E. coli - DiagnostikNet | BB
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"Infektionskrankheiten auf dem Vormarsch Herausforderungen für die Diagnostik" Jörg Hacker Treffpunkt in vitro Diagnostik Berlin, 30. April 2008 Uli Dobrindt H. Merkert Knut Ohlsen E. Brzuszkiewicz P. Bouchard T. Friedrich S. Homburg G. Krumbholz B. Plaschke J. Zdziarski Cooperation C. Buchrieser, Paris E. Carniel, Paris L. Emödy, Pecs G. Gottschalk, Göttingen T. Korhonen, Helsinki J. Kaper, Baltimore E. Oswald, Toulouse E. Ron, Tel Aviv C. Svanborg, Lund B. E. Uhlin, Umea 2 - Wichtige Erreger von Infektionen - Pathogenitätspotential - Resistenzen - Neue Entwicklungen in der Diagnostik und Epidemiologie 3 Robert Koch (1843-1910) Die häufigsten Todesursachen Developing Countries Number of Deaths (x1000) Developed Countries Number of Deaths (x1000) 1. HIV/AIDS 2 678 1. Ischaemic heart disease 3 512 2. Lower respiratory infections 2 643 2. Cerebrovascular disease 3 346 3. Ischaemic heart disease 2 484 3. Chronic obstructive pulmonary disease 1 829 4. Diarrhoeal diseases 1 793 4. Lower respiratory infections 1 180 5. Cerebrovascular disease 1 381 5. Trachea/bronchus/lung cancers 938 6. Childhood diseases 1 217 6. Road traffic accidents 669 7. Malaria 1 103 7. Stomach cancer 657 8. Tuberculosis 1 021 8. Hypertensive heart disease 635 9. Chronic obstructive pulmonary disease 748 9. Tuberculosis 571 674 10. Self-inflicted 499 10. Measles WHO World Health Report 2004 Erreger nosokomialer Infektionen Staphylokokken Escherichia coli Enterokokken Pseudomonaden 6 Nosokomiale Infektionen, Auftreten in Deutschland Pneumonie S. aureus 24,1 % P. aeruginosa 16,8 % Klebsiella spp.12,1 % E. coli 10,5 % Enterobacter spp. 9,1 % Harnwegsinfektionen Enterococcus spp. 11,6 % E. coli 10,5 % P. aeruginosa 16,8 % C. albicans 8,8 % Klebsiella spp.5,0 % Sepsis Koagulase-negative Staphylokokken 30,9 % S. aureus 15,5 % Enterococcus spp. 11,6 % Enterobacter spp. 5,8 % Klebsiella spp.5,0 % (Quelle: RKI) 7 - Wichtige Erreger von Infektionen - Pathogenitätspotential - Resistenzen - Neue Entwicklungen in der Diagnostik und Epidemiologie 8 Pathogenitätsfaktoren - die Waffen der Mikroben Fe3+Fe3+ Toxine Fe3+ Eisenaufnahme Systeme Adhäsine Plasmide Chromosomale DNA Kapseln Flagelle Invasine 9 Der Kampf der Mikroben mit den Zellen .... Kolonisierung, Adhäsion, Biofilmbildung 10 Bakterienzellwand Wirtszellmembran Lengeler 826, Fig. 33.10 Rezeptoren Fimbrie 11 Biofilmbildung von Staphylokokken Confokale Laser mikroskopie 3D –Struktur eines Biofilm 12 Der Kampf der Mikroben mit den Zellen .... Zellzerstörung durch Toxine 13 Der Kampf der Mikroben mit den Zellen .... Eindringen, Invasion 14 Der Kampf der Mikroben mit den Zellen .... Adhäsine Adhäsion an Epithelzellen, Kolonisierung Toxine Gewebezerstörung Invasine Invasion Biofilmbildung Wirtszellen 15 - Wichtige Erreger von Infektionen - Pathogenitätspotential - Resistenzen - Neue Entwicklungen in der Diagnostik und Epidemiologie 16 Antibiotika-Resistenzmechanismen von Krankheitserregern A C D B 50 30 TARGETS: A- Zellwand B - Proteinsynthese C - DNA-Replikation D - RNA-Synthese 50 30 30 RESISTENZEN: • Veränderung von Targetgenen/ Proteinen (Punktmutationen, Gentransfer) • Auspumpmechanismen (Gentransfer) • Modifikation, Abbau der Antibiotika (Gentransfer) 17 Resistente Erreger • Methicillin-resistente Staphylokokken • Vancomycin-resistente Enterokokken • Vancomycin-resistente Staphylokokken • Chinolon-resistente Enterobakterien • ESBL produzierende Enterobakterien • Multiresistente Mykobakterien • Therapie-resistente HI-Viren (AIDS) • Antimykotica-resistente Pilze 18 Staphylococcus aureus: Resistenz gegen Oxacillin Resistenzvorkommen in Europa 19 Enterococcus faecalis – Zunehmende Resistenz gegen Aminoglycosiden 20 Resistenzentwicklung bei Escherichia coli 21 - Wichtige Erreger von Infektionen - Pathogenitätspotential - Resistenzen - Neue Entwicklungen in der Diagnostik und Epidemiologie 22 Diagnostische Methoden - Mikroskopie - Serodiagnostik - „klassischer“ Erregernachweis -Nukleinsäure-basierte Diagnostik 23 Mikroskopische Verfahren Lichtmikroskopie Konfokale Laser(Scanning) Mikroskopie RasterelektronenMikroskopie (REM) FluoreszenzMikroskopie TransmissionselektronenMikroskopie (TEM) 24 Serologische Verfahren in der Mikrobiologie Allgemeines Prinzip: Antigen-Antikörper-Reaktion Y Y Y YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y YY Y Y Direkte oder aktive Hämagglutination Antikörper an Latexpartikel gekoppelt Y Y Y Y Y Y Y Spezifische Antikörper Bakterien in Suspension Y Y Agglutination nach Gruber Erythrozyten Sichtbare Verklumpung der Bakterien, Partikel oder Erythrozyten Beispiele: Identifizierung von S. aureus; Identifizierung der H-und O-Ag von Salmonellen 25 Erregernachweis - Kultur 26 Biochemische Charakterisierung durch eine „Bunte Reihe“ 27 Nukleinbasierte Verfahren • PCR • FISH • PFGE • Sequenzanalyse • CHIP Technologie 28 16S-rRNA und 23S-rRNA spezifische Gene Primer für konservierte Regionen 1 1 2 40 1391 16S rRNA 3 4 5 1543 6 7 1 tRNAile 16S tRNAala tRNAs 8 9 10 474 2905 23S rRNA 5.3S 23S Ribosom 29 Prinzip der fluoreszenz-basierten in situ Hybridisierung (FISH) Ribosom 28S 5S 5.8S Eukaryot 18S Nukleus 18S-RNA rRNA-spezifiische Oligonukleotidprobe (Fluoreszenz-markiert) 16S-RNA 16S Prokaryot 23S 5S Ribosom 30 FISH – Detektionen von Bakterien und Amoeben Spezifische Oligonukleotid-Sonden für: Acanthamoeba castellanii Chlamyda trachomatis 31 Prinzip der Pulsfeldgelektrophorese Anzucht •Einbettung der Bakterien in Agaroseblöckchen •Lyse • Restriktion mit selten schneidenden Enzymen im Blöckchen • Reinigung der DNA 1 2 3 4 5 kbp 361 262 208 •Auftrennung der DNA in einer Pulsfeldgelelektrophorese 76 32 Das Beispiel Escherichia coli 33 Escherichia coli Pathogene Bakterien Apathogene/ Kommensale Bakterien Intestinale Infektionen Extraintestinale Infektionen Wirtsspektrum: Mensch Vogel Schwein Rind 34 Genomvergleich des UPEC-Stammes 536 mit E. coli K-12 MG 1655 PAI II536 PAI III536 waa G+C content Genom vollständig MG 1655 536 ORF (-) PAI I536 ORF (+) Both strains Gesamtlänge: 4,938,875 bp 81 tRNA Gene 50.32 % G+C E. coli 536 Phage 4,938,875 bp ORF Anzahl: 4636 (ORFs mit zugeordneter Funktion : 3653) Brzuszkiewicz E,et al. PNAS, 2006 PAI V536 GEI IX536 PAI IV536 GEI VIII536 GEI VII wbb GEI VI 536 536 35 Genetische Struktur der Genominseln des E. coli Stammes 536 0 kb 25 kb 50 kb 75 kb 100 kb PAI I536 PAI II536 PAI III536 PAI IV536 PAI V536 GEI VI GEI VII GEI VIII aspV GEI IX metY DR – Direct repeats Integrasen intakter oder kryptischer tRNA locus 36 Genome comparison of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains K-12 array „Patho Array“ (456 ORFs) 536 PAI I 536 PAI II 536 PAI III 536 PAI IV 536 PAI V UPEC (extraintestinal E. coli) Other pathotypes (intestinal E. coli) E. coli “core” genome: 3125 ORFs 27.2 % of all translatable ORFs of the E. coli K-12 strain was variable among the E. coli strains tested 4290 probes specific for the translated ORFs of K-12 strain MG1655 Screening von ExPEC und IPEC Virulenzmarker-Genen in 150 Stämmen mittels Genom-Hybridisierung 50 EHEC 8 nicht-pathogene Stämme 32 ABU Isolate 40 UPEC Isolate 20 ESBL-pos. ExPEC (rezidive HWI) • Werden ExPEC-Marker auch in IPEC Stämmen gefunden? • Unterscheiden sich ABU-Isolaten hinsichtlich ExPEC-Markern von UPEC? • Unterscheiden sich ExPEC-Isolate von rezidiven UTIs ? 38 Detektion von ExPEC and IPEC Markergenen in verschiedenen E. coli -Isolaten UPEC, ABU ABU, nonpathogenic, UPEC ESBL ExPEC EHEC UPEC, ABU EHEC, ABU LEE, stx2, ureC Aerobactin S fimbriae, hlyA, colibactin Salmochelin Yersiniabactin chuA, modD, prrA stx1, st, lt, bfp, pic, AIDA, cdt, aaf, aggR, invE 39 Etablierung eines fimH/gyrA SNP-Chip (single nucleotide polymorphism) 40 Phylogentischer Stammbaum von fimH Varianten 41 Extraintestinal pathogenic E. coli – Colonization and Disease Acute Infection Urosepsis Newborn Meningitis Kidney Kidney Infection (Pyelonephritis) Ureter Bladder infection (Cystitis) Chronic Infection Bladder Urethra Commensals of the Gastro-Intestinal Tract „Commensals“ of the urinary tract („Asymptomatic bacteriuria – ABU“) Macroarray hybridization: Patho array 140 120 Detected ExPEC genes IPEC genes 100 80 60 40 20 0 ABU Strain no. 57 21 38 62 20 ECOR group A B1 B1 B1 B2 B2 B2 Genome size[Mb] 4.2 4.7 4.7 4.7 5.3 4.9 5.1 27 37 83972 63 64 5 B2 B2 B2 D 4.9 5.1 5.1 5.1 43 Single sequence typing (SLST) Typ I Fimbrien (fim) F1C Fimbrien (foc) Pap Fimbrien (pap) α-Hämolysin (hly) 44 Strukturen der Fimbrien-Adhäsine fim (Typ 1 Fimbrien) B E A C D F G H G S H foc/sfa (F1C) C B A D E F pap (P Fimbrien) I B A H C D J K E F G 45 Type I Fimbrien: Vergleich von fim Determinanten und benachbarten DNA Regionen in ABU Isolaten Fim yjhE fecEDCBARI fimBEAICDFGH E. coli K-12 gntP A ABU38 - ABU62 + + ABU57 ST553 ECOR B1 ABU21 + - ABU20 ST73 ABU37 - B2 ABU83972 D ECOR B2 - ABU27 ABU63 + + ABU64 D - ABU5 10 kb 46 Pap-Fimbrien: Inaktivierung von pap Determinanten in den ABU Stämmen 27, 37 and 63 Pap Gen cluster 24 4664 138 160 264 Punktmutationen PapG 1 341 Die ABU Stämme 27, 37 und 63 besitzen Punktmutationen in papG ähnlich wie im ABU Stamm 83972 beschrieben. Dadurch wird das Gen der P-Fimbrien Adhäsine funktionsuntüchtig. 47 α-Haemolysin Inaktivierung der Poren bildenden Proteine α-Haemolysin Stamm hlyC hlyA hlyB hlyD Hly + ABU37 A416→T (STOP) - ABU27 A416→T (STOP) ABU83972 - 48 Evolutionsprozesse bei Enterobakterien GenomReduktion GenomAcquisition Kommensale Bakterien Deletion, Mutation, Rearrangement, Transfer Intrazelluläre Bakterien, Obligat pathogen, Endosymbiont „Genomoptimierung“ Extrazelluläre Bakterien, Fakultativ pathogen, Symbiont 49 Zusammenfassung I • Infektionskrankheiten stellen ein großes Problem des öffentlichen Gesundheitswesens dar. • Pathogenität und Resistenz tragen zur krankmachenden Wirkung der Mikroben bei. • Das Genom von pathogenen Keimen besteht aus einem Kernteil und einem flexiblen Genpool, zum flexiblen Pool zählen die Pathogenitätsinseln. 50 Zusammenfassung II • Nukleinsäure-basierte Verfahren spielen eine zunehmende Rolle in der Diagnostik pathogener Mikroorganismen. • Pathogene E. coli Bakterien lassen sich mittels Nukleinsäure basierter Verfahren charakterisieren. • Kommensale Enterobakterien tragen oft degenerierte Pathogenitätsdeterminanten. 51
