Ausgezählt - ZAHNHEILKUNDE.DE

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In der Lebensmittelanalytik und der medizinischen Diagnostik von viralen
Infektionskrankheiten ist sie bereits fest etabliert: Die Real-Time PCR. Nun
kann diese innovative molekularbiologische Untersuchungsmethode auch zur
Diagnostik von parodontalpathogenen Keimen angewendet werden. Hier
erfahren Sie, wofür PCR steht, was das Real-Time Verfahren zu leisten
vermag – und warum der Direktor der Poliklinik für Parodontologie, Zahnerhaltung und Präventive Zahnheilkunde an der Universität Bonn, Prof. Dr. Dr. Søren
Jepsen, in der Real-Time PCR eine viel versprechende Neuerung für die mikrobiologische Diagnostik sieht.
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Die meisten der mehr als 500 verschiedenen Bakterienarten in der menschlichen Mundhöhle sind völlig harmlos. Einige jedoch lösen parodontalpathologische Prozesse aus: vor allem Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis (frühere Bezeichnung: Bacteroides forsythus) und Treponema denticola sind für den
parodontalen und periimplantären Gewebeverlust
mit verantwortlich.
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Mikrobiologie weist
therapeutischen Weg
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Die Identifizierung der „Leitkeime“ bildet die
Grundlage für eine gezielte, die konventionelle
Parodontitisbehandlung ergänzende Antibiotikatherapie. Erst der direkte Erregernachweis mit molekularbiologischen Nukleinsäuretests hat moderne Dia-
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gnostik einer breiten Anwendung zugänglich
gemacht. Methodisch hat sich dabei die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgesetzt, die seit ihrer
Entwicklung im Jahr 1983 die Molekularbiologie
revolutioniert hat.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Wie bei einem Kopierer werden bei der PCR
bestimmte Gensequenzen so oft vervielfältigt bis
genügende Mengen zur Bestimmung des Gen tragenden Materials eines Krankheitserregers vorliegen. Die gezielte Vermehrung von DNA-Abschnitten
erfolgt durch ein hitzestabiles Kopierenzym, der
Taq-Polymerase (Abb. 1 bis 5). Der eigentliche
Kopiervorgang erfolgt dabei in einem speziellen
Gerät, dem Thermocycler. Unter anderem bei der
Analyse parodontopathogener Markerkeime in der
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Parodontologie ist die PCR den klassischen Kulturverfahren durch ihre Vorteile bezogen auf
Geschwindigkeit, Zuverlässigkeit und Genauigkeit
überlegen.
Anlässlich des größten europäischen Parodontologie-Kongresses, der EuroPerio4, in Berlin stellte
GABA International einen neuen Test zur Erkennung
und exakten Quantifizierung von parodontalpathogenen Keimen vor. Die meridol Paro Diagnostik
basiert auf der Real-Time PCR, einer modifizierten
PCR. Entwickelt wurde die Methode von Carpegen,
Münster, unter der Leitung von Dr. rer. nat. Antje
Roetger.
Real-Time PCR
Bei der Real-Time-PCR kommt eine weitere Sonde
zum Einsatz: Zusätzlich zu den für jede Erreger-DNA
spezifischen Primern wird ein weiteres artspezifisches DNA-Fragment, die TaqMan-Sonde, verwendet
(Abb. 6). Diese bindet an die Zielsequenz des
Krankheitserregers und bedingt die hohe Spezifität
des Verfahrens. Während des Vervielfältigungspro-
zesses wird dieses Fragment (TaqMan-Sonde) abgespalten und zerstört (Abb. 7). Dabei wird ein Fluoreszenzsignal freigesetzt, das durch automatische
Laserdetektion online gemessen und aufgezeichnet
wird (Abb. 8 und 9). Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist ein Maß für die Menge des gebildeten Produktes: Die Anzahl der interessierenden
Mikroorganismen kann also exakt bestimmt werden
(Abb. 10). Das Verfahren identifiziert die sechs
Markerkeime Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis,
Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum ssp.,
und Prevotella intermedia (Abb. 11).
Die Real-Time-PCR wird nahezu vollständig automatisiert durchgeführt. Von der Probenaufarbeitung
bis zur Ergebniserstellung sind keine manuellen
Schritte erforderlich, mögliche Fehlerquellen sind
ausgeschlossen. Die akkurate Arbeit im Labor wird
vom Pipettierroboter ausgeführt. Der gesamte Analysenprozess dauert in etwa drei Stunden. Dadurch
ist die Real-Time-PCR für eine Hochdurchsatz-Analytik bestens geeignet. In vielen kommerziellen
Bereichen hat sie sich mittlerweile durchgesetzt
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Abb. 1: DNA-Molekül
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Abb. 2: DNA-Doppelstran
wird durch Erhitzen
geteilt
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Berechnungsempfehlung für die Probenentnahme
• Die Kosten für Versand, Porto, Auswertung und Material sind zusätzlich nach § 3 GOZ und § 4 Abs. 3
GOZ berechnungsfähig. Nach GOZ § 10 Abs. 2 Satz 6 müssen Art, Menge und Preis der verwendeten
Materialien aufgelistet werden. Ein Originalbeleg ist nicht erforderlich.
• Für die Probenentnahme kann eine nach Art, Kosten und Zeitaufwand gleichwertige Leistung der GOZ
als Analogposition nach § 6 Abs. (2) GOZ herangezogen werden; z. B.
Abb. 3: Primer (rot und
grün) binden an bestimmte DNA-Abschnitte
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Anwendung elektromechanischer
Verfahren zur Parodontaldiagnostik,
je Kieferhälfte oder Frontzahnbereich
Gegebenenfalls zusätzlich erbrachte Leistungen
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Beratung
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Eingehende, das gewöhnliche Maß
überschreitende, Beratung,
mindestens 10 Minuten
150 Punkte
Symptombezogene Untersuchung
80 Punkte
Entfernung harter und weicher
Zahnbeläge, einschließlich Polieren,
je Zahn (Reinigung der Zähne vor
der Probennahme)
10,90 Punkte
Faktor 1,0
Faktor 2,3
Faktor 3,5
€ 2,81
€ 6,46
€ 9,83
Faktor 1,0
Faktor 2,3
Faktor 3,5
€ 4,66
€ 10,72
€ 16,31
Faktor 1,0
Faktor 2,3
Faktor 3,5
€ 8,74
€ 20,10
€ 30,59
Faktor 1,0
Faktor 2,3
Faktor 3,5
€ 4,66
€ 10,72
€ 16,31
Faktor 1,0
Faktor 2,3
Faktor 3,5
€ 0,61
€ 1,40
€ 2,13
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Diesen Artikel stellen wir
Ihnen im Internet unter
www.zahnheilkunde.de
herunterladbar zur Verfügung.
Den vollständigen unverbindlichen Berechnungshinweis zu meridol Paro
Diagnostik von GABA
(Stand: 06/2003) erhalten
Sie telefonisch unter
07621 / 907-155.
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Abb. 4: Identische DNAStränge werden wieder
aufgebaut
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Abb. 5: Verdopplung des
DNA-Doppelstrangs
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Abb. 6: DNA-Einzelstrang
mit TaqMan-Sonde
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Abb. 7: TaqMan-Sonde
wird vom DNA-Strang
verdrängt
(z. B. Lebensmittelanalytik, Coronavirus, Dengue,
EBV, HSV 1/2, VZV usw). Sie spielt natürlich auch
in der Forschung eine große Rolle.
meridol Paro Diagnostik ist ein Komplettpaket,
bestehend aus dem Entnahmeset, der Analyse auf
Basis der Real-Time-PCR in einem zertifizierten Vertragslabor sowie einem detaillierten, übersichtlichen Ergebnisbericht und Therapieempfehlungen,
die sich an den Empfehlungen der Deutschen
Gesellschaft für Parodontologie orientieren.
Die Berechnung aller zusätzlich erbrachten Leistungen unterliegt selbstverständlich den Bestimmungen der GOZ bzw. GOÄ.
Ziel einer in der Poliklinik für Parodontologie,
Zahnerhaltung und Präventive Zahnheilkunde der
Universität Bonn unter der Leitung von Prof. Dr. Dr.
Søren Jepsen durchgeführten Pilotstudie war es,
ein neues molekularbiologisches Diagnostikverfahren mit dem etablierten „goldenen Standard“ – der
anaeroben Kultur – zu vergleichen.
Prof. Jepsen und Dr. Pia-Merete Jervøe-Storm
beschreiben ihr Vorgehen und die Ergebnisse:
„Hierfür haben wir bei Patienten mit fortgeschrittener chronischer Parodontitis subgingivale Plaqueproben entnommen und diese sofort in ein
anaerobes Transportmedium überführt. In einem
spezialisierten mikrobiologischen Labor (Zentrum
für Dental-Medizinische Diagnostik, Kiel, Leitung:
Dipl.-Biol. W. Falk) wurden Aliquote der Bakteriensuspension entweder der anaeroben Kultur auf
selektiven Nährböden zugeführt oder aber mit dem
neu entwickelten molekularbiologischen Diagnostikverfahren mittels Real-Time PCR analysiert
(Carpegen, Münster, Leitung: Dr. rer. nat. Antje
Roetger).
Beide Auswertungen wurden unabhängig voneinander und somit „Untersucher-blind“ durchgeführt.
Zum Vergleich der Ergebnisse wurde zunächst die
Häufigkeit eines positiven oder negativen Nachweises ausgewählter parodontalpathogener Bakterien
analysiert. Generell wurde eine sehr gute Übereinstimmung zwischen dem molekularbiologischen und
dem kulturellen Nachweis in den individuellen Plaqueproben beobachtet.
Allerdings fanden sich keimspezifische Besonderheiten. Porphyromonas gingivalis und Tannerella forsythensis wurden häufiger mittels Real-Time PCR als
in der Kultur nachgewiesen. Eine nähere Betrachtung der quantitativen Ergebnisse aus individuellen
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Abb. 10: Unterschied PCR und Real-Time PCR: Die
Messung bei der Real-Time PCR erfolgt während des
gesamten DNA-Vervielfältigungsprozesses; die PCR misst
erst am Ende des Vervielfältigungsprozesses.
Abb. 11: Ergebnisdarstellung von meridol Paro Diagnostik
Dr. Pia-Merete
Jervøe-Storm
ist Oberärztin in der Poliklinik für Parodontologie, Zahnerhaltung und Präventive Zahnheilkunde
an der Universität Bonn. Nach Studium und
mehrjähriger parodontologischer Tätigkeit in
Kopenhagen ist die Dänin seit 1989 an der Universität Bonn tätig. Sie beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit mikrobiologischen Diagnostikverfahren in der Parodontitistherapie.
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Proben (Taschen) zeigte, dass in diesen Fällen
(positiver molekularbiologischer und negativer kul3
tureller Nachweis) die Bakterienzahl jeweils 10
oder kleiner war. Es ist davon auszugehen, dass die
Keimmenge unterhalb der Detektionsschwelle der
anaeroben Kultur lag oder aber keine ausreichende
Menge vitaler Bakterien das Kulturlabor erreicht
hatte. Im Gegensatz dazu wurde Prevotella intermedia häufiger kulturell als molekularbiologisch nachgewiesen. Eine mögliche Erklärung ist, dass die
Differenzierung zwischen P. intermedia und
P. nigrescens in der Kultur Schwierigkeiten bereitet
(falschpositive kulturelle Ergebnisse) und der molekularbiologische Nachweis mittels Real-Time PCR
spezifischer ausfällt.
Neben der spezifischen und quantitativen Bestimmung der parodontalpathogenen Markerkeime wird
mit dem neuen Testverfahren zusätzlich die
Gesamtzahl der in der Probe vorhandenen Bakterien
quantifiziert. Die Gesamtkeimzahl stellt eine
Prof. Dr. Dr.
Søren Jepsen, M.S.
ist Direktor der Poliklinik für Parodontologie, Zahnerhaltung und Präventive Zahnheilkunde an der
Universität Bonn. Besonders parodontologische
Fragestellungen interessieren den 45-jährigen
gebürtigen Hamburger, der in den USA sowohl ein
Postgraduierten-Programm Parodontologie (Loma
Linda University, Kalifornien, USA) als auch ein
Post-Doktorat absolviert hat und danach zunächst
an der Universität Kiel tätig war.
Bezugsgröße für die Zahlen der Markerkeime dar.
Dadurch kann die Ergebnisdarstellung nicht nur in
Form von absoluten Zahlen erfolgen, sondern die
Anzahl spezifischer Bakterien kann in ein Verhältnis zur Gesamtkeimzahl gesetzt werden: Es werden
die relativen Anteile der einzelnen parodontalpathogenen Markerkeime an der Gesamtkeimzahl
angegeben.
Damit wird die Probenentnahme, die in der mikrobiologischen Paro-Diagnostik die größte Fehlerquelle darstellt, gewissermaßen standardisiert. Schwankungen, die sich in den absoluten Zahlen bemerkbar machen, werden durch die Verhältnisbildung
neutralisiert.“
Abb. 8: Bei der Zerstörung der TaqMan-Sonde
wird ein Fluoreszenzsignal freigesetzt, das durch
automatische Laserdetektion online gemessen
und aufgezeichnet wird.
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Abb. 9: Das Fluoreszenzsignal bleibt auch nach
Zerstörung der TaqManSonde erhalten.
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Zusammenfassung
Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem
neu entwickelten molekularbiologischen Verfahren offenbar eine sensitive und zugleich sehr
spezifische Methode zur raschen, quantitativen
Erfassung parodontalpathogener Mikroorganismen
in subgingivalen Plaqueproben bei Parodontitispatienten zur Verfügung steht.
Von großem Interesse ist die Möglichkeit, die
gesamte Bakterienzahl in einer Plaqueprobe
bestimmen und somit eine Aussage über den
relativen Anteil spezifischer Bakterien an der
Gesamtkeimzahl machen zu können. Da es
gegenwärtig keine Möglichkeit einer standardisierten Probeentnahme aus der parodontalen
Tasche gibt, wird dies vermutlich einen besseren
Vergleich konsekutiv, d. h. vor, während und
nach der Therapie entnommener Bakterienproben
erlauben. Dies kann uns eine erweiterte Aussage
über die mikrobiologischen Therapieeffekte, beispielsweise im Rahmen einer „Full mouth desinfection“, ermöglichen. (Jepsen, Jervøe-Storm)
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Verschiedene Tests in
der Paro-Diagnostik auf
Basis der PCR-Methode:
IAI Pado Test 4·5,
John O. Butler
microDent,
Hain Lifescience
ParoCheck,
Greiner Bio-One
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