Proteinabbau in der Zelle

Proteinabbau in der Zelle
Intrazelluläre Proteasen
Membran-Proteasen
Lysosomale
Proteasen
(Cathepsine)
Proteasom-System
(Zytosol / Nukleus)
Mitochondriale
Proteasen
Calpaine
Caspasen
Prozessierende
Proteasen
Die Halbwertzeit (t1/2) von Proteinen ist sehr variabel
Kurzlebige Proteine:
Ornithindecarboxylase:
<0,2 h
RNA-Polymerase I:
1,3 h
Tyrosin-Aminotransferase: 2,0 h
Serin-Dehydratase:
4,0 h
Langlebige Proteine:
Aldolase:
118 h
Cytochrom b:
130 h
Laktat-Dehydrogenase:
130 h
Immunglobulin G:
21 Tage
Aktin (Skelettmuskel):
ca. 3 Monate
Linsen-Crystallin:
>80 Jahre
(Dice and Goldberg, 1975)
Wann werden Proteine abgebaut?
• Geschädigte, denaturierte Proteine
• Aufrechterhaltung des Aminosäurepools
• Prozessierung von Vorläuferproteinen
• Signaltransduktion (Regulator-Proteine)
• Immunantwort
• Zellproliferation und Zelltod
Lysosom- und Proteasom-vermittelte Proteolyse
1. Endogene Proteine
2. Exogene Proteine
(Marker für
Abbau)
Proteasom-Weg
Peptidasen
Peptide, Aminosäuren
Endosom/
Lysosom-Weg
Lysosomen enthalten saure Hydrolasen
0,1-0,5 µM
pH 5,2
Proteasen
Nukleasen
Glycosidasen
Lipasen
Phospholipasen
Phosphatasen
Sulphatasen
H+
ATP
saure
Hydrolasen
Cathepsine
Cytosol pH 7,2
ADP + Pi
Area densa
elektronendichtes,
agglutiniertes Material
Proteindegradation im Lysosom
1-3: Heterophagie
4-5: Autophagie
Rezeptor-Liganden
Komplex
Plasmamembran
1.) Rezeptor-vermittelte
Endozytose
Exogenes Protein
2.) Pinozytose
3.) Phagozytose
Frühes
Endosom
Lysosom
Multiv esikuläre
s
Körperchen
4.) Makroautophagie
Mitochondrium
5.) Mikroautophagie
Autophagozytose bei Hunger
Invaginationsmembran
LC3 Marker
Autophagische
Vakuole
Autophagosom
LC3 Marker
Normal
Hunger
Aktuelle Forschung:
Gestörte Autophagie
und Tumorentwicklung
Das Ubiquitin-Proteasom-System
Ubiquitin
• Abbau von zelleigenen Proteinen.
• Selektiver und fein regulierter Prozess.
Su
2-Stufen Prozess:
bs
tra
t
1.) Substrat-Proteine werden für den Abbau
mit Ubiquitin-Molekülen markiert.
2.) Abbau erfolgt über das Proteasom.
Viele regulatorische Proteine werden
in ihrer Konzentration moduliert.
Proteasom
Nobel-Preis für Chemie 2004
”für die Entdeckung Ubiquitin-vermittelter Proteindegradation"
Aaron Ciechanover
Technion, Haifa
Avram Hershko
Technion, Haifa
Irwin Rose,
Irvine, CA, USA
„Der Verlierer“
Alexander Varshavsky
Auftrennung eines
Retikulozyten-Lysats:
• Fraktion 1: hitzestabil, ca. 9 kD,
(=Ubiquitin).
• Fraktion 2: hitzelabil (= Enzyme).
1.) ATP ist notwendig.
2.) Mischen der Fraktionen rekonstituiert proteolyt. Aktivität.
2 Komponenten beteiligt
Wie werden Substrate ausgewählt?
Ubiquitin: the kiss of death
•
•
•
•
•
•
“Stigma” für den Abbau.
8,5 kD (76 AS) Polypeptid.
vorhanden in allen
eukaryontischen Zellen.
hoch konserviert.
Lys48
Ub C-terminales Glycin bindet
kovalent an Lysin des Substrates
(Isopeptidbindung).
Lys-48 für Verknüpfung der
Polyubiquitinkette.
Lysin
C-Terminus
Gly76 wird mit e-NH2-Gruppe
bestimmter Lysine des Substratproteins verknüpft.
Die Ubiquitinylierung ist eine 3-Stufen-Reaktion
1.) E1: Ub-aktivierendes Enzym
2.) E2: Ub-konjugierendes Enzym
3.) E3: Ub-Protein Ligase
E3 erkennt das spezifische Targetprotein und transferiert Ub
auf Lys e-NH2-Gruppe des Substrates.
Das 26 S Proteasom, der “Schredder”
20S-Partikel
19S-Partikel
katalytisch
19S
(Deckel)
a
b
b
a
20S
(Kern)
19S
(Deckel)
S = Svedberg-Konstante
(Sedimentationskoeffizient)
regulatorisch
+
26S
Der Kern-Partikel (20S)
• 2 Kopien von 14 Proteinen.
• 7 Proteine bilden eine Ringstruktur.
• 4 Ringe (“donuts”) liegen übereinander.
• bestimmte ß-Proteine sind proteolytisch aktiv.
Die regulatorischen Partikel (19S)
• 2 regulatorische Partikel an jedem Ende.
• ebenfalls aus 14 Proteinen zusammengesetzt.
• dienen der Substrat-Erkennung u. Entfaltung.
Abbau im Proteasom
- Bindet Ub-konjugiertes Substrat.
- Isopeptidase spaltet Ub vom Protein.
- Unter ATP-Verbrauch wird Substrat entfaltet
(6 ATPasen im 19S-Partikel).
a
b
b
3 Threonin-Proteasen
a
 Proteasom ist multikatalytisch:
• Trypsin-Aktivität (Arg, Lys)
• Chymotrypsin-Aktivität (Tyr, Phe)
• Postglutamyl-Aktivität (Glu, Asp)
Kontrolle des Proteinabbaus über die AS-Sequenz
1.) Die N-End-Regel (Degrons)
• destabilisierende N-terminale AS (z.B. Arg, Lys, His)
• stabilisierende N-terminale AS (z.B. Ala, Gly, Met)
2.) „Destruction Box“ in mitotischen Cyclinen
3.) PEST-Sequenz
Proteine mit vielen Pro (P), Glu (E), Ser (S), Thr (T)
werden schneller abgebaut.
Aktivierung von Degradationssignalen
Beispiele:
Phosphoylierung
des Substratproteins
Dissoziation
eines Inhibitors
E1, E2 & E3
Hierarchie erhöht die Spezifität:
• E1: nur 1-3 Enzyme.
• E2: ca. 30 homologe Proteine, z.T. unterschiedliche
Lokalisation.
• E3: >300, oft selektiv für einzelne Substrate, mehrere Familien,
in unterschiedlicher E2/E3-Kombination, hochmolekulare
Komplexe (garantiert biologische Spezifität).
RING Finger E3-Ligasen
HECT E3-Ligasen
F-Box E3-Ligasen
E3 Ligasen werden auch aktiviert
Phosphorylierung
Liganden-Bindung
Allosterische
Aktivierung
Exkurs:
Proteinmodifikation durch Ub-verwandte Prozesse
• Mono- und Diubiquitinylierung.
• Sumoylierung
(Sumo: small ubiquitin-related modifier).
• Neddylierung (Nedd).
• Autophagosomen-Bildung (Apg-12)
• u.a.
Ub-verwandte Modifikationen werden:
• über E1, E2 und E3-Kaskaden reguliert.
• führen nicht zur Proteindegradation,
• oft antagonistisch zur Polyubiquitinylierung
• regulieren z.B. Transkription, Proteintargeting,
DNA-Reparatur, Endozytose u.a.
Übersicht:
Proteasom–vermittelte Proteolyse
in zellulären Prozessen
Elimination falsch gefalteter Proteine (ERAD)
Signaltransduktion, Transkriptionsfaktoren
Entzündungsregulation
Zellzyklusprogression
DNA-Reparatur
Programmierter Zelltod (Apoptose)
Circadiane Rhythmik (biologische Uhr)
Antigenprozessierung u. -präsentation (MHC-I)
Der Transkriptionsfaktor NF-kB wird durch
phosphorylierungsinduzierte Proteolyse aktiviert
Prinzip: Aktivierung von NF-kB durch Dissoziation seines Inhibitors
NF-kB-Aktivierung
durch Stressfaktoren:
• Zytokine
• Bakterien,Viren
verstärkte Aktivierung in:
• Entzündung: rheumatoide
Arthritis, Morbus Crohn.
• Tumoren, z.B.
Hodgkin-Lymphom.
Phosphorylierung des Inhibitors
IkB stimuliert Ubiquitinylierung.
IkB Degradation
NF-kB KernTranslokation
Targetgene: viele proinflammatorische und
anti-apoptotische Gene
Zellzyklus: Zyklischer Abbau von Cyclinen
Mitose-Phase
(Chromosomentrennung)
Gap-2
Cyclin-Abbau durch das Proteasom
aktiv
Gap-1
Cyclin B
Synthese-Phase
(DNA-Replikation)
Cdk1 (Cyclindependent kinase)
inaktive Cdk1
Proteasom und DNA-Reparatur
Tumorsuppressor p53: Wächter des Genoms
Normale Zelle
DNA-Schaden
STOP
p53:
Transkriptionsfaktor
Stabilisierung
STOP
p53
Abbau von p53 durch Mdm2
p53 E3 Ligase
Mdm2
Aktivierung von
p53 Targetgenen
p53
p53 Abbau
G1 Checkpoint
Sind DNA Schäden vorhanden?
Ist die Umgebung günstig?
Ist die Zelle groß genug?
Arrest,
Apoptose
DNA-Reparatur
Tumorsuppression
p53 ist in >50% von Tumoren mutiert u. inaktiv
Tumorzelle
STOP
p53
Mutation
Papillomviren
Kontrollpunkte defekt
E6
Mdm2
Amplifikation
E3 Ligase
E3 Ligase
E6-AP
Mdm2
p53
p53 inaktiv
STOP
p53
p53
p53 Abbau
p53 Abbau
G1 Checkpoint
Sind DNA Schäden vorhanden?
Ist die Umgebung günstig?
Ist die Zelle groß genug?
Arrest
Apoptose
Tumorgenese
Ein Proteasom-Inhibitor in klinischer Anwendung
Velcade® (Bortezomib)
• Zulassung: USA 1/2003, Europa 4/2004
für multiples Myelom.
• Zahlreiche klinische Studien für andere
Anwendungen
Knochenmarksausstrich
Multiples Myelom (Plasmacytom)
Targets von Velcade®/Bortezomib
 Hemmung des Zellzyklus (Cyclinabbau).
 Aktivierung der Apoptose (p53-Stabilisierung).
 Hemmung von NF-kB (Apoptose-Schutz blockiert).
In Zukunft:
Entwicklung selektiverer Wirkstoffe, z.B. spezifische E3-Ligase-Hemmer
Zusammenfassung
Lysosomen verdauen über Endosomen oder Autophagosomen
eingeschleuste Proteine.
Abbau endogener Proteine erfolgt i.d. R. über das fein regulierte
und selektive Ubiquitin/Proteasom-System.
Proteine werden unter ATP-Verbrauch durch Isopeptid-Bindung mit
mehreren Ub-Molekülen markiert (E1, E2, E3 Enzyme).
Unterschiedliche E2/E3-Enzyme garantieren biologische Spezifität.
Proteasom-vermittelter Abbau spielt eine regulatorische Rolle in
nahezu allen biologischen Prozessen.
Ub-verwandte Modifizierungen (z.B. Sumo) führen nicht zum
Proteinabbau, sondern besitzen andere Aufgaben.
Proteasom-regulierte Signalwege sind in verschiedenen
Erkrankungen gestört und bilden neue Drug-Targets.