Bericht
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Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 GENSPIRALEPRAKTIKUM 1 FRAGE- UND PROBLEMSTELLUNG In diesem Praktikum, das am Anfang von dreien Genspirale-Praktika steht, soll zuerst das gentechnische und sterile Arbeiten gelernt werden. Anschliessend soll DNA in einen Empfängerorganismus übertragen werden. VERWENDETE MATERIALIEN, GERÄTSCHAFTEN UND LEBEWESEN Damit die Durchführung dieser Praktika möglich wurde, bekamen wir Unterstützung von Novartis. Sie schickten uns ein Paket mit den nötigen Gerätschaften. Gerätschaften: - Mikroliterpipetten (0.5-10µl ; 20-200µl ; 200-1000µl) - Pipettierspitzen (weiss, gelb, blau) - Wärmeschrank - Wärmeschüttler - Styroporbox mit Eis - Eisbad - Heizblock / Thermoblock - Bunsenbrenner - Mikrowelle - Petrischalen - Bechergläser - Eppendorfröhrchen (weiss, grün, gelb, rot) - Pasteeurpipette Ausplatierrechen - Entsorgungsbeutel und Entsorgungsflasche Materialien: - Wachstumsmedium:-steriles LB-Agar-Medium - Plasmid-DNS - pGlo-DNS - 70% Ethanol - Zellstofftücher - destilliertes Wasser - Parafilm und Klebeband - LB-Medium Lebewesen: - kompetente E. coli K-12 Bakterien (Escherichia coli) 1 Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 BEOBACHTUNGEN GIESSEN VON PLATTEN MIT NÄHRMEDIUM Nachdem die Übungen zum sterilen Arbeiten durchgeführt wurden, die sehr ausführlich in der Anleitung beschrieben sind und die Arbeitsfläche vorbereitet (sterilisiert) wurde, wurde wir LB-Agar- Nährmedium in eine Petrischale gegossen. Leider war es an diesem Tag nicht möglich die Gashähne zu benutzen und darum standen auch keine Laborbrenner zur Verfügung. Durch diesen Umstand war es nicht möglich, während dem Giessen, einen Aufwärts-Luftstrom zu erzeugen, der das Medium vor Verschmutzung geschützt hätte. Das LB-Medium wurde nach Anleitung in die dafür vorgesehenen Petri-Schalen gegossen und danach abgekühlt. PIPETTIEREN MIT DEN MIKROLITERPIPETTEN Das wichtigste in Kürze: Einstellen: Die zu pipettierende Menge mithilfe des Zahlenrades an der Pipette einstellen. Ansaugen: Druckknopf nur bis zum ersten Widerstand durchdrücken und dann in Flüssigkeit eintauchen, dann den Druckknopf langsam loslassen Ablassen: Zweiten Druckknopf bis zum ersten Widerstand runter drücken. Anschliessend bis zum zweiten Widerstand durchdrücken, damit die evtl. restliche Flüssigkeit ausgestossen wird. Diesen Vorgang übte die Klasse einige Minuten. HERSTELLUNG EINES AUSPLATTIERRECHENS Der Ausplattierrechen wurde exakt nach Anleitung hergestellt und später im Versuch zum Verstreichen der Bakteriensuspension gebraucht. 2 Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 ÜBERTRAGUNG VON GENETISCHEM MATERIAL IN DEN EMPFÄNGERORGANISMUS Wie gaben als erstes Plasmid-DNS zu den einen Bakterien, pGlo-DNS zu den anderen. Eine Kontrollgruppe, die keine zusätzliche DNS enthielt, wurde auch erstellt. Danach setzten wir die Bakterien Wechselbädern aus, die jeweils 5min dauerten. Waren diese vorbei, gaben wir Nahrung in Form von LB-Medium hinzu. Die so vorbereiteten Bakterien wurden anschliessend auf zahlreiche Platten mit Nährmedium gegeben (wurden vom Chemieassistent vorbereitet): A: gelbe Platten B: C: D: violette Platten E: schwarze Platte F: LB-Amp + Plasmid-DNS LB-Amp – Plasmid-DNS LB-Amp + pGlo-DNS LB + Plasmid-DNS LB – Plasmid-DNS LB-Amp-Ara + pGlo-DNS Zur optimalen Verteilung der Bakterien, wurden diese mit dem Ausplattierrechen vorsichtig verstrichen. Die Platten wurden verschlossen und umgekehrt in den Wärmeschüttler gelegt, damit das Kondenswasser, das sich nach einiger Zeit bilden wird, die Bakterien nicht am Wachsen hindert und so die Versuchsergebnisse verfälscht. Nach diesem Versuch wurde alles wie angegeben aufgeräumt. Beim Arbeiten mit genetisch verändertem Material ist besondere Vorsicht geboten. Es sollten keine genetisch veränderten Bestandteile aus dem Labor herausgeraten, da diese sich sonst vermehren könnten und die „natürliche“, einheimische Population gefährden könnten. AUFGABEN Welche Nährstoffe und Mineralien braucht E.coli zum wachsen? E.coli braucht hauptsächlich Zucker und bestimmte Aminosäuren. E.coli produziert Vitamin K. Welche Inhaltsstoffe sind in LB-Medium enthalten? Im LB-Medium sind vor allem Hefeextrakt, Trypton und NaCl enthalten. Was ist ein Plasmid? Was ist ein Vektor? Plasmide sind kleine ringförmige, doppelsträngige DANN-Moleküle, die vor allem in Bakterien vorkommen. Sie können mehrere Gene enthalten (unter anderem Antibiotika-Resistenzen). Ein Vektor ist ein Transport- oder Vermehrungsmittel für DNS-Fragmente. Er 3 Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 transportiert DNS von einem Organismus zu einem anderen. Als Vektoren dienen vor allem Plasmide und Viren. Welche Wirkung hat Ampicillin auf Bakterien? Zu welcher Stoffklasse gehört es? Ampicillin ist ein Antibiotikum aus der Gruppe der Penicilline. Das heisst, dass es Bakterien abtötet (die nicht resistent dagegen sind). Es wirkt, indem es ein Enzym blockiert, das während der Teilungsphase des Bakteriums für die Ausbildung einer neuen Zellwand zuständig wäre. Dadurch werden die Zellen teilungsunfähig, leben aber weiter. Was ist Arabinose und welche Bedeutung hat es beim durchgeführten Versuch? Arabinose ist ein Einfachzucker (Monomer), der in unserem Experiment für die Ernährung der Bakterien auf der schwarzen Platte verantwortlich war. Die Bakterien, die sich auf dieser Platte befanden, hatten einen Arabinose-Promotor vor dem pGloGen, dieser hat dafür gesorgt, dass das pGlo-Enzym aktiviert wurde, sobald sich das Bakterium von Arabinose ernährte. Dadurch leuchteten diese Bakterien unter UVLicht grün. Warum eignen sich Bakterien gut, wenn ein gesamter Organismus genetisch verändert werden soll? Bakterien gehören zu den Prokaryonten, bestehen also aus nur einer Zelle und besitzen keinen Zellkern. Sie sind im Allgemeinen einfacher gebaut als die Eukaryonten. Ausserdem teilen sie sich in relativ schnellen Zyklen. Diese Eigenschaften vereinfachen es, mit den Bakterien zu arbeiten. Es wird einfacher an die DNA ranzukommen und sie muss nur in einer Zelle verändert werden, da der Organismus ja nur aus einer Zelle besteht. Warum sind Bakterien geeignete Organismen für gentechnische Veränderungen, wenn man Auswirkungen auch in späteren Generationen untersuchen möchte? Weil sich die Bakterien (wie schon erwähnt) relativ schnell teilen. Sie haben bei guten Umweltverhältnis ein exponentielle Wachstum. Durch diese kurzen Generationszeiten, lässt sich die Veränderung, die die genetische Veränderung mit sich bringt gut beobachten. Welche besonderen Eigenschaften sollte ein Labor-Organismus haben bzw. nicht haben? Er sollte leicht und kostengünstig gezüchtet/vermehrt werden können. Ausserdem ist es von Vorteil, wenn man die Vermehrung des Organismus gezielt kontrollieren kann. Über den Labor-Organismus sollte ausserdem so viel wie möglich bekannt sein. Der Labor-Organismus sollte gut unter Kontrolle gehalten werden können, so dass er 4 Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 sich ohne die „Hilfe“ des Menschen nicht selbstständig vermehren kann und ausserhalb des Labors Lebensräume kontaminieren könnte. Warum ist es möglich, dass auf einer Platte mit Nährmedium und Ampicilin dennoch Bakterien wachsen? Die Bakterien, die auf Ampicillin wachsen können, sind resistent gegen dieses Antibiotikum. In unserem Falle haben wir ihnen ein ampicillinresistentes Gen eingeschleust. DISKUSSION Dieses Praktikum hat uns das Arbeiten in einem gentechnischen Labor näher gebracht und stellt gleichzeitig die Grundlage für die weiteren zwei Genspirale-Praktika dar. Der Kern des Praktikums stellte die Übertragung von genetischem Material in den Empfängerorganismus dar. Das Ziel dieses Schrittes war, die Plasmid-DNS (welche ein Gen enthält, dass Ampicillin-Resistenz verleiht) und die pGlo-DNS (enthält das AmpicillinResistenz-Gen sowohl als auch das Gen, für die Produktion des Green Flourescent Protein) in die kompetenten (mit Salzlösungen vorbehandelten) Bakterien einzuschleusen. Danach wurden die verschiedenen Bakterien auf zahlreiche Platten mit unterschiedlichen Nährböden verteilt werden. Daraufhin liess man die Bakterien wachsen und Kolonien bilden. Je nach dem WO überall Bakterien wachsen, lässt sich feststellen, ob es gelang diese genetisch zu verändern. Da das Wachsen der Bakterien viel mehr Zeit benötigt, als uns während eines Praktikums zur Verfügung steht, kann ich in diesem Bericht nur Vermutungen anstellen. (Zur Vereinfachung nochmals die Tabelle mit den Bakterien-Verteilungen): gelbe Platten violette Platten schwarze Platte A: LB-Amp + PlasmidDNS B: LB-Amp – PlasmidDNS C: LB-Amp + pGlo-DNS D: LB + Plasmid-DNS E: LB – Plasmid-DNS F: LB-Amp-Ara + pGloDNS Ich erwarte auf allen Platten ein Bakterienwachstum, ausser auf Platte B. Auf dieser Platte war nämlich Ampicillin im Nährmedium enthalten, die Bakterien hingegen enthielten keine DNS, die Ampicillinresistenz verliehen hätte. Da auf der Platte A, sowohl Ampicillin als auch genetisch veränderte, ampicillinresistente Bakterien platziert waren, werden diese wunderbar gedeihen. Weil die pGlo-DNS in den Bakterien auf Platte C ihnen ebenfalls eine Ampicillinresistenz verleiht, erwarte ich auch auf dieser Platte ein Wachstum. Auf den Platten D und E werden die Kolonien optimal wachsen, da ihnen das LB-Medium alle für sie notwendigen Nährstoffe liefert. 5 Praktikumsbericht Genspirale Manuela Berger 9. November 2009 Die Platte F wird ebenfalls ein Bakterienwachstum erleben. Die auf ihr enthaltenen Bakterien enthalten nämlich pGlo-DNS, die sie resistent gegen Ampicillin macht. Ausserdem verursacht die Arabinose im Nährboden, dass der Arabinose-Promotor vor dem eingeschleusten pGlo-Gen dieses aktiviert und somit die Produktion des GFP beginnt. Die Bakterien auf der Platte F werden also unter UV-Licht grün leuchten. Im Rahmen des Genspiralepraktikums sind ausserdem die Reinigung von DNS, der Restriktionsverdau von Plasmid-DNS und das Auftrennen und Sichtbarmachen von DNSFragmenten mit Hilfe der Gel-Elektrophorese geplant. 6
