RECENT TRENDS AND NOVEL CONCEPTS IN COFACTOR
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RECENT TRENDS AND NOVEL CONCEPTS IN COFACTORDEPENDENT BIOTRANSFORMATIONS S. Kara, J.H. Schrittwieser, F. Hollmann, M.B. Ansorge-Schumacher Applied Mikrobiology Biotechnology, 2014, 1517-1529 Nadja Kleisch 11.02.2015 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Inhalt Einleitung Biokatalysatoren Cofaktoren Cofaktor-Regeneration Relevanz Ergebnisse Besondere Cosubstrate Ganzzellsysteme Kaskaden-Reaktionssysteme Nicht natürliche Cofaktoren Zusammenfassung 2 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Einleitung 3 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Biokatalysatoren • Biomoleküle wie Enzyme, die biochemische Reaktionen beschleunigen, indem sie die Aktivierungsenergie der Reaktionen herabsetzen • gehen unverändert aus den Reaktionen hervor können viele Reaktionszyklen hintereinander katalysieren • Einsatz zu Biosynthese sowohl im akademischen als auch im industriellen Bereich Vorteile: • milden Reaktionsbedingungen • hohe Reinheit • enantioselektiv, stereoselektiv und regioselektiv 4 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 5 Biokatalysatoren • Seitenketten der Aminosäuren sind nicht dazu geeignet Elektronenaustauschreaktionen zu katalysieren Cofaktoren: • verschiedene Moleküle und Molekülgruppen, die für die Funktion von bestimmten Enzymen unerlässlich sind • solche katalysieren insbesondere Redoxreaktionen • alle Reaktionen die der Energiegewinnung dienen Redoxreaktionen: • ein Stoff A, der Elektronen abgibt (Reduktionsmittel, Donator) reagiert mit einem Stoff B, der diese Elektronen aufnimmt (Oxidationsmittel, Akzeptor) [11] 6 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Cofaktoren [7] Stoffname Funktionstyp ATP - liefert durch Abspaltung eines Phosphats Energie ADP NAD+ NADP+ FAD NADH NADPH FADH2 - überträgt Phosphat an das Substrat (Phosphatdonator) nimmt Phosphat vom Substrat entgegen (Phosphatakzeptor) Elektronen- und Protonenakzeptor, Oxidationsmittel Elektronen- und Protonendonator, Reduktionsmittel Flavin umkehrbar oxidier- und reduzierbar Bsp.: NAD-abhängigen Dehydrogenasen Alkoholdehydrogenase (ADH) [12} 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Cofaktor-Regeneration • Cofaktoren werden in stöchiometrische Mengen benötigt • sehr teuer geeignete Regenerationsverfahren • total turnover number TTN • gibt an wie viel Mol. Produkt pro Mol. Cofaktor hergestellt werden • technische Anwendung größer 103 Möglichkeiten: a) gekoppelte Substratprozesse b) gekoppelte Enzymprozesse c) Ganzzellsysteme • bspw. immobilisierte Alcaligenes eutrophus Zellen • katalysieren Reduktion von oxidiertem NAD+ mit molekularem Wasserstoff d) elektrochemische Methoden • Einsatz von Mediatoren z.B. Methylviologen • synthetische Verbindung, die als Elektronenakzeptor des Photosystems I der Photosynthese fungieren und O2 reduzieren 7 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 8 Cofaktor-Regeneration gekoppelte Substratprozesse: • gleiches Enzym • billiges Cosubstrat kostengünstiger Alkohol • GG auf Produktseite schieben Cosubstrat im großem Überschuss - schädigenden Einfluss, Enzyminhibierung gekoppelte Enzymprozesse: [5] • zwei unterschiedliche Enzyme • Bsp. Formiatdehydrogenase • GG auf Produktseite schieben Kohlendioxid ausgasen oder zu Kohlensäure abreagieren + hoher Umsatz ist möglich [5] 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Relevanz • in den letzten Jahren konnten einige Regenerationsverfahren etabliert werden Forschungsziel: • Suche nach leistungsfähigeren, günstigeren und umweltfreundlicheren Regenerationssystemen Zusammenfassung der neusten Methoden in diesem Bereich: • besondere Cosubstrate • Ganzzellsysteme • Kaskaden-Reaktionssysteme • nicht natürliche Cofaktoren 9 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Methoden 10 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Besondere Cosubstrate • Einsatz von thermodynamisch stabileren Coprodukten • 1,4-Butandiol als „smart cosubstrat“ • Enone als Cosubstrat • Verwendung von Enoat-Reduktase, ermöglich eine NADPH-unabhängige Reduktion von C=C Bindungen in Enonen (enthält C=O und C=C Bindung) • Alternative Bereitstellung von Aminogruppen bei der Transaminierung • Einsatz einer ω-Transaminase, hat PLP als Cofaktor der selbstregenerierend ist • es entsteht Keton und Aminosäure als Produkt • um GG auf Produktseite zu verschieben Tautomerisierung des Ketons • Cosubstrate als organische Phase • Einsatz eines Zweiphasensystems zur Herstellung organischer Produkte • Verwendung von Cosubstrat Octyl-Formiat und Coprodukt, sie sind hydrophob genug um eine nicht mischbare Phase im Wasser zu bilden 11 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 12 Einsatz von thermodynamisch stabileren Coprodukten Oxidation von sekundären Alkoholen mittels ADH: • zur Produktion von Ketonen • erfordert ein NAD(P)+ Regeneration • Verwendung von Cosubstrat Keton (z.B. Aceton) im Überschuss nach Kroutil et. al: • Verwendung von Chloraceton, statt Aceton • durch Wasserstoffbrückenbindung ist aktivierte Keton stabiler keine Rückreaktion • weniger Cosubstrat • weniger Abfall [6] 13 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 1,4-Butandiol als „smart cosubstrat“ • in situ Regeneration von reduzierten Nicotinamid-Cofaktoren, benötigt große Menge an Elektronen Donoren (z.B. EtOH) negativ: viel Abfall, Enzyminhibierung Alternativ: 1,4-Butandiol Bsp.: zusammen mit ADH/Enoat Reduktase oder Monoaysgenase zur der Reduktion von C=C oder C=O Doppelbindung [6] 1.4 Butandiol γ-Butyrolactone • thermodynamisch stabil • keine Rückreaktion • Bedarf an Cosubstrat geringer 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Biotransformation mittels Ganzzellsysteme Vorteile: • Cofaktor-Regeneration findet innerhalb der Zelle statt • keine externe Enzymproduktion und Aufreinigung • Schutz der Enzyme • mechanischer Stress • organische Lösungsmittel Nachteil: spezifische Aktivität und Selektivität nicht so hoch Zellen produzieren Nebenprodukte Metabolic Engineering 14 15 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Designer Zellen • Ausschalten von unnötige Stoffwechselwegen z.B. Produktion von Nebenprodukte • Überexpression der benötigten Enzyme Bsp: E. coli • Überexpression der Carbonyl-Reduktase aus Candida parapsilasis • Verwendung im rein organischem System Acetophenon organische Phase Verhältnis 30:70 Isopropanol 1-Phenylethanol Aceton [6] 16 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Kaskaden-Reaktionssystem • klassische Regenerationsmethoden produzieren große Mengen an Coprodukt wertlos, Abfall Lösung: a) Produktion von „wertvollen“ Coprodukten (parallel) b) Verwendung von zwei Enzymen mit unterschiedlichem Cofaktorverbrauch deren Einsatz aus synthetischer Sicht sinnvoll ist (linear) • Produkt wird in zwei Stufen aufgebaut kein Nebenprodukt A Enzym 1 Enzym 2 B C 17 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Lineares Kaskadensystem Bsp: • Transformation von racematischem Lactat in L-Alanin • Zwischenprodukts Pyruvat + kein Abfall/Nebenprodukt D und L Lactat-Dehydrogenase zur Pyruvat-Produktion Lactat Pyruvat Alanin-Dehydrogenase zur L-Alanin-Produktion L-Alanin [6] 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Nicht natürliche Cofaktoren • Cofaktoren spielen wichtige Rolle bei vielen Redoxreaktionen • teuer zu produzieren • empfindlich gegenüber Hydrolyse NAD(P)H-Analoga: • relativ kostengünstig Produktion vom reaktivem Teil des NAD(P)H • synthetische NAD(P)H-Analoga, unterschiedlicher Komplexität Problem: • synthetische Cofaktoren können aufgrund der strukturellen Änderung keine Bindung mit dem Enzym eingehen viele Reaktion nicht katalysierbar Anwendung: • Reduktion von prothetischen Gruppen wie Flavin Bsp.: synthetischer Cofaktor 1 a kann bis zu 40 mal schneller als das normale NADH den Cofaktor FAD regenerieren 18 19 Flavin-Analoga: • Flavin-Analoga haben verschiedene Substituenten am Isoalloxazin-Ring [6] • Verwendungsmöglichkeiten bei der Oxidationen in der Organokatalyse • großen Einfluss auf katalytische Aktivität der Enzyme Übertragung von Elektronen Bsp.: • Massay and Coworkers haben Desaturase Aktivität auf „old yellow enzyme“ aus der Hefe übertragen unter Einsatz des synthetischen Cofaktors 8-cyano-8-demethyl-FMN • Desaturase- Aktivität ist die Fähigkeit Elektronen von einem Molekül auf ein anderes übertragen können und dabei das Substrat entsättigen OYE [6] u. [10] [2] 20 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 Zusammenfassung • Biokatalysatoren benötigen zum katalysieren von Redoxreaktionen Cofaktoren in stöchiometrischer Menge • Produktion der Cofaktoren ist teuer Regenerationsysteme klassisch: a) gekoppelte Substratprozesse (ein Enzym, ADH, Coprodukt) b) gekoppelte Enzymprozesse (zweites Enzym z.B. Formiatdehydrogenase) Verbesserung durch: • besondere Cosubstrate • Ganzzellsysteme • Kaskaden-Reaktionssysteme • nicht natürliche Cofaktoren Chloraceton, 1,4 Butandiol Designerzellen L-Alanin-Produktion Cofaktoranaloga Ziel: leistungsfähigere, günstigere und umweltfreundlichere Regenerationssysteme 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 21 Literatur und Quellen [1] U. Kragl, W. Kruse, W. Hummel, C. Wandrey; “Enzyme engineering aspects of biocatalysis: Cofactor regeneration as example” Biotechnology and Bioengineering, Vol. 52, 2, 309-319, 1996 [2] http://goo.gl/LJZTB7 (zuletzt überprüft am 10.02.15) [3] http://goldbook.iupac.org/C01128.html (zuletzt überprüft am 10.02.15) [4] Braun, Matthias, Olav Teichert, and Axel Zweck. 2006. “Biokatalyse in Der Industriellen Produktion.” Zukünftige Technologien 57: 7–66. [5] Hildebrand, Falk. 2009. “Prozessentwicklung Zur Enzymatischen Synthese Chiraler Alkohole Unter Elektrochemischer Cofaktorregenerierung.” Dissertation. [6] Kara, Selin, Joerg H. Schrittwieser, Frank Hollmann, and Marion B. Ansorge-Schumacher. 2014. “Recent Trends and Novel Concepts in Cofactor-Dependent Biotransformations.” Applied Microbiology and Biotechnology 98: 1517–29. [7] “Kofaktoren Teil I.” Uni Marburg: 1–21. [8] Meah, Y, and V Massey. 2000. “Old Yellow Enzyme: Stepwise Reduction of Nitro-Olefins and Catalysis of Aci-Nitro Tautomerization.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 10733–38. [9] Schroer, Kirsten, Von Der Fakultät Mathematik, and Informatik Naturwissenschaften. 2008. “Ganzzellbiotransformationen Mit Rekombinanten Escherichia Coli Zur Synthese Chiraler Alkohole.” Naturwissenschaften. [10] Xu, D, R M Kohli, and V Massey. 1999. “The Role of Threonine 37 in Flavin Reactivity of the Old Yellow Enzyme.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(March): 3556–61. [11] http://de.wikipedia.org/wiki/Redoxreaktion [12] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/_media/a:alkoholdehydrogenase.png 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015 22 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
