F1-Praktikum in Mikrobiologie
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F1-Praktikum in Mikrobiologie Block E: Physiologie der Mikroorganismen 04.12. - 08.12.2006 Universität Würzburg Biozentrum, Raum A 104 Leitung: PD Dr. Dagmar Beier Beginn: 04.12.2006, 9:15 Uhr 2 Diauxie, Katabolitrepression Escherichia coli kann neben Glucose auch andere Zucker wie z.B. Lactose als Kohlenstoffund Energiequelle nutzen. Der erste Schritt beim Lactoseabbau ist die Hydrolyse von Lactose zu Galactose und Glucose durch das Enzym β-Galactosidase. Die Expression der βGalactosidase wird durch Lactose induziert. Enthält das Wachstumsmedium aber gleichzeitig Glucose und Lactose, so verwerten die Bakterien zunächst nur die Glucose. Erst wenn die Glucose verbraucht ist, erfolgt die Adaptation an die noch vorhandene C-Quelle Lactose, da die Anwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium die Expression der β-Galactosidase reprimiert. Man bezeichnet diesen Effekt als "Katabolitrepression". Die Umstellung des Stoffwechsels vom Glucoseabbau zum Lactoseabbau schlägt sich in einer vorübergehenden Verlangsamung der bakteriellen Zellvermehrung nieder, so dass die Bakterienkultur in Gegenwart von Glucose und Lactose zwei exponentielle Wachstumsphasen durchläuft. Man bezeichnet dies als "Diauxie" (zweiphasiges Wachstum). In Enterobakterien wird die Katabolitrepression durch das Regulatorprotein CAP (auch als Crp bezeichnet) vermittelt. Unter Katabolitrepression stehende Gene enthalten in ihrer Promotorregion eine Bindestelle für einen Komplex aus CAP und dem Coaktivator cycloAMP (cAMP). Erst durch die Bindung von CAP-cAMP an den Promotor wird die Transkription der entsprechenden Gene aktiviert. Demzufolge wird die Expression Katabolitreprimierter Gene durch die Konzentration von cAMP in der Zelle gesteuert. Die Anwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium beeinflusst den cAMP-Spiegel in der Zelle über das Phosphotransferase (PTS)-System zur Aufnahme von Kohlenhydraten, das sich aus den Proteinen EI und HPr und den Zucker-spezifischen EII-Komponenten zusammensetzt. PTS-System: PEP EI Pyruvat HPr EIIA EIIC EIIB P Glucose P Glucose-6-P Ist im Medium Glucose vorhanden, wird diese über EIIglc aufgenommen, so dass EIIAglc vorrangig unphosphoryliert vorliegt. Ist keine Glucose vorhanden, überwiegt dagegen die phosphorylierte Form von EIIAglc. EIIAglc-P stimuliert die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase, was zur Erhöhung des cAMP-Spiegels und schließlich zur Ausbildung des CAP-cAMP Komplexes führt. Ein weiterer Effekt, der zur Katabolitrepression beiträgt, ist die „inducer-exclusion“: Unphosphoryliertes EIIAglc hemmt die Aktivität von nicht-PTS ZuckerPermeasen und unterdrückt somit die Aufnahme von Inducer-Molekülen die zur Aktivierung zusätzlicher kataboler Stoffwechselwege erforderlich wären. 3 Aufgabe: Untersuchung des Wachstumsverhaltens von E. coli in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen (Glucose, Glucose/Lactose, Glucose/Galactose, Glucose/Sorbit). Versuchsdurchführung: - 6 ml einer Übernacht(ÜN)-Kultur von E. coli B leu3 in CM-Minimalmedium mit 0.45 % Glycerin werden in ein Zentrifugenröhrchen (Plastik) überführt und 5 min in der Tischzentrifuge zentrifugiert. - Das Zellsediment wird 2x mit jeweils 6 ml Saline gewaschen und schließlich in 3 ml Saline resuspendiert. - 2 Erlenmeyerkolben mit Seitenansatz (Klettkolben) werden mit je 20 ml CM ohne C-Quelle gefüllt. Anschließend wird Glucoselösung (0.04 g/ml), Lactoselösung (0.2 g/ml), Galactoselösung (0.2 g/ml) bzw. Sorbitlösung (0.2 g/ml) zugegeben, wie in folgendem Pipettierschema angegeben: Kolben A: Gruppe 1 und 2: Kolben B: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung 50 µl Lactoselösung ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Gruppe 3 und 4: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung 50 µl Galactoselösung ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Gruppe 5 und 6: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung 50 µl Sorbitlösung - Zuletzt jeweils 1.0 ml der gewaschenen Bakteriensuspension zugeben. - Zelldichte der Kulturen sofort nach Zugabe der Bakterien mit Hilfe des Klett-Photometers bestimmen (als Leerwert: CM ohne C-Quelle). - Klettkolben im Wasserbadschüttler bei 37°C inkubieren und dann alle 30 min die Zelldichte mit dem Klett-Photometer bestimmen (für ca. 5 Stunden). - Auswertung: Die ermittelten Werte für die Zelldichte (Klett-Einheiten) sind in Abhängigkeit von der Zeit aufzutragen (mm-Papier). Bei welchen Kulturen ist Diauxie feststellbar? 4 Enzyminduktion und Katabolitrepression am Beispiel der β-Galactosidase von Escherichia coli Das Enzym β-Galactosidase katalysiert die Spaltung von Lactose in Galactose und Glucose. Eine E. coli-Zelle enthält bei Abwesenheit von Lactose im Nährmedium nur sehr wenige (<10) β-Galactosidasemoleküle. In Gegenwart von Lactose wird dagegen die Neusynthese von β-Galactosidase stark induziert. Die Syntheserate der β-Galactosidase ist dabei gekoppelt mit der von zwei weiteren Enzymen, nämlich der Galactosid-Permease und der Thiogalactosid-Transacetylase. Die Galactosid-Permease ist für den Transport der Lactose ins Zytoplasma der E. coli-Zelle notwendig, die Funktion der Thiogalactosid-Transacetylase ist unbekannt. Die Gene für die β-Galactosidase (lacZ), die Permease (lacY) und die Transacetylase (lacA) sind hintereinander angeordnet und ihre Expression wird gemeinsam reguliert. Die drei Gene bilden somit ein Operon. Die Regulation der Expression von lacZ, lacY und lacA erfolgt durch das Produkt eines weiteren Gens, lacI, das stromaufwärts vom lac-Operon liegt. lacI kodiert ein Repressorprotein. Zwischen dem lacI-Gen und den drei Strukturgenen lacZ,Y,A des lac-Operons liegt der lac-Promotor (P), an den die RNA-Polymerase bindet und die Transkription von lacZ,Y,A startet, sowie der Operator (O), eine DNA-Sequenz, an die der Repressor bindet. In Abwesenheit eines induzierenden Substrats (Lactose) bindet der Repressor an den Operator und verhindert die Transkription von lacZ,Y,A. Ist ein Induktor vorhanden, so bindet er an den Repressor und verhindert dadurch dessen Wechselwirkung mit dem Operator, so dass die Strukturgene transkribiert werden können. Das lac-Operon unterliegt zusätzlich einer positiven Genregulation, da seine Transkription auch vom Regulatorprotein CAP (CRP) und dem Coaktivator cAMP abhängig ist. Die Bindung eines Komplexes aus CRP und cAMP an die Promotorregion erleichtert die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor erheblich und ermöglicht dadurch erst eine effiziente Transkriptionsinitiation. Die Anwesenheit von Glucose im Nährmedium bewirkt eine Erniedrigung des cAMP-Spiegels in der Zelle und verhindert somit die Bildung des CRPcAMP-Komplexes wodurch die Transkription des lac-Operons reprimiert wird (Katabolitrepression). Lac- Transkription CAP-cAMP CAPBindestelle -35 -10 Operator lacZ lacY lac Promotor Transkription des lac-Operons in Anwesenheit des Induktors Lactose bei gleichzeitiger Abwesenheit von Glucose im Nährmedium. 5 Aufgabe: Die Induktion und Katabolitrepression der β-Galactosidase soll an einem E. coli-Stamm mit wildtypischem lac-Operon untersucht werden (E. coli B leu3), sowie an zwei Mutanten, die in der Regulation des lac-Operons gestört sind (E. coli W575; E. coli 1783). Versuchsdurchführung: Vorbereitung: Die drei E. coli-Stämme werden zunächst in CM-Minimalmedium mit 0.2 % Glucose vorgezüchtet und dann nach Verbrauch der Glucose über Nacht in CM mit 0.45 % Glycerin kultiviert: - Je 20 ml CM + 0.2 % Glucose mit E. coli B leu3, E. coli W575 bzw. E. coli 1783 animpfen und über Nacht bei 37°C schütteln. - Die Kulturen jeweils mit CM + 0.45 % Glycerin auf 200 ml auffüllen und ca. eine Stunde bei 37°C schütteln. Herstellung der Induktionsansätze in Erlenmeyerkolben: I) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783) 1 ml CM mit 0.45 % Glycerin II) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783) 0.5 ml CM mit 0.45 % Glycerin 0.5 ml Lactoselsg. (0.1 M) III) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783) 0.5 ml Lactoselsg. (0.1 M) 0.5 ml Glucoselsg. (0.1 M) - Die Erlenmeyerkolben mit den Induktionsansätzen werden im Wasserbadschüttler bei 37°C inkubiert. - Bei Beginn der Inkubation sowie nach 45 und 90 min wird jeweils 1 ml Suspension in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und mit 50 µl Toluol und 50 µl Natriumdesoxycholatlösung (1 %ig) versetzt. Die so hergestellten Proben werden unter mehrmaligem Schütteln 30 min bei 37°C inkubiert (Zelllyse). Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität in den hergestellten Zell-Lysaten: Der Test beruht darauf, dass β-Galactosidase vom farblosen, synthetischen Substrat oNitrophenylgalactosid (ONPG) das gelb gefärbte o-Nitrophenol abspaltet. Die Konzentration dieses Produkts wird photometrisch bei 420 nm bestimmt. 6 -Zur Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität werden folgende Ansätze hergestellt: 900 µl 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4 + 100 µl ONPG (5 mg/ml) + 100 µl Zell-Lysat (Die Zell-Lysate werden erst zugegeben, wenn alle Ansätze Phosphatpuffer und ONPG enthalten). - Die Testansätze werden 15 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Dann wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 40 µl Na2CO3-Lösung (10 %ig) gestoppt. - Die Extinktion der Proben wird bei 420 nm in Halbmikroküvetten bestimmt. Herstellung des Leerwerts: 1 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4 + 100 µl ONPG (5 mg/ml) + 40 µl Na2CO3-Lösung (10 %ig). Auswertung: Die Extinktionswerte der einzelnen Testansätze sind in die nachfolgende Tabelle einzutragen. Um welche Mutationen kann es sich bei den Stämmen E. coli W575 bzw. E. coli 1783 handeln? Zeit E. coli B leu3 E. coli W575 E. coli 1783 I II III I II III I II III -------------------------------------------------------------------------------------------------------------0 min -------------------------------------------------------------------------------------------------------------45 min -------------------------------------------------------------------------------------------------------------90 min -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 Alkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiae Fakultativ anaerobe Organismen können ihren Energiebedarf durch aerobe Atmung bzw. in Abwesenheit von Sauerstoff durch anaerobe Atmung oder Gärung decken. Unter aeroben Bedingungen wird Glucose vollständig zu CO2 und H2O abgebaut, wobei durch Substratkettenphosphorylierung und oxidative Phosphorylierung insgesamt 36 Mol ATP pro Mol Glucose entstehen. Das beim Glucoseabbau zu NADH + H+ reduzierte NAD+ wird dabei in der Atmungskette wieder vollständig regeneriert. Auch bei der anaeroben Atmung, bei der oxidierte anorganische Verbindungen wie NO3-, SO42- oder Fe3+ als terminale Elektronenakzeptoren genutzt werden, wird NAD+ durch Einspeisen von Elektronen in die Atmungskette aus NADH + H+ regeneriert. Bei der Gärung werden die bei der Oxidation organischer Substrate anfallenden Elektronen auf organische Akzeptoren übertragen. Gärungsreaktionen dienen somit der Regeneration von NAD+, das zur Aufrechterhaltung der Glycolyse erforderlich ist, die bei der Gärung den alleinigen energiegewinnenden Prozess darstellt. Der Energiegewinn bei der Gärung ist folglich sehr gering, so dass Gärungsreaktionen nur dann ablaufen, wenn keine geeigneten anorganischen terminalen Elektronenakzeptoren vorhanden sind. Gärungsreaktionen laufen auch ab, wenn Enzyme der Atmungskette fehlen (z.B. in Hefe-"petite"-Mutanten) oder durch Drogen blockiert sind. Bei vielen Bakterien wird das in der Glycolyse entstandene NADH + H+ dazu verwendet, deren Endprodukt, Pyruvat, zu Lactat zu reduzieren (Milchsäuregärung), wobei wieder NAD+ entsteht. Hefen, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, decarboxylieren das Pyruvat zunächst und reduzieren das dabei entstehende Acetaldehyd dann mit Hilfe von NADH + H+ zu Ethanol (alkoholische Gärung). Sowohl bei der Milchsäuregärung als auch bei der alkoholischen Gärung wird soviel NADH + H+ verbraucht, wie zuvor in der Glycolyse produziert wurde. Um Lactat oder Ethanol weiter abbauen zu können, wird NAD+ benötigt, das nur von der Atmungskette geliefert werden kann. Fakultativ anaerobe Organismen, die unter anaeroben Bedingungen Lactat oder Ethanol akkumulieren, können diese Substanzen folglich nur unter aeroben Bedingungen unter Energiegewinn weiterverwerten. Auch Glycerin kann nur unter aeroben Bedingungen als Energiequelle genutzt werden, denn beim Umbau von 1 Mol Glycerin zu Pyruvat müssten 2 Mol NAD+ zu NADH + H+ reduziert werden, bei der anschließenden Gärungsreaktion mit Lactat oder Ethanol als Endprodukt könnte aber nur 1 Mol NAD+ regeneriert werden. Wird in Hefezellen das bei der alkoholischen Gärung anfallende Acetaldehyd durch Hydrogensulfit oder Semicarbazid aus dem Prozess gezogen, so wird das in der Glycolyse entstehende NADH + H+ hauptsächlich dazu verwendet, um Dihydroxyaceton-3-phosphat zu 3-Phosphoglycerin zu reduzieren, das dann mit Hilfe der Phosphoglycerinkinase unter ATPBildung in Glycerin umgewandelt wird. NAD+ und NADH + H+ sind dabei in einem Kreislauf. Dieser Prozess wird auch angewendet, um Glycerin industriell herzustellen. 8 Aufgabe: Untersuchung der Fähigkeit von normalen (ρ+) bzw. atmungsdefekten (ρ-) Saccharomyces cerevisiae-Zellen, unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen Glucose zu Ethanol zu vergären. Versuchsdurchführung: - 4 100 ml-Erlenmeyerkolben werden mit je 20 ml YNB-Minimalmedium gefüllt. - Jeweils 2 Kolben werden mit einer Impföse voll normaler (ρ+) bzw. atmungsdefekter (ρ-) Saccharomyces cerevisiae-Zellen beimpft. - Je ein Kolben mit ρ+ Zellen und ρ- Zellen wird bei 30°C mindestens 15 h geschüttelt (aerobe Kultur). Das Medium in den beiden anderen Kolben wird mit jeweils 20 ml sterilem Paraffinöl überschichtet. Diese beiden Kolben werden dann ohne Schütteln >15 h bei 30°C im Brutschrank inkubiert (anaerobe Kultur). -Anschließend wird die in den 4 Kulturen gebildete Menge Ethanol mit Hilfe des optischen Tests gemessen. Hierzu werden von jeder Kultur 1 ml Zellsuspension in der Tischzentrifuge 1 min abzentrifugiert. Je 0.1 ml des zellfreien Überstands werden mit 0.9 ml H2O verdünnt. Optischer Test: Die Reduktion von Acetaldehyd mit NADH + H+ in der Alkoholdehydrogenasereaktion zu Ethanol kann auch rückwärts verlaufen. Entfernt man das gebildete Acetaldehyd mit Hilfe von Semicarbazid als Semicarbazon aus dem Reaktionsgleichgewicht, so wird der Alkohol quantitativ umgesetzt und dabei eine äquivalente Menge NADH + H+ aus NAD+ gebildet. NADH hat im Gegensatz zu NAD+ ein Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge von 340 nm. Die gebildete Menge an NADH kann daher photometrisch bestimmt werden. - In 9 Plastikküvetten werden jeweils 2.9 ml Semicarbazid/NAD+-Lösung gemischt mit: 1) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ+ Kultur (aerob). 2) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ- Kultur (aerob). 3) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ+ Kultur (anaerob). 4) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ- Kultur (anaerob). 5) 100 µl H2O (Leerwert). 6) 99 µl H2O + 1 µl 1% (v/v) Ethanol. 7) 98 µl H2O + 2 µl 1% (v/v) Ethanol. 8) 95 µl H2O + 5 µl 1% (v/v) Ethanol. 9) 90 µl H2O + 10 µl 1% (v/v) Ethanol. - Alle Ansätze werden mit jeweils 25 µl Alkoholdehydrogenase (10 mg/ml in H2O; 200-400 U/mg) versetzt (sorgfältig mischen) und 1 h bei 30°C inkubiert. - Danach wird die Extinktion der Proben bei 340 nm gegen Semicarbazid/NAD+-Lösung gemessen. 9 Auswertung: Aus den Meßwerten der Ansätze 5) bis 9) ist eine Eichkurve zu zeichnen. Mit Hilfe dieser Eichkurve und den Meßwerten der Ansätze 1) bis 4) ist die Menge Alkohol in g/l zu berechnen, die die Hefezellen unter den verschiedenen Kulturbedingungen produziert haben. Dichte von Ethanol = 0.78 g/ml. Aufgabe: Untersuchung der Fähigkeit von normalen und atmungsdefekten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, Glycerin unter aeroben Bedingungen als Energiequelle nutzen zu können. Die beiden Teststämme von S. cerevisiae (ρ+ bzw. ρ-) werden auf eine YEPD-Platte (enthält Dextrose = Glucose) und eine YEPG-Platte (enthält Glycerin) ausgestrichen. Die Agarplatten werden ÜN bei 30°C inkubiert. Das Wachstum der beiden Hefestämme auf den Platten ist zu protokollieren. 10 Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropher Mutanten Wildstämme von Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae wachsen in einem gepufferten Mineralsalzmedium, das Glucose als einzige organische Verbindung enthält, die als C- und Energiequelle benutzt wird. Auxotrophe Mutanten (Mangelmutanten) benötigen dagegen zusätzlich einen oder mehrere organische Stoffe (z.B. bestimmte Aminosäuren), die sie nicht mehr selbst synthetisieren können, weil durch eine Mutation ein Enzym defekt ist oder ganz fehlt. Diese Mangelmutanten wachsen jedoch je nach der Lage des genetischen Blocks nicht nur bei Zugabe des Endprodukts der unterbrochenen Biosynthesekette zum Nährmedium, sondern auch mit Zwischenprodukten, nämlich mit solchen, deren Synthese aufbauend auf dem Produkt erfolgt, dessen Synthese durch die Mutation verhindert wird. Befindet sich der genetische Block in einer verzweigten Biosynthesekette, so benötigen auxotrophe Mutanten unter Umständen mehrere Stoffe zum Wachstum (Polyauxotrophie). Aus der Art und Zahl der wachstumswirksamen Substanzen lassen sich Rückschlüsse auf die Lage des genetischen Blocks ziehen. Auxotrophe Mutanten akkumulieren oftmals das Zwischenprodukt der Biosynthesekette, das wegen des genetischen Blocks nicht mehr weiterverarbeitet werden kann. In vielen Fällen ermöglicht das akkumulierte Produkt anderen Mutanten, die ihren genetischen Block an einer früheren Stelle in der gleichen Biosynthesekette haben, das Wachstum ("Kreuzfütterung"). Aufgabe: Bei drei Tryptophan-Mangelmutanten von Saccharomyces cerevisiae ist die Lage des genetischen Blocks in der Tryptophan-Biosynthesekette durch einen Kreuzfütterungstest zu bestimmen. Versuchsdurchführung: - Jeweils 100 ml YEPD-Medium werden mit einer der drei Trp-Mangelmutanten von S. cerevisiae (HK51, HK78, HK145) angeimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt. - Jede Gruppe pipettiert von den 3 Kulturen jeweils 5 ml in je ein Zentrifugenröhrchen (Plastik). - Die Hefezellen werden abzentrifugiert (3 min), 2x mit je 5 ml Saline gewaschen und schließlich in 4 ml Saline suspendiert. - Jeweils 3 ml der Zellsuspensionen werden zusammen mit 15 ml geschmolzenem YNBMinimalmedium-Agar (40-45°C) in sterile Petrischalen gegossen. In eine vierte Petrischale werden 18 ml YNB-Minimalmedium-Agar ohne Zellen gegossen (Negativkontrolle). Durch leichtes Bewegen der Petrischalen wird der Agar gleichmäßig verteilt. - Die restlichen 1 ml Zellsuspension werden mit 5 ml Saline verdünnt. Ca. 50 μl der drei verdünnten Zellsuspensionen werden nach dem Erstarren des Agars auf jeder Agaroberfläche mit einer 1 ml-Glaspipette zickzackförmig ausgestrichen. Die Platten werden anschließend bei 30°C inkubiert. 11 - Nach 4 Tagen Inkubation wird das Wachstum der ausgestrichenen Stämme auf den Agarplatten überprüft. Akkumulierte Anthranilsäure ist bei UV-Bestrahlung der Agarplatten durch ihre blaue Fluoreszenz zu erkennen. Auswertung: Tragen Sie das Ergebnis des Kreuzfütterungstests in die nachfolgende Tabelle ein und geben Sie die Lage des genetischen Blocks bei den Mutanten an. Agar mit Mutante Wachstum der ausgestrichenen Mangelmutanten HK 51 HK 78 HK 145 ----------------------------------------------------------------------------------------------------HK51 HK78 HK145 HK51: A ----> B ----> C ----> Tryptophan HK78: A ----> B ----> C ----> Tryptophan HK145: A ----> B ----> C ----> Tryptophan Aufgabe: Lokalisierung des genetischen Blocks im Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren bei verschiedenen auxotrophen Mutanten von Saccharomyces cerevisiae durch einen Wachstumstest. Verwendete Mutanten von S. cerevisiae: HK1 (Wildtyp), HK11, HK51, HK78, HK99, HK145, KP171-1. Jede Gruppe untersucht eine Mutante. Der Wachstumstest wird in supplementiertem Minimalmedium durchgeführt. Als Wuchsstoffe werden verwendet: Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, p-Aminobenzoesäure, Indol, Anthranilsäure und Shikimisäure. Chorisminsäure und Prephensäure stehen nicht zur Verfügung. Die Konzentration der ausgegebenen Stammlösungen beträgt 1 mg/ml, bei pAminobenzoesäure 0.1 mg/ml. Überlegen Sie sich anhand des untenstehenden Schemas der Biosynthese aromatischer Aminosäuren, welche Wuchsstoffe bzw. welche Wuchsstoffkombinationen verwendet werden müssen, um den genetischen Block der jeweiligen S. cerevisiae-Mutante zu lokalisieren. (Einschließlich einer Negativkontrolle ohne Wuchsstoff ergeben sich 10 Testmöglichkeiten.) 12 Versuchsdurchführung: - 10 Kapsenbergröhrchen (Glasröhrchen mit Metallverschluß) werden mit 5 ml YNBMinimalmedium gefüllt. Anschließend werden jeweils 0.5 ml der entsprechenden Wuchsstofflösung(en) dazu pipettiert. - Die zu untersuchenden S. cerevisiae-Mutanten wurden 1 Woche in je 20 ml YNB (supplementiert mit 2 ml der entsprechenden Aminosäurestammlösung(en)) bei 30°C vorgezüchtet. Jeweils 10 ml der Kulturen werden abzentrifugiert (3 min), mit 5 ml Saline gewaschen, dann in 2.5 ml Saline resuspendiert und schließlich 1:20 mit Saline verdünnt. - Jedes Röhrchen wird mit 50 µl der 20-fach verdünnten Zellsuspension beimpft. - Nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C (Schüttler) wird das Wachstum in den Röhrchen (Größe des Zellsediments) protokolliert. Die Lage des genetischen Blocks bei der untersuchten Mutante ist zu ermitteln und in das vereinfachte Schema der Biosynthese aromatischer Aminosäuren einzutragen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------Zusatz zum Medium: --------------------------------------------------------------------------------------------------------------Wachstum: HK 1 ____________________________________________________________________ HK 11____________________________________________________________________ HK 51____________________________________________________________________ HK 78____________________________________________________________________ HK 99 ____________________________________________________________________ HK 145___________________________________________________________________ KP 171-1__________________________________________________________________ Tyrosin Prephensäure Phenylalanin Shikimisäure Chorisminsäure Anthranilsäure Indol Tryptophan p-Aminobenzoesäure 13 Assimilation von Stickstoff: Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli Die meisten Mikroorganismen assimilieren Stickstoff durch Einbau von NH3 in αKetoglutarat und Glutaminsäure. Ist NH3 in hohen Konzentrationen (> 1 mM) verfügbar, wird α-Ketoglutarat durch die Glutamat-Dehydrogenase unter Verbrauch von NAD(P)H + H+ direkt zu Glutaminsäure umgesetzt. Glutamatdehydrogenase (I) NH3 + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H+ Glutaminsäure + NAD(P)+ + Unter Stickstoff-Mangelbedingungen werden durch die Glutamin-Synthetase unter ATPVerbrauch NH3 und Glutaminsäure zu Glutamin umgesetzt. Bei der durch die Glutamin-2oxoglutarat-aminotransferase (GOGAT) katalysierten Reaktion von Glutamin und αKetoglutarat entsteht dann unter Verbrauch von NAD(P)H + H+ Glutaminsäure. GlutaminSynthetase (II) NH3 + Glutaminsäure + ATP (III) Glutamin + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H+ Glutamin + ADP + Pi GOGAT 2 Glutaminsäure + NAD(P)+ Glutaminsäure und Glutamin sind wichtige Vorstufen zur Biosynthese von Aminosäuren und Nucleotiden. Die Glutamin-Synthetase als Schlüsselenzym für ihre Synthese unterliegt vielfältigen Regulationsmechanismen, sowohl hinsichtlich ihrer Expression als auch der Enzymaktivität. Die Transkription des glnA-Gens, das die Glutamin-Synthetase codiert, wird durch das NtrB/NtrC Zweikomponenten-System in Abhängigkeit vom Glutamin- und α-KetoglutaratSpiegel in der Zelle reguliert. Der phosphorylierte Response-Regulator NtrC~P wirkt dabei als Transkriptionsaktivator für glnA. Der Phosphorylierungszustand von NtrC wird durch die bifunktionelle Kinase/Phosphatase NtrB kontrolliert. Die Aktivität von NtrB wird wiederum durch ein weiteres Protein, PII (GlnB), reguliert. Unter Stickstoff-Mangelbedingungen wird PII durch das UTase/UR-Enzym (GlnD) reversibel an einem Tyrosin-Rest uridyliert, während in Gegenwart hoher Glutamin-Konzentrationen vom selben Enzym der UMP-Rest wieder von PII abgespalten wird. Das UTase/UR-Enzym sellt somit den eigentlichen Sensor für das Verhältnis von Glutamin und α-Ketoglutarat in der Zelle dar. Das unmodifizierte PII interagiert mit NtrB, was die Inhibition der Autokinase-Aktivität von NtrB bei gleichzeitiger Stimulierung der Phosphatase-Aktivität von NtrB gegenüber NtrC~P bewirkt. Folglich liegt NtrC bei Stickstoff-Überschuß in der unphosphorylierten Form vor und die Transkription von glnA unterbleibt. PII-UMP interagiert nicht mit NtrB. Demzufolge überwiegt bei StickstoffMangel die Autokinase-Aktivität von NtrB, was zur Phosphorylierung von NtrC und zur Transkription von glnA führt. 14 Die Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase wird durch Adenylierung, katalysiert durch das bifunktionelle Enzym ATase, moduliert. Die Aktivität der ATase wird wiederum über PII kontrolliert. Durch Adenylierung, die in Gegenwart hoher Konzentrationen von Glutamin erfolgt, wenn PII unmodifiziert vorliegt, wird die Glutamin-Synthetase inhibiert. PII-UMP bindet dagegen an die ATase und stimuliert die Deadenylierung der Glutamin-Synthetase, wodurch diese aktiviert wird. Außerdem wird die Aktivität der Glutamin-Synthetase durch kumulative Feedback-Hemmung durch verschiedene Endprodukte des Glutamin- und Glutamatstoffwechsels (Tryptophan, Histidin, CTP, AMP, Glucosamin-6-phosphat, Carbamylphosphat, außerdem Glycin und Alanin) reguliert. Gln ATP PPi ATas GS-AMP GS ATas PPi Gln UTase UTP ATP H2O PII-UMP UR ADP UMP PII NtrB Gln Pi Gln NtrC~P H2O NtrB ADP NtrB~P NtrC Pi Signaltransduktionssysteme zur Regulation der Glutamin-Synthetase aus E. coli 15 Aufgabe: Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht in Nährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-Angebot Verwendete E. coli-Stämme: E. coli YMC10, E. coli RB9060 (ΔglnB), E. coli YMC26 (ΔglnD), E. coli NCM1850 (ntrC::Tn5) Versuchsdurchführung: - 50 ml Kulturen mit Ggln bzw. GLBgln-Medium werden mit Übernacht-Kulturen der E. coli Stämme YMC10, RB9060,YMC26 bzw. NCM1850 zu einer Start-OD600 von ca. 0.08 – 0.1 beimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert bis eine OD600 von ca. 0.5 erreicht ist. Pro Kultur werden zwei 2 ml-Aliquots in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und die Bakteriensuspensionen werden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 5 sec schockgekühlt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation sedimentiert (1 min, 12000 rpm), der Überstand wird verworfen. Die Zellpellets werden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glutamin-Synthetase (GS) Der Test beruht auf der Fähigkeit der Glutamin-Synthetase, statt NH3 auch NH2OH umzusetzen. In der Umkehrung der eigentlichen Reaktion wird Glutamin quantitativ in NGlutamylhydroxamsäure überführt. NH2 O + + CH2 - CH2 NH2OH ADP, H3N CH COO C GlutaminSynthetase CH2 NHOH O C AsO42-, Mn 2+ + CH2 + NH3 H3N CH COO Der Test ist sehr einfach, kann im Rohextrakt angewendet werden und zeigt die Aktivität des Enzyms genau an. Das entstehende N-Glutarhydroxamat gibt zusammen mit Fe(III)-Salzen einen stark gefärbten Komplex. Seine Konzentration kann bei 546 nm photometrisch bestimmt werden. - Die Zellpellets werden auf Eis aufgetaut und in 1 ml eiskalter Waschlösung (1% KCl) resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (1 min, 12000 rpm) werden die Zellen in 1 ml Permeabilisierungslösung (1% KCl, 0.1 mg/ml CTAB) resuspendiert. Die Proben, die identische Zellsuspensionen enthalten (siehe oben) werden nun vereinigt und die Zellsuspensionen werden für 3 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch erneute Zentrifugation geerntet und in 1 ml Reaktionsmix resuspendiert. Zwei mal 450 μl der Suspension werden für den enzymatischen Test verwendet und in 1,5 ml EppendorfReaktionsgefäße überführt, der Rest dient zur Bestimmung der Proteinkonzentration im ZellLysat. 16 - GS-Enzymtest: Die Eppendorf-Gefäße, die 450 μl der Zellsuspensionen enthalten, werden 5 min bei 37°C vorinkubiert. Die Transferase-Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösung gestartet. Nach 10- bzw. 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch die Zugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000 rpm) und die optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz ohne Zellsuspension) gemessen. Die Konzentration an γ-Glutamylhydroxamat in den Proben wird mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes bestimmt: P(λ) = P0(λ)e-ε(λ)cx P: Strahlungsleistung λ: Wellenlänge ε: Extinktionskoeffizient c: Konzentration x: Küvettendicke Am Photometer wird die dekadische Extinktion -log(P/P0) bestimmt. Der dekadische Extinktionskoeffizient des Komplexes aus Fe(III) und N-Glutarhydroxamat (ε546) beträgt 436 cm2/mmol. Die Dicke der Küvette beträgt 1 cm. Daraus ergibt sich: c (mmol/cm3) = - log(P/P0) / ε546 Die Glutaminsynthetase-Aktivität wird in nmol γ-Glutamylhydroxamat min-1 (mg Protein)-1 angegeben. -Bestimmung der Proteinkonzentration der Zell-Lysate: Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay“ ermittelt, der darauf beruht, dass sich das Absorptionsmaximun einer sauren Lösung von Coomassie Brilliant Blue G-250 von 465 nm nach 595 nm verschiebt, wenn die Substanz an Protein bildet. Zur Erstellung einer Eichgeraden werden 1, 2, 4, 6, 8 und 10 μl einer BSA-Lösung (1μg/μl) zu je 800 μl Wasser gegeben, das in 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße vorgelegt wurde. Anschließend werden die Ansätze mit 200 μl „Bio-Rad Protein Assay“-Lösung versetzt und gemischt. Nach fünf Minuten wird die OD595 der Ansätze gegen einen Leerwert (800 μl d H2O, 200 μl Bio-Rad Assay-Lösung) bestimmt. Von den Zell-Lysaten werden jeweils 10 und 20 μl entsprechend vermessen. Die Proteinkonzentration wird in mg/ml angegeben. 17 Aufgabe: Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwart von Inhibitoren Versuchsdurchführung: In diesem Experiment wird gereinigte Glutamin-Synthetase aus E. coli verwendet. Der GSEnzymtest wird im wesentlichen durchgeführt wie oben beschrieben. Dazu wird folgender Ansatz in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert und 5 min bei 37°C vorinkubiert: 450 μl Reaktionsmix 20 μl Glutamin-Synthetase-Lösung (1.7 μg/μl) 50 μl dH2O bzw. Inhibitor-Lösung Als Inhibitoren werden verwendet: Glycin (Stocklösung: 300 mM) Alanin (Stocklösung: 300 mM) CTP (Stocklösung: 100 mM) Glycin + CTP (1:1 Gemisch aus 600 mM Glycin und 200 mM CTP) Die Transferase-Reaktion wird wiederum durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösung gestartet. Nach 10 min wird die Reaktion durch die Zugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000 rpm) und die optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz ohne Enzym) gemessen. Die Glutaminsynthetase-Aktivität für die einzelnen Ansätze wird bestimmt und in nmol γGlutamylhydroxamat min-1 (mg Protein)-1 angegeben. 18 Antibiotika Antibiotika sind chemische Substanzen, die von bestimmten pro- oder eukaryontischen Mikroorganismen produziert und sezerniert werden und die andere Mikroorganismen abtöten oder in ihrem Wachstum inhibieren. Sie werden deshalb in der Medizin zur Bekämpfung bakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt, einige auch zur Bekämpfung von Pilzerkrankungen. Heute sind über 8000 antibiotisch wirksame Substanzen bekannt. Die meisten kommerziell verwendeten Antibiotika werden von filamentösen Pilzen (Penicillium, Cephalosporium) und von Bakterien der Actinomycetengruppe (v.a. Streptomyceten) sowie Bazillen gebildet. Antibiotikum Produzierender Mikroorganismus --------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bacitracin Bacillus subtilis Cephalosporin Cephalosporium sp. Chloramphenicol Streptomyces venezuelae (heute chem. Synthese) Cycloheximid Streptomyces griseus Cycloserin S. orchidaceus Erythromycin S. erythreus Griseofulvin Penicillium griseofulvin Kanamycin S. kanamyceticus Lincomycin S. lincolnensis Neomycin S. fradiae Nystatin S. noursei Penicillin Penicillium chrysogenum Polymyxin B Bacillus polymyxa Streptomycin S. griseus Tetracycline S. aureofaciens, S. rimosus Die Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber verschiedenen Antibiotika ist unterschiedlich. Gewöhnlich sind Gram-positive Bakterien sensitiver gegenüber Antibiotika als Gram-negative Bakterien. Antibiotika, die sowohl auf Gram-positive, als auch auf Gramnegative Bakterien wirken, werden als "Breitband-Antibiotika" bezeichnet. Einige natürlich vorkommende Antibiotika können durch chemische Modifikationen effektiver gemacht werden. Die so hergestellten semisynthetischen Antibiotika besitzen oft ein erweitertes Wirkungsspektrum. 19 Wirkungsweise verschiedener Antibiotika: Angriffsort im Mikroorganismus Beispiel --------------------------------------------------------------------------------------------------------------1) Bakterielle Zellwand (Murein) - Penicilline (z.B. Penicillin G, Ampicillin) - Cephalosporine (z.B. Cephamycin) 2) Proteinsynthese (a) bei Prokaryonten (b) bei Eukaryonten 3) Zytoplasmamembran (a) bei Prokaryonten (b) bei Eukaryonten 4) Nukleinsäuresynthese (a) bei Prokaryonten (b) bei Pro- und Eukaryonten - Aminoglycoside (z.B. Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin, Neomycin) - Tetracycline - Fusidinsäure - Chloramphenicol - Makrolidantibiotika (z.B. Erythromycin) - Lincomycin - Puromycin - Cycloheximid - Polymyxine (z.B. Polymyxin B) - Gramicidin A - Gramicidin S - Polyene (z.B. Nystatin) - Nalidixinsäure (inhibiert DNA-Synthese) - Rifamycine (z.B. Rifamycin B, Rifampicin; inhibieren RNA-Synthese) - Actinomycin D (inhibiert RNA-Synthese) Klassifizierung von Antibiotika aufgrund ihrer chemischen Struktur: 1. Kohlenhydrat-haltige Antibiotika: Reine Zucker (Nojrimycin) Aminoglycoside (Streptomycin) Orthosomycine (Everninomicin) N-Glycoside (Streptothricin) C-Glycoside (Vancomycin) Glycolipide (Moenomycin) 2. Makrocyclische Lactone: Makrolid-Antibiotika (Erythromycin) Polyene (Candicidin) Ansamycine (Rifamycin) Makrotetrolide (Tetranactin) 20 3. Chinone und Chinonderivate: Tetracycline (Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin) Anthracycline (Adriamycin) Naphthochinone (Actinorhodin) Benzochinone (Mitomycin) 4. Aminosäure- und Peptidantibiotika: Aminosäurederivate (Cycloserin) β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine) Peptidantibiotika (Bacitracin) Chromopeptide (Actinomycin D) Depsipeptide (Valinomycin) Chelatbildende Peptide (Bleomycine) 5. Heterocyclische, N-haltige Antibiotika: Nucleosid-Antibiotika (Polyoxine) 6. Heterocyclische, O-haltige Antibiotika: Polyether-Antibiotika (Monensin) 7. Alizyklische Derivate: Cycloalkanderivate (Cycloheximid) Steroid-Antibiotika (Fusidinsäure) 8. Aromatische Antibiotika: Benzenderivate (Chloramphenicol) Kondensierte aromatische Antibiotika (Griseofulvin) Aromatische Äther (Novobiocin) 9. Aliphatische Antibiotika: Phosphor-haltige Verbindungen (Fosfomycine) Resistenz von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika: Die Resistenz von Mikroorganismen gegenüber bestimmten Antibiotika kann verschiedene Ursachen haben: 1. Dem Mikroorganismus fehlt die Struktur, an der das Antibiotikum angreift. Beisp.: Mycoplasmen besitzen keine Zellwand und sind daher resistent gegenüber Penicillinen. 2. Der Mikroorganismus ist impermeabel für das Antibiotikum. Beisp.: Resistenz von Pseudomonas aeruginosa gegenüber Penicillinen. 3. Der Mikroorganismus inaktiviert das Antibiotikum (enzymatischer Abbau oder chemische Modifikation). Beisp.: Spaltung von Penicillinen durch β-Lactamase; Acetylierung von Chloramphenicol durch Chloramphenicol-Acetyltransferase (Cat-Protein); Inaktivierung von Streptomycin oder Kanamycin durch Phosphorylierung. 4. Das Ziel des Antibiotikums in der Zelle ist verändert und dadurch für das Antibiotikum unzugänglich. Beisp.: Resistenz gegenüber Rifamycin durch Veränderung der β-Untereinheit der RNA-Polymerase; Resistenz gegenüber Erythromycin durch Veränderung der 50SUntereinheit der Ribosomen. 21 5. Das Antibiotikum wird durch ein spezifisches Efflux-System aus der Zelle transportiert. 6. Der Reaktionsweg, in den ein Antibiotikum eingreift, kann verändert sein. Häufig ist die Resistenz von Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika auf extrachromosomalen Plasmiden, den sog. R-Faktoren, genetisch determiniert. Solche plasmidkodierten Resistenzen sind z.B. gegenüber Antibiotika wie Chloramphenicol, Erythromycin, Gentamycin, Kanamycin, Penicillinen und Tetracyclinen gefunden worden. Viele R-Faktoren enthalten auch mehrere Resistenzgene. R-Faktoren können durch Konjugation nicht nur auf Bakterien der gleichen Art, sondern auch auf andere Bakterien übertragen werden. Eine besondere Gefahr liegt z.B. darin, dass RFaktoren von E. coli auch auf pathogene Enterobakterien wie Shigella dysenteriae (Erreger der Ruhr) oder Salmonella typhimurium (verursacht Gastroenteritis) übertragen werden können. Vor allem durch den starken Einsatz von Antibiotika in der Medizin und als Zusatz von Futtermitteln sind R-Faktor-tragende Bakterien stark angereichert worden und stellen heute ein beachtliches medizinisches Problem dar. Eine zurückhaltende Anwendung der Antibiotika ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt die einzige Möglichkeit, um eine Verringerung der resistenten Keime zu erreichen, da keine therapeutischen Methoden verfügbar sind, um RFaktoren zu eliminieren. Aufgabe: Untersuchung der Resistenz von R-Faktor-tragenden E. coli- und B. subtilis-Stämmen gegenüber verschiedenen Antibiotika. Bakterienstämme: E. coli K-12 E. coli W945 (R1drd16) E. coli K-12 (R1drd19) E. coli EndoI (R64) E. coli DH5α (pACYC184) B. subtilis B. subtilis 1E7 (pE194 cop6) Versuchsdurchführung: Jeweils 0.1 ml ÜN-Kultur von den 7 Stämmen werden auf YT-Agarplatten ausplattiert (4 Platten pro Stamm). Anschließend werden Papierplättchen auf die Agarplatten gelegt, die zuvor mit 5 µg, 10 µg, 50 µg bzw. 100 µg verschiedener Antibiotika getränkt wurden (bei Penicillin G 50 µg, 100 µg, 500 µg bzw. 1000 µg). 22 Zum Tränken der Papierplättchen werden folgende Antibiotikalösungen verwendet: Penicillin G (Pn) Ampicillin (Ap) Kanamycin (Km) Streptomycin (Sm) Tetracyclin (Tc) Chloramphenicol (Cm) Erythromycin (Em) (10 mg/ml bzw. 100 mg/ml in H2O) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H2O) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H2O) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H2O) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in 50% Ethanol) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol) Die Agarplatten mit den aufgelegten Papierplättchen werden 2-3 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen, damit die Antibiotika in den Agar diffundieren können. Danach werden die Platten ÜN bei 37°C inkubiert. Bakterien, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv sind, werden abgetötet, so dass sich im Zellrasen klare Zonen um das entsprechende Plättchen bilden. Auswertung: Das Resistenzmuster der versch. E. coli- und B. subtilis-Stämme ist zu bestimmen und in die folgende Tabelle einzutragen. (R = resistent; S+, S++ und S+++ = schwach, mittel und stark sensitiv) Pn Ap Km Sm Tc Cm Em --------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli K-12 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli W945 (R1drd16) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli K-12 (R1drd19) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli EndoI (R64) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli DH5α (pACYC184) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------B. subtilis --------------------------------------------------------------------------------------------------------------B. subtilis 1E7 (pE194 cop6) 23 Untersuchung der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens (Tetracyclin), Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces venezuelae (Chloramphenicol) und Streptomyces rimosus (Oxytetracyclin) Die wichtigste Stoffwechselleistung der Streptomyceten ist ihre Fähigkeit, chemisch sehr unterschiedliche antibiotisch wirkende Substanzen zu synthetisieren. Etwa 80% der therapeutisch eingesetzten Antibiotika werden aus Streptomyceten isoliert. Aufgabe: Biologischer Nachweis der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus und Streptomyces venezuelae. Streptomyceten-Stämme: Streptomyces aureofaciens Streptomyces griseus subsp. griseus Streptomyces venezuelae Testkeime: E. coli K-12 (in 2xYT, 37°C) Bacillus megaterium (in 2xYT, 30°C) Bacillus subtilis (in 2xYT, 30°C) Pseudomonas fluorescens (in 2xYT, 24°C) Serratia marcescens (in 2xYT, 30°C) (1) Agarstrichtest: Die Streptomycetenstämme werden jeweils in der Form eines dicken Impfstrichs in der Mitte von GYM-Agarplatten ausgestrichen (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Platten werden ca. 4 Tage bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die versch. Testkeime senkrecht zum Antibiotika-Produzenten hin ausgestrichen (jeweils 1 Tropfen ÜN-Kultur der Teststämme ausstreichen). Die Platten werden danach 1-2 Tage bei 30°C bebrütet. Mikroorganismen, die sensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) des jeweiligen Streptomycetenstammes sind, können in seiner unmittelbaren Nachbarschaft nicht wachsen. (2) Agarzylindertest: Jeweils 100 µl von stationären Kulturen der Streptomycetenstämme in GYM-Medium werden auf GYM-Agarplatten ausplattiert (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Agarplatten werden für 25 Tage bei 30°C inkubiert. Danach werden aus den Platten Agarzylinder ausgestochen. Die mit den verschiedenen Streptomycetenstämmen bewachsenen Agarzylinder werden in eine leere Petrischale gesetzt (bewachsene Seite nach oben) und mit ca. 20 ml geschmolzenem, 0,75 %igem YT-Weichagar (ca. 42°C) umgossen, der zuvor mit einem der oben angegebenen Testkeime angeimpft wurde (0.5 ml ÜN-Kultur des Testkeims pro 20 ml Weichagar). Nach dem Erstarren des Weichagars werden zur Kontrolle Papierplättchen auf die Agarplatten gelegt, die mit 50 μg der von dem jeweiligen Streptomyceten produzierten Antibiotika getränkt wurden (S. aureofaciens: Tetracyclin; S. griseus: Streptomycin; S. venezuelae: Chloramphenicol). Die Petrischalen werden dann ÜN bei 30°C bzw. 37°C (siehe Testkeime) inkubiert. Es bilden sich Hemmzonen um die Agarzylinder bzw. Kontrollplättchen, wenn der 24 Testorganismus sensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) der Streptomyceten ist. Aufgabe: Quantitative Bestimmung der Oxytetracyclinproduktion durch Streptomyces rimosus. Versuchsdurchführung: Zwei Impfösen Myzel von S. rimosus RF-107 werden in 5 ml Vorzuchtmedium inokuliert (100 ml-Schikanekolben) und 48 Stunden bei 30°C geschüttelt. Anschließend werden 45 ml Produktionsmedium mit 5 ml Vorkultur beimpft (200 ml-Schikanekolben) und bei 30°C geschüttelt. Nach 24, 48, 72 und 96 Stunden werden von der Kultur je 2 µl bzw. 20 µl auf Papierplättchen pipettiert. Die Plättchen werden nach dem Antrocknen jeweils auf eine YTAgarplatte gelegt, die zuvor mit 3.5 ml geschmolzenem, 0.75 %igem YT-Weichagar + 100 µl ÜN-Kultur von Micrococcus luteus oder M. flavus (Oxytetracyclin-sensitive Testkeime) überschichtet wurde. Als Kontrolle werden von einer Oxytetracyclinlösung (0.01 mg/ml bzw. 0.1 mg/ml in Methanol/HCl pH 2.0) 0.02 µg, 0.05 µg, 0.1 µg, 0.2 µg, 0.5 µg, 1.0 µg, 1.5 μg und 2 μg auf Filterplättchen pipettiert und ebenfalls auf die Agarplatte gelegt. Nach einer Inkubation ÜN bei 30°C wird die produzierte Oxytetracyclinmenge vergleichend mit Hilfe einer Eichkurve bestimmt. 25 Anhang: Stämme, Medien, Chemikalien (mit Mengenangaben für 10 Gruppen) Diauxie, Katabolitrepression: E. coli B leu3 (auf YT-Platte, 37°C) 1.0 l CM-Minimalmedium ohne C-Quelle: 0.2 g MgSO4 x 7 H2O 2.0 g Zitronensäure (C6H8O7 x H2O) 2.0 g Na2HPO4 x 12 H2O 5.0 g KH2PO4 2.0 g (NH4)H2PO4 (ersatzweise (NH4)2HPO4) 3.4 g KOH 1.0 l H2O nach dem Autoklavieren 50 mg Leucin (aus einer 10 mg/ml-Stammlösung) zugeben. 200 ml CM mit 0.45 % Glycerin (= 195.5 ml CM + 4.5 ml 20 % Glycerin) 100 ml Glucoselösung (0.04 g/ml) 100 ml Lactoselösung (0.2 g/ml) 100 ml Galactoselösung (0.2 g/ml) 100 ml Sorbitlösung (0.2 g/ml) 500 ml Saline (für 1.0 l: 5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO4 x 7 H2O; 1.0 l H2O) Enzyminduktion und Katabolitrepression am Beispiel der β-Galactosidase von Escherichia coli: E. coli B leu3 E. coli W575 E. coli 1783 (auf YT-Platte, 37°C) ( " " ) ( " " ) 2.0 l CM mit 0.45 % Glycerin (= 1.955 l CM + 45 ml 20 % Glycerin) 200 ml CM mit 0.2 % Glucose (= 198 ml CM + 2 ml 20 % Glucose) 200 ml 20 %ige Glucoselösung (für CM mit 0.2 % Glucose) 200 ml 20 %ige Glycerinlösung ( für CM mit 0.45 % Glycerin) 26 100 ml 0.1 M Lactose 100 ml 0.1 M Glucose 100 ml Toluol 100 ml Natriumdesoxycholatlösung (1 %ig) 200 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4 (mit 7 µl β-Mercaptoethanol pro 1.0 l) 50 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) (5 mg/ml) 100 ml 10 % Natriumcarbonat Alkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ+ (auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C)) Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ- (auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C)) 1.0 l YNB-Hefe-Minimalmedium: HM-Agarplatten: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids 5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose) H2O ad 100 ml; sterilfiltrieren, bei 4°C lagern; vor Gebrauch 1:10 mit H2O verdünnen. 4.0 g Yeast extract 10.0 g Maltose 15.0 g Agar H2O ad 992 ml nach dem Autoklavieren 8.0 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben. 500 ml steriles Paraffinöl 500 ml Semicarbazid/NAD+-Lösung: 75 mM Na-Pyrophosphat (= 9.97 g pro 500 ml) 20 mM Glycin (= 0.75 g pro 500 ml) 75 mM Semicarbazid-hydrochlorid (= 4.18 g pro 500 ml) 7.5 mM β-NAD (Fluka)(= 2.49 g pro 500 ml) (β-NAD erst unmittelbar vor dem Versuch zugeben). 10 ml 1 % (v/v) Ethanol p.a. Alkoholdehydrogenase (Fluka): aus Bäckerhefe, NAD/NADH-frei, 200-400 U/mg, kurz vor Gebrauch in H2O lösen (10 mg/ml). 27 1.0 l YEPD-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract 20.0 g Bacto-Pepton 15.0 g Agar 960 ml H2O nach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben. 1.0 l YEPG-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract 20.0 g Bacto-Pepton 15.0 g Agar 975 ml H2O nach dem Autoklavieren 25 ml 86 %ige Glycerinlösung zugeben. Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropher Mutanten: Saccharomyces cerevisiae HK 1 S. cerevisiae HK 11 S. cerevisiae HK 51 S. cerevisiae HK 78 S. cerevisiae HK 99 S. cerevisiae HK 145 S. cerevisiae KP 171-1 (auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium, 30°C) ( " ) ( " ) ( " ) ( " ) ( " ) ( " ) 1.0 l YEPD-Medium: 10.0 g Yeast extract 20.0 g Bacto-Pepton 960 ml H2O nach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben. 1.0 l YNB-Minimalmedium: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids 5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose) H2O ad 100 ml; sterilfiltrieren, bei 4°C lagern; vor Gebrauch 1:10 mit H2O verdünnen. 1.0 l YNB-Minimalmedium-Agar: (a) 6.7 g YNB w/o amino acids 5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose) H2O ad 100 ml; sterilfiltrieren, bei 4°C lagern; (b) 900 ml H2O + 15 g Agar; autoklavieren; Ansätze (a) und (b) mischen. 1.0 l Saline (5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO4 x 7 H2O; 1.0 l H2O) 28 Je 100 ml: Tyrosin Phenylalanin Tryptophan Indol Anthranilsäure Shikimisäure p-Aminobenzoesäure (1 mg/ml) ( " ) ( " ) ( " ) ( " ( " ) (0.1 mg/ml) ) Regulation von Expression und Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli: E. coli YMC10 E. coli RB9060 (ΔglnB) E. coli YMC26 (ΔglnD) E. coli NCM1850 (ntrC::Tn5) (auf LB-Platte, 37°C) (auf LB-Platte, 37°C) (auf LB-Platte, 37°C) (auf LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin, 37°C) 1.0 l GLBgln: 10 g Bacto Pepton 5 g Bacto Yeast Extract 10 g NaCl H2O ad 870 ml nach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml GlutaminLösung (20 mg/ml) zugeben. 1.0 l Ggln: 10.5 g K2HPO4 4.5 g KH2PO4 0.246 g MgSO4 x 7 H2O H2O ad 870 ml nach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml GlutaminLösung (20 mg/ml) zugeben. 1 l Waschlösung: 1% KCl 500 ml Permeabilisierungslösung: Reaktionsmix: 1% KCl, 0.1mg/ml CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid) benötigt werden bei Durchführung aller Experimente 15 ml Reaktionsmix pro Gruppe 2.25 ml 1 M Imidazol, pH 7.0 0.37 ml 0.8 M Hydroxylamin pH 7* 45 μl 0.1 M MnCl2 1.5 ml 0.28 M Na-Arsenat 0.15 ml 0.04 M Na-ADP 9 ml H2O * Hydroxylamin bei pH 7 ist instabil, es muß daher unmittelbar vor Gebrauch durch Mischen gleicher Volumenteile einer 1.6 M 29 Hydroxylammoniumchlorid-Lösung und einer NaOH-Lösung hergestellt werden. Die NaOH-Lösung wird vorher so eingestellt (1.4 M), dass der pH-Wert der Mischung etwa 7 beträgt. Stopp-Lösung: 55 g FeCl3 x 6 H2O 20 g Trichloressigsäure 21 ml konz. HCl H2O ad 1 l Glutamin-Lösung: 2.92 g ad 100 ml H2O (0.2 M), frisch hergestellt Inhibitor-Lösungen: 300 bzw. 600 mM Glycin (10 ml) 300 mM Alanin (10 ml) 100 bzw. 200 mM CTP (2 ml) Antibiotika: Escherichia coli K12 E. coli W945 (R1drd16) (Kmr) E. coli K12 (R1drd19) (Cmr, Smr, Apr, Kmr) E. coli EndoI (R64) (Smr) E. coli DH5α (pACYC184) (Cmr, Tcr) Bacillus subtilis (Smr) Bacillus subtilis 1E7 (pE194 cop6) (Emr, Smr) Bacillus megaterium Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Streptomyces aureofaciens Streptomyces griseus subsp. griseus Streptomyces rimosus Streptomyces venezuelae Micrococcus luteus oder M. flavus (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 37°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 37°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 37°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 37°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 37°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 30°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 30°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 30°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 24°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 30°C) (auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Tetracyclin bzw. in GYM-Medium, 30°C) (auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Streptomycin bzw. in GYM-Medium, 30°C) (auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Oxytetracyclin bzw. in GYM-Medium, 30°C) (auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Chloramphenicol bzw. in GYM-Medium, 30°C) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium, 30°C) 30 1.0 l 2xYT-Medium: 16.0 g Bacto-Trypton 10.0 g Yeast extract 10.0 g NaCl 1.0 l H2O 10 l YT-Agarplatten: 8 g Bacto-Trypton 5.0 g Yeast extract 5.0 g NaCl 15.0 g Agar 1.0 l H2O 8 x 200 ml 0.75 % YT-Weichagar 1.0 l GYM-Medium: 10.0 g Maltose 4.0 g Yeast extract 2.0 g CaCO3 pH 7.2 H2O ad 992 ml nach dem Autoklavieren 8 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben. 2.0 l GYM-Agarplatten: GYM-Medium mit 15.0 g Agar pro 1.0 l. 500 ml Vorzuchtmedium für Streptomyces rimosus: für 1.0 l: 7.0 g CaCO3 16.0 g Corn steep 40.0 g Dextrin 2.0 g (NH4)2SO4 1.4 ml D/L-Milchsäure pH 7.1-7.2 mit NaOH H2O ad 1.0 l 1.0 l Produktionsmedium für Streptomyces rimosus: 70.0 g Maltose 9.0 g Corn steep 6.0 g CaCO3 3.5 g (NH4)2SO4 3.0 g NH4Cl 1.0 g MgSO4 x 7 H2O 0.1 g MnSO4 x H2O 5 mg CoCl2 x 6 H2O H2O ad 1.0 l. 31 Antibiotika-Stammlösungen Penicillin G (Na-Salz) Ampicillin Kanamycin Streptomycin Tetracyclin Chloramphenicol Erythromycin Oxytetracyclin (je 10 ml, bei Oxytetracyclin 1 ml): (10 mg/ml; 100 mg/ml in H2O) (1 mg/ml; 10 mg/ml; 100 mg/ml in H2O) (1 mg/ml; 10 mg/ml in H2O) (1 mg/ml; 10 mg/ml in H2O) (1 mg/ml; 10 mg/ml in 50 % Ethanol) (1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol) (1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol) (0.1 mg/ml; 1 mg/ml in Methanol/HCl pH2) 32 Zeitplan: Montag, 04.12.2006 Induktion und Katabolitrepression (S. 5): Versuchsdurchführung. Wachstumstest (S. 10): Herstellung der Versuchsansätze. Kreuzfütterungstest (S. 11): Herstellung der Versuchsansätze. Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (24h-Wert). Diauxie (S. 3): Kultur von E. coli B leu3 in CM mit Glycerin ansetzen. Alkoholische Gärung (S. 8, 9): ÜN-Kulturen der Saccharomyces cerevisiae-Stämme in YNB ansetzen. Dienstag, 05.12.2006 Diauxie (S. 3): Versuchsdurchführung. Alkoholische Gärung (S. 8, 9): Versuchsdurchführung. Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (48h-Wert). Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): ÜN-Kulturen der Testkeime ansetzen. Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): ÜN-Kulturen der Stämme in 2xYT ansetzen. Regulation von Expression und Aktivät der Glutamin-Synthetase (S. 15): ÜN-Kulturen der Teststämme in Ggln- und GLBgln- Medium ansetzen. 33 Mittwoch, 06.12.2006 Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (72h-Wert). Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Herstellung der Testansätze. Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): Versuchsdurchführung. Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase (S. 15): Teststämme in Ggln- und GLBgln-Medium kultivieren, Zellpellets einfrieren. Donnerstag, 07.12.2006 Regulation von Expression und Aktiviät der Glutamin-Synthetase: - Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht in Nährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-Angebot (S. 15) - Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwart von Inhibitoren (S. 17) Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (96h-Wert). Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): Auswertung. Freitag, 08.12.2006 Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Auswertung. Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Auswertung. Wachstumstest (S. 10): Auswertung. Kreuzfütterungstest (S. 11): Auswertung. Kolloquium
