Wachstumsvoraussetzungen für strikte Anaerobier
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Versuch 4 Verfasser: Assistentin: Protokoll der Donnerstags-Gruppe B Michael Schmitz Christine Lehmann Wachstumsvoraussetzungen für strikte Anaerobier Einleitung In diesem Versuch geht es um die Züchtung bzw. den Nachweis von strikt anaeroben Bakterien in einem Agarshake. Unter strikt anaeroben Bakterien versteht man Mikroorganismen, welche in Anwesenheit von O2 nicht überleben können. Methode • Zuerst stellten wir ein komplexes Nährmedium folgender Zusammensetzung her: Fleischextrakt, Pepton (hydrolisierte Peptide als C- und N-Quellen), Hefe, NaCl Reduktionsmittel (Natriumthioglykolat) → O2 wird reduziert, Red.mittel oxidiert Redoxindikator (Resazurin) → bei O2 -Anwesenheit rosa, unter anoxischen Bedingungen farblos. Das Nährmedium wurde autoklaviert. • Herstellen der Agarshakes Wir füllten aseptisch je 5.4 ml des Nährmediums in 6 RG ab. Das erste RG wurde mit 0.6 ml Inoculum (in unserem Experiment ein Kompostaufguss aus dem Botanischen Garten) beimpft. Von diesem RG aus wurde eine Verdünnungsreihe mit dem Faktor 10 hergestellt, wobei das 6. RG nicht beimpft wurde und als Referenz diente. Jedem RG wurden noch 3 ml einer 2.4 %-igen Agarlösung beigefügt, die in einem warmen Wasserbad flüssig gehalten wurde, sowie 9 µl Resazurinlösung. Jedes RG wurde gut gemischt und mit einem Gummistopfen verschlossen. Sobald sich das Medium verfestigt hatte, wurden die RG bei 32°C in einem Wärmeschrank während einer Woche inkubiert. Ergebnisse • In den Agarshakes sind die wachsenden Bakterienkolonien als weisse Punkte (bis zu 2 mm Durchmesser) gut sichtbar. Diese Kolonien können mit einer Pasteurpipette ‚gepickt‘ und unter dem Mikroskop angeschaut oder auf spezifischeren Medien weiter kultiviert werden. • In allen RG (ausser Referenz) sind Bakterien gewachsen. In den entfärbten Bereichen hat es anaerobe Bakterien. In den rosa Bereichen (teilweise am oberen Rand) sind aerobe Bakterien vorhanden. Blasen im RG weisen auf Gasentwicklung hin, wobei es sich sehr wahrscheinlich um CO2 handelt. • Ein Vorteil von Agarshakes ist, dass Sauerstoff in diesem halbfesten Medium schlecht nachdiffundieren kann. • Wir haben verschiedene weitere Strategien und Techniken (Anaerobenkammer, Anaerobentöpfe etc.) kennengelernt, um Wachstumsvoraussetzungen für anaerobe Bakterien zu schaffen oder mit anaeroben Bakterien zu arbeiten (siehe Experimentieranleitung).
