AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 1 von 14 KLASSIFIZIERUNG
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AVID II / 1993 KLASSIFIZIERUNG: PRRS / SSS Seite 1 von 14 Familie : nicht klassifiziert Genus : Arterivirus-like 1. ALLGEMEINES Das Virus des Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) wurde bisher nur im Schwein nachgewiesen. Es verursacht das respiratorische Syndrom und in tragenden Sauen zusätzlich Spätaborte (reproduktives Syndrom). Die Aborte, die insbesondere in fortgeschrittenem Seuchenstadium mit Übertragen einhergehen, führten zu der Bezeichnung "Seuchenhafter Spätabort beim Schweinen" (SSS). Das PRRSV wurde in Primärkulturen porziner Lungenmakrophagen isoliert und vermehrt. Die bislang untersuchten europäischen PRRSV-Isolate ergaben keine gesicherten Hinweise auf serologische Divergenzen. Vergleichende Untersuchungen mit dem von Collins u. Mitarb. beschriebenen in einer permanenten Zell-Linie zu vermehrenden Isolat VR 2332 (USA) und verschiedenen europäischen Isolaten ergaben allerdings antigene Unterschiede zwischen VR 2332 und Lungenmakrophagen-Isolaten aus Europa. Erste serologische Untersuchungen lassen zudem auf das Vorkommen antigenetisch unterschiedlicher Stämme in den USA schließen. Weitergehende Untersuchungen unter Einbeziehung schwach pathogener europäischer PRRSV-Stämme sowie von Isolaten, die zu späteren Zeitpunkten des Seuchengeschehens gewonnen wurden, müssen zeigen, inwieweit antigene Unterschiede zwischen verschiedenen PRRSV-Isolaten bestehen und welche Schlußfolgerungen bezüglich diagnostischer Maßnahmen sich daraus ergeben. Zu diagnostischen Zwecken werden in der Bundesrepublik Deutschland die Isolate PRRSV I.10, PRRSV 2.46, PRRSV Cobbelsdorf sowie SSSV VR1653/91 eingesetzt. Die Isolate PRRSV I.10 und PRRSV 2.46 stellen Prototyp-Stämme für PRRSV dar. Der Virusnachweis erfolgt durch Virusisolierung in Primärkulturen porziner Lungenmakrophagen. Der direkte PRRSV-Antigennachweis mittels Immunfluoreszenz- oder Peroxidasetechnik kann an Kryostatpräparaten sowie an durch Lungenspülung gewonnenen Lungenmakrophagen vorgenommen werden, wobei sowohl die geringe Sensitivität als auch die hohen Hintergrundreaktionen diese Technik nur in Ausnahmefällen als geeignet erscheinen lassen. An der Optimie- AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 2 von 14 rung der Methode einschließlich des Antigennachweises an abortierten Feten wird gearbeitet. Der PRRSV-Antikörpernachweis erfolgt im indirekten Peroxidase Monolayer Assay (IPMA). Weiterhin wurde ein ELISA zum Nachweis von PRRSV-Antikörpern beschrieben, dessen Eignung für eine Bestandsdiagnose nachgewiesen ist (Albina u. Mitarb.). Die Anwendung zur Einzeltierdiagnose sowie die Sensitivität gegenüber verschiedenen PRRSV-Stämmen bedarf einer weiteren Abklärung. 2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 2.l Direkter Virus/Antigennachweis 2.1.1 Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenz - Lunge und Lungenmakrophagen - Lymphknoten - Milz - Tonsillen 2.1.2 Virusnachweis mittels Anzüchtung in Zellkulturen A - Blutserum - Blutplasma - Brusthöhlenflüssigkeit - Lunge / Lungenmakrophagen B - Milz - Lymphknoten - Leber - Knochenmark C - bei Saugferkeln können auch alle übrigen Gewebe mit Ausnahme des Zentralnervensystems zur Virusisolierung verwendet werden. Die Effizienz der Virusisolierung nimmt von A nach C ab. 2.2 Indirekter Virus/Antigennachweis AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 3 von 14 - Blutserum - Blutplasma - Brusthöhlenflüssigkeit - Kolostrum 3. UNTERSUCHUNGSGANG 3.1 Antigennachweis mittels direkter Immunfluoreszenz Der Antigennachweis erfolgt an Organ-Kryostatschnitten: - Schnitte mit Aceton fixieren (-20 oC, 10 Minuten), - Färbung mit FITC-konjugiertem PRRSV-Antiserum oder FITC-konjugiertem PRRSV-spezifischen mAK (Verdünnungsmittel 0,2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,6) ; evtl. Kontrastierung durch Zusatz von Evans Blau (3 Teile Konjugat-Gebrauchslösung + 1 Teil 0,01%ige Evans-Blau-Lösung), - Inkubation bei 37 oC, 1 Stunde, - Negative Kontrollen: Kryostatschnitte von Normalschweinen. Bei positivem Nachweis von Virusantigen zeigen die Zellen eine diffuse oder feingranuläre zytoplasmatische Fluoreszenz. Sie sind in Bereiche der Lungen mit beginnender interstitieller Pneumonie oder in lymphatischem Gewebe sehr locker eingestreut. 3.2 Virusnachweis mittels Anzüchtung in der Zellkultur 3.2.l Vorbereitung des Untersuchungsmaterials Organe: Originalsuspension unverdünnt sowie 1:10 und 1:100 verdünnt; Körperflüssigkeiten: unverdünnt sowie 1:10 und 1:100 verdünnt. 3.2.2 Zellkultulturen und deren Beimpfung AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 4 von 14 Anzüchtung von Lungenmakrophagen (LM - siehe ANHANG) in 24-Loch-Mikroplatten oder 25 cm2 - Zellkulturflaschen: - Zelldichte: 2 x 106 Lungenmakrophagen/ml Kulturmedium (KM - siehe ANHANG), - Menge : 1 ml Zellsuspension pro Plattenloch bzw. 6 ml pro Flasche, - Inkubation mindestens 1 Stunde bei 37 oC unter 5% CO2, - Zellkulturüberstand abnehmen - LM-Kulturen mit neuem KM derart überschichten, daß der Zellrasen gerade vollständig bedeckt ist, - Probenmaterial unverdünnt, 1:10 und 1:100 verdünnt auf die Kulturen verimpfen (0,1 ml pro Loch bzw. 0,5 ml pro Flasche), - Ansätze 1 Stunde bei 37oC unter 5% CO2 inkubieren, - Zugabe von KM zu den Kulturen (0,9 ml pro Loch bzw. 5,5 ml pro Flasche). Die Zellkulturansätze werden täglich auf das Auftreten eines zytopathischen Effektes (ZPE) untersucht. Der ZPE kann bereits nach 1 bis 2 Tagen auftreten. Da der ZPE in einigen Fällen erst in der 3. Passage beobachtet werden kann, ist eine Passagierung der Zellkulturen in solchen Fällen über mindestens 3 Passagen erforderlich. Hierzu werden die Zellkulturen mittels einer Pipette oder eines "Kratzers" resuspendiert und im Verhältnis 1:3 auf neue LM-Kulturen verimpft. Der ZPE führt in der Regel innerhalb weniger Stunden zu einer vollständigen Lyse der LM, die sich durch eine vollständige Auflösung der Zellstruktur und in fortgeschrittenem Stadium durch feine korpuskuläre Strukturen auszeichnet. Bei manchen Proben wird eine antivirale Aktivität in unverdünnten sowie 1:10 verdünnten Ansätzen festgestellt, die das Auftreten eines ZPE verhindert. Weiterhin kann es bei einigen Isolaten nach 2 bis 3 Passagen zum Verlust der Virusreplikation und somit des ZPE kommen. Die Spezifität des ZPE sollte deshalb sofort nach Auftreten eines ZPE überprüft werden. Hierzu erfolgt eine Titration des Isolates auf LM-Kulturen, die in 96-Loch Flachboden-Mikrotiterplatten oder auf Objektträgern angelegt wurden. Die Titrationsansätze werden beim ersten Auftreten eines ZPE mit absolutem Äthanol (-20oC) für 10 Minuten fixiert und entsprechend dem Verfahren des Antikörpernachweises (3.3) unter Verwendung eines PRRSV-Antiserums oder eines PRRSV-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK) und eines negativen Kontrollserums AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 5 von 14 oder irrelevanten mAK auf PRRSV-Antigen untersucht. Nicht infizierte LM-Kulturen dienen als Kontrolle. 3.3 Antikörpernachweis mittels indirektem Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) 3.3.1 Vorbereitung der Zellkulturen Anzüchtung von Lungenmakrophagen (LM - siehe ANHANG) in 96-LochFlachbodenmikroplatten oder Terasakiplatten: - Zelldichte: Mikroplatten : 1,2-1,5 x 106 Zellen/ml KM (siehe ANHANG), Terasakiplatten : 1,0 x 106 Zellen/ml KM; - Menge : Mikroplatten: 100 µl pro Loch, Terasakiplatten 10 µl pro Vertiefung; - Inkubation über Nacht bei 37 oC unter 5% CO2, - mikroskopische Überprüfung der Zellkulturen, - Infizierung der Kulturen in den Reihen A,C,E,G mit PRRSV (Virusgehalt etwa 0,5 MOI [multiplicity of infection = Verhältnis KID 50/Zellzahl], Impfmenge 100 µl bei Mikroplatten bzw. 10 µl bei Terasakiplatten), - die Reihen B,D,F und H dienen als nicht infizierte Kontrollen. Die infizierten Kulturen zeigen etwa 17 bis 30 Stunden nach Infektion einen ZPE. Die Kinetik der Infektion kann je nach PRRSV-Stamm und LM-Charge differieren und innerhalb weniger Stunden zu einem weit fortgeschrittenen ZPE führen, der einen Gebrauch dieser Kulturen für den IPMA nicht mehr zuläßt. Deshalb sollte die Infektion der Platten etwa 3 Stunden nach der Inokulation einer "Pilotplatte" erfolgen. Diese "Pilotplatte" wird ab etwa 16 Stunden nach Infektion in kurzen Zeitabständen auf das Auftreten eines ZPE untersucht. AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 6 von 14 Sobald die ersten Anzeichen eines ZPE festgestellt werden, erfolgt die Fixierung der gesamten Plattencharge: - Platteninhalt ausschlagen, Platten auf Eis lagern, - Mikroplatten : pro Loch 100 ìl absolutes Äthanol (-20oC) einpipettieren, Inkubation 10-15 Minuten auf Eis; - Terasakiplatten: Platten zweimal mit Äthanol fluten, Inkubation nach dem zweiten Fluten 15 bis 30 Minuten bei 4 oC . Die Pilotplatte wird verworfen. Die fixierten Mikrotiterplatten werden bis zum Gebrauch unter Äthanol waagrecht bei –70 oC gelagert, Terasakiplatten werden trockengeschlagen und ebenfalls bei –70 oC aufbewahrt. 3.3.2 Durchführung des IPMA 3.3.2.1 Vorbereitung der Platten (Inaktivierung zellulärer Peroxidase) - Äthanol ausschlagen, - Platten mit eiskaltem PBS waschen, - in jedes Loch 100 µl eiskalte PBS/Methanol-Lösung (80:20) pipettieren, - Platten 5 Minuten auf Eis inkubieren, - in jedes Loch 20 µl einer H2O2-Lösung (1:192 in PBS) zupipettieren - Inkubation für 15 Minuten auf Eis, - Platten ausschlagen, - Platten zweimal mit PBS waschen. Damit sind die Platten (IPMA-Platten) fertig zum Gebrauch. 3.3.3.2 Durchführung des Antikörpernachweises Der Antikörpernachweis wird zweckmäßig in den Verdünnungsstufen 1:80, 1:320 und 1:1280 durchgeführt. Dies ermöglicht die Beurteilung bei unterschiedlicher Hintergrundfärbung ("stickyness") von Seren sowie die Ermittlung von PRRSV-Antikörper-Titerstufen, die Hinweise auf die epidemiologische Situation AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 7 von 14 zulassen. Es können auch Serumverdünnungen von 1:20 getestet werden, jedoch treten dabei vermehrt Hintergrundreaktionen auf. Je Ansatz sollten ein positives und ein negatives Kontrollserum mitgeführt werden. - Vorverdünnung der Seren 1:20 mit IPMA-Puffer (siehe ANHANG), - IPMA -Platten mit 120 µl IPMA -Puffer/Loch beschicken, - 40 ìl vorverdünntes Serum in je ein Loch mit infizierten und nicht infizierten LM-Kulturen der Säulen 1,4,7 oder 10 pipettieren (Verdünnung 1:80), - durch Mischen und Überpipettieren von je 40 µl aus den beschickten Löchern in die Säulen 2,5,8 oder 11 die Verdünnung 1: 320 und durch Wiederholen dieses Vorganges in die Säulen 3,6,9 oder 12 die Verdünnung 1: 1280 herstellen. Bei Verwendung von Terasakiplatten erfolgen alle Verdünnungsschritte in Mikrotiterplatten. Danach werden je 10 µl auf eine infizierte und eine nicht infizierte LM-Kultur übertragen. - Inkubation der Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur, - Platten ausschlagen, - Platten dreimal mit PBS waschen, - Platten ausschlagen, - Zugabe von 100 µl Peroxidase-konjugiertem anti-Schwein-IgG (H+L)/Loch (Gebrauchsverdünnung in PBS + 5% Pferde-Normalserum), - Inkubation 1 Stunde bei Raumtemperatur, - Platten ausschlagen, - Platten dreimal mit PBS und einmal mit Aqua bidest. waschen, - Platten ausschlagen, - in jedes Loch 100 µl frisch angesetzte AEC-Substratlöung (siehe ANHANG) einpipettieren, - nach etwa 10 Minuten (mikroskopisch ist bei den mit PRRSV-Antiserum inkubierten Kulturen ein deutlicher Unterschied zwischen infizierten und nicht infizierten Löchern zu erkennen) Platten ausschlagen, - Platten zweimal mit Aqua bidest. waschen, - pro Loch 100 µl Aqua bidest. einpipettieren. AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 8 von 14 Mikroskopische Auswertung: Als Antikörper-positiv wird ein Serum bewertet, wenn sein Ansatz in infizierten Kulturen eine PRRSV-spezifische zytoplasmatische Peroxidasefärbung zeigt, eine entsprechende Färbung in nichtinfizierten Kulturen sowie mit negativen Kontrollseren nicht auftritt Die Platten können über kurze Zeiträume bei 4 oC trocken oder unter Aqua bidest. aufbewahrt werden. Zur mikroskopischen Auswertung sind die Platten wieder mit Aqua bidest. aufzufüllen. AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 9 von 14 ANHANG 1 Medien und Lösungen Kulturmedium (KM): MEM Eagle + NEAA1 40 % BME Eagle, Glasgow modification1 2 40 % Tryptose phosphate broth 10 % FKS 10 % Vor Gebrauch Zusatz von: IPMA-Puffer - Penicillin 100 I.E./ml - Streptomycin 100 ug /ml - Baytril 10 ug /ml Casein 2,0 g PBS ad 100 ml (Unter Erhitzen (50 oC) im Wasserbad lösen) Tween 20 0,1 ml Filtration zur Entfernung ungelöster Caseinpartikel Lösung A: AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol)3 AEC-Substratlösung: 6,0 mg N,N-Dimethylformamid 1,5 ml (kann über einige Wochen gelagert werden) Lösung B: Na-Acetat, pH 5.0 0,05 m (steril filtriert !) Gebrauchslösung Lösung A: 1,5 ml Langsam zugeben zu Lösung B: 28,5 ml Vor Gebrauch Zugabe von 0,15 ml H2O2 (3% in Aqua bidest.) AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 10 von 14 ANHANG 1 (Fortsetzung) Anti-Schwein-IgG (H+L)-PO4: Gebrauchsverdünnung 1:2000 H2O25 Bezugsquellen: Stammlösung 1 Fa. Gibco 2 Fa. Difco 3 Fa. Serva 4 Fa. Dianova 5 Fa. Merck 30% AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 11 von 14 ANHANG 2 Lungenmakrophagen-Zellkultur Ausgangsmaterial sind primäre Lungenmakrophagen gesunder Schweine. Für die Gewinnung von Lungenmakrophagen (LM) können Ferkel und Läuferschweine aus PRRS-freien Beständen bis zu einem Alter von 12 Wochen verwendet werden. Die Tiere werden narkotisiert (z.B. mit Hypnodil/Stresnil) und mittels Durchtrennung der A./V. axillaris entblutet. (Eine Entblutung im Halsbereich kann zur Aspiration von Blut und somit zur Untauglichkeit der Lunge führen !) Die Lunge wird entnommen, die LM im Labor durch Instillation von Kulturmedium (ohne FKS-Zusatz !), leichtes Kneten der Lungenflügel und Dekantieren der Waschflüssigkeit in ein Becherglas gewonnen. Alternativ können die LM durch mehrmalige Instillation und nachfolgende Aspiration von Kulturmedium mittels eines auf eine Spritze (20 ml) aufgesetzten Schlauches gewonnen werden. Der Vorgang wird solange wiederholt bis die Waschflüssigkeit keine deutliche Trübung mehr aufweist oder eine Rotfärbung auf Kontamination mit Erythrozyten hinweist. Grobe Verklumpungen werden mittels Filtration durch Gaze entfernt. Die Waschflüssigkeit muß umgehend in Zentrifugenröhrchen überführt werden, da die LM sonst am Boden des Becherglases anhaften und die Zellausbeute wesentlich reduziert wird (evtl. kann die Zellsuspension mittels eines Magnetrührers sanft bewegt werden). Die Zellsuspension wird bei 400g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in KM resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wird das Pellet wieder in KM aufgenommen, die Zellen werden unter 0,1% Trypanblau ausgezählt, mit KM auf die vorgesehene Dichte eingestellt und in den jeweiligen Kulturgefäßen kultiviert. Kontaminationen mit Erythrozyten können durch Behandlung mit Gey's Puffer beseitigt werden. Diese wird nach dem ersten Waschen des LM-Pellets durchgeführt, wobei das Pellet in Gey's Puffer resuspendiert und bis zur vollständigen Hämolyse inkubiert wird. Diese Behandlung kann aber zu einer unterschiedlich starken Schädigung der LM führen. Schonender ist das Abschütten der Erythrozyten nach Anhaften der LM an den Kulturgefäßen. Hierzu werden die Erythrozyten frühestens 1 Stunde nach Beschicken der Kulturgefäße durch leichtes Schütteln in Suspension gebracht, während die LM weiter an den AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 12 von 14 ANHANG 2 (Fortsetzung) Kulturgefäßen anhaften. Durch Dekantieren des KM werden die Erythrozyten entfernt. Gegebenenfalls kann der Vorgang wiederholt werden. Nach Abschluß des Dekantierens werden die einzelnen Kulturen mit der vorgesehenen Menge KM beschickt. Soweit erforderlich, können LM in flüssigem Stickstoff bevorratet werden. Hierzu werden die LM auf eine Zelldichte von 30 x 106 / ml Einfriermedium (90% FKS, 10% DMSO) eingestellt und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert. Nach dem Auftauen werden die LM auf eine Dichte von 1 x 106 / ml KM eingestellt und in den vorgesehenen Kulturgefäßen ausgesät. Nach einem Tag erfolgt ein Mediumwechsel. Danach können die Kulturen in den unterschiedlichen Testsystemen verwendet werden. AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 13 von 14 LITERATUR ALBINA, E., Y. LEFORBAN, T. BARON, J. PLANA DURAN and P. VANNIER (1992): An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Ann. Rech. Vet. 23, 167-176. COLLINS, J.E., D.A. BENFIELD, W. CHRISTIANSEN, L. HARRIS, D.E. GORCYCA, D.W. CHLADEK and R. MORRISON (1991): Swine Infertility and Respiratory Syndrome (Mystery Swine Disease). 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BRAAMSKAMP (1991): Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Vet. Quart., 13, 121-130. AVID II / 1993 PRRS / SSS Seite 14 von 14 SACHBEARBEITER Dr. V.F. Ohlinger, Dr. B. Haas, und Prof. Dr. R. Ahl: Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Anstaltsteil Tübingen, Postf. 1149, 72076 Tübingen Dr. J. Beyer,: Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Friedrich Loeffler Institute, 17498 Insel Riems Prof. Dr. K.H. Witte: Staatl. Veterinäruntersuchungsamt Arnsberg, Zur Taubeneiche 10-12, 59821 Arnsberg 2
