Immunohistochemie, Immunozytochemie Immunglobulindetektion
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Immunohistochemie, Immunozytochemie Immunglobulindetektion Institut für Immunologie und Biotechnologie Universität Pécs, Medizinische Fakultät Die Immunhistologie • Methode der modernen histopathologischen Diagnostik und Forschung. • Antigene in Zellen und Gewebeschnitten im mikroskopischen Bild nachzuweisen. Direkte Immunohistochemie Immunglobulindetektion in der Mäusemilz 1. Die Milz-Gefrierschnitte der Maus werden in Aceton fixiert 2. Die endogene Peroxidaseaktivität soll mit Phenyl-hydrasine (in PBS) für 10 Min. gehemmt werden 3. Zweimal waschen mit PBS 4. Die nicht-spezifische Proteinbindung wird (mit 5 % BSA in PBS) geblockt 5. Inkubation mit Peroxidasekonjugiertem-anti-Maus-Ig- Antikörper für 45-60 Min. 6. Dreimal waschen mit PBS (je 5 Min.) 7. Entwicklung mit der Substratlösung (Amino-Ethyl Karbazol (AEC) + H2O2 in 0.1 M Na-Acetate-Puffer (pH 5.2) 8. Die Auswertung wird unter dem Lichtmikroskop gemacht Die Gewebefixierung • Unfixierte Gefrierschnitte Æ Fixierung mit Aceton (PFA) • Das Standardverfahren ist das formalinfixierte und in Paraffin eingebettete GewebeÆ Proteinkreuzbindung Æ Maskierung oder Zerstörung der Antigenstrukturen ÆAndauen der Schnitte mit Pronase E (Protease) Spezifische- und nicht-spezifische Interaktionen zwischen den Geweben und den Antikörpern Nicht-spezifische Ag-Ak Bindung Spezifische AgAk Bindung ++++ Ionische- O=CH S S Aldehyd- Hydrophobische- Sulfid- Fc-Rezeptor Substanzen der Markierung • Sichtbarmachung von gewebegebundenen Antigen-Antikörperkomplexen • • • • Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome), Enzyme, partikuläres Material (z.B. Goldpartikel) radioaktive Isotopen Doppelfärbung, Multiple Markierung HRPOKonjugierung Ag 1 (Strept)avidin-Biotin AP-Komplex Ag 2 Die häufig gebrauchten Enzym-Substrat Systeme Peroxidase (HRPO) DAB – Diaminobenzidin (braun) AEC – Amino-Ethyl-Karbazol (rot) True Blue (blau) Alkalische Phosphatase (ALP) NBT – Nitroblue Tetrasolium (blau) BCIP – Bromo-Chloro-Indoyl Phosphate (blau) Es wird ein farbloses Chromogen in ein farbiges Enzymprodukt umgewandelt Substratsysteme Lymphknotenschnitte mit Immunhistochemie Lymphknoten: B-Zellen Markiert mit anti-CD20, (Immunoperoxidase Färbung: AEC) Lymphknoten: T-Zellen Markiert mit anti-CD45-RO, (Immunoperoxidase Färbung: AEC) Pankreas-Schnitte mit Immunohistochemie Pankreas (Bauchspeicheldrüse), Pankreas, Anti-Insulin Anti-Glukagon Fluoreszenzfarbstoffe Immunfluoreszenz CD4+ T-Lymphozyten Thymus einer transgenen Maus Anti-CD8Ærot, anti-CD4Æ grün TubulinÆgrün Actin Ærot Nukleus Æblau Endothel Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Konventionelles Fluoreszenzmikroskopisches Bild, Anti-Tubulin, mitotische Zelle Konfokalmikroskopisches Bild Konfokalmikroskopische Bilder Das Kleinhirn einer Ratte HeLa-Zellen Herzmuskel
