Molekularbiologie 2 - Wer war am Tatort?

Molekularbiologie 2 - Wer war am Tatort?
DNA-Tatortanalyse – Genetischer Fingerabdruck
Inhaltsverzeichnis
Theoretischer Teil ................................................................................................................................... 2
1. Der genetische Fingerabdruck – Ausgangslage der Analyse ......................................................... 2
2. Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ......................................................................................... 2
3. DNA-Sequenzen zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks ............................................... 5
4. Die zweifelsfreie Unterscheidung von zwei beliebigen Personen ................................................... 6
5. Die Gelelektrophorese ..................................................................................................................... 7
6. Glossar ............................................................................................................................................ 9
6. Weiterführende Literatur ................................................................................................................ 11
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Theoretischer Teil
1. Der genetische Fingerabdruck – Ausgangslage der Analyse
Bei dem Verfahren des DNA-Fingerprinting (DNA-Profiling, DNA-Typing) wird DNA verwendet, um
eine Verwandtschaft oder Identität von menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Individuen aufzuzeigen. So bezeichnet das DNA-Fingerprinting das Erstellen eines genetischen Fingerabdrucks und
wird mittlerweile routinemässig bei verschiedensten Fragestellungen eingesetzt. Diese Methode hat
beispielsweise dabei geholfen, unschuldige Tatverdächtige wieder auf freien Fuss zu setzen und
schuldige Täter dingfest zu machen, Kinder mit ihren Verwandten zusammenzuführen, gestohlene
Tiere zu identifizieren und nachzuweisen, ob Hamburger wirklich aus Rindfleisch und nicht aus
anderen Fleischarten bestehen. Der genetische Fingerabdruck wird in Kriegs- oder Katastrophenzeiten auch dazu benutzt, sterbliche Ueberreste zu identifizieren.
2. Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Wie DNA ausserhalb der Zellen vermehrt wird
Ein grosses Problem in den Anfängen der DNA-Forschung war, dass für die damaligen Untersuchungstechniken und Analysen der DNA meist grössere Mengen davon benötigt wurden, als
verfügbar waren.
Der Biochemiker Kary B. Mullis machte sich die natürliche Eigenschaft der DNA zur Replikation zu
Nutze und entwickelte 1983 eine Technik, mit der man bestimmte DNA-Sequenzen in vitro in kurzer
Zeit vervielfachen kann. Diese Technik – die Polymerase-Ketten-Reaktion – hat die DNA-Analyse
stark vereinfacht und damit die Molekularbiologie revolutioniert.
Infobox: Die Replikation – Wie DNA vermehrt wird
In einer sich teilenden Zelle wird die gesamte DNA mit Hilfe komplexer Enzymreaktionen verdoppelt
um sie an die Tochterzellen weiterzugeben (Replikation). Dazu wird zuerst die doppelsträngige DNA
entwunden und in Einzelstränge zerlegt. Durch ein weiteres Enzym wird durch die Anlagerung von
einer spezifischen Sequenz an Basenpaaren ein kurzes Stück DNA-Doppelstrang gebildet (Primer).
Der Primer bildet nun den Startpunkt der Replikation. Die DNA-Polymerase synthetisiert vom Primer
ausgehend durch Paarung und Verknüpfung der Basen einen Gegenstrang, sodass wieder ein DNADoppelstrang entsteht – sie leistet also gewissermassen Kopierarbeit.
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Da ein DNA-Strang eine Orientierung hat – also ein “Vorne” (5’-Ende) und ein “Hinten” (3’-Ende) –
und die DNA-Polymerase nur in der Lage ist, die neuen Bauteile (Nukleotide) am 3’-Ende anzusetzen, wächst der neugebildete DNA-Strang nur immer in einer Richtung (5’ –> 3’).
In einem gezeichneten Doppelstrang ist jeweils der obere der beiden Stränge in einer 5’-3’
Orientierung angegeben. Der untere, komplementäre Gegenstrang ist in der entgegengesetzten
Richtung, also in einer 3’ – 5’ Orientierung angegeben.
5’ – GGATCTCAGGATCCATG – 3’
3’ – CCTAGAGTCCTAGGTAC – 5’
Bei der PCR wird der DNA-Doppelstrang durch Hitze (95 °C) in Einzelstränge getrennt (=Denaturierung). Synthetisch hergestellte Einzelstrang-DNA-Teile mit etwa 20 – 30 Nukleotiden dienen als
Primer und somit als Startpunkt für die DNA-Polymerase. Um den Anfang und das Ende der zu
vermehrenden Zielsequenz zu begrenzen werden zwei verschiedene Primer verwendet. Durch das
Absenken der Temperatur auf 50 – 60 °C lagern sich die im Überschuss vorliegenden Primer schnell
und spezifisch an die komplementären DNA-Sequenzen an und umgeben so die zu vermehrende
Zielsequenz.
Infobox: Der PCR-Zyklus
Ein PCR-Zyklus besteht aus drei Reaktionen:
1.
Denaturierung bei 94 °C: Auftrennen des DNA Doppelstrangs in Einzelstränge.
2.
Annealing bei 54°C: Anlagerung der Primer und der hitzebeständigen DNA-Polymerase.
3.
Elongation bei 72°C: Verlängerung des DNA Gegenstranges ausgehend von den Primern in
5’ – 3’ Richtung.
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94°C: Auftrennen des DNADoppelstranges (Denaturierung)
52°C: Anlagerung der Primer (Annealing);Polymerase bindet an
Primer
72°C: Verlängerung der Primer;
Herstellung des DNADoppelstranges (Elongation)
Abbildung 1: Reaktionsschritte des PCR-Zyklus (Denaturierung, Annealing, Elongation).
Es gibt heute PCR-Geräte, welche die Temperaturwechsel selbständig ausführen. Mit jedem Zyklus,
bestehend aus den drei Reaktionen, wird die gewählte DNA-Sequenz verdoppelt. Nach 30 Zyklen sind
bei optimalen Bedingungen aus einem DNA-Strang etwa ein Milliarde Kopien (2
30
= 1'073'741'824)
entstanden.
Start
Zyklus 1
Zyklus 2
Zyklus 3
Zyklus 4
Zyklus 5
Zyklus 6
Z.B. Tatort DNA
Abbildung 2: Vervielfältigung von DNA-Fragmenten über mehrere PCR-Zyklen.
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3. DNA-Sequenzen zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks
Zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks reichen Dank PCR-Technik geringe Mengen an
DNA aus. Diese findet man in kleinsten Spuren von menschlichen Zellen – z.B. in der Wurzel eines
ausgefallenen Haares, in Blutspuren oder auch in Speichelresten.
Für die eindeutige Zuordnung einer am Tatort gefundenen DNA-Probe mittels genetischem Fingerabdrucks macht man sich zu Nutze, dass nur etwa 5% unseres Genoms sogenannt kodierende Sequenzen sind. Das heißt, nur hier befinden sich die eigentlichen Gene bzw. die wichtigen Erbinformationen. Der grösste Teil unseres Genoms, nämlich 95 Prozent, besteht aus nicht-kodierender DNA,
welche keine Informationen über unseren Bauplan enthält. Diese Abschnitte sind in bestimmten
Bereichen von Mensch zu Mensch verschieden, ohne sichtbare Auswirkungen. Genau diese
Individualisierung macht man sich für den genetischen Fingerabdruck zunutze.
Für den genetischen Fingerabdruck werden die nicht-kodierenden Stellen der DNA untersucht. In
diesen Bereichgen gibt es kleine DNA-Grundeinheiten von wenigen Basenpaaren, die sich von
Person zu Person verschieden oft wiederholen. Man bezeichnet einen solchen Genomabschnitt als
Short Tandem Repeat (STR).
Abbildung 3: Darstellung eines nicht-kodierenden STR-Genomabschnitts mit sieben Wiederholungen der Basenabfolge TCTT.
Da solche STR-Sequenzen mit den Chromosomen vererbt werden, kann es sein, dass Person A auf
einem Chromosom der Mutter am Genort 1 fünf TCTT Basenpaar-Wiederholungen aufweist und auf
dem Chromosom des Vaters nur deren drei. Person A besitzt somit zwei Allele dieses Genomabschnitts: Ein Allel besitzt fünf TCTT Wiederholungen, während das zweite Allel drei TCTT Wiederholungen besitzt.
Person A:
…….
……..
………
…….
Person B kann hingegen am gleichen Genort von der Mutter neun und vom Vater vier TCTT
Wiederholungen geerbt haben. Person B besitzt somit zwei andere Allele auf diesem Genomabschnitt
als Person A:
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Person B:
……..
……..
……….
………
Solche Wiederholungen oder SRT-Sequenzen können also von Person zu Person unterschiedlich
sein und bieten daher eine geeignete Grundlage für einen genetischen Fingerabdruck.
Wenn man Primer benutzt, die an die flankierenden Bereiche der STRs binden, können diese
Sequenzen mittels PCR kopiert werden. Für Person A werden also zwei DNA-Stücke mit der Länge
von fünf bzw. drei TCTT Wiederholungen kopiert. Das bedeutet, dass sich die kopierten Sequenzen in
ihrer Länge bzw. Grösse unterscheiden. Diese Längenunterschiede können für die Analyse genutzt
werden. Wenn man genügend verschiedene STRs im Genom “anschaut”, kann ein DNA-Profil erstellt
werden, das für jede Person einzigartig ist und sich eindeutig von einer anderen Person unterscheidet.
4. Die zweifelsfreie Unterscheidung von zwei beliebigen Personen
Wie kann man nun mit einem genetischen Fingerabdruck zwei beliebige Personen zweifelsfrei voneinander unterscheiden? Die “power of discrimination” ist die Fähigkeit des genetischen Fingerabdrucks,
Individuen mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit voneinander zu unterscheiden. Je mehr Stellen
auf dem Erbgut angeschaut und getestet werden, umso höher ist die “power of discrimination” und
damit die Wahrscheinlichkeit, dass man die richtige Person als Täter identifiziert. Um die “power of
discrimination” zu erhöhen, werden deshalb in der Praxis Tatort-DNA und Vergleichsproben von Opfer
und Verdächtigen an mindestens 13 verschiedenen Stellen auf dem Erbgut untersucht.
Häufig sind die Allel-Häufigkeiten eines Genortes nicht gleichmässig in der gesamten Bevölkerung
verteilt. So kann man beobachten, dass einzelne Allele eines bestimmten Genortes bei Europäern
häufiger vorkommen als bei Afrikanern oder Personen aus Lateinamerika. Ein Blick auf Abbildung 4
zeigt zum Beispiel, dass Kaukasier häufiger die Allele 6 oder 9.3 eines spezifischen Genomabschnitts
(Genort, Locus) haben, aber kaum je das Allel 10.
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% der
Gesamtpopulation
Allele
Abbildung 4: Allelfrequenzen verschiedener ethnischen Gruppen.
Um die Häufigkeit der Genotypen zu berechnen, multipliziert man die Häufigkeit der beobachteten
Allele. Nehmen wir an, ein Verdächtiger aus der Volksgruppe der Kaukasier hat an einer Stelle auf
dem Erbgut eine Kopie des Allels 16 mit einer Häufigkeit von 0.222 (22.2 Prozent) und eine Kopie des
Allels 17 mit einer Häufigkeit von 0.222 (22.2 Prozent). An diesem Genort zeigt somit die Kombination
dieser Allele eine Frequenz von 0.222 • 0.222 = 0.0493 (4.9 Prozent). Dies bedeutet, dass rund 5
Prozent der Kaukasier oder einer von 20 Kaukasiern der Täter sein könnte! Die “power of
discrimination” von nur einem Genort reicht also offenbar nicht aus, um einen Täter zweifelsfrei zu
identifizieren!
Die Lösung für dieses Problem ist die Untersuchung mehrerer verschiedener Genorte. Hat z.B. der
Verdächtige an einem zweiten Genort ein Allel, das mit der Frequenz von 0.008 (0.8 Prozent) für
Kaukasier auftritt und ein zweites Allel mit einer Frequenz von 0.142 (14.2 Prozent), beträgt die
gesamte Allelfrequenz an diesem Genort 0.008 • 0.142 = 0.0011 (also 1 aus 1000 oder 0.1 Prozent).
Kombinieren wir nun noch die beiden Allelfrequenzen miteinander, so erhalten wir 0.0011 • 0.0493 =
0.000054 (also 1 aus 20'000 oder 0.005 Prozent). Das heisst, dass nur einer aus 20’000 Personen der
Täter gewesen sein kann! Je mehr Genorte zur Analyse herangezogen werden, desto besser wird die
“power of discrimination” oder anders gesagt, umso kleiner wird der Kreis der Verdächtigen.
5. Die Gelelektrophorese
Nachdem die Tatort-DNA gesammelt und mittels PCR vervielfältigt wurde, trennt man die kopierten
(nun in Überzahl vorliegenden) DNA-Stücke aufgrund ihrer unterschiedlichen Grösse in einem
Agarosegel voneinander. Die unterschiedlich langen DNA-Stücke können so einem Allel des
untersuchten Genorts zugeordnet werden (Abbildung 5).
Infobox: Agarose
Agarose ist ein aus den Zellen von Rotalgen gewonnenes Polymer, das aus dem Zweifachzucker
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Agarobiose besteht. Agarose löst sich beim Aufkochen in Wasser auf, und beim Abkühlen bildet es
ein dreidimensionales Netz bestimmter Porengrösse, ein Gel. In der Küche wird Agarose immer
häufiger als Ersatz für die aus tierischen Grundstoffen hergestellte Gelatine verwendet.
Das Auftrennen der DNA-Proben erfolgt durch das Anlegen einer elektrischen Spannung. Da die
DNA-Stücke negativ geladen sind, wandern sie in der Elektrophoresekammer in Richtung Pluspol
(Anode). Grössere DNA-Fragmente werden durch das Netz des Agarose-Gels stärker behindert und
sind deshalb oben in der Bahn zu sehen, während kleinere Fragmente sich weniger stark “verheddern” und deshalb weiter unten im Gel anzutreffen sind. Ohne elektrische Spannung würde keine
Auftrennung erfolgen.
Zusätzlich zu den Proben lässt man häufig einen DNA-Grössenmarker mit mehreren DNA-Stücken
unterschiedlicher Länge mitlaufen. Als Resultat erhält man eine “Leiter”, mit der man Fragmente
unbekannter Grösse auf demselben Gel vergleichen und so die unbekannte Probengrösse abschätzen bzw. eine erwartete Grösse eines DNA Stücks überprüfen kann.
Da die DNA im Gel nicht sichtbar ist, muss sie angefärbt werden. Dies geschieht im Rahmen dieses
Kurses mit GelRed. Dieser Farbstoff ist strukurell und funktionell ähnlich wie das giftige
Ethidiumbromid, es kann jedoch unsere Haut nicht durchdringen und ist deshalb ungefährlich. GelRed
färbt die DNA auf dem Agarosegel dadurch, dass es sich zwischen die Basen der DNA schiebt und
mit UV- Licht sichtbar gemacht werden kann. Durch die Bestrahlung mit UV Licht werden die
Fluorophore des GelRed angeregt und leuchten rot. Dadurch werden die DNA Stücke gleicher Grösse
als rote Banden im Agarosegel sichtbar.
Abbildung 5: Schematische Darstellung einer Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-Proben.
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6. Glossar
Agarose: Aus den Zellen von Rotalgen gewonnenes Polymer aus dem Disaccharid Agarobiose.
Agarose löst sich beim Aufkochen in Wasser, beim Abkühlen bildet es ein dreidimensionales Netz
bestimmter Porengrösse, ein Gel.
Allel: Eine von zwei oder mehr verschiedenen (alternativen) Formen eines Gens an einem
bestimmten Ort eines Chromosoms (Genlocus) oder Genoms.
Annealing (=Anlagerung): Zweiter Schritt in einem PCR-Zyklus. Anlagerung der Primer an
einzelsträngige DNA (Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen den entsprechenden Basen).
Denaturierung der DNA: Auftrennen doppelsträngiger Nukleinsäuren durch Lösen der Wasserstoffbrücken. Dabei verlieren die Makromoleküle ihre biologischen Aktivitäten. Stellt auch den ersten
Schritt in einem PCR-Zyklus dar. Trennung der komplementären Stränge durch Hitzebehandlung.
DNA-Klonierung: DNA-Klonierung (Genklonierung) ist eine Technik der DNA-Rekombination, bei der
spezifische DNA-Fragmente in ein Klonierungsplasmid eingebaut werden, das dann in kultivierbare
Wirtszellen (etwa E. coli Zellen) eingeschleust wird und dort während des Wachstums dieser Zellen
integriert bleibt.
dNTPs: Abkürzung für alle vier Deoxynukleotid Triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) die zur
Synthese der DNA gebraucht werden.
Elektrophorese: Trennverfahren für elektrisch geladene Makromoleküle aufgrund ihrer
unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit in einem Gel oder einem anderen Trennmedium unter
der Einwirkung einer elektrischen Gleichspannung.
Elongation (=Verlängerung): Dritter Schritt in einem PCR-Zyklus. Die Polymerase synthetisiert,
ausgehend von den Primern, zum vorhandenen Einzelstrang den Gegenstrang.
Ethidiumbromid: Fluoreszenzfarbstoff zum anfärben von DNA. Bei Bestrahlung mit UV-Licht
fluoresziert die Probe rosa bis lila. Erbgutschädigend!
Exon: Informationstragende Bereiche innerhalb eines (eukaryotischen) Gens oder des davon
kodierten Primärtranskripts (entsteht während der DNA-Transkription und umfasst Exons und Introns).
GelRed: GelRed ist ein sichere und ungiftige Alternative zu Ethidiumbromid zur Färbung der DNA in
Agarose Gelen, da es unsere Haut nicht durchdringen kann. Der Farbstoff schiebt sich zwischen die
DNA und kann mit UV-Licht angeregt werden.
Genom: Gesamtheit der genetischen Information einer Zelle oder eines Organismus.
Genotyp: Die gesamte genetische Konstitution einer Zelle. Auch die Allele (Marker) an einem oder
mehreren Genorten (Loci)
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Insert: Ein DNA-Stück, das durch Restriktionsverdau und Ligation in ein Plasmid eingesetzt wird.
Intron: Bereich eines Primärtranskripts (oder der zugrunde liegenden DNA), der während der RNAProzessierung entfernt wird und daher im reifen, physiologisch aktiven Transkript (z.B. mRNA) fehlt.
Klon: Population von Zellen (oder Individuen) gemeinsamer Abstammung; aus einer einzigen Zelle
durch Teilung hervorgegangene, genetisch identische Zellen. Ein DNA-Klon besteht aus DNAMolekülen, die durch Replikation eines einzigen DNA-Moleküls entstanden sind.
Ko-Faktoren: Ionen oder kleine Moleküle, die von einem Enzym für dessen Funktion benötigt werden.
Ligation: Vorgang, bei dem das Enzym Ligase zwei entsprechende DNA-Enden miteinander
verknüpft.
Locus: Ort eines Gens oder einer anderen definierten Sequenz auf einem Chromosom. Alle Allele
eines bestimmten Gens besetzen denselben Locus.
Lyse: Vorgang, durch den eine Zelle zerstört oder aufgelöst wird und dadurch den Zellinhalt freisetzt.
Multiple cloning site (MCS): Kurze DNA-Sequenz, welche mehrere Erkennungsstellen für
verschiedene Restriktionsenzyme enthält.
Nukleotide: Fundamentale Einheit von DNA und RNA. Sie bestehen aus einem Zucker (Deoxyribose
oder Ribose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen Base (Adenin, Thymin, Guanin oder
Cytosin und Uracil anstelle von Thymin in der RNA).
Oligonukleotid: Ein DNA oder RNA-Molekül bestehend aus einer kleinen Anzahl von Nukleotiden.
Origin of replication (ORI): Mit dem Replikationsursprung bezeichnet man spezifische DNAAbschnitte im Genom eines Organismus, an denen die Replikation beginnt. Eukaryotische
Chromosomen enthalten etliche Startpunkte, Bakterienchromosomen und Plasmide dagegen oft nur
einen.
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR): Methode zur Vervielfachung eines spezifischen DNASegments. Die DNA wird in mehrfachen Zyklen synthetisiert, ausgehend von kurzen OligonukleotidPrimern. Die Zyklen werden jeweils durch kurze Hitzebehandlung zur Trennung der komplementären
Stränge unterbrochen.
Plasmid: Kleines, ringförmiges DNA-Molekül in Bakterien, das sich autonom replizieren kann und sich
nicht im Zellkern sondern frei in der Zelle befindet. Plasmide werden häufig in der Gentechnik
verwendet, um Gene zwischen Organismen zu übertragen (Klonierungsplasmid).
DNA-Polymerase: Enzym, das in der Zelle und bei der PCR an einem DNA-Einzelstrang durch
Anlagerung der komplementären Nukleotide den Gegenstrang synthetisiert. Die Polymerase braucht
Primer als Startstelle.
Polymorphismus: Mit Polymorphismen bezeichnet man die genetischen Unterschiede an einem
bestimmten Locus. Ein einzelner Locus kann in verschiedenen Individuen polymorph sein.
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Power of discrimination: Die Fähigkeit, zwei beliebige Genotypen voneinander zu unterscheiden. Je
mehr Loci analysiert werden, desto grösser ist die power of discrimination.
Primer (=Starter): Einzelsträngiges Oligonukleotid, das zu einem Abschnitt auf einer einzelsträngigen
Nukleinsäure komplementäre Sequenzen aufweist und sich an diesen anlagert (Ausbildung der
Wasserstoffbrücken). Primer wirken als Startstelle zur eigenen Verlängerung gemäss den Regeln der
Basenpaarung, sodass ein komplementäres Polynukleotid entsteht.
Rekombinante DNA: Jedes DNA-Molekül, das durch Verknüpfen von DNA-Abschnitten
verschiedener Herkunft gebildet ist. Rekombinante DNAs werden vielfältig beim Klonieren von Genen
verwendet.
Restriktionsenzym: Jedes (bakterielle) Enzym, das eine spezifische kurze Basensequenz – seine
Schnittstelle – in Doppelstrang-DNA-Molekülen erkennt und schneidet. Restriktionsenzyme werden in
der Gentechnik vielfach eingesetzt.
RFLP (Restriktionsfragment Längen Polymorphismus): Mutationen innerhalb von Restriktionsschnittstellen verändern die Länge von Restriktionsfragmenten und erzeugen damit die als “genetischen Fingerabdruck” (fingerprint) erhaltenen Muster von DNA Fragmenten nach gelelektrophoretischer Auftrennung.
Restriktionsverdau: Vorgang, bei dem Restriktionsenzyme DNA-Moleküle spezifisch schneiden.
STR (Short Tandem Repeat): Kleine, repetitive DNA Sequenzen, die nur zwei bis vier Nukleotide lang
sein können. STRs werden vererbt und unterscheiden sich von Person zu Person und von Locus zu
Locus. STRs sind die Basis für PCR-basierende DNA-Tests.
Transformation: Dauerhafte, erbliche Veränderung einer prokaryotischen Zelle infolge der Aufnahme
und der stabilen Weitergabe einer fremden DNA (z.B. Plasmide)
VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats): DNA-Sequenzen, welche aus grossen, repetitiven
Elementen bestehen. Die sich wiederholenden DNA-Elemente können viele Kilobasen lang sein.
VNTRs werden vererbt und können sich von Person zu Person und von Locus zu Locus
unterscheiden.
6. Weiterführende Literatur
Crime Scene Investigator PCR Basics
TM
Kit Manual. Biorad.
Molekulare Zellbiologie. Lodish, H. et al.; Aus dem Engl. Übersetzt von Lange C. et al., 4. Auflage,
Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl., 2001.
1 Kb Plus DNA Ladder (Cat. No. 10787-018) Manual. Invitrogen
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