Mikrobiologischer Trinkwassertest in weniger als einer - Wiley-VCH
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Biophotonik Mikrobiologischer Trinkwassertest in weniger als einer Stunde Innovative Stand-Alone-Lösung, die mehrtägige Laboruntersuchungen ersetzen könnte Wasser ist Leben und so ist es in Deutschland auch das am besten kontrollierte Lebensmittel. Verunreinigungen aller Art sind darin tabu. Besonders Bakterien sind als lebende Organismen im „Lebensmitteln Nr. 1“ nicht willkommen. Wasserversorger müssen mit regelmäßigen Tests nachweisen, dass ihr Wasser frei von den Kleinstlebewesen ist. Die Tests dazu dauern bisher noch mehrere Tage und dürfen nur von geschultem Personal im Labor durchgeführt werden – für die Versorger und die Verbraucher ein unbefriedigendes Verfahren, denn es ist teuer und zeitaufwendig. Eine effizientere Messmethode entwickeln Forscher derzeit in einem Förderprojekt des BMBF. Die Abwesenheit von Bakterien ist eines der wichtigsten Anzeichen von gesundem Trinkwasser. Üblicherweise müssen Labore für diesen Nachweis Bakterienkulturen anlegen. Das Problem ist nur, dass die Kulturen erst auf eine entsprechende Keimdichte anwachsen müssen, bevor die ganze Pa­ lette der Nachweisverfahren angewendet werden kann [1]. Diese Kultivierung dauert üblicherweise mehrere Tage. Wertvolle Zeit geht verloren, denn die Erreger vermehren sich in dieser Zeit natürlich nicht nur in der Petrischale, sondern gleichzeitig auch in der Quelle der Probe, sei das die Wasser­ leitung im Bad oder ein Grundwasserbrunnen [2]. Kultivierungsschritt raubt wertvolle Zeit An dieser Stelle setzt der Forschungs­ verbund OptoZell an. Er kombiniert die indi­viduellen Stärken von Wissenschaftlern aus drei deutschen Forschungsinstituten und der European Aeronautic Defense and Space Company (EADS). Zusammen konstruieren sie ein Gerät, das die mikrobiologische Belastung von Trinkwasser in weniger als einer Stunde feststellen kann – und das vollautomatisch und vor Ort. Somit entfällt 28 Optik & Photonik April 2009 Nr. 1 Die Autoren ALOIS FRIEDBERGER Dr. Alois Friedberger promovierte an der Universität Kassel in Physik über die Entwicklung einer MEMS-Technologie. Er forschte am Berkeley Sensor & Actuator Center (BSAC) der University of California in Berkeley an MEMS/MOEMS und am Siemens Forschungszentrum in Neuperlach im Bereich Oberflächen-Mikromechanik. Nun leitet er ein Forschungsteam bei EADS Innovation Works, dem Forschungszentrum der EADS in München. Seine Themenfelder umfassen Sensorsysteme und mikrofluidische Strukturen für Sicherheits- und Luft-/ Raumfahrtanwendungen. Dr. Alois Friedberger, Dr. Andreas Helwig, Dr. Christoph Heller, Dr. Ulrich Reidt, EADS Innovation Works, München Leonhard Meixner, Karl Neumeier, Waltraud Hell, Prof. Dr. Karlheinz Bock, Dr. Karlheinz Bock, Fraunhofer-Institut für Zuverlässigkeit und Mikrointegration, München Dr. Petra Lindner, Dipl.-Ing. (FH) Ramona Molz, Prof. Dr. Hans Wolf, Universität Regensburg, Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Dipl.-Ing. Ninette Zullei-Seibert, Dr. Gudrun Preuß, Institut für Wasser­ forschung GmbH, Dortmund Dipl.-Journ. (FH) Clemens Homann, Institut für Photonische Technologien CLEMENS HOMANN Clemens Homann, Jahrgang 1980, studierte Physik in Leipzig bis er 2004 nach Bonn in den Studiengang Technikjournalismus wechselte. Neben dem Studium arbeitet er unter anderem für die dpa, die Stiftung Warentest und das Hamburger Abendblatt. Seit Januar 2009 unterstützt er als diplomierter Fachjournalist die Öffentlichkeitsarbeit für den Forschungsschwerpunkt Biophotonik des BMBF und das Eu-Exzellenznetzwerk „Photonics4Life“ am Institut für Photonische Technologien (IPHT) in Jena. ●● Dr. Alois Friedberger Teamleiter Biologische und Chemische Sensoren EADS Innovation Works European Aeronautic Defence and Space Company (EADS) 81663 München Tel: +49 (0)89 607 205-55 E-Mail: [email protected] Website: www.eads.net Clemens Homann Öffentlichkeitsarbeit Forschungsschwerpunkt Biophotonik Albert-Einstein-Strasse 9 07745 Jena Tel: +49 (0)3641 206-064 E-Mail: [email protected] Website: www.ipht-jena.de © 2009 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Biophotonik auch der Weg ins Labor und der schnelle Nachweis macht entsprechende Gegenmaßnahmen wie eine Desinfektion rechtzeitig möglich. Das Kernstück des laborunabhängigen Schnelltestsystems ist eine kombinierte Filtrations- und Messzelle, in der sowie die Anreicherung der Bakterien auf einer speziellen Filtermembran als auch die anschließende optische Detektion der Keime erfolgt. Ab­ bildung 1 zeigt das bereits sehr kompakte Labormuster zur Durchführung der Trinkwasseruntersuchung. In dem Minilabor regelt ein integriertes Mikrofluidiksystem die Zufuhr der Probenund Reagenzlösungen. Aus Vorratsgefäßen werden die Trinkwasserprobe, die Farbstoffe und das Reinigungsmittel in das System eingespeist. Ein Selektor- und ein 4-WegeSchaltventil regeln dabei die unterschiedlichen Flüssigkeitsströme im System. Eine Präzisionspumpe sorgt für den genau dosierten Transport der Flüssigkeiten durch das Gerät. Am Ende des Kreislaufes werden verbrauchte Materialien in einem Abfallbehälter gesammelt. Auch tote Bakterien fallen auf Die Anreicherung der Bakterien erfolgt auf superflachen mikromechanischen Filtern mit einem Porendurchmesser von 450 Nanometern (Abb.2). Wenn die Präzisionspumpe die zu untersuchende Trinkwasserprobe durch diese Filter hindurch pumpt, halten sie die Bakterien aufgrund des größeren Durchmessers zurück. Anschließend gibt das System spezielle Farbstoffe hinzu, welche die zu detektierenden Bakterien anfärben [3]. Um eine möglichst präzise und aussagekräftige Messung zu gewährleisten, sollen bei den Bakterien auf dem Mikrofilter die Gesamtkeimzahl, die Zahl der lebenden und die Zahl der toten Bakterien bestimmt werden. Für diese Aufgabe wählte der Forschungsverbund die zellfärbenden Fluoreszenz-Farbstoffe SYTO62, PI und cFDA aus. Darüber hinaus können durch Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper Bakterien auch spezifisch nachgewiesen werden. Der unspezifische Farbstoff SYTO62, der alle in der Probe vorhandene Zellen anfärbt, gehört zu den nukleinsäurebindenden Fluoreszenzfarbstoffen. Er dringt durch die Membran der Bakterien in sie ein und bindet dort an deren Nukleinsäuren. Bei dem spezifisch tote Zellen färbenden Farbstoff PI handelt es sich um einen Farbstoff, der von der Membranpermeabilität abhängig ist. Er kann nur in die Zelle eindringen, wenn die Membran nicht intakt ist und die Zelle damit tot ist. cFDA ist ein Farbstoffkonjugat, das erst durch © 2009 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Abb. 1: Das kompakte Labormuster mit Steuerlaptop Die Förderinitiative BMBF-Forschungsschwerpunkt Biophotonik Im Forschungsschwerpunkt Biophotonik bringt das Bundesforschungsministerium seit dem Jahr 2002 Wissenschaftler, Ingenieure und Ärzte zusammen, um optische Lösungen für medizinische und biologische Fragestellungen zu erarbeiten. Gemeinsames Ziel ist es, Krankheiten in ihren Ursachen zu verstehen, diese früh und präzise zu diagnostizieren und gezielt behandeln zu können. Abb. 2: Schnitt der Filtermembran unter dem Rasterelektronenmikroskop www.biophotonik.org enzymatische Reaktionen innerhalb aktiver Bakterienzellen in einen fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt wird. Die Fluoreszenzfarbstoffe besitzen jeweils unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlängen. Werden die mit ihnen gefärbten Zellen mit Licht einer für den jeweiligen Farbstoff definierten Wellenlänge angeregt, so fluoreszieren die Bakterien (Abb. 3). Da die Signalintensität des Fluoreszenzlichtes mit der Anzahl der vorhandenen Bakterien in der Probe korreliert, ist die quantitative Abschätzung der Zellzahlen möglich. Je schmutziger, desto heller Dazu misst das Schnelltestsystem mit dem Fluoreszenzmesskopf das emittierte Licht und schließt anhand der Intensität auf die Anzahl der auf dem Filter vorhandenen gefärbten Zellen. Der optische Teil des Messkopfes besteht dafür aus je einer LED für jede Fluoreszenzfarbe und einem Würfel, auf dem Strahlteiler, Anregungs- und Emissionsfilter auf einem Schlitten sitzen. Der Abb. 3: Fluoreszierende Bakterien im Mikroskop Würfel lässt sich in drei verschiedene Positionen manövrieren, je nach gewünschter Wellenlänge. Mit Hilfe mehrerer Linsen beleuchtet eine LED den Mikrofilter im Bereich des Messfelds. Das Fluoreszenzlicht aus dem Messfeld wird schließlich auf einen Photomultiplier gelenkt, der die auftreffenden Photonen zählt. An der Vorderseite des Fluoreszenzmesskopfes befindet sich eine Aufnahme für die wechselbare Einmaldurchflusszelle, die gleichzeitig den Kontakt zur Fluidik herstellt. Der Fluoreszenzmesskopf besitzt die äußeren Abmessungen von www.optik-photonik.de 29 Biophotonik Zellzahlen im Trinkwasser nach Desinfektion (n = 30) 1,00E+06 1,00E+05 Zellzahl / mL 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 Standardverfahren TrinkwV (Koloniezahl 22 °C) 1,00E+00 1,00E-01 Gesamtzellzahl b) Geschädigte + Aktive Abb. 4: Drei-Farben-Fluoreszenzmesskopf Aktive Zellen Kultivierbare Bakterien Detektion aktiver Zellen in Wasserproben 10.000.000 Korrelation zu Zellzahlen: 0,98 7.000.000 8.000.000 6.000.000 Messignal Fluoreszenzintensität [cps] 8.000.000 5.000.000 4.000.000 6.000.000 4.000.000 3.000.000 2.000.000 2.000.000 1.000.000 0 0 a) 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 n = 3, 1-fache SD, 20 ml Filtrationsvolumen 4000 4500 0 100 µl BL1 5000 E. coli /ml c) 176 1 ml TW1 1060 1 ml TW2 1760 5 mL TW3 5300 10 mL TW4 10600 10 mL TW5 15000 100 µL OW2 aktive Zellen/Probe Abb. 5: Erste Ergebnisse des Praxistests. a) Linearität von Fluoreszenzsignal und Zellzahl, b) Ermittelte Zell­zahlen in Trink­wasserproben mit verschiedenen Assays, c) Lebendzellzahlbestimmung in Trinkwasser (TW) und in Rohwasser (OW) mit optischem Messaufbau 300 mm x 180 mm x 110 mm (Abb. 4). Um ihn zu evaluieren, verwendeten die Forscher zwei Typen kleiner Kunststoffkugeln, sogenannter Beads. Sie weisen eine mit Bakterien vergleichbare Größe auf und sind mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefüllt. Beide lassen sich mit blauem Licht mit einer Wellenlänge von 485 Nanometer anregen und emittieren daraufhin Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge von 520 Nanometer. Die zwei Beadtypen besitzen eine unterschiedliche Fluoreszenzintensität, die zum einen größer und zum anderen kleiner ist als die Intensität von zum Beispiel mit cFDA angefärbten Bakterien. So können je nach Beadtyp minimal 22 beziehungsweise 872 Beads, die sich auf der Oberfläche des Mikrofilters befinden, nachgewiesen werden. Wesentliche Voraussetzung um mit Bakterien eine ähnliche Nachweisgrenze zu erreichen ist, dass keine unspezifische Adsorption des Farbstoffs, der zum Anfärben der Bakterien verwendet wird, stattfindet und sich keine anderen fluoreszierenden Partikel im Bereich des Messfelds befinden. Vor allem unspezifische Bindungen von Farbstoffen an den Filter oder an Bestandteile der Probe sind problematisch, denn sie führen zu falsch positiven Messergebnissen. 30 Optik & Photonik April 2009 Nr. 1 Die Mikrofilter lassen sich nach Verschleiß problemlos austauschen, aber um weitere Kosten zu senken, integrierten die Forscher eine automatische Reinigungsprozedur, die sich an das Detektionsverfahren anschließt. Die Steuerung der einzelnen Komponenten sowie die Auswertung des Signals vom Detektor, dem Photomultiplier, erfolgt über einen Laptop-Computer mit einer selbst erstellten, auf LabView basierten benutzerfreundlichen Software. Sie ermöglicht unter anderem die Auswahl verschiedener Flüssigkeiten, Wahl von Pumpgeschwindigkeiten und -volumina sowie Wahl der Flussrichtung. Bakteriendetektor im Praxistest Seit Ende letzten Jahres bewährt sich das Testmuster des Forschungsverbundes im Praxistest. Bei EADS, am Regensburger Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene und am Institut für Wasserforschung in Dortmund untersuchen die Verbundforscher, inwieweit sich Bakterien mit dem OptoZellGerät zuverlässig nachweisen lassen. Dazu filtrierten die Institute zunächst ­definierte Konzentrationen an fluoreszenzgefärbten Modellorganismen und maßen deren Fluoreszenzintensität auf dem Filter. In diesem Fall griffen sie auf Escherichia coli zu- rück. Diese nahezu überall vorkommenden Fäkalbakterien eignen sich vor allem, weil sie sich leicht kultivieren lassen. Bisher verhält sich die Zellzahl in bestimmten Zellzahl­ bereichen (500–5000 Zellen/ml) zum gemessenen Fluoreszenzsignal linear. So gelingt den Forschern mit diesem unspezifischen Test zur Bestimmung der Gesamtzellzahl der Nachweis von minimalen Konzentrationen von etwa 500 Bakterien pro Milliliter bei einem Filtrationsvolumen von 20 Milliliter. Das entspricht ca. 10.000 Zellen auf dem ­Filter (Abb. 5 a). Die ersten Untersuchungen von nicht aufbereitetem Wasser (Rohwasser) und Trinkwasserproben zeigen, dass das Testmuster die Gesamtzellzahlen sowie die Anzahl aktiver Zellen in unterschiedlich beschaffenen Wasserproben effektiv und reproduzierbar erfasst. Hinsichtlich der erfaßbaren Bakterien erreicht es mit den ausgewählten Fluoreszenz-Assays im Vergleich zu den Standardkultivierungsverfahren eine sehr viel höhere Sensitivität der Bakteriendetektion in Trinkwasserproben (Abb. 5 b) [4]. Aufgrund der mikroskopisch detektierbaren Zellzahlen im Trinkwasser streben die Wissenschaftler jetzt Messbereiche ­zwischen 100 und 100.000 Zellen auf den Filtermembranen an. Je nach Volumen der © 2009 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Biophotonik eingesetzten Probe und nach weiteren ­Optimierungsschritten können somit auch Trinkwasserproben erfolgreich untersucht werden, die in der Regel nur einen sehr geringen Anteil an stoffwechselaktiven Bakterien aufweisen. In verschiedenen Versuchsreihen wiesen die Forscher einen linearen Anstieg der Messsignale mit steigenden Zellzahlen in unterschiedlichen Wasserproben nach. Dabei beobachteten sie Korrelationskoeffizienten bis 0,98 (Abb. 5 c). Danksagung Das Projekt Optozell wird vom BMBF im Rahmen des Forschungsschwerpunktes Biophotonik gefördert (Referat „Optische Technologien“). Wir danken außerdem den Herren Eberhard Rose und Thomas Ziemann für ihre Beiträge beim Herstellen der Mikrofilter und zum Aufbau des Labormusters. Benötigen Sie kundenspezifische FILTER oder KATALOGWARE? Referenzen Schnelle Kontrolle bisher Mangelware Der Hauptvorteil des fluoreszenzbasierten Filtrationsnachweises von Bakterien ist seine Schnelligkeit gegenüber der herkömmlichen Kultivierungsmethode. Die halbquantitative unspezifische Bakteriendetektion ist in wenigen Minuten möglich, während die Standardkultivierung ganze Tage in Anspruch nimmt [5]. Außerdem erlaubt der Bakteriensensor einen vollautomatischen Ablauf der Messungen, so dass kein hochqualifiziertes Personal und keine aufwen­ dige Laborausstattung notwendig sind. Veränderungen der Bakterienkonzentrationen lassen sich auf diese Weise sehr viel schneller und sensitiver erfassen, als es mit den bisher üblichen Standardkultivierungsverfahren möglich ist. Auch erweist sich diese Art des Zellnachweises hinsichtlich der erfaßbaren Bakterien in vielen Fällen als sensitiver. Bakterien, die im Wasser vorhanden sind, aber aufgrund vielfältiger Faktoren in ihrem Wachstum gehemmt sein können, werden mit Kultivierungsverfahren nicht zwingend erfasst. Trotz dieser Wachstumshemmung sind sie dennoch hygienisch relevant und im Wasser nicht erwünscht. Die Überwachung von Wasser wird angesichts der weltweiten Verknappung der Wasserreserven immer wichtiger. Methoden, mit denen die Qualität von Trink­wässern schnell und preisgünstig beurteilt werden können, erlauben eine intensivere Überwachung der Trinkwassersysteme. So könnte ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet des OptoZell Wassertests das zeitnahe Aufspüren von terroristischen Anschlägen mit Mikroorganismen auf die Trinkwasserversorgung sein. In kostensensitiven Bereichen oder in weniger entwickelten Ländern macht ein derartiges Testsystem eine Kontrolle der Wasserqualität überhaupt erst möglich. Laut UNICEF haben eine Milliarde Menschen auf der Welt keinen Zugang zu sauberem Wasser. Die fehlende Wasserinfrastruktur könnte OptoZell zwar nicht ersetzen, aber zumindest eine bezahlbare Methode bereitstellen, um krankmachendes Wasser von trinkbarem zu unterscheiden. [1]Rompre, A., Servais, P., Baudart, J., de-Roubin, M. R., Laurent, P., 2002. Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches. J Microbiol Methods 49, 31–54. [2] Gracias, K. S., McKillip, J. L., 2004. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can J Microbiol 50, 883–890. [3]Reidt, U., Chauhan, L., Müller, G., Molz, R., Lindner, P., Wolf, H., Friedberger, A., Reproducible Filtration of Bacteria with Micromechanical Filters. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, Volume 16, Number 4, December 2008, pp. 337–350 (14) [4]Venkateswaran, K., Murakoshi, A., Satake, M., 1996. Comparison of commercially available kits with standard methods for the detection of coliforms and Escherichia coli in foods. Appl Environ Microbiol 62, 2236–2243. [5]Brenner, K. P., Rankin, C. C., Sivaganesan, M., Scarpino, P. V., 1996. Comparison of the recoveries of Escherichia coli and total coliforms from drinking water by the MI agar method F&E Biomedizin Bildgebung OEM Laseranwendungen Schnelle Lieferung – kostenlose technische Beratung • Über 1300 Filter lagernd – Versand am gleichen Tag • Kundenspezif. Design & Beschichtung – über 25 Jahre Erfahrung mit Beschichtungsverfahren • Hohe Transmission, starke Blockung and the U. S. Environmental Protection Agency-approved membrane filter method. Appl Environ Microbiol 62, 203–208. mehr optik mehr technologie mehr service BENÖTIGEN SIE EIN ANGEBOT ODER EINEN KOSTENLOSEN KATALOG? DANN KONTAKTIEREN SIE NOCH HEUTE UNSER VERTRIEBSBÜRO! Tel Mail Web + 49 (0) 721-627 37-30 [email protected] www.edmundoptics.de
