünnung) anti-NFATc2 Fa. Santa Cruz anti-mouse IgG Fa. Sigma-Aldrich, (1:250) Biotechnology, (1:10.000) St. Louis, USA Heidelberg anti-β-Aktin Fa. Sigma- (1:2.000) Aldrich, St. Louis, USA anti-Erk Fa. Cell anti-rabbit IgG Fa. Amersham (1:1000) Signaling, (1:5000) Biosciences, anti-pErk Danvers, USA (1:1000) anti-Lamin (1:1000) Aylesbury, Großbritannien Material und Methoden Blockingpuffer: 1 TBST-Puffer: 10 TBS-Puffer: 26 5% Milchpulver (w/v), Fa. Roth, Karlsruhe 1x TBST-Puffer 1x TBS-Puffer 0,1% Tween(v/v), Fa. Serva, Heidelberg 1,4 M NaCl 25 mM KCL 250 mM Tris pH auf 7,4 mit HCl einstellen 2.4 DNA-Pulldown Assay Hierfür wurde der proximale Promotorabschnitt des humanen Interleukin-2-Gens verwendet. Dieser Promotorabschnitt kann als Ziel von NFATc2 agieren, da dieser die passende NFAT-Konsensusbindungssequenz (GGAAA) enthält. Proteine aus nukleären Extrakten wurden mit 1 μg biotinylierten doppelsträngigen Oligonukleotiden (Fa. Biomers, Ulm) mit der Sequenz aus dem humanen Interleukin-2-Promotor (5`-AGGAGGAAAAACTGTTTC-3`) für 3h bei 4 °C auf dem Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend wurden mit Streptavidin gekoppelte Agarosebeads (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) zugegeben und erneut für 1h bei 4 °C auf dem Überkopfschüttler inkubiert. Nun wurden die Proben bei 1600 rpm abzentrifugiert und 3x mit 1 ml Zelllysepuffer (siehe Abschnitt 2.3.1) gewaschen. Zur Western Blot Analyse (siehe 2.3.4) wurden die Proben mit 50 µl 2x Lämmli über 5 min aufgekocht. Material und Methoden 27 2.5 Thymidin-Proliferationsassay Die Zellproliferationsrate lässt sich durch die Bestimmung des Einbaus von 3H markiertem Thymidin in die DNA proliferierender Zellen bestimmen. 24h nach Transfektion oder nach pharmakologischer Behandlung der Zellen in einer 24well-Platte wurde pro well 5 μCi [methyl-3H]-Thymidin (Fa. Amersham Biosciences, Aylesbury, Großbritannien) zugegeben. Nach Inkubation im Brutschrank über 4h wurde das Medium entfernt und durch eiskalte 5%ige Trichloressigsäure ersetzt. Nach 30 min wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem Wasser gewaschen und mit 500 µl 1 M NaOH lysiert. Das Lysat wurde mit 5 ml Szintillationscocktail (Fa. Packard, Dreieich) versetzt und anschließend die Radioaktivität mithilfe eines Liquid Scintillation Counters (Pharmacia Wallac 1410, Fa. Wallac, Freiburg) quantifiziert. 2.6 Luciferase-Reportergenassay Reportergenassays dienen der Analyse der Transkriptionsaktivität zuvor transfizierter Promotorkonstrukte (siehe Tabelle 3). Die Luciferase aus Photinus pyralis („Firefly“) diente hierbei als Reportergen. In einer 24-well-Platte wurden 4x104 Pankreaskarzinomzellen ausgesät und mit 100 ng des entsprechenden Promotorkonstruktes transfiziert. Zur Normalisierung der Transfektionseffizienz wurden jeweils 15 ng des „Renilla“ Reporterkonstruktes kotransfiziert. Dieses Konstrukt exprimiert die Luciferase der Renilla reformis und steht unter der Kontrolle des Rous-Sarkom-Virus (RSV) Promotors. Die Zellen wurden 48h später mit 1x PBS gewaschen. Anschließend wurde zur Lyse 100 µl 1x Passive Lysis Buffer (Fa. Promega, Mannheim) zugegeben und 15 min auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Homogenisierung und anschließender Zentrifugation bei 1.000 rpm wurde das Pellet verworfen und 20 µl des Material und Methoden 28 Überstandes zur Analyse abgenommen. Nun wurden die jeweiligen Substrate für die beiden Luciferaseenzyme „Firefly“ und „Renilla“ aus dem „Dual-Luciferase®Reporter Assay System“ (Fa. Promega, Mannheim) nacheinander zugegeben und die Biolumineszenz mittels eines Luminometers (Luminat LB 9501, Fa. Berthold Technologies, Mannheim) gemessen. Die „Firefly“-Aktivität entsprach der Induktion des entsprechenden Promotorkonstruktes. Durch die Bildung eines Quotienten mit der „Renilla“-Aktivität konnte die Transfektionseffizienz normalisiert werden. Alle Ansätze wurden in Dreifachbestimmung durchgeführt und Mittelwert bzw. Standardabweichung mithilfe der Computersoftware Microsoft Excel (Fa. Microsoft) berechnet. 1x PBS: siehe 2.1 2.7 RNA-Analyse 2.7.1 RNA-Extraktion aus Zelllinien Nach Entfernung des Kultivierungsmediums wurden die Zellen mit kaltem 1x PBS gewaschen und jeweils 2 ml RLT-Lysispuffer (Fa. QIAGEN, Hilden) versetzt mit 20 µl 2-Mercaptoethanol auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden anschließend mit einem Zellschaber mobilisiert und mit dem Lysispuffer abgenommen. Die RNAExtraktion erfolgte mithilfe des RNeasy Midi-Kit (Fa. QIAGEN, Hilden) nach Protokoll des Herstellers. Material und Methoden 29 2.7.2 cDNA Herstellung 2.7.2.1 DNase-Verdau der Gesamt-RNA Um genomische DNA zu entfernen, welche sich in der Probe befinden konnte, wurde zunächst ein DNase-Verdau nach folgendem Ansatz durchgeführt: 5 µl PCR-Puffer Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt 5 µg RNA 2 µl RNAsin Fa. Promega, Mannheim 1 µl DNase Fa. QIAGEN, Hilden add 50 µl Aqua bidest (DEPC-behandelt) Dieser Ansatz wurde über 30 min bei 37°C inkubiert. 2.7.2.2 Phenol-Chlorophorm-Extraktion Im Anschluss an den DNase-Verdau wurde eine Phenol-Chlorophorm-Extraktion durchgeführt, um in der Lösung enthaltene Proteine zu entfernen. Hierfür wurde die Probe mit 50 µl Aqua bidest (DEPC-behandelt) versetzt und anschließend 1 Volumen eines Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisches (Verhältnis 25:24:1) zugegeben. Es folgte eine Zentrifugation bei 13.000 rpm. Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt und erneut mit dem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch versetzt. Es erfolgte nun erneut eine Zentrifugation bei 13.000 rpm. Anschließend wurde die obere Phase erneut in ein neues Gefäß überführt. In einem weiteren Schritt wurde diese nun mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) versetzt, bei 13.000 rpm zentrifugiert und die obere Phase zur weiteren Behandlung abgenommen. Material und Methoden 30 2.7.2.3 Fällung der RNA Um eine höhere RNA-Konzentration zu erzielen, wurde der Probe 1/10 Volumen Natrium-Acetat (pH 5,2), 3 Volumen 100% Ethanol und 1 µl Muschelglycogen (Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) zugegeben. Es folgte die Fällung der RNA bei -80 °C über 30 min. Anschließend wurde die Probe über 30 min bei 13.000 rpm und einer Temperatur von 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen. Nun wurde das Pellet mithilfe einer Speedvac (Fa. Eppendorf, Hamburg) getrocknet und anschließend in 11 µl Aqua bidest gelöst. 2.7.2.4 Reverse Transkription Zunächst wurde 1 µl Random-Hexamer-Primer (0,5 µg/µl) (Fa. Biomer) zugegeben. Die Anlagerung der Primer erfolgte bei 70 °C über 10 min. Anschließend erfolgte eine Abkühlung der Probe auf Eis. Im Anschluss erfolgte die First-Strand-Synthese mithilfe des folgenden Ansatzes: + 4 µl First strand buffer Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA + 2 µl 0,1 M DTT Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA + 1 µl dNTP (10 mM) Fa. Peqlab, Erlangen Inkubation bei 43 °C über 2 min + 1 µl Superscript II (Reverse Transkriptase) Fa. Invitrogen Lifetechnologies, Carlsbad, USA Inkubation bei 42 °C über 50 min Im Anschluss weitere Inkubation bei 72 °C über 15 min zur Inaktivierung der Reversen Transkriptase. Material und Methoden 31 2.7.3 Real-Time-quantitative-PCR Die Quantifizierung der mRNA eines spezifischen Gens erfolgte mithilfe einer Real-Time-quantitative-PCR (polymerase chain reaction). Hierfür wurde der SYBR® Green PCR Master Mix (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) verwendet. SYBR® Green ist ein fluoreszierender Farbstoff, welcher in der Lage ist, sich in der kleinen Furche doppelsträngiger DNA einzulagern. Dadurch ist es möglich, die Amplifikation der cDNA zu verfolgen. Die Durchführung der Real-Timequantitative-PCR erfolgte mithilfe des ABI Prism 7700 Sequence Detector Systems (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt). Die Auswahl der Primer erfolgte mithilfe der PrimerExpress® Software (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt). Als Referenzgen wurde CyclophilinA verwendet. Tabelle 6 gibt einen Überblick über die verwendeten Primer: Tabelle 6: Real-Time-quantitative-PCR Primer Bezeichnung: Sequenz: CyclophilinA for: 5’-CCCTCCACCCATTTGCT-3’ rev: 5’-CAATCCAGCTAGGCATGGGA-3’ for: 5’-GCCATGGAAGGAAGAAAAGCT-3’ rev: 5’-GGGAATGTCATTAAGGCAGCA-3’ for: 5’-AGTGGCAGACACTCGACGGT-3’ rev: 5’-ATTCGGCCTTTCGCATAGG-3’ for: 5’-CACCATGAAGCGAAACACAGA-3’ rev: 5’-ATTCGTAGCCACCAGGTCCAG-3’ for: 5’-TCTTATTGCGCTGCTACCGTT-3’ rev: 5’-ACTGATCCTCCAATAGCAGCAAA-3’ for: 5’-CAGTGGGCTGTGAGGAGGTT-3’ rev: 5’-GCTCCTGGCAAAAGGTCAGA-3’ for: 5’-TCCAGCACATCATGTACTGCG-3’ rev: 5’-TCTGCTGCTGAATGACTGTGG-3’ CDK4 CDK6 p15 Cyclin D1 c-Myc NFATc2 Material und Methoden Ansatz: 32 25 μl SYBR® Green PCR Master Mix 5 μl Primer Mix 0,25 μl cDNA 19,75 μl H2O Primer Mix: 6 μl Primer for (20 pmol/μl) 6 μl Primer rev (20 pmol/μl) 28 μl H2O Die Durchführung der Real-Time-quantitative-PCR erfolgte nach folgendem Programm: 2 min 50 °C 10 min 95 °C 15 s 95 °C 1 min 60 °C 40 x Die Expression des Zielgens wurde dreifach bestimmt, die Expression des Referenzgens wurde doppelt bestimmt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mithilfe der ΔΔCT-Methode (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt). Ergebnisse 33 3. Ergebnisse 3.1 Untersuchungen zur Wirkung des EGFR-Antikörpers Cetuximab auf Pankreaskarzinomzelllinien Zunächst wurde der Einfluss von Cetuximab auf das Proliferationsverhalten von Pankreaskarzinomzellen in vitro untersucht. Des Weiteren wurde mithilfe von Luciferase-Reportergenassays der Einfluss von Cetuximab auf die Aktivität verschiedener endogener Transkriptionsfaktoren untersucht. Für diese Untersuchung wurden Reporterkonstrukte für diejenigen Transkriptionsfaktoren ausgewählt, von denen bekannt ist, dass sie eine besondere Rolle im Pankreaskarzinom oder in der Zellwachstumskontrolle spielen. 3.1.1 Cetuximab hemmt Tumorwachstum Der Einfluss von Cetuximab auf das Proliferationsverhalten von kultivierten Tumorzellen wurde mithilfe eines Thymidin-Proliferationsassays bestimmt. Sowohl 8988t Zellen als auch IMIM-PC1 Zellen wurden mit Cetuximab behandelt und der Einbau von 3[H]-Thymidin in die DNA gemessen. Es zeigte sich sowohl für 8988t Zellen als auch für IMIM-PC1 Zellen eine Reduktion der Proliferationsrate der mit Cetuximab behandelten Zellen um 40% im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Abbildung 3). Ergebnisse 34 Abbildung 3: Cetuximab reduziert die Proliferationsrate 8988t (A) und IMIM-PC1 Zellen (B) wurden über 24h mit Cetuximab (250 µg/ml) behandelt. Die Proliferation wurde durch den Einbau von 3[H]-Thymidin quantifiziert. Die Aktivität der unbehandelten Kontrolle wurde gleich 100% gesetzt und die jeweilige Abweichung der Aktivität der behandelten Zellen in Prozent zu der Aktivität der Kontrolle angegeben. 3.1.2 Identifikation Cetuximab regulierter Transkriptionsfaktoren Um den Einfluss von Cetuximab auf die transkriptionelle Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, wurde ein Luciferase-Reportergenassay durchgeführt. Dabei wurden zunächst sowohl 8988t Zellen als auch IMIM-PC1 Zellen mit artifiziellen Reporterkonstrukten transient transfiziert. Es wurden dabei Reporterkonstrukte mit Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren KLF/BTE (BTE-Reporterkonstrukt), Sp1, NFκB, NFAT, p53, STAT (GAS-Reporterkonstrukt), Smad (3TP-Lux) und TCF (TOPflash-Reporterkonstrukt) verwendet. Die transfizierten Zellen wurden im Anschluss mit Cetuximab behandelt. Es zeigte sich in beiden Zelllinien eine deutliche Abnahme der NFAT-vermittelten Transkription. Für die übrigen Transkriptionsfaktoren zeigten sich nur geringe oder keine Effekte auf die transkriptionelle Aktivität durch eine Cetuximab Behandlung. Lediglich die transkriptionelle Aktivität von Sp1 wurde durch die Behandlung Ergebnisse 35 signifikant reduziert, wenn auch nicht im Ausmaß der Hemmung der Aktivität von NFATc2 (Abbildung 4). Abbildung 4: Effekte von Cetuximab auf die transkriptionelle Aktivität 8988t (A) und IMIM-PC1 Zellen (B) wurden mit Reporterkonstrukten (100 ng) transfiziert, die Bindungsstellen für BTE, Sp1, NFκB, NFAT, p53, 3TP-Lux, GAS und TOPflash beinhalten und anschließend über 24h mit Cetuximab (250 µg/ml) behandelt. Danach wurde die Luciferaseaktivität der mit Cetuximab behandelten Gruppen bzw. der unbehandelten Kontrollgruppen gemessen und als relative Aktivität der basalen Reporteraktivität dargestellt. Ergebnisse 36 3.2 Expression von NFATc2 in Pankreaskarzinomzelllinien Aufgrund der oben gezeigten Ergebnisse wurde die Expression von NFATc2 im Pankreaskarzinom untersucht. Für die Expressionsanalyse wurden folgende etablierte Zelllinien ausgewählt: 8988t, 8988s, S-028, S-007, IMIM-PC1, IMIM-PC2 und Panc-1. Die Expression des NFATc2 Proteins wurde mithilfe einer Western Blot Analyse von zuvor hergestellten Gesamtzelllysaten untersucht. Es zeigte sich eine deutliche Expression von NFATc2, sowohl in 8988t Zellen als auch in IMIMPC1 Zellen. Für die übrigen untersuchten Zelllinien ließ sich nur eine geringe Expression (8988s bzw. S-028) bzw. keine Expression (IMIM-PC2 bzw. Panc-1) von NFATc2 nachweisen (Abbildung 5). Aufgrund dieser Ergebnisse wurden für die weiteren Untersuchungen die Pankreaskarzinomzelllinien 8988t und IMIM-PC1 verwendet. Abbildung 5: Expression von NFATc2 Mithilfe einer Western Blot Analyse wurde die NFATc2 Expression auf Proteinebene in den Pankreaskarzinomzelllinien 8988t, 8988s, S-028, S-007, IMIM-PC1, IMIM-PC2 und Panc-1 untersucht. Als Ladungskontrolle wurde die β-Aktin Expression verwendet. Ergebnisse 37 3.3 Regulation von NFATc2 durch die EGFR-Erk Kaskade Der in 3.1.2 gezeigte Effekt von Cetuximab auf die transkriptionelle Aktivität verschiedener Wachstumsfaktoren deutet auf eine wichtige Rolle von NFATc2 bei der Proliferationshemmung von Pankreaskarzinomzellen durch Hemmung des EGF-Rezeptors hin (siehe 3.1.1). Im Folgenden sollte nun die Regulation von NFATc2 durch die EGFR-Erk Signalkaskade analysiert werden. 3.3.1 Hemmung der EGFR-Erk Kaskade blockiert NFATc2 Zunächst wurde erneut ein Luciferase-Reportergenassay durchgeführt. 8988t Zellen wurde zusätzlich zum in der Zelle enthaltenen endogenen NFATc2 durch Transfektion NFATc2 zugeführt. Im Anschluss folgte eine Behandlung mit Cetuximab. Ohne Behandlung mit Cetuximab lies sich eine Steigerung der transkriptionellen Aktivität durch Erhöhung der intrazellulären Konzentration von NFATc2 erreichen. Die transkriptionelle Aktivität war hier von der Dosis des zusätzlich transfizierten NFATc2 abhängig. Je höher die Dosis des zusätzlich transfizierten NFATc2, desto höher war die transkriptionelle Aktivität. So ließ sich durch zusätzliche Transfektion von NFATc2 die transkriptionelle Aktivität, im Vergleich zur alleinigen Aktivität durch das endogene NFATc2, verdoppeln. Dieser Effekt konnte durch eine Behandlung mit Cetuximab deutlich, jedoch aber nicht vollständig antagonisiert werden (Abbildung 6). Ergebnisse 38 Abbildung 6: Effekt von Cetuximab auf die transkriptionelle Aktivität von NFATc2 8988t Zellen wurden mit einem NFATc2-Reporterkonstrukt alleine oder zusammen mit unterschiedlichen Konzentrationen (50 ng, 100 ng, 150 ng) eines NFATc2-Expressionskonstruktes transient co-transfiziert. Im Anschluss folgte eine Behandlung mit Cetuximab (250 µg/ml) über 48h. Die Luciferaseaktivität wurde gemessen und ist dargestellt als relative Aktivität der basalen Reporteraktivität. Für die Funktion von NFATc2 als Transkriptionsfaktor ist seine zelluläre Lokalisation entscheidend. Deshalb wurde zunächst die zytoplasmatische und nukleäre Lokalisation von NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen mit und ohne Hemmung des EGF-Rezeptors durch Cetuximab untersucht. Nach Inkubation mit Cetuximab wurden zytoplasmatische und nukleäre Proteinextrakte gewonnen. Diese wurden dann mithilfe einer Western Blot Analyse auf NFATc2 untersucht. Es zeigte sich bei der unbehandelten Kontrolle, dass NFATc2 vorwiegend nukleär lokalisiert ist. Im Zytoplasma hingegen lassen sich nur geringe Mengen NFATc2 nachweisen. Dieses Verteilungsmuster wurde durch die Behandlung mit Cetuximab deutlich verändert. Nun zeigte sich NFATc2 überwiegend im Zytoplasma, wohingegen im Zellkern kaum noch NFATc2 nachweisbar war (Abbildung 7). Ergebnisse 39 Abbildung 7: Effekt von Cetuximab auf die zelluläre Lokalisation von NFATc2 8988t Zellen wurden über 12h mit Cetuximab (250 µg/ml) behandelt. Die anschließend aus den Zellen gewonnenen nukleären und zytoplasmatischen Extrakte wurden einer Western Blot Analyse auf NFATc2 unterzogen. Um festzustellen, ob der oben gezeigte Effekt auch durch eine Hemmung von Erk zu erzielen ist, wurden die Pankreaskarzinomzellen mit Uo126 behandelt. Uo126 hemmt MEK, welches dann Erk, das downstream von MEK steht, nicht mehr phosphorylieren und damit aktivieren kann. NFATc2 zeigte sich bei der unbehandelten Kontrolle wie erwartet überwiegend im Zellkern. Erk ließ sich in seiner aktivierten, phosphorylierten Form nachweisen. Die Behandlung mit Uo126 führte zu einem Verlust der phosphorylierten Form von Erk und gleichzeitig, analog zur Hemmung des EGF-Rezeptors, zu einer deutlichen Reduktion von NFATc2 im Zellkern. (Abbildung 8). Ergebnisse 40 Abbildung 8: Effekt einer Hemmung von MEK auf Erk und NFATc2 8988t Zellen wurden über einen Zeitraum von 15 min, 30 min oder 60 min mit Uo126 (0,5 µM) behandelt. Im Anschluss wurden nukleäre Extrakte (NE) bzw. Gesamtzelllysate (WCL) der Zellen erstellt und in einer Western Blot Analyse auf NFATc2 (NE), sowie Erk (WCL) und pErk (WCL) untersucht. 3.3.2 Aktivierung der EGFR-Erk Kaskade stimuliert NFATc2 Um den Einfluss einer Stimulierung der EGFR-Erk Signalkaskade auf NFATc2 zu untersuchen, war es notwendig, Versuchsbedingungen zu schaffen, in denen die EGFR-Erk Kaskade durch extrazelluläre Faktoren möglichst wenig aktiviert wird. Aus diesem Grund wurden die Pankreaskarzinomzellen über 24 Stunden einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt, denn Serum (FCS) ist ein starker Aktivator der untersuchten Signalkaskade. Umgekehrt eignet sich Serum aber genau aus diesem Grund ausgezeichnet zur Stimulation der Signalkaskade in diesen Versuchsansätzen. Des Weiteren ist natürlich EGF selbst ein starker Aktivator der EGFR-Erk Signalkaskade und kann somit ebenfalls in den im Folgenden dargestellten Versuchsansätzen zur Stimulation verwendet werden. Zunächst wurden unter initial serumfreien Versuchsbedingungen 8988t und IMIMPC1 Zellen mit FCS stimuliert. Es zeigte sich, dass unter serumfreien und damit Ergebnisse 41 unstimulierten Bedingungen NFATc2 kaum im Zellkern zu finden ist. Werden die Zellen aber über einen bestimmten Zeitraum mit Serum stimuliert, so kommt es zu einer starken Anreicherung von NFATc2 im Zellkern (Abbildung 9). Abbildung 9: Der Effekt einer Stimulation mit FCS auf NFATc2 8988t Zellen und IMIM-PC1 Zellen wurden über 24h Stunden einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt und dann über 15 min bzw. 30 min mit FCS (100 µl/ml) stimuliert. Anschließend wurden die Zellen geerntet und nukleäre Extrakte hergestellt, welche dann in einer Western Blot Analyse auf NFATc2 untersucht wurden. Als Ladungskontrolle diente Lamin. Um zu klären, ob dieser Effekt auf NFATc2 über die EGFR-Erk Kaskade vermittelt wird, wurde ein weiterer Stimulationsversuch durchgeführt. Erneut wurden Pankreaskarzinomzellen unter initial serumfreien Versuchsbedingungen mit FCS stimuliert. Zusätzlich zu einer Stimulation mit FCS wurde auch eine EGFStimulation durchgeführt. Auch hier ließ sich in der unstimulierten Kontrolle kaum nukleäres NFATc2 nachweisen. Dies änderte sich aber deutlich nach Stimulation mit EGF bzw. FCS, wobei der EGF-Effekt noch ausgeprägter zu sein schien. Es befand sich nun deutlich mehr NFATc2 im Zellkern. Der Effekt der Stimulation konnte ebenfalls im Phosphorylierungsstatus von Erk nachgewiesen werden. Ohne Stimulation durch FCS oder EGF war wesentlich weniger aktives, phosphoryliertes Erk nachweisbar als nach der Stimulation. (Abbildung 10) Ergebnisse 42 Abbildung 10: Effekt einer Stimulation mit FCS oder EGF auf NFATc2 und ErK 8988t Zellen wurden über 24h Stunden einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt und dann über 30 min mit FCS (100 µl/ml) oder EGF (25 ng/ml) stimuliert. Nach Abschluss der Stimulation wurden die Zellen geerntet und sowohl nukleäre als auch zytoplasmatische Extrakte hergestellt, welche dann mithilfe einer Western Blot Analyse auf den Gehalt von NFATc2 und Erk, bzw. der aktivierten, phosphorylierten Form von Erk (pErk) überprüft wurden. Durch die Aktivierung der EGFR-Erk Kaskade konnte eine gesteigerte nukleäre Translokation von NFATc2 gezeigt werden. Es wurde nun mithilfe eines DNAPulldown Assays untersucht, ob diese Aktivierung auch zu einer gesteigerten Bindung von NFATc2 an der DNA führt. Hierfür wurde der proximale Promotorabschnitt des humanen Interleukin-2-Gens verwendet. Dieser Promotorabschnitt kann als Ziel von NFATc2 agieren, da dieser die passende Konsensusbindungssequenz (GGAAA) enthält. Unter serumfreien Bedingungen wurden die Pankreaskarzinomzellen analog den vorhergehenden Versuchen mit EGF oder FCS stimuliert. Im Anschluss wurde dann ein DNA-Pulldown Assay durchgeführt. Hier zeigte sich, dass eine Stimulierung der EGFR-Erk Kaskade nicht nur einen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation von NFATc2 hat, sondern zusätzlich auch zu einer stärkeren Bindung von NFATc2 an der DNA führt (Abbildung 11). Ergebnisse 43 Abbildung 11: Eine Stimulierung mit FCS bzw. EGF führt zu einer gesteigerten Bindung von NFATc2 an der DNA. 8988t Zellen wurden über 24h Stunden einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt und dann über 30 min mit FCS (100 µl/ml) oder EGF (25 ng/ml) stimuliert. Anschließend wurden nukleäre Extrakte erstellt und ein DNA-Pulldown Assay mithilfe der NFATbinding site (5`-AGGAGGAAAAACTGTTTC-3`) des proximalen Promotorabschnitts des humanen Interleukin-2-Gens durchgeführt. Obere Reihe: DNA-Pulldown Assay für NFATc2. Untere Reihe: Western Blot für Lamin aus nukleären Extrakten. 3.3.3 Hemmung von EGFR oder Erk blockiert FCS/EGF Stimulation von NFATc2 Die unter 3.3.2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass es durch eine Stimulation von Pankreaskarzinomzellen mit FCS oder EGF NFATc2 zu einer Zunahme von nukleärem NFATc2 und zusätzlich zu einer vermehrten DNA-Bindung von NFATc2 kommt. Dieser Effekt sollte durch eine Hemmung von EGFR oder Erk blockiert werden können, falls die gezeigten Effekte tatsächlich über die EGFR-Erk Kaskade vermittelt werden sollten. Zunächst wurden Pankreaskarzinomzellen unter serumfreien Bedingungen entweder nur mit FCS bzw. EGF stimuliert oder aber mit FCS bzw. EGF stimuliert und zusätzlich mit Uo126 oder Cetuximab behandelt. Bei den unbehandelten Kontrollgruppen zeigte sich wie erwartet eine geringe Menge NFATc2 im Zellkern und auch phosphoryliertes Erk war nur wenig nachweisbar. Diese Situation änderte sich wie erwartet bei einer Stimulation mit FCS bzw. EGF. Erk ging vermehrt in seinen phosphorylierten Zustand über und die Menge an NFATc2 im Zellkern nahm ebenfalls deutlich zu. Wurden die Zellen aber zeitgleich der Ergebnisse 44 Stimulation mit Cetuximab oder Uo126 behandelt, so blieb der Effekt der Stimulation gänzlich aus. Es ließ sich, genau wie bei der unbehandelten Kontrolle, kaum phosphoryliertes Erk und ebenfalls kaum nukleäres NFATc2 mehr nachweisen (Abbildung 12) Abbildung 12: Effekt einer Hemmung von EGFR oder Erk auf NFATc2 8988t Zellen wurden zunächst über 24h einem serumfreien Medium ausgesetzt. Die Zellen wurden dann entweder über 1h mit Cetuximab (250 µg/ml) vorbehandelt und anschießend über 30 min mit FCS (100 µl/ml) stimuliert (A) oder über 1h mit Uo126 (0,5 µM) vorbehandelt und anschließend über 30 min mit EGF (25 ng/ml) stimuliert (B). Im Anschluss wurden aus den Zellen nukleäre Extrakte gewonnen und mithilfe von Western Blot Analysen NFATc2, Erk und phosphoryliertes Erk (pErk) nachgewiesen. Nun wurde ein weiterer DNA-Pulldown Assay durchgeführt, um festzustellen, ob eine Hemmung von Erk bei gleichzeitiger Stimulation durch EGF neben dem gezeigten Einfluss auf die zelluläre Lokalisation von NFATc2 auch dessen Bindung an der DNA beeinflusst. Analog des Versuchsaufbaus in Abschnitt 3.3.2 wurden die Pankreaskarzinomzellen unter serumfreien Versuchsbedingungen mit EGF stimuliert. Zusätzlich wurden die Zellen jedoch noch mit Uo126 behandelt. Ergebnisse 45 Es zeigte sich wie erwartet die im vorangegangenen Abschnitt beschriebene gesteigerte DNA Bindung von NFATc2 unter Stimulation mit EGF im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Wird jedoch zusätzlich zu der EGF-Stimulation mit Uo126 behandelt, kann dieser Effekt nicht mehr beobachtet werden. Die Bindung von NFATc2 verbleibt auf dem Niveau der unbehandelten Kontrollgruppe (Abbildung 13). Abbildung 13: Effekt einer Hemmung von Erk (Extrazellulär regulierte Kinase) auf die Bindung von NFATc2 (nuclear factor of activated T-cells) an der DNA. 8988t Zellen wurden über 24h einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt und anschließend über 1h mit Uo126 (0,5 µM) vorbehandelt. Es folgte eine Stimulierung mit EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) (25 ng/ml) über 30 min. Im Anschluss wurden nukleäre Extrakte erstellt und ein DNA-Pulldown Assay mithilfe der NFAT-binding site (5`-AGGAGGAAAAACTGTTTC-3`) des proximalen Promotorabschnitts des humanen Interleukin-2-Gens durchgeführt. Obere Reihe: DNA-Pulldown Assay für NFATc2 (DNANFATc2). Untere Reihe: Western Blot für Lamin aus nukleären Extrakten. 3.3.4 Regulation von NFATc2 durch die EGFR-Ras-Raf-MEK-Erk-Kaskade Zur Untersuchung der Rolle der einzelnen Mitglieder der EGFR-Ras-Raf-MEK-Erk Signalkaskade in Bezug auf die transkriptionelle Regulation von NFATc2 wurden erneut Luciferase-Reportergenassays unter Verwendung eines artifiziellen NFATresponsiven Reporter-Promotorkonstruktes durchgeführt (NFAT-Luc). Eine konstitutive Aktivierung der Signalkaskade an unterschiedlichen Orten wurde durch transiente Transfektion von Expressionskonstrukten von konstitutiv-aktiven Ergebnisse 46 Formen der einzelnen Mitglieder erreicht. Eine Hemmung der Signalkaskade an unterschiedlichen Orten wurde durch die transiente Transfektion von Expressionskonstrukten von dominant-negativen Formen der einzelnen Mitglieder oder durch pharmakologische Inhibition erreicht. Zusätzlich wurde, ausgenommen bei den unbehandelten Kontrollgruppen, ein NFATc2-Expressionskonstrukt transient transfiziert, um eine Überexpression von NFATc2 zu erreichen. Es zeigte sich, dass durch eine Überexpression von NFATc2 die transkriptionelle Aktivität von NFATc2 um Faktor 4 erhöht werden kann. Durch zusätzliche Transfektion eines konstitutiv-aktiven EGF-Rezeptors kann die transkriptionelle Aktivität sogar um den Faktor 7 gesteigert werden. Die Aktivierung der Signalkaskade durch Expression von konstitutiv-aktivem Ras oder konstitutivaktivem MEK führte schließlich zu einer Steigerung der transkriptionellen Aktivität um den Faktor 9 bzw. 10 (Abbildung 14, A). In einem zweiten Versuchsansatz zeigte sich durch Transfektion des NFATc2 Konstruktes analog des vorangegangenen Ansatzes eine Steigerung der NFATc2 Transkriptionsaktivität in diesem Falle auf das etwa 5 fache der unbehandelten Kontrolle. Diese Aktivierung kann aber deutlich durch die Zugabe des N17-RasExpressionskonstruktes bis auf das 2fache der Aktivität im Vergleich zur Kontrolle reduziert werden. Einen ähnlichen Effekt zeigte die Transfektion des dominantnegativen Erk Konstruktes. Hier konnte die Aktivität auf das 3fache der Kontrolle reduziert werden. Auch die pharmakologische Hemmung von MEK durch Uo126 führte zu einer Reduktion der transkriptionellen Aktivität von NFATc2 auf das etwa 2,5fache der unbehandelten Kontrolle. Die Steigerung der Transkriptionsaktivität von NFATc2 durch die Transfektion mit einem NFATc2 Expressionskonstrukt ließ sich durch Hemmung der einzelnen Mitglieder der EGFR-Ras-Raf-MEK-Erk Signalkaskade auf etwa die Hälfte reduzieren. Eine Reduktion der Aktivität auf den Ausgangswert der Kontrollgruppe konnte nicht erreicht werden. (Abbildung 14, B) Ergebnisse 47 Abbildung 14: Regulation der transkriptionellen Aktivität von NFATc2 durch die EGFR-RasRaf-MEK-Erk-Kaskade: 8988t Zellen wurden mit einem NFATc2-Reporterkonstrukt (pNFAT-Luc) und ebenfalls, ausgenommen der unbehandelten Kontrollgruppe, mit einem NFATc2 Expressionskonstrukt transfiziert. Je nach Ansatz wurde zusätzlich ein Expressionskonstrukt für einen konstitutiv-aktiven EGF-Rezeptor (EGFR, pSG5-v-ErbB), konstitutiv-aktives Ras (V12-Ras), konstitutiv-aktives MEK (c.a. MEK), dominant-negatives Ras (N17-Ras) oder dominant-negatives Erk (d.n. Erk) co-transfiziert bzw. eine Behandlung mit Uo126 (0,5 µM) über 1h durchgeführt. Es wurden jeweils 100 ng des entsprechenden Konstruktes transfiziert. Die Durchführung der Luciferase-Reportergenassays erfolgte 48h nach Transfektion. Die Luciferaseaktivität der unbehandelten Kontrollgruppen wurde gleich 1 gesetzt und die jeweilige Änderung der Aktivität in den verschiedenen Ansätzen in x-facher Steigerung der unbehandelten Kontrollgruppe angegeben. 3.3.5 Hemmung von Calcineurin antagonisiert die EGFR-Erk induzierte Translokation von NFATc2 In Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung der Phosphatase Calcineurin durch eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration zu einer Dephosphorylierung von NFAT und damit zu einer Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern führt. Dieser Effekt kann durch Cyclosporin A (CsA) gehemmt Ergebnisse 48 werden. CsA verhindert die Dephosphorylierung von NFAT durch Calcineurin. Infolgedessen kommt es zu keinem „shift“ von NFAT in den Zellkern. NFAT, welches sich bereits im Zellkern befunden hat, wird durch verschiedene Kinasen rephosphoryliert und damit inaktiviert. Als Folge dieser Inaktivierung kommt es zu einer Translokation von NFAT vom Zellkern ins Zytoplasma. Um zu untersuchen, ob die Aktivierung der EGFR-Erk Signalkaskade einen von Calcineurin unabhängigen Effekt auf die Translokation von NFATc2 hat, oder ob es einen direkten Effekt Dephosphorylierungsaktivität der von EGFR-Erk Calcineurin Signalkaskade auf gibt, zunächst wurden die Pankreaskarzinomzellen unter serumfreien Versuchsbedingungen mit FCS stimuliert, wobei jeweils eine Gruppe zusätzlich mit CsA bzw. mit Uo126 behandelt wurde. Eine weitere Gruppe wurde sowohl mit CsA als auch mit Uo126 behandelt. Wie erwartet befand sich in der unbehandelten, unstimulierten Kontrollgruppe nur wenig NFATc2 im Zellkern. Wurden die Zellen aber durch Zugabe von FCS stimuliert, so kam es zu einer deutlichen Zunahme von NFATc2 im Zellkern. Dieser Stimulationseffekt konnte durch Hemmung von Calcineurin durch CsA fast vollständig gehemmt werden. Wurden die Zellen nicht mit CsA, sondern mit Uo126 behandelt, so konnte ebenfalls der Stimulationseffekt durch FCS deutlich reduziert werden. Der Effekt konnte nahezu vollständig antagonisiert werden, wenn die stimulierten Zellen gleichzeitig mit CsA und Uo126 behandelt wurden (Abbildung 15). Ergebnisse 49 Abbildung 15: Cyclosporin A antagonisiert die EGFR-Erk induzierte Translokation von NFATc2: 8988t Zellen wurden über 24h Stunden einem serumfreien Nährmedium ausgesetzt und anschließend über 1h mit Uo126 (0,5 µM) und/oder über 30 min mit Cyclosporin A (CsA) (1 µM) vorbehandelt. Es folgte eine Stimulation der Zellen mit FCS (100 µl/ml) über 30 min. Im Anschluss wurden die Zellen geerntet und nukleäre Extrakte hergestellt. Diese wurden dann mithilfe einer Western Blot Analyse auf NFATc2 untersucht. Als Ladungskontrolle diente Lamin. 3.4 Knockdown von NFATc2 hemmt EGF/FCS induziertes Wachstum In den bisherigen Versuchen konnte durch Stimulation von Pankreaskarzinomzellen durch FCS oder EGF für NFATc2 eine gesteigerte nukleäre Translokation, eine erhöhte Bindung an der DNA und eine Stimulation der transkriptionellen Aktivität gezeigt werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung des EGF-Rezeptors durch Cetuximab zu einer deutlichen Proliferationshemmung in Pankreaskarzinomzellen führt. Analog dieser Beobachtungen sollte eine Stimulation des EGF-Rezeptors zu einer Zunahme der Zellproliferation führen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden erneut Thymidin-Proliferationsassays durchgeführt, wobei ein zusätzliches Augenmerk auf die Rolle von NFATc2 bei der EGF/FCS vermittelten Proliferation von Pankreaskarzinomzellen gelegt wurde. Dies sollte mithilfe der RNA InterferenzMethode (RNAi) untersucht werden. Ergebnisse 50 Zunächst wurde ein Vorversuch durchgeführt, um die Effizienz der Repression der endogenen NFATc2 Expression mithilfe von siRNA zu kontrollieren. Durch transiente Transfektion von NFATc2 siRNA konnte sowohl in 8988t Zellen als auch in IMIM-PC1 Zellen eine deutliche Reduktion von NFATc2 erreicht werden (Abbildung 16). Abbildung 16: Repression der endogenen NFATc2 Expression mithilfe von siRNA: 8988t Zellen (A) und IMIM-PC1 Zellen (B) wurden zweimal im Abstand von 24h transient mit jeweils einer NFATc2 siRNA oder mit einer Kontrolle (Silencer® Negative Control) transfiziert. Nach weiteren 24h wurde Gesamtzelllysat aus den Zellen gewonnen, welches im Anschluss mithilfe einer Western Blot Analyse auf NFATc2 untersucht wurde. Als Ladungskontrolle wurde die β-Aktin Expression verwendet. Nun wurden mit 8988t Zellen Thymidin-Proliferationsassays durchgeführt. Hierfür wurde zunächst die endogene NFATc2 Expression mithilfe von siRNA reprimiert. Im Anschluss wurden die Zellen unter serumfreien Versuchsbedingungen mit FCS oder EGF stimuliert. Die Proliferation wurde durch den Einbau von 3[H]-Thymidin quantifiziert. Durch eine Stimulation der Pankreaskarzinomzellen mit FCS konnte die Proliferationsrate verdoppelt werden. Ein ähnlicher Effekt konnte durch eine Stimulation mit EGF erreicht werden. Hier kam es zur Steigerung der Proliferationsrate um 85 Prozentpunkte im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Wurde hingegen in den Pankreaskarzinomzellen NFATc2 durch Ergebnisse 51 transiente siRNA Transfektion ausgeschaltet, so ließ sich dieser Effekt zu einem großen Teil unterdrücken. Es konnte durch die Stimulation mit FCS nur noch eine Steigerung der Proliferationsrate um 25 Prozentpunkte, durch die Stimulation mit EGF nur noch einer Steigerung der Proliferationsrate um 15 Prozentpunkte beobachtet werden. Ebenfalls zeigte sich durch die alleinige Ausschaltung von NFATc2 ohne Stimulation durch Serum oder EGF eine Reduktion der Proliferationsrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe um 25 Prozentpunkte (Abbildung 17). Abbildung 17: Repression von NFATc2 hemmt FCS/EGF induziertes Wachstum: 8988t Zellen wurden im Abstand von 24h insgesamt zweimal transient entweder mit NFATc2 siRNA (siRNA NFATc2 #2) oder einer Kontrolle (Silencer® Negative Control) transfiziert. Anschließend wurden die Zellen über Nacht einem serumfreien Medium ausgesetzt und dann entweder mit FCS (100 µl/ml) oder EGF (25 ng/ml) über 24h stimuliert. Die Proliferation wurde durch den Einbau von 3[H]-Thymidin quantifiziert. Die Aktivität der unbehandelten Kontrolle wurde gleich 100% gesetzt und die jeweilige Abweichung der Aktivität der behandelten Zellen in Prozent zu der Aktivität der Kontrolle angegeben. Ergebnisse 52 3.5 Identifikation von NFATc2 Targetgenen der Zellzykluskontrolle Nun sollen Zielgene von NFATc2 identifiziert werden, welche eine besondere Rolle bei der Proliferation von Pankreaskarzinomzellen spielen. Um den Einfluss von NFATc2 auf Regulationsmechanismen des Zellzyklus zu bestimmen, wurde die mRNA Expression von Cyclin D1, CDK6, CDK4 und p15 in Abhängigkeit von NFATc2 in 8988t Zellen mithilfe einer Real-Time-quantitativePCR untersucht. Zusätzlich wurde die Expression von NFATc2 mRNA selbst in Abhängigkeit von NFATc2 untersucht. Es zeigte sich eine deutliche Stimulation der mRNA Expression von NFATc2 (Faktor 2), Cyclin D1 (Faktor 2,5), CDK6 (Faktor 2,5) und CDK4 (Faktor 2,3) durch FCS bzw. EGF. Dieser Effekt konnte durch gleichzeitige Ausschaltung von NFATc2 deutlich antagonisiert werden. Die mRNA Expression von NFATc2 und CDK6 konnte trotz Stimulation mit EGF bzw. FCS deutlich unter den Ausgangswert der unbehandelten Kontrolle gesenkt werden (Faktor 0,5). Des Weiteren führte eine Stimulation mit FCS nach Ausschaltung von NFATc2 zu einem nur noch geringen Anstieg der mRNA Expression von Cyclin D1 (Faktor 1,2) und CDK4 (Faktor 1,5). Die mRNA Expression von p15 konnte hingegen durch Ausschaltung von NFATc2 um den Faktor 2,5 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gesteigert werden. Eine Stimulation mit EGF führte tendenziell, jedoch nicht signifikant, sowohl in der Gruppe mit NFATc2 als auch in der Gruppe ohne NFATc2 zu einer Reduktion der p15 mRNA Expression (Abbildung 18). Ergebnisse 53 Abbildung 18: mRNA Expression in Abhängigkeit von NFATc2: 8988t Zellen wurden im Abstand von 24h insgesamt zweimal entweder mit NFATc2 (nuclear factor of activated T-cells) siRNA (Small interfering RNA) (siRNA NFATc2 #2) oder einer Kontrolle (Silencer® Negative Control) transient transfiziert. Im Anschluss wurden die Zellen über Nacht einem serumfreien Medium ausgesetzt und dann entweder mit fötalem Kälberserum (FCS) (100 µl/ml) oder EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) (25 ng/ml) über 24h stimuliert. Es folgte die Isolation der RNA (Ribonukleinsäure). Die Expression von NFATc2, Cyclin D1, p15, CDK6 (Cyclinabhängige Kinase) und CDK4 wurde mittels Real-Time-quantitative-PCR ermittelt. Dargestellt ist die relative Expression bezogen auf die mRNA (Messenger Ribonukleinsäure) in den jeweiligen unbehandelten Zellen. Diskussion 54 4. Diskussion 4.1 Die EGF-Rezeptor Signalkaskade als therapeutischen Ansatz bei der Behandlung des Pankreaskarzinoms Die Therapie des Pankreaskarzinoms gestaltet sich bis zum heutigen Tag schwierig. Durch Chemotherapeutika wie Gemcitabine, 5-Fluorouracil oder Capecitabine können aufgrund der hohen Chemoresistenz des Pankreaskarzinoms bisher nur geringe Therapieerfolge erzielt werden. Aktuelle Untersuchungen zeigen, dass neue Substanzen aus dem Bereich der Targeted Therapy einen vielversprechenden neuen Ansatz bei der Therapie des Pankreaskarzinoms darstellen können. Hierbei ist derzeit insbesondere die Hemmung der Ras-Raf-MEK-Erk Signalkaskade aufgrund ihrer bedeutsamen Rolle beim Pankreaskarzinom von zentralem Interesse. In gesunden Zellen spielt diese Signalkaskade unter anderem eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Zellzyklus. Eine gesteigerte Aktivierung durch Wachstumsfaktoren oder eine Mutation von Mitgliedern dieser Signalkaskade, wie sie typisch bei vielen Karzinomen ist, kann zu einer Dysregulation von Proteinen der Zellzykluskontrolle und damit zu einer Zellzyklusprogression und gesteigerten Proliferation von Karzinomzellen führen (Pruitt und Der, 2001) (Roovers und Assoian, 2000) (Mirza et al., 2004). Therapeutische Möglichkeiten ergeben sich prinzipiell an jedem Punkt innerhalb dieser Signalkaskade, wobei der Eingriff in die Signalkaskade auf unterschiedliche Prinzipien und Methoden beruhen kann. Von besonderem Interesse sind hierbei Proteine aus der Ras-Familie. Ras-Proteine sind membranständige G-Proteine, welche eine zentrale Rolle bei der Regulation der Zellproliferation und Zelldifferenzierung über nachgeschaltete Signalkaskaden einnehmen. Bei etwa 30% aller malignen Erkrankungen kann die Mutation eines Mitglieds der Ras-Familie nachgewiesen werden (Bos, 1989). Insbesondere beim Pankreaskarzinom, bei welchem in 75-90% der Fälle eine Mutation des k-Ras Gens nachgewiesen werden kann, scheint hier ein zentraler Therapieansatz zu Diskussion 55 liegen (Almoguera et al., 1988). Die Mutation eines Ras-Proteins führt zu seiner dauerhaften Aktivierung mit der Folge einer kontinuierlichen Stimulation der nachgeschalteten hemmender Raf-MEK-Erk Substanzen Kaskade. noch am Obwohl Anfang die Entwicklung steht, konnte Rasin Pankreaskarzinomzellen mithilfe der RNA-Interferenz Methode (siRNA) bereits in vivo und in vitro eine Wachstumshemmung durch Ausschaltung von k-Ras erreicht werden (Zhu et al., 2006). Ein weiterer möglicher Therapieansatz ergibt sich aus der Kenntnis der Synthese der Ras-Proteine. Ras-Proteine werden als zytosolische Vorläuferproteine synthetisiert. Für ihre Funktionsfähigkeit an der Zellmembran müssen diese mithilfe der Farnesyltransferase im Rahmen einer posttranslationellen Modifikation farnesyliert werden (Basso et al., 2006). Eine Hemmung dieser Farnesylierung durch Farnesyltransferaseinhibitoren (FTIs) sollte so zu einem Verlust der Ras-vermittelten Signaltransduktion in Tumorzellen führen können. Präklinische Untersuchungen führten sowohl in vitro als auch in vivo zu vielversprechenden Ergebnissen, in der klinischen Anwendung konnten FTIs im Rahmen einer Monotherapie bisher jedoch nicht überzeugen (Brunner et al., 2003). Allerdings gibt es derzeit beispielsweise ermutigende Untersuchungen zur Anwendung von FTIs bei anderen Zielproteinen oder im Rahmen einer Kombinationstherapie bei verschiedenen Tumoren. Dies soll jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit sein. Anstelle einer Hemmung von Ras kann auch sein direktes Zielprotein innerhalb der Signalkaskade ein mögliches Therapieziel darstellen. Die Familie der RafSerin/Threonin-Kinasen besteht aus A-Raf, B-Raf und C-Raf1 (Wellbrock et al., 2004). Die Aktivierung von Ras führt zur Translokation von Raf an die Zellmembran und dessen Aktivierung durch Phosphorylierung. Neben einer Aktivierung durch Stimulation übergeordneter Signaltransduktionswege ist auch eine aktivierende Mutation von B-Raf bekannt. Diese Mutation tritt beispielsweise bei 70% aller Malignen Melanome auf. Bei anderen Krebserkrankungen ist diese Mutation jedoch deutlich seltener zu finden (Davies et al., 2002) (Cohen et al., 2003) (Tannapfel et al., 2003). Sorafenib ist sowohl ein potenter Inhibitor der CRaf Kinase als auch der wildtyp- und mutierten B-Raf Kinase. Darüber hinaus konnten für Sorafenib zusätzlich auch signifikante Effekte gegen VEGFR-1, Diskussion 56 VEGFR-2, VEGFR-3 und PDGFR gezeigt werden. Neben der Hemmung der Signaltransduktion der Raf-MEK-Erk Kaskade hat Sorafenib somit auch eine antiangiogene Wirkung (Wilhelm et al., 2004). Im Rahmen einer Therapie des fortgeschrittenen Hepatozellulären Karzinoms wird Sorafenib bereits erfolgreich angewendet. Hier konnte ein signifikanter Überlebensvorteil durch Sorafenib gezeigt werden (Llovet et al., 2008). Eine erste Anwendung im Rahmen einer Phase I Studie als Kombinationstherapie mit Gemcitabine beim Pankreaskarzinom ist bereits erfolgt. Eine Aussage über die Wirksamkeit dieses Therapieansatzes bedarf jedoch noch weiterer Studien (Siu et al., 2006). Substrat aktivierter Raf-Proteine sind MEK1 und MEK2, welche ihrerseits wiederum Erk1 und Erk2 phosphorylieren und aktivieren können. Dabei sind ErkProteine die einzig bekannten Substrate von MEK1/2. Erk1/2 ist für die Regulation einer Vielzahl nukleärer, aber auch zytoplasmatischer Proteine beteiligt und ist somit über die Regulation von Wachstumsfaktoren an der Regulation der Genexpression unmittelbar beteiligt (Yoon und Seeger, 2006) (Schulze et al., 2004) (Zuber et al, 2000). Hierdurch reguliert Erk1/2 vielfältige Zellfunktionen, die unter anderem für Migration und Proliferation der Zelle von Bedeutung sind. Erk1/2 ist in vielen Tumoren konstitutiv aktiv. Ursache dieser gesteigerten Aktivierung ist dabei häufig nicht etwa eine aktivierende Mutation von Erk1/2, sondern die gesteigerte Aktivierung übergeordneter Regulatoren innerhalb der Signalkaskade, beispielsweise durch eine Mutation von Ras oder einer Zellrezeptorüberexpression (Hoshino et al., 1999). Einer der ersten MEKInhibitoren war Uo126. Uo126 hemmt sowohl MEK1 als auch MEK2. Im Gegensatz zu dem Raf-Inhibitor Sorafenib hat Uo126 keinen oder einen nur geringen Effekt auf andere Kinasen (Favata et al., 1998). Aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften eignet sich Uo126 nicht für die Anwendung am Menschen. Trotzdem zeigte Uo126 in vitro einen antiproliferativen Effekt auf transformierte Zelllinien. Heute ist Uo126 ein wichtiger MEK-Inhibitor im Rahmen der Grundlagenforschung. Inzwischen wurden weitere MEK-Inhibitoren entwickelt. Diese stehen jedoch am Anfang ihrer klinischen Anwendung und werden im Rahmen von Phase I und Phase II Studien getestet (Rinehart et al., 2004) (Adjei et al., 2008). Diskussion 57 Anstelle der Mitglieder der Ras-Raf-MEK-Erk Signalkaskade stellt der EGFRezeptor selbst ein interessantes Ziel für die Entwicklung einer inhibitorischen Substanz auf dem Gebiet der Targeted Therapy dar. Der EGF-Rezeptor ist nicht nur für die Aktivierung der oben beschriebenen Signalkaskade verantwortlich, sondern auch für die Regulation anderer Signalkaskaden, wie etwa die pI3K-AktSignalkasde oder den Jak-STAT-Signalweg, zuständig (Citri et al., 2003). Diese Signalkaskaden sind ebenfalls für das onkogene Potenzial einer Zelle von Bedeutung. Die Folgen einer gesteigerten Aktivierung des EGF-Rezeptors durch Mutation, Überexpression oder Überexpression von EGF-Rezeptor Liganden können somit vielfältig sein. Neben einer gesteigerten Proliferation und Migration, welche vorwiegend über die Ras-Raf-MEK-Erk-Kaskade vermittelt wird, ist der EGF-Rezeptor hierdurch auch für weitere onkogene Funktionen, wie beispielsweise Angiogenese, Anti-Apoptose oder Invasion und Metastasierung verantwortlich (Jimeno und Hidalgo, 2006). Der Einsatz von small-moleculeInhibitoren stellt eine Möglichkeit der Hemmung der intrazellulären Tyrosinkinasedomäne des EGF-Rezeptors dar. So führte eine Behandlung mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Erlotinib in vitro zu einem Zellzyklus-Arrest und einer Apoptoseinduktion. Auch in vivo konnten Anti-Tumor Effekte durch Erlotinib gezeigt werden (Moyer et al., 1997) (Pollack et al., 1999). Erlotinib ist bereits bei der Therapie des Pankreaskarzinoms und des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms zugelassen. Im Gegensatz zu Tyrosinkinaseinhibitoren wie Erlotinib ist die Wirkung von Antikörpern nicht gegen die intrazelluläre, sondern gegen die extrazelluläre Domäne des EGF-Rezeptors gerichtet. Es wurden bereits einige EGF-Rezeptor Antikörper entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit soll jedoch primär auf die Charakterisierung von Cetuximab eingegangen werden. Cetuximab ist ein chimärer, monoklonaler IgG1-Antikörper, der mithilfe von rekombinanter DNATechnologie aus einer Säugerzelllinie gewonnen wird. Der EGF-Rezeptor ist das einzige Mitglied aus der EGF-Rezeptorfamilie, das von Cetuximab gebunden werden kann. Cetuximab hat im Vergleich zu den natürlichen, endogenen Liganden EGF und TGFα eine wesentlich höhere Affinität zum EGF-Rezeptor (Kim et al., 2001). Die Rezeptorbindung von Cetuximab führt, im Gegensatz zu einer Diskussion 58 Bindung von endogenen Liganden, nicht zu einer Phosphorylierung und Aktivierung des Rezeptors, sondern zu einer Rezeptorinternalisierung und Degradation (Doody et al., 2007). Folge dieser Rezeptordownregulierung ist eine Reduktion der aktivierbaren EGF-Rezeptoren an der Zelloberfläche und somit eine Hemmung der durch den EGF-Rezeptor aktivierbaren Signalkaskaden. Des Weiteren kann Cetuximab als IgG1 Antikörper gezielt eine Reaktion des Immunsystems gegen die Tumorzellen im Rahmen der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC, antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity) vermitteln (Mellstedt et al., 2003). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Cetuximab die Translokation des EGF-Rezeptors in den Zellkern hemmen kann. Folge ist eine Hemmung der Reparaturmechanismen der durch Chemotherapie oder Strahlentherapie induzierten Schäden an der DNA und damit eine Reduzierung der Strahlen- und Chemoresistenz des Tumors (Dittmann et al., 2005). Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine deutliche Hemmung der Proliferation durch eine Behandlung mit Cetuximab bei den untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien 8988t und IMIM-PC1 gezeigt werden. Ähnliche Effekte konnten durch andere Arbeitsgruppen für weitere Karzinomzelllinien gezeigt werden (Huang et al., 1999) (Peng et al., 1996) (Fan et al., 1994) (Prewett et al., 1996). 4.2 Interpretation der Ergebnisse zur Regulation von NFATc2 durch die EGFRezeptor Signalkaskade im Pankreaskarzinom Interessanterweise konnte im Rahmen dieser Arbeit durch Inhibition des EGFRezeptors mit Cetuximab neben einer Proliferationshemmung der Pankreaskarzinomzelllinien zusätzlich auch eine Hemmung des onkogenen Transkriptionsfaktors NFATc2 beobachtet werden. Diese Untersuchungen belegten NFATc2 als Target von Cetuximab. NFATc2 ist ein Mitglied der Familie der NFAT-Transkriptionsfaktoren. Weitere Mitglieder dieser Familie sind NFATc1, NFATc3, NFATc4 und TonEBP (NFATc5). Neben ihrer Bedeutung für die Diskussion 59 Regulation der Immunantwort sind NFAT-Proteine auch an der Entwicklung des Nerven- und Skelettsystems sowie der Herzentwicklung beteiligt (Horsley und Pavlath, 2002) (Musaro et al., 1999) (de la Pompa et al., 1998) (Pavlath und Horsley, 2003) (Ranger et al., 1998) (Graef et al., 2001). Aktuelle Untersuchungen führen zu einer immer größer werdenden Bedeutung der Familie der NFATTranskriptionsfaktoren bei der Karzinogenese. So konnte in Vorarbeiten zu dieser Arbeit im Rahmen von immunhistochemischen Untersuchungen an mehr als 40 Pankreaskarzinomen eine kombinierte oder individuelle Überexpression von NFATc1 und NFATc2 in über 80 % der untersuchten Gewebe gezeigt werden. Zusätzlich konnten NFATc1 und NFATc2 beispielsweise bereits in den Vorläuferstadien PanIN-1 und PanIN-2 nachgewiesen werden (Ellenrieder, unveröffentlichte Befunde). Als Ursache der gesteigerten Expression von NFATc2 konnte in über 80% der untersuchten Pankreasgewebe eine Amplifikation auf Chromosom 20q13 identifiziert werden (Holzmann et al., 2004). Die Überexpression von NFATc2 konnte für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten etablierten Pankreaskarzinomzelllinien 8988t und IMIM-PC1 auf Proteinebene bestätigt werden. Interessanterweise zeigten vorangegangenen Untersuchungen, dass diese beiden Zelllinien im Gegensatz zu verschiedenen anderen Pankreaskarzinomzelllinien keine Expression von NFATc1 aufweisen (Buchholz et al., 2006) (Ellenrieder, unveröffentlichte Befunde). Die beobachtete Hemmung der Translokation von NFATc2 vom Zytoplasma in den Zellkern durch Cetuximab konnte ebenso durch eine Hemmung der nachgeschalteten gezeigt Ras-Raf-MEK-Erk Kaskade durch den MEK-Inhibitor Uo126 werden. Weitere Untersuchungen zeigten zusätzlich, dass eine Aktivierung der Ras-Raf-MEK-Erk-Kaskade durch eine Stimulation des EGFRezeptors mit EGF bzw. FCS wiederum zu einer vermehrten nukleären Translokation und gesteigerten DNA-Bindung von NFATc2 führt. Dieser Stimulationseffekt konnte durch eine gleichzeitige Hemmung der Signalkaskade sowohl auf Rezeptor-Ebene durch Cetuximab als auch durch Uo126 wirkungsvoll unterbunden werden. Des Weiteren konnte mithilfe von Reportergenassays zusätzlich gezeigt werden, dass eine artifizielle Aktivierung einzelner Mitglieder der EGFR-Ras-Raf-MEK-Erk-Kaskade beispielsweise durch Überexpression oder Diskussion 60 konstitutiv-aktive Reporterkonstrukte mit einer erhöhten Transaktivierung eines NFATc2-responsiven Promotorkonstruktes verbunden ist. Diese Aktivierung war hierbei umso ausgeprägter, je weiter distal das untersuchte Mitglied in der Kaskade lokalisiert ist. Umgekehrt führte eine Inhibition der einzelnen Mitglieder zu einer verminderten Transaktivierung des Promotorkonstruktes. Die dargestellten Untersuchungen lassen auf eine Regulation von NFATc2 durch eine intakte EGFNFAT Signalkaskade bei den untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien schließen. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Aspekt bezüglich der Regulation von NFAT im Pankreaskarzinom auf. Denn Untersuchungen an T-Lymphozyten haben bereits gezeigt, dass die Calcium-abhängige Phosphatase Calcineurin von entscheidender Bedeutung für die Regulation der NFAT-Proteine ist (Loh et al., 1996) (Luo et al., 1996) (Shibasaki et al., 1996) (Shaw et al., 1995). Im Rahmen von Vorarbeiten konnte dieser Regulationsmechanismus für Pankreaskarzinomzellen ebenfalls bestätigt werden. So konnte, analog der Beobachtungen an T-Lymphozyten, gezeigt werden, dass die Aktivität von Calcineurin für die Funktion von NFATc1 von entscheidender Bedeutung ist. Die Dephosphorylierung von NFATc1 durch Calcineurin führte zu einem Shift von NFATc1 in den Zellkern und konsekutiv zu einer gesteigerten DNA-Bindung und transkriptionellen Aktivität von NFAT (Buchholz et al., 2006). Erwähnenswert ist hierbei, dass Calcineurin ausschließlich den nukleären Import von NFAT regulieren kann. Die Rephosphorylierung und die damit verbundene Inaktivierung und zytoplasmatische Translokation von NFAT lässt sich primär durch konstitutivaktive oder Signalling-regulierte Kinasen, wie beispielsweise die Casein Kinase 2 oder GSK3 erklären (Crabtree und Olson, 2002). Die Calcineurin-induzierte Aktivierung von NFATc1 kann durch Cyclosporin A (CsA) inhibiert werden. Cyclosporin A kann irreversibel an die aktive Domäne von Calcineurin binden und hemmt somit die Dephosphorylierung und Aktivierung von NFAT (Arora-Gupta et al., 2004) (Puri et al., 2004) (Venkatesh et al., 2004). Zusammenfassend führen also beide Signalwege, die mitogene EGFR-Erk MAPK Signalkaskade und die Calcium-Calcineurin-Kaskade, zu einer Zunahme von nukleärem und transkriptionell aktivem NFATc2. Während die Mechanismen für die Calcineurin-abhängige nukleäre Translokation und Aktivierung sehr gut Diskussion 61 analysiert und beschrieben sind, werden in weiterführenden Untersuchungen die Mechanismen der Erk-vermittelten Aktivierung weiter definiert werden müssen. Basierend auf unseren Ergebnissen erscheint denkbar, dass Erk primär auf der Seite des nukleären Export in das nukleär-zytoplasmatische „Shuttling“ von NFATc2 eingreift und hierüber zu einer gesteigerten Menge von NFATc2 im Zellkern beiträgt. Die beobachtete Zunahme der Transkriptionsaktivität könnte Folge einer gesteigerten DNA-Bindungsaffinität sein oder aber auch über Stimulation der Interaktion von Partnerprotein erfolgen. In weiterführenden Projekten unserer Arbeitsgruppen wird die Bedeutung dieser Mechanismen für die EGFR-induzierte Stimulation von NFATc2 weiter analysiert werden. 4.3 Interpretation der Ergebnisse zur Rolle von NFATc2 bei der Zellzyklusregulation im Pankreaskarzinom Mithilfe der RNA-Interferenz Methode (siRNA) gelang es die NFATc2 Expression durch Transfektion verschiedener siRNA Sequenzen effektiv zu reprimieren. Dies ermöglichte Untersuchungen zum Einfluss von NFATc2 auf das Wachstumsverhalten der Pankreaskarzinomzellen. Hierfür wurden analog der Untersuchungen mit Cetuximab Thymidin-Proliferationsassays durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der proliferationssteigernde Effekt einer Stimulation mit EGF bzw. FCS durch eine Ausschaltung von NFATc2 deutlich reduziert werden konnte. Diese Ergebnisse gaben Hinweis auf eine zentrale Rolle von NFATc2 bei der Zellzyklusregulation. Für die Zellproliferation ist der Wechsel der Zelle von der G1-Phase in die S-Phase innerhalb des Zellzyklus entscheidend. Dieser Vorgang steht unter der Kontrolle verschiedener Cycline, Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) und deren Inhibitoren, welche wiederum durch mitogene Signalkaskaden, beispielsweise der Ras-Raf-MEK-Erk Kaskade, reguliert werden können (Talarmin et al., 1999) (Mirza et al., 2004) (Yamamoto et al., 2006). CDKs werden durch Cycline aktiviert. Cycline und CDKs bilden in der Folge Komplexe, welche über Phosphorylierung weiterer Zellzyklusregulatoren zu Diskussion 62 einem Zellzyklusprogress führen können. Eine Dysregulation dieser Regulatoren zum Beispiel durch Überexpression kann zu einer unkontrollierten Proliferation der Zelle führen (Sherr, 1996). In Vorarbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass NFAT-Proteine eine wichtige Rolle bei der Expression von Zellzyklusregulatoren spielen können. So führte ein Verlust der NFATc1 Expression oder eine Hemmung der Aktivierung von NFATc1 zu einem Zellzyklusarrest der Tumorzellen in der G1-Phase. Im Gegensatz hierzu kam es durch Stimulation von NFATc1 nach nukleärer Translokation über eine Bindung an den c-Myc Promotor zu einer transkriptionellen Induktion von c-Myc und in der Folge gesteigerten c-Myc Expression. Voraussetzung hierfür ist jedoch ein intakter Calcineurin / NFATc1 Signalweg und eine normal regulierte c-Myc Expression. Amplifikation Karzinomzelllinien, verfügen, welche entzogen sich über eine chromosomale beispielsweise den c-Myc beschriebenen Regulationsmechanismen (Buchholz et al., 2006). Folge einer Hochregulierung von c-Myc ist unter anderem die Induktion von Cyclin D1, Cyclin D2 und verschiedenen CDKs (Amati et al., 1998) (Mateyak et al., 1999). Im Rahmen des vorliegenden Projektes wurde der Effekt einer Aktivierung von NFATc2 durch die Ras-Raf-MEK-Erk Kaskade auf bekannte Regulatoren der G1 / S-PhasenTransition untersucht. Hierfür wurde erneut in Zellen der Zelllinie 8988t die Expression von NFATc2 mithilfe der RNA-Interferenz Methode reprimiert und der Effekt einer EGF bzw. FCS Stimulation auf die Expression verschiedenen Zellzyklusregulatoren mittels Real-Time-quantitative-PCR analysiert. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass NFATc2 essenzieller Mediator einer extrazellulären Stimulation der Expression sowohl von Cyclin D1 als auch CDK4 und CDK6 ist. Interessanterweise konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass NFATc2 nicht nur einen Effekt auf die Expression proliferationsfördernder Cycline bzw. CDKs besitzt, sondern auch die Expression des antiproliferativen p15 (INK4b) entscheidend regulieren kann. p15 gehört zu der Gruppe der CDK-Inhibitoren und verhindert durch eine Bindung an CDK4 oder CDK6 eine Cyclin-CDK Komplexbildung und führt somit indirekt zu einem Zellzyklusarrest in der G1Phase (Sherr und Roberts, 1995) (Sherr und Roberts, 1999). Es zeigte sich, dass die mRNA Expression von p15 in hohem Maße von der Anwesenheit von NFATc2 Diskussion 63 abhängig war. Ohne NFATc2 kam es zu einer deutlich gesteigerten p15Expression in den untersuchten Pankreaskarzinomzellen. Zusammenfassend gelang es im Rahmen der vorliegenden Arbeit zu zeigen, dass NFATc2 einen zentralen Mediator extrazellulär-induzierter Zellproliferation darstellt, indem NFATc2 nicht nur für die Induktion wichtiger Zellzyklusinduktoren (Cyclin D1, CDK4, CDK6) sondern auch für die Zellzyklusinhibitoren (p15) verantwortlich ist. transkriptionelle Repression von Hierdurch wird klar, warum eine Hemmung des für die Aktivierung von NFATc2 so entscheidenden EGFR-RasRaf-MEK-Erk Signalwegs durch Cetuximab bzw. eine Ausschaltung von NFATc2 durch siRNA zu der dargestellten deutlichen Proliferationshemmung der Pankreaskarzinomzellen führen konnte. Umgekehrt wird gleichzeitig ebenso deutlich, welche enorme Bedeutung der EGFR-NFATc2 Signalweg für das onkogene Potenzial des Pankreaskarzinoms haben kann. Interessanterweise konnte im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich gezeigt werden, dass dieser Signalweg selbst die Expression von NFATc2 regulieren kann. So führte eine Stimulation des EGF-Rezeptors zu einer Steigerung der NFATc2 mRNA Expression. Ein möglicher Hinweis, dass die gesteigerte Expression von NFATc2 im Sinne einer autokrinen Stimulation neben der Regulation von NFATc2 für die Tumorprogression im Pankreaskarzinom von Bedeutung sein könnte. 4.4 Bedeutung und Ausblick Das onkogene Potenzial des EGFR-Ras-Raf-MEK-Erk Signalwegs ist in vielen Tumoren bekannt und macht die Signalkaskade zu einem interessanten Therapieansatz sowohl beim Pankreaskarzinom als auch bei einer Vielzahl von anderen Tumoren, wie beispielsweise dem Hepatozellulären Karzinom oder dem nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom. Insbesondere für das Pankreaskarzinom, welches nur schlecht auf herkömmliche Chemotherapeutika oder Strahlentherapie Diskussion 64 anspricht, ist die Entwicklung neuer Substanzen dringend erforderlich, denn durch schnelles Tumorwachstum und frühzeitige Metastasierung entzieht sich das Pankreaskarzinom häufig der Möglichkeit einer kurativen chirurgischen Intervention. Neben der Entwicklung neuer Substanzen aus dem Bereich der „Targeted Therapy“ ist auch die Erprobung verschiedener Substanzkombinationen Gegenstand laufender Untersuchungen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte NFATc2 als ein wichtiger onkogener Mediator der EGFR-Signalkaskade identifiziert werden. Über Induktion und Repression verschiedener Zellzyklusregulatoren ist NFATc2 von zentraler Bedeutung für die Zellproliferation. Die Entwicklung von Substanzen, welche eine selektive Inhibition von NFATc2 im Rahmen einer „Targeted Therapy“ ermöglichen, könnten zu einem neuen Therapieansatz beim Pankreaskarzinom führen. Auch könnte die Entwicklung einer solchen Substanz nicht nur eine Anwendung beim Pankreaskarzinom, sondern auch bei verschiedenen anderen soliden Tumoren finden, denn das Wissen um die onkogenen Funktionen der NFAT-Proteine wird derzeit immer größer. So konnte beispielsweise NFATc2 in Kolonkarzinomzellen nachgewiesen werden, was gleichzeitig mit einer deutlich erhöhten Invasivität der Tumorzellen einherging (Jauliac et al., 2002). Ebenso konnte gezeigt werden, dass NFATc2 zu einer gesteigerten Invasivität von Mammakarzinomzellen führen kann (Yiu und Toker, 2006). Die Entwicklung effektiver und gleichzeitig verträglicher NFAT-Inhibitoren ist hier jedoch nur ein Aspekt bei der Entwicklung neuer Therapieprotokolle. Durch den hochspezifischen Wirkansatz der Substanzen aus dem Bereich der „Targeted Therapy" wird es auch immer wichtiger werden, Methoden zu entwickeln, die eine Stratifizierung von Patienten ermöglicht, die tatsächlich von einer vorgesehen Therapie profitieren können. Zusammenfassung 65 5. Zusammenfassung Cetuximab ist ein monoklonaler Antikörper, der zur Blockade des EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor)-Rezeptors eingesetzt werden kann. Heute wird Cetuximab bereits in der Therapie von Kolorektalen Karzinomen und Plattenepithelkarzinomen des Kopf und Halses erfolgreich angewendet. Auch bei einer Anwendung im Rahmen einer Therapie des Pankreaskarzinoms konnten mit Cetuximab erste Erfolge erzielt werden. Die Blockade des EGF-Rezeptors durch Cetuximab im Rahmen der vorliegenden Arbeit führte zu einer Wachstumshemmung der untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien 8988t und IMIM-PC1. Ziel dieser Arbeit war es die molekularen Mechanismen dieser Wachstumshemmung zu identifizieren. Hierfür durchgeführte Reportergenassays ließen auf eine mögliche Rolle des Transkriptionsfaktors NFATc2 (nuclear factor of activated T-cells) in diesem Zusammenhang schließen. So führte Cetuximab zu einer signifikanten Hemmung der transkriptionellen Aktivität von NFATc2. Die zelluläre Lokalisation ist für die Funktion von NFATc2 entscheidend. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mithilfe vom Protein-Analysen, DNA (Desoxyribonukleinsäure)-Pulldown Assays und Reportergenassays gezeigt werden, dass eine Aktivierung der EGF-Rezeptor-Erk (Extrazellulär regulierte Kinase) -MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) Signalkaskade zu einer gesteigerten nukleären Lokalisation, einer Zunahme der DNA- Bindung und einer erhöhten transkriptionellen Aktivität von NFATc2 führt. Umgekehrt zeigte sich, dass diese Effekte durch eine Blockade der EGF-Rezeptor Signalkaskade antagonisierbar waren. Interessanterweise gelang es im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich eine funktionelle Interaktion des aus Untersuchungen an T-Lymphozyten bekannten Calcineurin-NFAT Signalwegs und der EGF-RezeptorErk Signalkaskade im Pankreaskarzinom nachzuweisen. So konnte die EGFRezeptor-Erk induzierte Zunahme der nukleärer Expression von NFATc2 durch eine Hemmung von Calcineurin mithilfe von CsA (Cyclosporin A) blockiert werden. In weiterführenden Experimenten wird zu klären sein, ob die EGF-Rezeptor-Erk Zusammenfassung 66 MAPK vermittelte Zunahme der nukleären NFATc2 Menge Folge eines gesteigerten nukleären Imports ist oder auf einer Blockade des Exports beruht. Die Repression der endogenen NFATc2 Expression mithilfe der RNA (Ribonukleinsäure)-Interferenztechnologie konnte in Thymidin-Proliferationsassays die Bedeutung von NFATc2 für das durch FCS (Fötales Rinderserum) bzw. EGF induzierte Wachstum in Pankreaskarzinomzellen zeigen. Als mögliche Ursache hierfür konnten mithilfe von Real-Time-quantitative-PCR (polymerase chain reaction) Untersuchungen Gene der Zellzykluskontrolle identifiziert werden, welche durch NFATc2 reguliert werden können. So konnte sowohl die Induktion wichtiger G1-Zellzyklusinduktoren, wie etwa Cyclin D1, CDK (Cyclinabhängige Kinase)4 und CDK6 als auch die transkriptionelle Repression des Zellzyklusinhibitors p15 durch NFATc2 gezeigt werden. Zusammenfassend zeigt dieser Arbeit, dass eine Blockade des EGF-Rezeptors durch Cetuximab eine Hemmung des Transkriptionsfaktors NFATc2 über den dem Rezeptor nachgeschalteten Signalweg über Erk und Calcineurin zur Folge hat und es somit über einen Verlust der Funktion von NFAT als Mediator der Zellzyklusinduktion zu einer Hemmung der Proliferation im Pankreaskarzinom kommen kann. Literaturverzeichnis 67 6. Literaturverzeichnis 1) Adjei AA, Cohen RB, Franklin W, Morris C, Wilson D, Molina JR, Hanson LJ, Gore L, Chow L, Leong S, Maloney L, Gordon G, Simmons H, Marlow A, Litwiler K, Brown S, Poch G, Kane K, Haney J, Eckhardt SG. 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