Signal Transduction in Chimeras of the E. coli Chemotaxis

Berichte aus der Pharmazie
Karin Winkler
Signal Transduction in Chimeras of
the E. coli Chemotaxis Receptors and
Bacterial Class III Adenylyl Cyclases
D 21 (Diss. Universität Tübingen)
Shaker Verlag
Aachen 2012
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Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2012
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Signaltransduktion ist ein komplexer Vorgang, den alle lebenden Zellen verwenden,
um die Umwelt zu überwachen und die erforderlichen Maßnahmen zu ergreifen. Den
eigenen Bedürfnissen entsprechend hat jeder Organismus eigene Signalwege mit
speziellen Proteinen und Molekülen entwickelt. In vielen Signalwegen ist cAMP als
sekundärer Botenstoff beteiligt. Die Bildung von cAMP aus ATP wird durch
Adenylatcyclasen (ACs) katalysiert.
In der bakteriellen Signalübertragung ist häufig eine periplasmatische Sensordomäne
an cytoplasmatischen Output gekoppelt. Die E. coli Chemorezeptoren Tsr und Tar
sind Beispiele für vorgeschaltete Empfänger, die nach der Bindung von Liganden
Konformationsänderungen erfahren. Die HAMP Domäne ist ein Signalwandler, der
häufig Sensordomänen mit Outputdomänen verbindet. Sie leitet das Rezeptorsignal
weiter, indem sie selbst ihre Konformation ändert. Die katalytischen Bereiche der
ACs sind den HAMP Domänen meist nachgeschaltet und können das übertragene
Signal aufnehmen und entsprechende Reaktionen durchführen. Es gibt viele
Informationen über Chemotaxis-proteine, HAMP Domänen und ACs. Die S-helix
hingegen, die den C-Terminus der HAMP Domäne mit der AC Outputdomäne
verbindet, wurde bisher noch nicht untersucht.
In E. coli und vielen anderen Bakterien wird fast das gesamte cAMP aus der Zelle
ausgeschleust und taucht im Kulturmedium auf. Die Mechanismen, die Bakterien für
den cAMP Export verwenden, wurden qualitativ mithilfe des MacConkey Plattentests
und quantitativ mit dem ß-Galactosidase Test untersucht.
Zur Untersuchung der bakteriellen Signalübertragung wurden Triple-Chimären
bestehend aus einem Chemorezeptor, einer HAMP Domäne und einer AC
Outputdomäne verwendet. Es wurde in vitro gezeigt, dass AC-Module erfolgreich mit
denen von Chemotaxisproteinen getauscht werden können, d.h. AC Outputdomänen
konnten auf Chemotaxis Rezeptor-signale antworten. Die in vitro Daten wurden
durch in vivo Experimente untermauert.
Die S-helix ist ein konserviertes Motiv in Signalproteinen, das vorgeschaltete
Empfänger mit nachgeschalteten Outputdomänen verbindet. Laut Voraussagen bildet
sie ein zwei-helikales paralleles Coiled-Coil und kommt v.a. in Histidinkinasen, aber
auch in ACs, z.B. in CyaG aus Arthrospira maxima, vor.
Um eine Funktion für die S-helix in CyaG zu ermitteln, wurde in einer Chimäre aus E.
coli Tsr Rezeptor und HAMP und Outputdomäne von CyaG der 25 Reste
umfassende
Bereich
zwischen
HAMP
und
katalytischer
Domäne
entfernt.
Überraschenderweise
wurde
ein
umgekehrtes
Signal
als Antwort
auf
die
Serinbindung beobachtet, d.h. Serin stimulierte nun die AC Aktivität im Gegensatz zu
der Chimäre, die die S-helix enthielt. Biochemische Untersuchungen der S-helix in
CyaG zeigten, dass das Entfernen von einer bis zu drei Heptaden plus einem Stutter,
d.h. 1, 2 oder 3 x 7 + 4 Aminosäuren, nötig und ausreichend ist, um eine
Signalinversion zu erhalten. Es wurde dargelegt, dass für eine Signalumkehr das
Entfernen eines Bereiches bestimmter Länge an der richtigen Position zwingend ist,
das Entfernen an einem Stück jedoch nicht. Die Herausnahme von Heptaden und
Stuttern alleine verhinderte die Regulierbarkeit der Chimären. Die auch in vivo
beobachtete Signalinversion unterstreicht die in vitro Daten. Da nicht nur das
Entfernen, sondern auch das Einführen dieses Bereiches zu einer Signalumkehr
führte, kann davon ausgegangen werden, dass die S-helix als unabhängiges,
strukturelles Modul an der Signalübertragung beteiligt ist.