Genetischer Code

Wiederholung
 Genetischer Code
 Transskription
 Processing
 Translation
1
Transgene Pflanzen
 Gentechnologie; direkte Veränderungen
 Kallus- oder Protoplastenkulturen von Pflanzen
 Einschleusen der DNA
 Regeneration von Pflanzen oder Blütensprossen
Methoden der Biotechnologie
 Biotechnologie = praxisorientierte
Manipulation von Zellen und Organismen mit
wissenschaftlichen Methoden
 Transgene Organismen: Gene (DNA) von
einem Organismus werden auf einen anderen
transformiert: Gentransfer
 Übertragene Gene produzieren die gleichen
Proteine wie im Ursprungsorganismus
Grüne Biotechnologie
 Die Grüne Biotechnologie ist der Zweig der Biotechnologie, der sich
mit den Pflanzen befasst (Pflanzenbiotechnologie)
 Sie bedient sich moderner Methoden der Biochemie,
Systembiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und
Verfahrenstechnik, um Nutzpflanzen zu verbessern, pflanzliche
Inhaltsstoffe (Phytochemikalien, Sekundärmetabolite) oder Fasern
zu gewinnen oder um pflanzliche Enzyme bzw. Wirkprinzipien
(Bionik) für neue Anwendungsbereiche zu erschließen
 Die Übergänge zu den anderen Zweigen der Biotechnologie sind
fließend. So können pflanzliche Zellen oder Enzyme zur Produktion
industrieller Stoffe (weiße Biotechnologie) oder gar von
Medikamenten (rote oder Pharmazeutische Biotechnologie)
genutzt werden
 Und auch zur Entgiftung von Böden (Phytoremediation) oder als
Umweltsensoren sind Pflanzen geeignet, ein Berührungspunkt zur
grauen Biotechnologie (Wasseraufbereitung).
Grüne Gentechnik (Agrogentechnik)
 Die Funktion der meisten Gene in Pflanzen ist unbekannt, daher muss




man, um sie zu erkennen, die Steuerung des Gens modifizieren
Normalerweise werden Effekte von Genen durch einen Vergleich dreier
Pflanzenpopulationen aufzuklären versucht (Wildtyp, Überexpressoren
und „Knock out“-Population).
Hierfür gibt es verschiedene Techniken, wie etwa RNAi (RNA-Interferenz,
RNA Silencing)
Allen Techniken ist gemein, dass sie doppelsträngige RNA produzieren, die
der Pflanze den „Befehl“ gibt, „normale“ Ribonukleinsäure des zu
untersuchenden Gens abzubauen
Außerdem gehören auch deskriptive Techniken zur Standardausrüstung
der gentechnischen Pflanzenforschung

Dabei werden Gene kloniert, dann bestimmt man die Häufigkeiten von Transkripten
(Bauanleitungen für Proteine) oder mittels so genannter DNA-Chips gleich die meisten
Gene einer Pflanze in ihrer Ablesehäufigkeit.
 Der Agrobakterium-vermittelte Gentransfer ist ebenfalls eine wichtige
Technik. Bei dieser gentechnischen Methode werden einzelne Erbfaktoren
von Zellen eines Organismus in Zellen eines anderen Lebewesens
übertragen
RNA Silencing
 Transkriptionelles Gen-Silencing ist ein Resultat von
DNA-Methylierung oder Histonmodifikationen. Durch diese
Modifikationen der Histonenden wird eine Art
heterochromatischer Zustand um das Gen geschaffen, welcher
es der Transkriptions-maschine (RNA-Polymerase,
Transkriptionsfaktoren, etc.) verwehrt, zu binden. Das
klassische Beispiel ist das als Positionseffekt-Variegation
(PEV) bezeichnete Phänomen. Es verändert den Chromatinzustand und kontrolliert somit die Transkriptionsaktivität des
betroffenen Gens oder der Genregion.
 Post-Transkriptionelles Gen-Silencing (PTGS) entsteht
durch den intensivierten Abbau der mRNA eines bestimmten
Gens. Durch den Abbau der mRNA wird die Translation und
somit die Bildung des spezifischen Genproduktes (meist ein
Protein) verhindert. Ein Mechanismus ist der Abbau durch
mehr oder weniger spezifische siRNAs (small interfering
RNA)
RNA Interferenz, RNA Silencing
 Die RNA-Interferenz (kurz RNAi oder auch RNA-
Silencing) ist ein natürlicher Mechanismus in den Zellen
von eukaryotischen Lebewesen, welcher der
zielgerichteten Abschaltung von Genen dient
 Die RNA-Interferenz beruht auf einer Wechselwirkung
kleiner spezialisierter Moleküle der Ribonukleinsäure
(miRNA) mit der Erbinformationübertragenden mRNA
unter Beteiligung mehrerer Enzymkomplexe
 Als Folge wird die mRNA in mehrere Bruchstücke
gespaltet und die zu übertragende Information wird
zerstört oder eine Translation in ein Protein verhindert
Somatische Hybridisierung
 Die somatische Hybridisierung wiederum erlaubt es, gewünschte





Merkmale verschiedener Elternpflanzen zu kombinieren
Im Vergleich zum Agrobakterium-vermittelten Gentransfer müssen
hierbei keine spezifischen Gene identifiziert und isoliert werden
Außerdem wird damit die Einschränkung der Transformation
(Gentransfer) überwunden, nur wenige Gene in einen vorgegebenes
Erbgut einführen zu können
Auch kann bei der Zellfusion die Chromosomenzahl der Zellen
multipliziert werden, also die Anzahl der Chromosomensätze
(Ploidiegrad) erhöht werden
Dies kann die Ertragsfähigkeit von Pflanzen steigern
(Heterosiseffekt)
Molekulare Marker oder biochemische Analysen werden genutzt,
um aus der somatischen Hybridisierung hervorgegangene Pflanzen
zu charakterisieren und zu selektieren.
Rote Biotechnologie
 Rote Biotechnologie, auch medizinische Biotechnologie genannt,






umfasst die Bereiche der Biotechnologie, die medizinische
Anwendungen, insbesondere im Bereich der Gesundheit, zum Ziel
haben. Die Farbe Rot steht für die Farbe des Blutes.
Es soll ein praktischer Nutzen aus den Forschungsergebnissen der
Bio- und Gentechnologie gewonnen werden.
Dazu gehören:
die Entwicklung entsprechender Produkte (Therapeutika,
Diagnostika, Impfstoffe etc.),
die dazu erforderlichen Plattformtechnologien sowie
die Modellorganismen aus dem tierischen Bereich, die zur
Entwicklung neuer Therapeutika benötigt werden und
die Produktion von Wirkstoffen durch genetisch veränderte
Organismen.
Rote Gentechnik
 Eine gentechnische Methode der roten Biotechnologie ist die
Gentherapie. Hier wird davon ausgegangen, dass Krankheiten
durch defekte Gene verursacht werden, die man versucht zu
ersetzen. Bei Ansätzen der in vitro Gentherapie werden dem
Patienten Zellen entnommen, gentechnisch verändert und
dann dem Patienten wieder zugeführt. Bei Ansätzen der in
vivo Gentherapie wird der Patient direkt mit der KorrekturDNA in einem Vektor (z.B. Retroviren) behandelt, die die
DNA mit dem Genom der Zielzellen in Kontakt bringen soll.
 Biotechnologische Medikamente werden durch transgene
Organismen (Mikroorganismen, Nutztiere oder
Pharmapflanzen) hergestellt. Dabei wird iterativ so lange
verändert bis ein Wirkstoff entsteht, der die Krankheit heilen
kann.
Weiße Biotechnologie
 Die Weiße Biotechnologie, auch Industrielle Biotechnologie
genannt, ist der Bereich der Biotechnologie, der
biotechnologische Methoden für industrielle
Produktionsverfahren einsetzt. Dazu werden biologische und
biochemische Kenntnisse und Prozesse durch die
(Bioverfahrenstechnik) in technische Anwendungen
übertragen. Dabei kommen Organismen (zum Beispiel
Bakterien wie Escherichia coli oder Corynebacterium
glutamicum, Hefen, etc.) oder auch Enzyme oder
Enzymsysteme zum Einsatz.
 Durch große Fortschritte in der Entwicklung
biotechnologischer Methoden und Anwendungen hat die
Weiße Biotechnologie in den vergangenen Jahren stark an
Bedeutung gewonnen und wird auch zukünftig als
Wachstumsbranche gesehen.
Weiße Biotechnologie
 Großes Potential wird in diesen Bereichen erwartet:
 Optimierung von Produktionsverfahren, zum Beispiel für
Grund- und Feinchemikalien
 Reduzieren der Rohstoffabhängigkeit, zum Beispiel durch
Nutzung nachwachsender Rohstoffe statt fossiler Rohstoffe
 Reduzierung der Energie- und Entsorgungskosten, zum
Beispiel durch Ersetzen chemischer Verfahren
 Entwicklung neuer Produkte und Systemlösungen mit hohem
Wertschöpfungspotenzial, zum Beispiel durch
Nutzbarmachung von biologischen Stoffwechselwegen mit
gentechnischen Methoden
Weiße Gentechnik
 Durch gelenkte Evolution werden hier Stämme von mutierten
Mikroorganismen erzeugt und aufgrund ihrer Erträge der
gewünschten Produkte, die durch ein Screening festgestellt wurden,
selektiert
 Dieser Vorgang wird in iterativen Zyklen wiederholt, bis die
angestrebten Veränderungen erreicht sind
 Zur Identifizierung von nicht kultivierbaren Organismen untersucht
man Metagenome, d. h. die Gesamtheit der Genome eines
Lebensraums, Biotops oder einer Lebensgemeinschaft (Biozönose).
In Metagenomen können beispielsweise Biokatalysatoren
aufgefunden werden, die bisher noch nicht bekannte biochemische
Reaktionen katalysieren und neue, interessante
Stoffwechselprodukte bilden.
 Zum Einschleusen von Plasmid-DNA in die Bakterie wird u. a. die
Eigenschaft von Calciumchlorid genutzt, Zellmembranen
durchlässig zu machen.
 DNA schneiden
 Einbau in Plasmide (Vektoren) oder Bakteriophagen:
Transformation
 DNA Klonierung: Vermehrung der Bakterien +
Vektoren
 Screening: Bakterien ohne Vektoren erkennen
(Antibioticum/Galaktidodase)
 Zerschneiden DNA an definierten Stellen
 Sticky ends: überhängende Einzelstränge zum
„Kleben“ an DNA
Herstellung rekombinanter
DNA.
Ein Restriktionsenzym heftet sich
an die Erkennungs-stellen der
DNA, die durch eine bestimmte
Nucleotidsequenz
gekennzeichnet sind (im Beispiel
GAATTC oder CTTAAG). Das
Enzym zerschneidet die DNA
zwischen zwei Nucleotiden der
Erkennungsstelle. Wird das
Enzym zum Zerschneiden der
DNA zweier unterschiedlicher
Organismen benutzt, so haben
die resultierenden DNA-Fragmente komplementäre klebrige
Enden. Durch Hinzufügen von
DNA-Ligase verbinden sich die
DNA-Fragmente an ihren
klebrigen Enden dauerhaft.
Wenn Fragmente aus
unterschiedlichen Quellen auf
Diese Weise kombiniert werden,
entsteht als Ergebnis
rekombinante DNA.
 Plasmide und Vektoren sind Vehikel, die die Fremd-
DNA einbringen
 Klonieren: Plasmide in Bakterien
 PCR
 Zur Sequenzbestimmung: viel DNA nötig
 DNA-Abschnitt wird ausgeschnitten (Restriktions



Endonucleasen)
Auf Plasmid übertragen (E. coli), z.B.
R-Plasmid
Bakterien + Antibiotikum
Wird durch Bakterien repliziert, die Plasmid
haben
Plasmide werden isoliert, klonierte DNA
herausgeschnitten
 MULLIS und FALOONA 1983
 Starke Vervielfältigung eines DNA-Abschnittes
 Primer: kurzer DNA Abschnitt, komplementär zum
Gewünschten
 „Aufschmelzen“ durch Hitze
 Hitzebeständige DNA-Polymerase
 Ti-Plasmide
 Genkanonen
 Mikroinjektion
 Liposomen
 Elektroporation
Zwei alternative Methoden zur Übertragung eines fremden Gens in eine Pflanzenzelle. (a) Mit einer
Genkanone werden DNA-beschichtete Partikel auf Pflanzenzellen geschossen. (b) Mit einer feinen Nadel werden
Gene direkt in das Cytoplasma eines Protoplasten injiziert, der mithilfe einer Mikropipette stabilisiert wird. Bei
beiden Methoden gelangen einige der ins Cytoplasma eindringenden Gene in den Zellkern und können in die
Chromosomen eingebaut werden.
 Unbegrenztes Wachstum, Entdifferenzierung,




Polaritätsverlust, Irreversibel, transplantierbar
Agrobacterium tumefaciens
Bakterienfreie Tumoren
Haben Plasmide: Ti (tumor inducing) -Plasmide
t-DNA (transferred DNA) Abschnitt wird in die
pflanzliche Zellkern-DNA integriert
 Hierbei werden die Zellen des zu transformierenden
Gewebes zuerst durch Pektinasen vereinzelt (siehe
Protoplastenkultur) und anschließend durch Zellulasen die
Zellwände aufgelöst (Protoplastenisolation). So erhält man
nur noch durch die Zellmembran zusammengehaltene
Protoplasten
 Für den eigentlichen Gentransfer wird diesen Protoplasten
entweder Polyethylenglykol hinzugefügt oder es erfolgt ein
kurzer Stromstoß (Elektroporation), wodurch die
Membran durchlässig für die DNA wird. Die Methode ist
zwar bei allen Pflanzen anwendbar, allerdings ist es äußerst
schwierig, anschließend aus den Protoplasten wieder
Pflanzen zu regenerieren
Gewebekultur. Vollständige Pflanzen
oder Pflanzenorgane wie Sprosse oder
Wurzeln können auf einem künstlichen
Medium, das Nährstoffe und Hormone
enthält, aus isolierten Zellen oder
Geweben gezogen werden.
Wildkraut, Kohlgewächse (Brasicacae)
ca. 30 cm, 10.000 Pflanzen / m2
6 Wochen: Samenreife
Zwittrige Blüten, Selbstbestäubung, 30 bis 50 Samen
pro Blüte, mehrere 1.000 pro Pflanze
 5 Chromosomen (haploid)
 Genom = klein, wenig disperse repetitive DNA




 Jahr 2000: Gesamtsequenz des Genoms
 125 Mb DNA, kodieren für 25 000 Proteine; ca. 100 Mb
proteincodierend; daher pro Protein durchschnittlich
4 kb
 250 Mbit = ca. 31,3 MB Information bzw. 25 MB für
Proteine; ca. 1 kB für 1 Protein
 Chemische Methode
 Basenspezifische Spaltung denaturierter EinzelstrangDNA durch Chemikalien
 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
 Enzymatische Methode
 Einbau in Bakteriophagen-Einzelstrang
 Hybridisierung mit einer synthetischen DNA
 Desoxynucleoside3P + DNA-Polymerase - Lösung
 Veränderte Nucleoside (Didesoxy), Synthese wird
abgebrochen
 Gelelektrophorese
 DNA-Microarrays
 Die DNA-Chip-Technologie nutzt Techniken aus der
Halbleiterfertigung, um bekannte Gene auf einem
fingernagelgroßen Plastik- oder Glasplättchen, dem
Microarray, zu identifizieren und deren Aktivität zu
messen
DNA-Bruchstücke auf Glasplatte
Isolation von m-RNA
Inverse Transskriptase cDNA, cDNA +
Fluoreszenzfarbstoff
4. cDNA + Fluoreszenzfarbstoff + Microarray
5. Gepaarte DNA (ungepaarte wird
abgewaschen)
1.
2.
3.
 Zerschneiden mit Restriktionsenzymen
 Auftrennen durch Gelelektrophorese gemäß der




Länge der Fragmente
(RFLP = RestriktionsfragmentlängenPolymorphismus
Färben
Übertragen vom Gel auf Zellulose
Sonden
Detektion