Die Optische Pinzette

Die Optische Pinzette
Lehrstuhl für Physikalisch-Medizinische Technik
LPMT
Friedrich Alexander Universität Erlangen
Betreuer: Lena Lautscham
Titelbild angelehnt an [Padgett and Bowman (2011)], [Ashkin (1978)]
Table of Contents
Inhaltsverzeichnis
Table of Contents
i
1 Einleitung
1.1 Vorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1
2 Theorie der optischen Falle
2.1 Fallenkräfte . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.1 Rayleigh Regime d << λ . . . . . . .
2.1.2 Geometrische-/Strahlenoptik oder Mie
2.1.3 Intermediate Regime d ≈ λ . . . . . .
3
3
4
5
7
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Regime d >> λ
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3 Kraftmessung und Kalibration
3.1 Positions- und Kraftbestimmung mittels CCD-Kamera . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Theorie der Kraftbestimmung mit Hilfe der Brown’schen Molekularbewegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 Überführen der gemessenen Spektren in physikalische Einheiten . . . . . .
11
13
4 Aufbau
15
5 Durchführung
5.1 Montage und Justage der Komponenten . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Durchlichtstrahlengang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Fallenstrahlengang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Justieren der Quadrantenfotodiode . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Beadlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1 Maximale Fallenkraft für beide Beadgrößen bestimmen . . . . .
5.3.2 Laser Intensität variieren und Fallenkraft bestimmen . . . . . .
5.3.3 Bestimmung der Minimalkraft, bei der ein Bead gefangen wird
6 Auswertung
6.1 Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.1 Maximale Fallenkraft . . . . . . . . . . . . .
6.1.2 Fallenkraft in Abhängigkeit der Laserleistung.
6.1.3 Minimale Fallenkraft um Bead zu halten . . .
6.2 Anwendung der optischen Pinzette . . . . . . . . . .
Bibliography
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9
9
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19
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21
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22
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22
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23
i
1 Einleitung
Arthur Ashkin entdeckte 1970, dass kleine Partikel und Atome in einem stabilen optischen Potential, welche durch den Strahlungsdruck von Laser Licht geformt werden, gefangen werden
können [Ashkin (1970)]. Der erste Aufbau, der diesen Effekt nutzte (gebaut von Joe Dziedzic
und Arthur Ashkin), bestand aus zwei sich gegenüber stehenden fokussierten Laserstrahlen,
die das Teilchen zwischen sich einfingen. Der höhere Strahlendruck im Strahlfokus drückte das
Teilchen auf den zweiten Laser zu und fing es somit in der Gleichgewichtsposition. Von diesem
Aufbau lernten Sie, dass das Teilchen nicht nur zwischen den Lasern, sondern auch senkrecht
zu diesen gefangen war. Sie fanden heraus, dass es nicht nur die Steukraft gibt, die das Teilchen
vom Laser weg beschleunigt, sondern auch noch eine senkrecht dazu wirkende Gradientenkraft,
die aufgrund eines axialen Intensitätsgradienten auftritt. Mit dieser Kenntnis konnten sie 1985
Laserfallen mit nur einem fokussierten Laserstrahl aufbauen [Ashkin et al. (1986)].
Die optische Pinzette ist heutzutage ein wichtiges Instrument in der Biologie und der Medizinischen Physik. Sie erlaubt berührungsloses Festhalten von Partikeln und ermöglicht Kraftund Materialmessungen an lebenden Zellen, Makromolekülen, Kraftmessungen im Vakuum und
vieles mehr. Hier kommen häufig sogenannte Mikrosphären oder Beads zum Einsatz. Dies sind
kleine Kugeln aus unterschiedlichen Materialien, wie Glas, Latex oder Polystyrol. Diese Beads
sind in unterschiedlichen Größen erhältlich, gängigerweise werden Größen von einigen 100nm
verwendet. Die Sphären sind teilweise mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen und können, z.B.
mit Proteinen, beschichtet werden. Diese Beschichtungen erlauben es, die Kugeln wiederum an
andere Proteine oder auch an Zellen anhaften zu lassen. Anschließend kann durch die optische
Falle eine Kraft auf die Sphäre und damit auf die Zelle bzw. das Protein ausgeübt werden. Des
Weiteren kann die Position des Beads über spezielle Detektionsmethoden, z.B. Quadrantenphotodioden mit einer nm-Präzision und einer zeitlichen Auflösung im µs-Bereich gemessen werden.
Damit ist die Positionsgenauigkeit ca. um einen Faktor 100 höher als die optische Auflösung eines
Lichtmikroskops. Die zeitliche Auflösung ist sogar um einen Faktor 102 − 103 höher als gängige
Kameras dies erlauben. Gute Einführungen in das Thema der optischen Pinzette findet man
in [Neuman and Block (2004), Svoboda and Block (1994)]
1.1 Vorbereitung
Zur Vorbereitung beschäftigen Sie sich bitte mit den folgenden Fragen, die größtenteils in dieser
Versuchsanleitung behandelt werden, die Sie lesen sollten.
• Welchen Impuls und Energie haben Photonen?
• Wie und nach welchen Formeln erfolgt der Impulsübertrag bei Stößen mit verschiedenen
Oberflächen?
• Worin unterscheiden sich die Regime, mit denen die Fallenkraft erklärt wird. Warum unterscheidet man verschiedene Regime?
• Mit Hilfe der Formel 2.4 berechnen Sie für ein Experiment an einem Teilchen mit Durchmesser 4µm und einem Laser der Wellenlänge λ= 1064nm den Gütefaktor des Rayleigh
λ
Regimes Q, wobei ω0 = π·N
A ist. Wie kann es sein, dass man auch Teilchen fangen kann,
für die der Gütefaktor kleiner als 1 ist?
• Was ist wichtig um eine Laserfalle zu bauen?
1
1.1 Vorbereitung
• Machen Sie sich mit den verschiedenen Bauteilen der Falle vertraut (zB. was ist und wie
funktioniert ein Dichroid?)
• Mit der Falle unterbindet man die Brown’sche Molekularbewegung. Berechnen Sie für drei
Medien mit Viskositäten η von 1mPa s, 10 mPa s und 40mPa s, wie weit sich ein Teilchen
mit einem Radius von 1 bzw- 4 µm innerhalb 1 Sekunde, 1 Minute und 1 Stunde bei 22◦ C
bewegt. Wie groß ist die mittlere Geschwindigkeit dieser Teilchen und somit ihre kinetische
Energie?
• Welche Methoden der Kraftkalibration gibt es für Laserfallen? Und wie funktioniert eine
Quadrantenfotodiode?
2
2 Theorie der optischen Falle
2.1 Fallenkräfte
Seit Kepler wird Licht ein Impuls zugeordnet. Maxwell postulierte 1873, dass elektromagnetische Wellen (EM-Wellen) einen Strahlungsdruck auf Materie ausüben und von Einstein und
Planck haben wir um 1900 gelernt, dass Licht Teilchen Eigenschaften besitzt. Diese Licht Quanten bezeichnet man als Photonen. Sie tragen den Impuls pabs = Ec = λh , wobei E die Energie,
c die Lichtgeschwindigkeit, h die Planckkonstante
und λ die Wellenlänge ist. Da die Kraft (F )
d~
p
~
als Impulsänderung definiert ist F = dt , übt die EM-Welle durch Absorption oder Reflektion eine Kraft aus (die Streukraft). Ausgedrückt als Kraft pro Fläche nennt man diese auch
Strahlungsdruck. Für Objekte mit makroskopischen Dimensionen ist der Strahlungsdruck von
’normalen’, nicht koherenten Lichtquellen zu gering, um einen messbaren Effekt zu zeigen, aber
für mikroskopische Objekte (< 100µm) zeigen sich zu berücksichtigende Effekte. Diese Effekte
werden durch den hohen Grad an räumlicher Kohärenz und spektralen Reinheit von Laserlicht
verstärkt und resultieren in starken optischen Kräften [Ashkin (1980)].
Optische Streukräfte werden allgemein definiert als
Qnm P~
F~Streu =
c
(2.1)
mit dem dimensionslosen Faktor Q , der den Anteil der Energie beschreibt, die genutzt wird um
Kraft zu erzeugen(Q=1 für eine ebene Welle die auf ein perfekt absorbierendes Teilchen trifft),
nm ist der Brechungsindex des Suspensionsmediums (für biologische Proben in wässriger Lösung
nm ≈ 1, 33 @ 20◦ C), c die Lichtgeschwindigkeit und P~ die einfallende Laserleistung.
Da P~ nur über eine limitierten Bereich verändert werden kann, bestimmt Q die Fallenkraft,
welche von der numerischen Apertur (NA=nm sin α, α dem Halbenwinkel des maximalen Licht
Kegels), der Wellenlänge, dem Polarisierungszustand,der Laser-Moden-Struktur, dem relativen
Brechungsindex und der Teilchengeometrie abhängt. Optische Kräfte reagieren sensibel auf kleine Störungen der Geometrie und können deshalb nicht durch eine exakte Beziehung beschrieben
werden, sondern nur durch theoretische Modelle. In Abhängigkeit des Verhältnisses von der Laserwellenlänge λ und dem Durchmesser d des gefangenen Objekts betrachtet man unterschiedliche Modell-Regime, um die Kräfte zu beschreiben, die auf das gefangenen Teilchen wirken.
Während die Streukraft in allen Regimen gleich erklärt wird, wird die Gradientenkraft in den
verschiedenen Regimen durch unterschiedliche physikalische Effekte und somit mit unterschiedlichen Konzepten erklärt.
Man unterscheidet die folgenden drei Regime:
• Rayleigh-Regime (d << λ) Der Teilchendurchmesser ist sehr klein gegen die Wellenlänge. In diesem Fall idealisiert man das Teilchen als Dipol und verwendet die elektromagnetische Theorie des Lichtes zur Beschreibung der Kräfte.
• Übergangs-Regime (d ≈ λ) Der Teilchendurchmesser und die Wellenlänge des Lasers sind ungefähr gleich groß. Die theoretische Beschreibung ist kompliziert und es gibt
verschiedene Ansätze. Es ist jedoch der Fall, der am häufigsten genutzt wird, da so die
Fallenkräfte maximal sind.
• Strahlenoptik oder Mie-Regime (d >> λ) Der Teilchendurchmesser ist sehr viel größer
als die Wellenlänge des Laser. In diesem Fall werden die wirkenden Kräfte durch Strahlenoptik beschrieben.
3
2.1 Fallenkräfte
Im folgendem werden alle drei Regime kurz beschrieben.
2.1.1 Rayleigh Regime d << λ
In diesem Regime werden die optischen Kräfte, die auf Teilchen wirken, die kleiner als die
Wellenlänge des Lasers sind, beschrieben. Es hat deshalb Relevanz beim Fangen von Atomen
oder Molekülen und wird hier kurz erläutert. In diesem Regime wird die elektromagnetische
Wellentheorie des Lichtes benutzt und die Teilchen als, durch den elektrischen Feld Vektor
des Laserbeams induzierte, Dipole behandelt. Da das Teilchens sehr viel kleiner ist als die
Wellenlänge nehmen wir das elektrische Feld am Teilchen als homogen an. Im Rayleigh Regime
wird die Fallenkraft in Streu- und Gradientenkraft aufgeteilt. Die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen
zwischen Strahl und Teilchen erklären das Zustandekommen der Gradientenkraft.
α D ~ 2E
F~Grad = ∇ E
.
(2.2)
2
Die Gradientenkraft ist die Lorentzkraft, die auf das vom Licht induzierte Dipolmoment des Teilchens wirkt. Sie wirkt parallel zum Gradienten bzw. in Richtung der Energiedichte, d.h. entgegen
dem einfallenden Licht. DieDGradientenkraft
hängt also vom Gradienten des mittleren
E
2 quadram −1
2
2
3
~
tischen elektrischen Feldes E und der Polarisierbarkeit des Teilchens α = nm r m
mit
2 +2
nS
Radius r, Brechungsindex nS des Teilchens (angenommen als Sphäre) und m = nm , ab.
~=E
~ ×B
~ (sein Betrag
Die Streukraft hängt vom zeitlichen Mittelwert des Poynting-Vektors
S
h
i
beschreibt die Intensität der Lichtwelle und hat die Einheit Zeit Energie
und Fläche und dem Streuquerschnitt einer Kugel σ ab.
D E
~ σ
S
~
FStreu = nm
,
(2.3)
c
2 2
m −1
Der Wirkungsquerschnitt einer Kugel ist gegeben als: σ = 83 π(kr)4 r2 m
und hängt vom
2 +2
S
Radius r, dem Brechungsindex nS des Teilchens, dem Wellenvektor k = 2πnm /λ mit m = nnm
,
dem relativen Brechungsindex des Teilchen nS und des umgebenden Mediums nm ab.
Die Streukraft wirkt in Richtung der Lichtausbreitung.
Die Kräfte fasste Ashkin zu einem Gütefaktor Q zusammen, der die axiale Stabilität der Falle
πω 2
beschreibt. Für eine axiale Position z = √3λ0 , bei der die Streukraft größer ist als die axiale
Gradientenkraft, ergibt sich:
√
Fgrad
λ5
3 3 n2m
Qrel :=
=
,
(2.4)
Fstreu
64π 5 ( m22 −1 ) r3 ω02
m +2
wobei ω0 = πNλ A der Durchmesser des gaussischen Laser-Intensität-Profils in der T EM00 Mode
ist (bitte informieren was diese Mode bedeutet). Damit man eine stabile Falle hat, muss Q > 1
sein an der Stelle des maximalen Intensitätsgradientens, d.h. dieser muss hier größer als die
Streukraft sein. Die Gradientenkraft kann durch eine größere Numerische Apertur (N A) vergrößert werden, welche die Größe des Laserfokusses verringert. Mit höheren Streukräften Fstreu
verschiebt sich die Gleichgewichts-Fallenposition den Laserstrahl hinab. Da Q mit 1/r3 abfällt,
ist die Falle stabiler für kleinere Teilchen. Die Einzelstrahlgradientenlaserfallen, die als “optical
tweezers” bezeichnet werden, wurden ursprünglich für Rayleighteilchen entwickelt [Ashkin et al.
(1986)].
4
2.1.2 Geometrische-/Strahlenoptik oder Mie Regime d >> λ
2.1.2 Geometrische-/Strahlenoptik oder Mie Regime d >> λ
Die optischen Kräfte für Teilchen mit Durchmesser größer als die Laserwellenlänge werden durch
geometrische Optik beschrieben. In der geometrischen Optik wird der Lichtstrahl in individuelle
Strahlen mit passender Intensität, Richtung und Polarisation aufgeteilt. Die Strahlen propagieren in einem homogenen Medium linear und können ihre Richtung durch Reflektion oder
Brechung ändern, sowie ihre Polarisation an dielektrischen Oberfläche den Gesetzen der Fresnel
Formel folgend ändern (Fresnel Formel Seite 485ff in [Hecht (2002)]). Beugungseffekte werden in
diesem Regime vernachlässigt, da man annimmt, dass alle Strahlen eines Lichbündels auf genau
einen Punkt fokusiert werden. Beim Brechen und Reflektieren an einem Teilchen ändert sich
der Impuls des Strahls und eine Kraft wirkt auf das Teilchen. Diese Kraft ist schematisch in 2.1
dargestellt.
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Kräfte Fa und Fb , die sich durch Brechung von
einem Strahlenpaar a und b an einer Sphäre ergeben. Richtung und Stärke der
Kräfte sowie ihre Summe hängen von der Position der Sphäre im Laserstrahl ab.
Eine axiale und transverse Verschiebungen des Teilchens aus dem Fallenfokus f
gleichen sie somit aus, wie man in (a) Sphäre unter dem Fokus, (b) Sphäre über
dem Fokus und (c) Sphäre rechts vom Fokus, sieht. [Ashkin (1992)].
Auch in diesem Regime ist die optische Kraft wieder aufgeteilt in Streu- und Gradientenkraft.
Die Streukraft wirkt in Richtung des einfallenden Lichtes und entsteht hauptsächlich durch
Reflektion an den Oberflächen des Teilchens (äußere Oberflächen und innere Oberflächen, wenn
das Licht das Teilchen verlässt), die eine Impulsänderung entgegen des einfallenden Lichtes,
bewirkt.
Die Gradientenkraft wirkt in Richtung des Intensitätsmaximums und somit mit oder entgegen
der Streukraft.
Die Gesamtkraft, die auf das Teilchen wirkt, ist die Vektorsumme der Impulsänderungen/ Kräfte
aller Lichtstrahlen. Reflektierte Strahlen tragen mit der Impulsänderung P R bei und die unendliche Anzahl gebrochener Strahlen mit abnehmenden Kräften P T 2 , P T 2 R,... (siehe Bild 2.2).
Das Verhältnis zwischen Reflektion (R) und Transmission (T) ist für nicht magnetische Materialien durch die Fresnel Formeln in Abhängigkeit von der Polarisation (parallel oder senkrecht
zur Oberfläche) gegeben, als:
R⊥ :=
reflected power
nm cos(Θi ) − nS cos(Θt )
nm − nS
=
=
irradiation power
nm cos(Θi ) + nS cos(Θt )
nm + nS
nS cos(Θi ) − nm (Θt )
R|| : =
nS cos(Θt ) + nm cos(Θi )
(2.5)
(2.6)
5
2.1 Fallenkräfte
T⊥ :=
transmitted power
2nm cos(Θi )
nm
=
=
irradiation power
nm cos(Θt ) + nS cos(Θi )
nm + nS
2nm cos(Θi )
T|| : =
nS cos(Θi ) + nm cos(Θt )
(2.7)
(2.8)
wobei der Einfallswinkel Θi und Reflektionswinkel Θr gleich groß sind und nm sin(Θi ) = nS sin(Θt )
(Snellius’sches Brechungsgesetz), wobei Θt der Brechungswinkel zum Lot hin beim Übergang von
nm nach nS ist.
Die Strahlenergie nimmt mit jeder Reflektion j ∈ N oder Transmission k mit einem Faktor der
durch die Fresnel Koeffizienten Rk und T j gegeben ist, ab. Für die Strahlen mit Energien P R,
P T 2 ,... erhält man verschiedene Winkel (π +2Θi , α,...) zum einfallenden Strahl (siehe Abbildung
2.2).
Abbildung 2.2: Geometrien und Intensitäten des gebrochenen und mehrfach reflektierten Strahls
in einer Kugel [Ashkin (1992)].
Mit dem einfallenden Impuls pro Zeit F =
und die Gradientenkraft in y-Richtung:
F|| = Fstreu
F⊥ = Fgrad
nm P
c
ergeben sich für die Streukraft in z-Richtung


∞
X
nm P 
=
1 + R cos(2Θi ) −
T 2 Rj cos(α + jβ) ,
c
j=0


∞
X
nm P 
=
R sin(2Θi ) −
T 2 Rj sin(α + jβ) .
c
(2.9)
(2.10)
j=0
dabei bezeichnet F|| den Kraftanteil in Richtung des einfallenden Strahls und F⊥ den senkrechten
Anteil, wodurch sich die Cosinus- bzw. Sinusterme ergeben. Der Anfangsimpuls in z- Richtung
wird durch den Term +1“in der Streukraft ausgedrückt. Addiert man die Kräfte im komplexen
”
Raum (Fstreu + iFgrad ), kann man die Kräfte weiterhin unterscheiden und die Formel mit Hilfe
der geometrischen Reihe vereinfachen:
T
2
∞
X
j=0
Rj exp(i(α + jβ))
geometrische Reihe
=
T2
exp(iα) + Rexp(2iΘi )
exp(iα)
= T2
, (2.11)
1 − R exp(iβ)
1 + cos(2Θt ) + R2
wobei die Relationen α = 2(Θi − Θt ) und β = π − 2Θt eingesetzt wurden, die man mit etwas
6
2.1.3 Intermediate Regime d ≈ λ
Überlegung aus 2.2 konstruieren kann.
Diese Formeln sind keine Näherung, sondern exakt, da man mit der geometrischen Reihe alle
Strahlen addiert hat. Teilt man die beiden Kraftkomponenten nun wieder auf erhält man:
cos(2(Θi − Θt )) + R cos(2Θi )
nm P
1 + R cos(2Θi ) − T 2
,
(2.12)
Fstreu =
c
1 + R2 + 2R cos(2Θt )
nm P
2 sin(2(Θi − Θt )) + R sin(2Θi )
Fgrad =
R sin(2Θi ) − T
.
(2.13)
c
1 + R2 + 2R cos(2Θt )
Da die Falle dreidimensional ist, treffen die Strahlen die Sphäre unter verschiedenen Winkeln
Θi . Damit ein Teilchen stabil gefangen wird, muss die Gradientenkraft größer als die Streukraft
sein.
Aus Einfachheitsgründen werden diese Kräfte oft mit Hilfe eines Qualitätsfaktor analog zum
Raleigh Regime beschrieben,
c
Q=F
.
(2.14)
nm P
Ashkin hat diesen für eine Vielzahl von Strahlprofilen und Polarisationen berechnet (siehe Abbildung 2.1.2).
Abbildung 2.3: Werte des Qualitätsfaktors für die Streukraft QS , die Gradientenkraft Qg und die
Größe der Gesamtkraft Qmag : (a) für einen einzelnen Strahl, der eine dielektrische
Sphäre mit Brechungsindex n = 1.2 unter einem Winkel von Θ trifft [Ashkin
(1992)].
Aus Abbildung 2.1.2 sehen wir, dass die Gradientenkraft bei circa 70 ◦ maximal ist. Um hohe
Einfallswinkel zu erhalten, nutzt man Objektive mit hoher Numerischen Apertur, zum Bau von
optischen Fallen. Die Fallenkraft kann weiter vergrößert werden, indem man die hintere Objektivöffnung leicht überfüllt, d.h. den Strahlradius weiter aufweitet als die Öffnung groß ist. Dieses
Überfüllen vergrößert das Verhältnis von Gradienten zu Streukraft, da die äußeren/extremalen
Strahlen überproportional zur axialen Gradientenkraft beitragen. Deshalb wird der Strahl so
aufgeweitet, dass die 1/e2 Intensitätspunkte des gaussverteilten Lasers zur Objektivapertur passen, wodurch mehr Intensität in den extremalen Strahlen ist und außerdem ungefähr 87% des
einfallenden Lasers in das Objektiv fallen lässt [Neuman and Block (2004)].
2.1.3 Intermediate Regime d ≈ λ
Das Intermediate Regime ist das passenste und somit relevanteste Regime für das Fangen von
Beads mit einem ungefähren Durchmesser von 1µm, welche für Cell-rheology und biologische
Proben, die mit Infrarot Lasern ( 1064nm) untersucht werden, häufig zum Einsatz kommen. Für
Teilchen dieser Größe muss man Beugungsphänomene berücksichtigen und für stark fokussierte
Strahlen kann man den Vektorcharakter der Strahlen nicht vernachlässigen, was in paraxialen
7
2.1 Fallenkräfte
Näherungen gemacht wird. Deshalb muss man hier Berechnungen mit einem rigeroseren Ansatz
für die Randbedingungen benutzen. Das macht die Berechnung der Kräfte kompliziert. Einen
Lösungsansatz dafür kann man z.B. in [Svoboda and Block (1994)] finden.
8
3 Kraftmessung und Kalibration
Die Fähigkeit, Kräfte ohne direkte Berührung auf eingefangene Objekte ausüben zu können,
macht eine optische Pinzette interessant für unterschiedlichste biologische Versuche. Bei vielen
Experimenten möchte man die auf die Objekte wirkenden Kräfte bzw. die Position der Objekte
messen. Dazu ist es nötig, die Auslenkung der Sphäre aus der Ruhelage im Zentrum der Falle
zu bestimmen. Es sind verschiedene Verfahren vorstellbar, wie diese Größen gemessen werden
können. Die Position/Auslenkung des Objekts kann genutzt werden, um die Kraft der Falle
und/oder Kräfte, die auf das Teilchen ausgeübt werden, zu ermitteln. Um eine effektive Kraft zu
erhalten, ist es nötig, dass man die gemessene Auslenkung mit einer bekannten Kraft kalibriert.
Fallentheorien sind nicht in der Lage, die Fallenkraft akkurat für ein bestimmtes Objekt und
eine bestimmte Fallengeometrie auszurechnen, deshalb müssen wir diese empirisch mit Hilfe von
Kalibrationsmessungen bestimmen.
3.1 Positions- und Kraftbestimmung mittels CCD-Kamera
Es ist möglich, Bilder der gefangenen Sphäre mit der Kamera aufzunehmen. Mit einem Algorithmus zur Bestimmung des Schwerpunktes der Sphäre lässt sich deren Position mit einer hohen
Genauigkeit bestimmen. Bei Kenntnis von Pixelgröße und der optischen Vergrößerung des abbildenden Systems ist eine Berechnung der Entfernung von Objektpositionen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten möglich. Diese Methode weist jedoch einige Schwächen auf. Die offensichtlichste ist
die begrenzte zeitliche Auflösung der Kamera. Bewegungen, die hochfrequenter als die maximale
Bildfrequenz der Kamera sind, lassen sich mit dieser Methode nicht detektieren. Des Weiteren
besteht keine Möglichkeit, den Ursprung der Falle direkt zu bestimmen. Es ist zwar möglich,
den Ursprung durch den Schwerpunkt aller Objektpositionen festzulegen, dies kann aber zu
Fehlern führen, da z.B. eine Strömung innerhalb der Lösung eine permanente Auslenkung des
Objekts zur Folge hätte. Dann würde der berechnete Ursprung fälschlicherweise in Richtung der
Strömung verschoben.
Der große Vorteil dieser Methode besteht darin, dass neben der Kamera, die in jedem Fall für
eine Kontrolle der Probenpositionierung nötig ist, keine weiteren Komponenten benötigt werden.
3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD
Für die beiden weiteren Methoden, die hier vorgestellt werden sollen, kommt eine sogenannte
Quadrantenfotodiode(QPD) zum Einsatz. Bei dieser speziellen Art der Fotodiode wird die aktive
Fläche in Segmente geteilt, die jeweils separat unter Lichteinfall einen Fotostrom generieren.
Diese Fotoströme sind idealerweise proportional zur auftreffenden Lichtleistung und werden
durch Operationsverstärker, die als Transimpedanzverstärker betrieben werden, in Spannungen
umgewandelt. Auch bei der Umwandlung der Fotoströme in Spannungen sollte idealerweise ein
linearer Zusammenhang bestehen. Eine schematische Zeichnung einer solchen QPD ist in 3.1 zu
sehen.
Der in der Probe entstehende Laserfokus wird auf die Quadrantenfotodiode abgebildet. Die
Kondensorlinse fungiert dabei als abbildendes System. Ein Objekt, das sich in der Falle befindet,
wirkt als Streuzentrum. Kommt es nun zu einer Auslenkung des Objekts aus der Ruhelage,
so wird das Licht beim Durchtritt durch die Sphäre nicht symmetrisch gebrochen und verläuft
danach nicht mehr auf der optischen Achse des Systems. Beim Auftreffen auf die Kondensorlinse
9
3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD
2
1
~
3
4
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung einer QPD mit Laserspot
führt dies zu einer lateralen Verschiebung des Spots in der Bildebene. Die beschriebene Situation
ist in Abbildung 3.2 dargestellt.
```
```
DD
```
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
@
@
@
@
@l
Abbildung 3.2: Strahlengang zwischen Objekt und QPD
Durch Abweichung des Spots von der Mittellage wird die eingestrahlte Lichtleistung in den
einzelnen Quadranten unterschiedlich. Es entstehen unterschiedliche Fotoströme in den einzelnen
Segmenten. Durch geeignete Summen- und Differenzenbildung lassen sich aus den resultierenden
Spannungen die lateralen Abweichungen bestimmen:
disp · x = (U 1 + U 4 − U 2 − U 3)
(3.1)
disp · y = (U 1 + U 2 − U 3 − U 4)
(3.2)
Für eine Kenntnis der Objektposition ist es demnach nötig, den Umrechnungsfaktor disp zwischen den Spannungsdifferenzen Ui und Auslenkungen x und y zu bestimmen, d.h. die Falle
muss kalibriert werde. Wie man das macht wird im Folgendem erklärt.
Die verschiedenen Spannungen die man von der Photodiode erhält sind proportional zu der
Auslenkung der Kugeln aus der Mitte des Strahls (bis zu einer Auslenkung von circa einem Kugeldurchmesser) [Svoboda and Block (1994)]. Diese Auslenkung kann genutzt werden, um die
Kraft der Falle und/oder Kräfte die auf das Teilchen ausgeübt werden, zu ermitteln. Um eine
effektive Kraft zu erhalten, ist es nötig, dass man die gemessene Auslenkung mit einer bekannten
Kraft kalibriert. Aus dieser Kalibration ergibt sich auch ein Positionskalibrationskoeffizient, der
die gemessene Voltzahl der Photodiode in ein Auslenkung mit Einheit Meter übersetzt. Neben
10
3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden
aktiven Kalibrationsmethoden mit fixierten Beads, welche die Reibungskraft nutzen, um die
Falle bzw. Photodiode zu kalibrieren, gibt es eine passive Methode mit Beads in Lösung, bei der
anhand der Brown’schen Bewegung der Beads schneller und genauer die Fallensteifheit (k) und
der Positionskalibrationskoeffizient (disp) bestimmt wird.
3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden
Es gibt verschiedene Möglichkeiten der Kalibration mit aktiven Methoden. Eine Methode, den
Umrechnungsfaktor disp zu bestimmen, besteht darin, ein Bead in das Zentrum der Falle einzubringen und dann um eine genau definierte Strecke zu verfahren. Dazu wird das Bead auf dem
Glasboden des Probenschälchens fixiert. Anschließend erfolgt die Translation des Objekttisches.
Das dazugehörige Spannungssignal wird aufgezeichnet. Daraus ergibt sich direkt der Umrechnungsfaktor. An diesem Setup ist es möglich mit Hilfe der automatischen Probenpositionierung
und der Kamera ein fixiertes Bead um eine bestimmte Strecke aus dem Fokus auszulenken und
diese Auslenkng dann einem bestimmten Photodiodensignal uQP D [V ] zuzuordnen.
Auslenkung[m] = disp[
m
] · uQP D [V ]
V
Das Problem dieser Methode ist, dass die Beads dafür fixiert sein müssen, d.h. man muss eine
extra Probe herstellen.
Eine andere Möglichkeit wäre es, die Fallenposition so schnell zu verändern, dass das gefangene
Bead auf Grund von Reibung nicht folgen kann. Eine Bewegung der Fallenposition ist aber in
unserem Setup nicht möglich.
3.2.2 Theorie der Kraftbestimmung mit Hilfe der Brown’schen Molekularbewegung
Das zweite Verfahren zur Positionsbestimmung mittels Quadrantenfotodiode nutzt das zwangsläufige
Auftreten von Diffusion im umgebenden Medium aus. Diese führt zu Schwankungen der Objektposition innerhalb der Falle und entsteht durch die Wechselwirkung der Mikrosphäre mit den
Molekülen des Mediums. Die daraus resultierenden Schwankungen in den Spannungssignalen
werden mittels einer Fouriertransformation frequenzanalysiert.
Brown’sche Bewegung eines freien Teilchens
Die Brown’sche Bewegung eines Teilchens ist die thermisch verursachte Bewegung eines Teilchens. Wie im Equipartitions Theorem beschrieben trägt jeder Freiheitsgrad f (der quadratisch zur Hamiltonfunktion beiträgt) 21 kB T zur mittleren kinetischen Energie eines Teilchen
in thermischen Equilibrium bei. Diese kinetische Energie führt dazu, dass das Teilchen sich mit
Translations- und Rotationsbewegungen bewegt.pDiese Energie (E) ist unabhängig von der Masse (m) des Teilchens. Die Geschwindigkeit v̄ = 2 · E/m ist es nicht und deshalb bewegen sich
leichte Teilchen schneller als schwere derselben Größe.
Die mittlere Auslenkung in drei Dimensionen x̄, durch die Bewegung mit Geschwindigkeit v
eines freien Teilchens im thermischen Gleichgewicht, ist:
r
√
3
1
kB T
2
(3.3)
x̄ = kB T = mv̄ → x̄ = v̄ 2 = 3
2
2
m
Die mittlere quadratische Auslenkung x2 gibt die Varianz von x an, da die mittlere Auslenkung
hxi sich zu 0 mittelt (Brown’sche Bewegung).
V ar[x] = x2 − hxi2 = x2 .
(3.4)
11
3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD
Die Diffusionskonstante für ein sphärisches Teilchen in Wasser ist durch die Einstein Relation
gegeben als:
D=
kB T
kB T
=
,
γ
6πηr
(3.5)
(detailiertere Rechnungen hierzu sind z.B.
2 auf Seite 409 in [Schwabl (2002)] zu finden).
Die mittlere quadratische Auslenkung x in einer Dimension kann man schreiben als:
2kB T
x2 = 2Dt =
t,
γ
(3.6)
mit dem Reibungstherm γ = 6πηr, mit η der Viskosität des Mediums und r dem Radius der
Kugel.
Brown’sche Bewegung in einem harmonischen Potential (wie z.B. der Falle)
Die Bewegung eines Teilchen in der Falle ist nicht frei, sondern auf ein harmonisches Potential
(U = 1/2kx2 ), als das wir die Falle ansehen, beschränkt. Die nachfolgenden Rechnungen sind
übernommen von [Gittes and Schmidt (1998)].
Unter der Annahme, dass die Fallenkraft k linear von der Auslenkung xt abhängt, ist die Langevin Gleichung für ein Teilchen in einem viskösen Medium mit Reibungskoeffizient γ und thermischer Kraft Ft :
Ft = mẍt + γ ẋt + kxt .
(3.7)
In einem rein viskosem Medium entsteht die Kraft aus unendlich kurzen Kollisionen und die
Autokorrelation der Kraft Ft ist :
hFt Ft+t0 it = C · δt0 , C ∈ < = const.
(3.8)
In thermischen Equilibrium gleicht Ft sich mit der Zeit zu 0 aus. Wir transformieren unsere
Rechnungen in den Fourierraum und nutzen die Konvention:
Z
F[x](f ) = x̂f = xt e(−2πif t) dt
(3.9)
Z
und F ∗ [x](t) = xt = x̂f e(2πif t) df.
(3.10)
Da wir im Bereich von kleinen Reynolds Nummern messen (µm Größe Teilchen), betrachten wir ein System, das einem überdämpften Oszillator entspricht, und können deshalb den
Trägheitsterm vernachlässigen.
F̂f = 2πiγf x̂f + kx̂f → x̂f =
F̂f
F̂f
1
=
·
.
2πiγf + k
γ 2πif + k/γ
(3.11)
Die Power spectral density (PSD) ist nach dem Wiener-Chintschin-Theorem eine Konstante:
F̂f F̂f∗ = C · F[δt ] = C.
(3.12)
Die PSD ist definiert als das Energiespektrum |x̂f |2 . Diese wird normierte um unabhängig von
der Gesamtdauer τ des Signals xt zu sein. Aus der PSD lernen wir, wie Fluktuationen über
verschiedenen Frequenzen verteilt sind. Mit den Formeln 3.11 und 3.12 bekommen wir:
P SD(f ) =
12
1
C
γ −2
1
A
|x̂f |2 =
·
=: 2 2
,
τ
τ (2πf )2 + (k/γ)2
4π f + fc2
(3.13)
3.2.3 Überführen der gemessenen Spektren in physikalische Einheiten
wobei wir die kritische Frequenz fc =
Mit Parseval’s Theorem
+∞
R
|xt |2 dt =
k
2πγ
R∞
und die Amplitude A =
!
C
τ γ2
definieren.
|x̂f |2 df
[Dennery and Krzywicki (1995)] und dem
Gleichverteilungssatz für das harmonische Potential 12 kB T = 12 k x2t können wir die Amplitude über die thermische Kraft ausdrücken:
−∞
kB T
= x2t =
k
−∞
+∞
Z
−∞
+∞
Z
dξ
f
ξ= f
A
1
|x̂f |2 df = c
τ
4π 2 fc
3.13
3.14
|F̂f |2 = C = Aτ γ 2 =
−∞
1
A
,
=
2
1+ξ
4πfc
4πτ kB T fc 2
γ = 2kB T τ γ,
k
(3.14)
(3.15)
mit der Einstein Relation (equation 3.5) folgt:
A=
2kB T
= 2D
γ
(3.16)
Einsetzen in 3.13 ergibt die PSD, welche eine Lorentzfunktion ist:
P SD(f ) =
kB T
2
2π γ(fc2 +
f 2)
(3.17)
Die PSD wird durch die kritische Frequenz in zwei Bereiche/Regime geteilt.
Für Frequenzen f << fc ist die PSD näherungsweise konstant, da das Teilchen in der Falle
fixiert ist:
f <<fc 2kB T γ
kB T
1 A
P SD(f ) =
≈
= 2 2 =: P SD0
(3.18)
2
2
k
4π fc
f
2
2
fc 2π γ(1 + 2 )
fc
|{z}
≈0
Für höhere Frequenzen f >> fc fällt die PSD mit 1/f 2 ab, wie sie es für ein freies Teilchen tun
würde, d.h. hochfrequente Bewegungen sind nicht durch die Falle beeinflusst.
3.2.3 Überführen der gemessenen Spektren in physikalische Einheiten
Wenn wir das Power Spectrum τ1 |ûelec |2 , welches wir durch Autokorrelation und Fouriertransformation des Auslenkungssignals uelec von der Photodiode in Volt bekommen, mit einer Lorentzfunktion der Form
AV
1
2
2 (f + fc2 )
fitten, erhalten wir Werte für AV und fc (Beispiel siehe Abbildung 3.3).
Der Faktor 12 rührt daher, dass wir unser Spektrum nur für positive Frequenzen (P SD0V )
aufnehmen, aber die thermische Kraft für die Frequenzen von −∞ bis +∞ gegeben ist. Deshalb
ist P SD0V = τ1 |uelec |2 = 21 P SD(f ). Wir können die PSD in Volt zu der Beadtrajektorie, die
von k und γ abhängt, in Beziehung setzen 3.17 :
1
1
kB T
|ûmech |2 = 2
τ
2π γ(f 2 + fc2 )
mit
uelec [V ] · disp[
Wir bekommen:
m
] = umech [m] .
V
s
disp =
(3.19)
kB T
6π 3 ηrAV
(3.20)
13
3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD
Abbildung 3.3: Fit einer Lorentzfunktion an eine Kalibrationsmessung in x-Richtung und im xKanal der Quadranten Photodiode. Grau die original aufgenommen Daten, grün
die logarithmisch gebinnten Daten, blau der Fit mit der Lorentzfunktion (3.17),
aus der man die Kornerfrequency fc erhält, mit der man die Fallensteifigkeit k
berechnen kann.
und mit Gleichungen 3.14 und 3.16 wird die Fallensteifigkeit als:
k = 12π 2 ηrfc berechnet.
(3.21)
Aus Gleichung 3.17 bekommen wir direkt die Fallensteifigkeit
k =2·
kB T
kB T 4πfc
=2·
P SD0v πfc
AV
(3.22)
kB T
2kB T
=2·
.
fc2 2π 2 P SD0v
AV
(3.23)
und den Reibungs Koeffizienten
γ =2·
Mit diesen Kalibrationsfaktoren kann man die gemessenen Daten für eine Sphäre mit bekanntem
Radius bei einer Temperatur T und einem Medium der Viskosität η, von Volt in physikalische
Einheiten umrechnen. Wenn wir die Daten als Auslenkung der Sphäre ausdrücken wollen multiplizieren wir sie mit disp, welches die Einheiten Meter pro Volt [m/V] hat. Um etwas über
die Kräfte in unserer Probe zu lernen, können wir u als eine Kraft in Newton [N] ausdrücken,
indem wir sowohl mit disp, als auch der Fallensteifigkeit (k) in Newton pro Meter [N/m] (wie
eine Federkonstante) multiplizieren. Den Faktor der diese Beiden verbindet F cal := disp · k hat
m
N
die Einheiten [ N
V ] = [ V ] · [ m ].
14
4 Aufbau
Da dies ein Praktikumsaufbau im Rahmen des Fortgeschrittenenpraktikums ist, handelt es sich
um eine einfach konfigurierte Laserfalle, die es ermöglicht Kräfte zu erzeugen und zu messen.
Für eine schematische Darstellung des Strahlengangs siehe Abbildung 4.1.
Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des Laser Tweezer Strahlengangs
Im Folgenden soll zunächst ein kurzer Überblick über die verwendeten Komponenten und deren
Bedeutung für die Funktion der Pinzette gegeben werden.
• Laser Als Lichtquelle einer optischen Falle dient ein Laser. Aufgabe des Lasers ist es,
die benötigte Lichtintensität für die Falle zur Verfügung zu stellen. Laser sind für diesen
Zweck gut geeignet, da das Licht sowohl monochromatisch und koherent ist, als auch i.d.R.
ein gaußförmiges Strahlprofil aufweist. Monochromatisches Licht ist wichtig, da es bei polychromatischem Licht aufgrund der chromatischen Aberration zu einer longitudinalen
Defokussierung kommt. Dadurch sinkt der Intensitätsgradient im Fokus und die Falle wird
instabiler. Als gaußförmiges oder TEM00-Strahlprofil bezeichnet man einen rotationssymmetrischen Strahlquerschnitt, dessen radialer Intensitätsverlauf durch eine Gaußfunktion
beschrieben wird (siehe Theorie). Andere Intensitätsverläufe senken in den meisten Fällen
die Fallenstärke. Da dieser Versuchsaufbau für die Arbeit mit biologischen Materialien,
wie Zellen, Proteinen etc. ausgelegt ist, muss auch die durch die Laserstrahlung entstehende Wärmeentwicklung berücksichtigt werden. Biochemische Reaktionen, z.B. in Zellen,
sowie das Verhalten von Proteinen sind oft sehr temperatursensitiv. Deshalb muss die Absorption der Strahlung in der Probe, die zu einer deutlichen Temperaturerhöhung führen
kann, möglichst gering gehalten werden. Aus diesem Grund werden bei optischen Pinzetten
häufig Laser im nahen Infrarotbereich verwendet. In diesem Wellenlängenbereich liegt die
Absorption sowohl von biologischem Material als auch von Wasser auf einem moderaten
Niveau. Für den Praktikumsversuch fiel die Wahl des verwendeten Lasers aus den oben genannten Gründen auf das Modell MIL-100mW-III1064 der Firma Pusch OptoTech. Hierbei
15
4 Aufbau
handelt es sich um einen DPSS-Laser mit kontinuierlicher Emission bei einer Wellenlänge
von 1064nm und einer Leistung von 100mW.
• Dichroitische Spiegel Der vorliegende Aufbau vereint zwei Strahlengänge. Ein Strahlengang ist der des Infrarotlichts, das zur Erzeugung der Falle verwendet wird. Der zweite
Strahlengang dient der optischen Kontrolle, weshalb hier sichtbares Licht zum Einsatz
kommt. Das sichtbare Licht erzeugt ein Bild der Probe auf der Kamera. Beide Strahlengänge verwenden sowohl das Mikroskopobjektiv, als auch die Kondensorlinse. Deshalb
müssen sie an geeigneter Stelle vereinigt bzw. voneinander getrennt werden. Dies geschieht
mit Hilfe sogenannter dichroitischer Spiegel, welche aus dünnen Glasplatten, auf die mehrere dielektrische Schichten aufgetragen wurden, bestehen. Dadurch kommt es an der Oberfläche zu Interferenzerscheinungen, welche dazu führen, dass gewisse Wellenlängenbereiche
des Lichts reflektiert, andere hingegen transmittiert werden. Somit ist eine Trennung des
Spektrums möglich. In diesem Fall wird vor dem Objektiv ein dichroitischer Filter eingebracht, der sichtbares Licht transmittiert und Infrarotlicht reflektiert. Oberhalb der Kondensorlinse wird ein dichroitischer Spiegel mit denselben Eigenschaften eingesetzt. Dieser
reflektiert das von der Kondensorlinse aufgefangene Infrarotlicht auf die 4-QuadrantenFotodiode (QPD).
• Mikroskopobjektiv Aufgabe des Objektivs ist es, das Laserlicht in die Probe zu fokussieren, sowie die Probe auf die Kamera abzubilden. Entscheidend für die Stärke eines Laser
Tweezers ist ein starker Intensitätsgradient des Laserlichts in der Fokusebene, d.h. es ist
eine Fokussierung auf einen möglichst kleinen Punkt erwünscht. Die Größe dieses Fokus
wird durch die Beugung begrenzt und kann durch folgende Formel berechnet werden:
d = 2 · 1, 22 · λ
f
D
(4.1)
Hierbei bezeichnet d den Durchmesser des Fokuspunkts, λ die Wellenlänge des Lichts, f die
Brennweite des Objektives und D den Durchmesser der abbildenden Linse. Aus Gleichung
4.1 folgt, dass eine hohe Numerische Apertur des Objektives für eine gute Fokussierung
nötig ist. Die Wahl fiel auf das Modell 100X DIN Semi-Plan, Spring Loaded Intl, ein Standard Objektive der Firma Edmund Optics. Es handelt sich um ein Öl- Immersionsobjektiv
mit einer 100-fachen Vergrößerung und einer hohen Numerischen Apertur von NA = 1,25
. NA-Werte über 1,0 lassen sich nur mit Hilfe einer Immersionsflüssigkeit erreichen. Dafür
wird ein spezielles Immersionsöl verwendet. Außerdem führen sehr große NA-Werte dazu, dass der Arbeitsabstand sehr klein wird. Es müssen dann Probenschälchen mit einem
dünnen Glasboden verwendet werden und eine Fokussierung in größerer Tiefe innerhalb
der Probe ist nicht möglich. Das Objektiv ist, im Gegensatz zu den meisten Objektiven in
wissenschaftlichen Mikroskopen, für eine Tubuslänge von lT ubus = 160mm korrigiert und
erzeugt nach dieser Länge ein Zwischenbild.
• Strahlaufweitung/ Teleskop Das Objektiv bildet Punkte der Gegenstandsebene als
Punkte in der Zwischenbildebene ab. Für den Laserstrahl sind Bild- und Gegenstandsebene vertauscht. Daraus resultiert, dass der Strahl in der Zwischenbildebene fokussiert
werden muss. Das Objektiv bildet diesen Punkt dann in der Gegenstandsebene innerhalb
der Probe ab und erzeugt damit an dieser Stelle das Zentrum der Falle. Dies ist wichtig, da
sonst Objekte, die sich in der Falle befinden, nicht scharf auf der Kamera abgebildet werden können. Damit ein Mikroskopobjektiv die theoretisch mögliche NA auch erreicht, ist
es unerlässlich, dass die gesamte bildseitige Aperturblende des Objektives von der Laserstrahlung beleuchtet wird. Der Strahldurchmesser sollte also möglichst dem Durchmesser
der Aperturblende entsprechen. Um die Gradientenkraft zu maximieren ist es wichtig, dass
die extremal/ äußeren Bereiche des Laserstrahl relativ viel Intensität haben. Da die Intensität im Laserstrahl aber Gaussverteilt, ist soll der Laserstrahl aufgeweitet werden, um
16
Abbildung 4.2: Schematische Darstellung Teleskop Strahlengangs
die äußersten Strahlbereiche niedriger Intensität am Objektiv abzuschneiden. Dazu benutzt man ein Linsensystem. Der Originallaserstrahl hat circa einen Radius a von 1,5mm,
den wir auf einen Radius c von circa 6mm aufweiten wollen. Wir haben Linsen mit den
Brennweiten f1 =75mm, f2 =20mm und unsere dritte ’Linse’, das Objektiv hat eine hintere
Fokuslänge von f3 =160mm. Der Aufweitungswinkel γ ist gegeben als
c
f3
(4.2)
b
⇔ b = x2 · tanγ
x2
(4.3)
tanγ =
Wie man in Abbildung 4.2 sieht, gilt außerdem
tanγ =
Mit Hilfe der Linsengleichung ergibt sich
1
1
x1 · x2
1
=
+
⇔ f2 =
f2
x1 x2
x1 + x2
des weiteren gilt
b
x1
= tanα =
a
f1
(4.4)
und somit folgt:
x2 · tanγ
a
x1 · a
=
⇔ x2 =
x1
f1
f1 · tanγ
(4.5)
zusammen mit 4.4 ergibt sich:
f2 =
x1 · a
f1 · tanγ · (1 +
a
f1 ·tanγ )
⇔ x1 =
f2 · (f1 · tanγ + a)
a
(4.6)
Somit ergeben sich für uns als sinnvoll x1 ≈ 38.75 + 75mm ≈ 113mm und x2 ≈ 40mm
• 4-Quadranten-Fotodiode Zur exakten Positionsdetektion wird eine sogenannte QPD
verwendet. Diese 4-Quadranten- Fotodioden sind kreisförmige Dioden, deren aktive Fläche
in 4 Segmente unterteilt ist. Trifft Licht auf die Diode, entsteht ein Fotostrom, der in
eine Spannung umgewandelt werden kann. Die genaue Funktionsweise wurde bereits in
Abschnitt 3.1 erläutert. Vor der Quadrantenfotodiode wird ein Neutralfilter angebracht,
um die auftreffende Intensität zu reduzieren und Streulicht heraus zu filtern.
• Beleuchtung Da der Versuchsaufbau auf einem invertierten Mikroskop basiert, wurde
auch eine Beleuchtungseinheit integriert, mit der die Probe im Durchlicht untersucht werden kann. Als Lichtquelle dient eine LED, welche weißes Licht emittiert. Die Beleuchtungseinheit wurde nach dem Köhlerschen Prinzip entworfen, die ein gleichmäßiges Ausleuchten
17
4 Aufbau
der Probe ermöglicht. Die Einheit enthält eine feste Leuchtfeld-, sowie eine einstellbare
Aperturblende. In das Gehäuse der Beleuchtungseinheit wurde außerdem die Quadrantenfotodiode und der dazugehörige dichroitische Spiegel integriert.
• Feldlinse Im Zuge der Einstellarbeiten am Aufbau wurde eine kissenförmige Verzeichnung
des Bildfeldes auf der Kamera registriert. Diese konnte durch den Einsatz einer Feldlinse
mit 75mm Brennweite, die in der Zwischenbildebene des Objektives platziert wird und auf
die erste Linse des nachfolgenden Teleskops fokussiert, korrigiert werden.
• Kamera Eine CCD-Kamera dient zum einen als Messinstrument, zum anderen ermöglicht
sie eine optische Kontrolle der Probe. Hier stehen unzählige unterschiedliche Typen zur
Auswahl. Wichtige Größen sind z.B. die Anzahl der Pixel und die damit erzielbare Auflösung
bzw. Messfeldgröße, sowie die maximale Bildfrequenz. Eine leistungsfähigere Kamera kann
zu besseren Ergebnisse führen, bedeutet i.d.R. aber auch höhere Anschaffungskosten. In
diesem Fall fiel die Wahl auf eine FireWire-Kamera des Typs DMK 21BF04 der Firma
The Imaging Source. Die Kamera zeichnet Schwarz-Weiß-Bilder in VGA Auflösung von
640x480 Pixeln mit max. 60 fps auf. Ein Infrarot-Sperrfilter vor der Kamera dient zum
Abblocken gestreuten Laserlichts.
• Probenpositionierung Zur Positionierung der Probe wird ein manueller xyz-Verstelltisch
eingesetzt. Zum Einsatz kommt das Modell Large X-Y-Z Axis Leadscrew Drive Stage von
Edmund Optics. Der Tisch weist einen Verfahrweg von ±7, 5mm in x-y-Richtung und
±6mm in z-Richtung bei einer Schrittweite von 0,5mm pro Umdrehung auf. Erweitert
wird dieser durch ein Computer gesteuerten XYZ-Stage. (Programm: APT-User)
• Spannungsversorgung Da sich in dem Aufbau viele Geräte befinden, die mit Strom
versorgt werden müssen, wurde ein Netzgerät entworfen, das die benötigten Spannungen
liefert. Das Netzgerät verfügt über einen Hauptschalter an der Rückseite des Geräts, um
dieses vom Stromnetz zu trennen. Jeder Spannungskanal kann außerdem an der Vorderseite über einen separaten Schalter ein- und ausgeschaltet werden. Die Spannungen zur
Versorgung des Infrarotlasers und der Durchlichtbeleuchtung sind regelbar ausgelegt und
können über einen Einstellknopf neben dem entsprechenden Schalter justiert werden.
• Vibrationsgedämpfter Arbeitsplatz Optische Pinzetten erzeugen Kräfte im pN-Bereich.
Gleichzeitig soll die Objektposition in der Falle mit nm-Genauigkeit vermessen werden. Die
gefangenen Objekte befinden sich dabei in wässriger Lösung. Vibrationen können auf die
Messung einen enormen Einfluss nehmen. Aus diesem Grund muss eine möglichst gute
Entkopplung von mechanischen Schwingungen stattfinden. Das Setup wurde deshalb auf
einem vibrationsgedämpften Arbeitsplatz der Firma Newport aufgebaut.
• Datenakquisitionssystem Zur Messung der Spannungssignale von der Leistungskontrollund der 4-Quadranten- Fotodiode kommt eine PCI-Einsteckkarte des Typs PCI-6221 von
National Instruments zum Einsatz. Die Karte hat insgesamt 8 differenzielle Spannungseingänge. Die maximale Abtastfrequenz des A-D-Wandlers liegt bei 250kHz. Da insgesamt
fünf Spannungskanäle aufgezeichnet werden müssen, sinkt die maximal nutzbare Abtastfrequenz um den Faktor fünf auf 50kHz. Zur Steuerung werden selbst implementierte C++Programme verwendet.
18
5 Durchführung
5.1 Montage und Justage der Komponenten
Essentiell für die Funktion einer optischen Falle ist das präzise Ausrichten der einzelnen Komponenten im Strahlengang. Da Infrarotlicht für das menschliche Auge nicht sichtbar ist, müssen hier
Hilfsmittel zum Einsatz kommen. Zum einen IR-Detektorkarten, die Infrarotlicht (kurzfristig)
in sichtbares Licht umwandeln. Zum anderen eignet sich eine USB-Webcam zum Visualisierung
des Laserlichts. Die Platte des vibrationsgedämpften Tisches weist Bohrungen der Größe M6 in
einem 25mm-Raster auf. Diese dienen der Befestigung für die Halter der optischen Komponenten. Gleichzeitig eignen sich die durch die Bohrungen vorgegebenen Linien gut zur Festlegung
der optischen Achsen.
Da Infrarotlicht nicht für das Auge sichtbar ist, ist es besonders wichtig, die Augen vor möglichen Reflektionen des Lasers mit Laserschutzbrillen zu schützen!!!!!!!
Zu Beginn des Versuchs soll der Strahlengang nachverfolgt und überprüft bzw. in Teilen neu
justiert werden, wie im Folgendem beschrieben. Anschließend werden verschiedene Messungen
durchgeführt.
5.1.1 Durchlichtstrahlengang
Der gesamte Aufbau wurde für eine Strahlhöhe von 76mm konzipiert. Zur Kontrolle von Strahlhöhe
und -verlauf wurde eine spezielle Einstellhilfe gefertigt. Diese kann in die Bohrungen der Tischplatte eingesetzt werden und bietet somit die Möglichkeit, die Einstellung des Strahlverlaufs
schnell und einfach zu kontrollieren.
Als erster Schritt wird die Beleuchtungseinheit eingeschaltet. Es wird ein Blatt Papier auf die
Probenhalterung gelegt und unmittelbar über dem Objektiv positioniert. Die Beleuchtungseinheit wird in der Höhe so eingerichtet, dass auf dem Papier ein möglichst kleiner Leuchtfleck
entsteht. Anschließend wird das Papier wieder entfernt und die Beleuchtung mittig über dem
Objektiv fixiert. Wenn am meisten Intensität hinter dem Objektiv ankommt, sitzt die Beleuchtung richtig. Als nächstes wird das Licht mit einem Spiegel um 90◦ aus der Senkrechten in
die Waagerechte gebracht. Der Spiegel wird so eingestellt, dass das Licht parallel zum Tisch
und entlang der Bohrlöcher des Tisches läuft. Da das Objektiv nicht für eine Abbildung im
Unendlichen korrigiert ist, entsteht nach der Tubuslänge von 160mm ein Zwischenbild. Dieses
Zwischenbild weist eine 100-fache Vergrößerung auf und könnte theoretisch direkt von der Kamera aufgenommen werden. Da der Chip der Kamera nur eine begrenzte Größe hat, würde der
Bildausschnitt aber sehr klein. Außerdem werden für die FCS- und FRAP-Versuche zusätzliche
optische Komponenten benötigt, wodurch ein Anbringen der Kamera in der Zwischenbildebene
aus Platzgründen ebenfalls erschwert würde. Deshalb wird ein Teleskop eingesetzt, welches die
Abbildung verkleinert und nochmals auf die Kamera fokussiert; hierzu werden eine 100mm und
eine 50mm Linse benutzt. Da man so starke Abbildungsverzerrungen erhält, wird eine Feldlinse in die Zwischenbildebene eingebaut. Zunächst wird die Probe so fokussiert, dass man ein
scharfes Bild in der Zwischenbildebene erhält. Dort wird dann die Feldlinse plaziert. Diese hat
bei uns eine Brennweite von 75mm , welche den Abstand zur nachfolgenden 100mm Linse auf
75mm festlegt. Die nächste Linse wird zusammen mit der Kamera so positioniert, dass man
ein schönes unverzerrtes Bild auf der Kamera erhält. Zur abschließenden Kontrolle der Justage
wird ein Microlineal auf den Probenhalter aufgelegt. Mit dem Programm IC Capture wird die
Kamera angesteuert. Der Verstelltisch wird nun so eingestellt, dass auf der Kamera die Skala
scharf dargestellt wird und das Bild nirgends abgeschnitten oder verzerrt wird.
19
5.3 Messungen
5.1.2 Fallenstrahlengang
Hier wird als Erstes der Laser montiert. Der Laserkopf befindet sich auf einer Trägerplatte,
welche mit drei Schrauben am Tisch befestigt wird. Durch die Muttern auf den Schrauben lässt
sich der Laser in Höhe und Neigung einstellen. Mit Hilfe eines Pinholes, sowie der Einstellhilfe
wird die Position und Ausrichtung des Lasers an zwei möglichst weit voneinander entfernten
Punkten auf dem Tisch kontrolliert. Verläuft der Laserstrahl auf der richtigen Achse, wird ein
Spiegel eingesetzt. Dieser befindet sich ebenfalls in einer einstellbaren Halterung und lenkt den
Laser horizontal um 90◦ ab. Auch hier wird der Strahlenverlauf wieder an zwei Punkten exakt
überprüft. Bei beiden bisherigen Schritten muss man größtmögliche Sorgfalt walten lassen,da
diese die Qualität der weiteren Einstellarbeiten erheblich beeinflussen können.
Nun werden auf einer Schiene, die dem Raster des Tisches angepasst ist, die beiden Teleskoplinsen eingebaut, wobei mit der Justierhilfe darauf geachtet wird, dass der Strahl weiterhin gerade
verläuft und die Linsen genau mittig trifft.
Im nächsten Schritt wird ein dichroidischer Spiegel eingebaut, der den Laserstrahl wiederum
um 90◦ abgelenkt und mit dem Durchlichtstrahlengang vereinigt. Das Laserlicht wird nun über
einen 90◦ Spiegel senkrecht nach oben durch das Objektiv gelenkt. Zunächst wird das Objektiv
allerdings ausgebaut und überprüft, ob der Strahl senkrecht nach oben und mittig durch die
folgenden Bauteile des Durchlichtstrahlenganges geht. Mit Hilfe des Dichroiden kann man justieren. Nun wird das Objektiv wieder eingesetzt und überprüft, dass der Laserstrahl mittig ins
Objektiv trifft und auch nochmal überprüft, ob das Objektiv überfüllt wird (am besten mit der
Web-Cam). Ansonsten müssen die Teleskoplinsen nochmal verrückt werden.
Jetzt wird eine Probe mit Wasser eingesetzt. Man sollte eine Reflektion des Lasers am GlasWasser Übergang sehen. Man stellt die Objektivneigung nun so ein, dass eine symmetrische
Reflektion zu erkennen ist. Diese Reflektion ist stark fokusabhängig. Daran kann man sie von
anderen möglicherweise auftretenden Reflektionen unterscheiden.
5.1.3 Justieren der Quadrantenfotodiode
Als letzter Arbeitsschritt steht noch das Einstellen der QPD aus. Dazu wird am Netzgerät die
Versorgungsspannung für die Operationsverstärker eingeschaltet. Danach wird das Programm
QPD-Live aufgerufen. Dieses zeigt am Bildschirm die aktuellen Differenzspannungen für x- und
y-Richtung, sowie die Summe aller Spannungen an. Für diese Spannungen muss ein Nullabgleich durchgeführt werden. Eine Grobeinstellung hierfür erfolgt über eine laterale Verschiebung
der Beleuchtungseinheit, bzw. ein Verkippen des dichroitischen Spiegels im Lampengehäuse.
Zur Feineinstellung kann die QPD mittels zweier Einstellschrauben lateral in ihrer Halterung
verfahren werden.
5.2 Beadlösung
Wir benötigen 2 Bead Lösungen:
• 1µm Beads Circa 1 µl 1µm Silica Beads in 2ml MilliQ Wasser. Lösung gut vortexen und
kurz ultraschallen, damit die Beads sich voneinander lösen.
• 4µm Beads Circa 3-5 µl 4µm Silica Beads in 2ml MilliQ Wasser. Lösung gut vortexen
und kurz ultraschallen, damit die Beads sich voneinander lösen.
5.3 Messungen
5.3.1 Maximale Fallenkraft für beide Beadgrößen bestimmen
Dazu ein Bead fangen. Das Signal der QPD mit QP Dlive beobachten und mit Hilfe der Feinjustageschrauben an der QPD möglichst das x- und y- Signal auf Null abgleichen. Nun mit QP Dwrite
20
5.3.2 Laser Intensität variieren und Fallenkraft bestimmen
die Messung starten. Jede Messung dauert 10s, das Programm führt automatisch 10 Messungen
durch, wenn man es nicht durch Schließen beendet. Während der Messung sollte das Bead mit
IC Capture beobachtet werden und sobald Dreck oder ein weiteres Bead in die Falle fällt, die
Messungen gestoppt werden. Die Messdaten werden vom Programm im Desktop Ordner QP Dwrite /Debug abgelegt und müssen vor dem Starten der nächsten Messreihe
in einen entsprechend benannten neuen Ordner verschoben werden, da sie sonst
überschrieben werden!!!!! Es soll für beide Beadgrößen jeweils fünfmal ein Bead gefangen
werden und jeweils möglichst viele (maximal 10) Messungen durchgeführt werden. So soll der
Zusammenhang zwischen Beadgröße und Fallenkraft untersucht werden. Mit dem Matlab Programm CAlQP D .m kann man sich die von der QPD aufgenommenen Spektren anzeigen und die
Fallenkraft in x bzw. y-Richtung ausrechnen (mit Hilfe der Formel 3.21) lassen.
5.3.2 Laser Intensität variieren und Fallenkraft bestimmen
Im nächsten Schritt soll der Zusammenhang zwischen Laserleistung und Fallenkraft untersucht
werden. Dazu setzt man ein Glasstück in den Laserstrahlengang, direkt nach dem Laser, ein,
welches einen Teil des Laserlichts auf eine Photodiode reflektiert. Mit dieser Photodiode soll
die Laserintensität aufgenommen werde. Die Werte der Photodiode kann man mit AP Dwrite
auslesen/aufnehmen. Indem man die Spannung des Lasers am Netzgerät variiert, verändert
man die Intensität des Strahls. Es soll für 5 verschiedene Spannungen/ Laserintensitäten die
Fallenkraft bestimmt werden, für beide Bead Größen (siehe oben). Tip: Es ist einfacher, die
Beads bei hoher Intensität zu fangen und diese dann herab zu drehen.
5.3.3 Bestimmung der Minimalkraft, bei der ein Bead gefangen wird
Wieviel Kraft wird benötigt, um ein Bead in der Falle zu halten? Um dies zu testen fängt man ein
Bead und dreht dann die Intensität soweit runter, dass das Bead sich bei leichtem Wackeln des
Tisches aus der Falle löst. Und notiert sich die von der Photodiode gemessene Laserintensität.
Bitte für beide Bead Größen durchführen.
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6 Auswertung
6.1 Daten
6.1.1 Maximale Fallenkraft
Die Messungen der Fallenkraft in x- und y-Richtung sollen für jedes Bead über die Messung und
anschließend für die fünf Beads gemittelt werden. Ist die Kraft in x- und y- Richtung identisch?
Erklären Sie mögliche Ursachen für Abweichungen. Vergleichen Sie die gemessene Fallenkraft
für die beiden Beadgrößen. Passt Ihr Ergebniss zur Theorie?
6.1.2 Fallenkraft in Abhängigkeit der Laserleistung.
Mitteln Sie die gemessenen Fallenkräfte (für x- und y- Richtung) bei den verschiedenen Intensitäten. Tragen Sie diese gegeneinander auf. Was für ein Verlauf ergibt sich?
6.1.3 Minimale Fallenkraft um Bead zu halten
Aus dem in 6.1.2 erstellten Graphen der Fallenkraft gegen Laserleistung extrapolieren Sie die
Fallensteifigkeit, bei der das Bead nicht mehr gefangen wurde.
FF alle = mean(xQP D − mean(xQP D )) ∗ dispx ∗ kx
(6.1)
Vergleichen Sie diese mit der Kraft die ein Teilchen nach Stokes hat
F~ = 6ηπr~v
(6.2)
Als ~v nutzen Sie die in der Vorbereitungsaufgabe berechnete Teilchengeschwindigkeit in einem
Medium mit Viskosität 1mP as
6.2 Anwendung der optischen Pinzette
Abschließend informieren Sie sich über zwei Anwendungsgebiete der optische Pinzette und beschreiben sie d iese genauer.
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Literaturverzeichnis
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