Extrazelluläre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum und Apoptose

U. Albrecht
Extrazelluläre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum und
Apoptose
U. Albrecht
1. Extrazelluläre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum
Einzelliger Organismus -> Teilung -> neues Individuum
-> natürliche Selektion begünstigt die Zellen welche:
1) am schnellsten wachsen
2) schlechte Zeiten am besten überleben.
-> Proliferation ist beeinflusst nur von Nährstoffangebot und Sex.
Mehrzellige Organismen -> Selektion nicht auf Ebene jeder Einzelzelle sondern auf dem Zellverband
-> Zellverband unterliegt strikten Kontrollen welche Proliferation verhindern.
-> im adulten Organismus teilen sich Zellen nicht -> in Ruhephase
-> Ausführen spezialisierter Funktionen.
-> Nährstoffe normalerweise im Ueberfluss
-> Zellen müssen gebremst werden nicht zu proliferieren, dagegen würden
Bakterein und Hefen unter diesen Bedingungen prolifereiern.
-> was ist Unterschied in der Regulation?
Für mehrzellige Organismen Nahrung für Zellen alleine nicht genug für Zellteilung
-> Zellen müssen positives Signal von anderen Zellen erhalten.
-> Wachstumsfaktoren
-> binden an Rezeptoren der Zelloberfläche
-> intrazelluläre negative Signale werden übergangen.
Hefe:
Zelleproliferiert ausser negatives Signal wird erhalten
Tierzelle: Zelle stopt ausser postives Signal wird erhalten.
U. Albrecht
4 Fragen:
1) Wie ist Säugerzellzykluskontrollsystem
2) Wie ist Proliferation kontrolliert
3) Was sind die Extrazellulären Signale
4) Wie überstimmen diese Signale das intrazelluläre Blockiersystem?
U. Albrecht
Regulation des Säugerzellzyklus wird mit kultivierten Zellinien studiert
Säugerzellen teilen sich in Kultur nur etwa 50 mal, dann Zelltod -> senescence
Allerdings: in Kulturen -> wenige Zellen entrinnen Zelltod
-> teilen sich unbegrenzt => Zelllinie
-> sehen aus wie normale Zellen aber Achtung:
Nachteil: Abnormal -> mindestens 1 Mutation
Vorteil:
Unlimitiertes Zellmaterial -> standardisiert und genetisch homogen
Wachstumsfaktoren stimulieren die Proliferation von Säugerzellen
Säugerzellen -> Kulturmedium mit Nährstoffen -> wachsen nicht !!
-> + Serum -> Wachstum !
Vergleiche: Hefe keine Nährstoffe -> Zellzyklusarrest
Säugerzellen kein Serum -> Zellzyklus arrest -> G0
Was ist Serum ? -> Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration (10-9 - 10-11 M)
Einer der ersten aufgereinigten Wachstumsfaktoren = platelet-derived growth factor
(PDGF)
U. Albrecht
Platelets sind kleine Zellen ohne Nukleus. Sie
zirkulieren im Blutstrom und helfen die Blutgerinnung an geschädigtem Gewebe zu stimulieren.
Dadurch wird übermässiges Bluten verhindert.
Platelets sezernieren auch Faktoren die Heilung
stimulieren.
Im Bild ist ein aufgeschnittenes Platelet (Blutplättchen)
gezeigt um die sekretorischen Vesikel zu zeigen.
Einige dieser Vesikel enthalten den sogenannten
platelet derived growth factor (PDGF).
Serum
Serum = Ueberstand nach Koagulation
Plasma
Plasma = Ueberstand ohne Koagulation
Warum dieser Unterschied? Platelets sekretieren ihren Inhalt, wenn sie in den Blood
Clot eingeschlossen werden -> PDGF gelangt ins Serum
U. Albrecht
Mitogene -> Zellteilung
Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum Survival Factors -> suprimieren Apoptose
U. Albrecht
Wachstumsfaktoren haben spezifische Rezeptoren
Growth
Factor
Receptor
Kombination von mehreren Faktoren
wichtig für viele Zelltypen
Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration -> Isolation über Identifikation der DNA
U. Albrecht
Serum Deprivation verhindert Durchgang von G1 Checkpoint
Zellkulturen -> beobachten mit time-lapse Video
-> experimentelle Behandlung -> Effekt
z.B.
-> Serum weg für 1 Stunde -> dramatischer Effekt
Videographischer Referenzpunkt: Mitose
3.5 h nach
Mitose Serumentzug
gehen in G0
+ Serum
mehr als 3.5 h nach
Mitose Serumentzug
Cycle geht weiter
Zellen sind commited
dauert 8 Stunden
G1 checkpoint ist 3.5 Stunden von Mitose weg!
Wachstumsfaktoren kritisch zwischen Mitose und G1-Checkpoint !
-> wenn Serum entfernt -> Protein Synthese geht runter
weil Protein Synthese inhibitoren (Cycloheximide) in später G2
-> Zellen durch Mitose -> Stop in G1
U. Albrecht
3.5 h
Serumentzug
S
G2
M
G1
Cycloheximide
G1-Checkpoint Maschinerie ist nötig für G1-S Transition
aber nicht für Mitose
U. Albrecht
Benachbarte Zellen kompetitieren für Wachstumsfaktoren
Zellproliferation muss reguliert weil damit:
Regulation abhängig von:
1) Anzahl Zellen
2) räumliche Anordnung sichergestellt ist.
1) Zell-Zell Interaktionen
2) Kontakt zu extracellulärer Matrix
z.B. Epithel -> Zellen sterben -> müssen ersetzt werden und in Platz passen. Nur Zellen die
in Kontakt sind mit basal lamina proliferieren
-> messen
1) Zelldichte
2) Kontakt zu basal lamina
Meiste Experimente mit Fibroblasten -> nur bedingt übertragbar auf Organe.
U. Albrecht
Dissozierte Zellen
-> kultivieren in Schale -> heften sich an
-> wachsen zu konfluentem Monolayer -> dann Stop
=> zelldichteabhängige Inhibition der Zellteilung
Wounding experiment:
Kontakt Inhibition?
U. Albrecht
-> nicht nur Kontakt sondern Menge von Wachstumsfaktoren ist wichtig
Zelldichte abhängige Inhibition -> Fähigkeit der Zelle lokale Wachstumsfaktorkonzentration
zu ändern.
z.B. PDGF -> 10-10M = ca. 1 Molekül in Kugel mit 3 m Durchmesser
Fibroblast hat etwa 105 PDGF Rezeptoren -> kann alles PDGF in der Umgebung
von Kugel mit 150 m Durchm. binden.
eine Zelle kann Umgebung von PDGF befreien -> Kompetition zwischen Zellen
-> viele Zellen -> kein freies PDGF mehr
-> Proliferationsstop.
U. Albrecht
Normale Tierzellen müssen verankert sein um Start zu passieren
Kompetition für Wachstumsfaktoren nicht einziger Einfluss auf Proliferation -> Form der Zelle wichtig!
Fibroblasten und Epithelzellen -> teilen sich nicht wenn in Suspension
Anchorage dependence of cell division
Gut ausgebreitete Zellen -> grössere Oberfläche -> mehr Wachstumsfaktoren und Nahrung -> teilen
sich besser
Focal adhesion point genügt -> Intracelluläre actin filamente + extracelluläre matrix Moleküle
Proliferation ist gekoppelt an die
Organisation des Zytoskelets.
Lamin und Fibronektin -> können als
Wachstumsfaktoren wirken.
Zelle in Zyklus -> M-Phase rund
-> G1 flach
-> attachement und detachement
-> wichtig um neugenerierte Tochterzellen in den Zellverband einzubetten.
U. Albrecht
Das Studium von Krebszellen offenbahrt Gene wichtig für Zellzykluskontrolle
Externe Einflüsse wie Wachstumsfaktoren und Zellform
-> Wie übersetzt in molekulare Sprache?
Effekte auf
Zellkern und
Proliferation
Wachstumsfaktor
Bindet an Rezeptoren
Studium von Krebszellen die ein Gen
mutiert haben oder
mehrere
können proliferative Gene sein -> Assembly control System
oder antiproliferative Gene
-> Disassambly of control System
Mutiertes Gen = Oncogen (gleiches Gen ohne Mutation = Proto-oncogen)
Wenn mutiert = Tumor-suppressor Gene
U. Albrecht
Zellzyklus Progression ist koordiniert mit Zellwachstum in Hefe
In Hefe Nahrungsangebot und Zellgrösse gekoppelt an Zellteilung (siehe vorher)
Wie kann Grösse gemessen werden?
In Hefe möglicherweise über messen von G1 cyclin das parallel zum Wachstum synthetisiert wird. Hypothet.
Cln3 Bindeprotein auf DNA konstant -> von gewisser Grösse an Cln3 frei -> Zellteilung.
U. Albrecht
Zellwachstum und Zellteilung kann unabhängig reguliert werden in Säuger Zellen
Hefe: Verhältnis Cytoplasma/DNA starr
Säuger: Verschiedene Zelltypen mit spezialisierter Funktion -> Verhältnis Cytoplasma/DNA
variabel
Wie wird dann in Säugerzellen Zellteilung Reguliert?
spezielle Wachstumsfaktoren die entweder Wachstum oder Replikation beeinflussen.
z.B. Neuronen
-> können sehr viel wachsen ohne sich zu teilen
-> nerve growth factor (NGF) von zu enervierenden Zellen sezerniert
-> Wachstum des Neurons in die Richtung der sezernierenden Zelle.
Grösse eines Organs: Anzahl Zellen + Grösse der Zellen
Reguliert durch Zellwachstum, Zellteilung und Zelltod (Apoptose)
Moleküle die dies regulieren: Sekretierte Proteine, Zelloberflächen Strukturen, Extrazelluläre
Matrix
Eingeteilt in:
1) Mitogene -> Zellteilung
2) Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum
3) Survival Factors -> suprimieren Apoptose
U. Albrecht
Zellen können Teilung verzögern durch Eintritt in Ruhephase
Säugerzellen in Kultur -> kein Serum (Growth factors) -> machen Zyklus fertig bis G1,
dann Stop -> G0
G0 -> Protein Synthese reduziert, nur noch ca. 20%
Auch Nahrungsmangel führt zu Stop -> G0
Hefe -> G1 checkpoint -> Start
Säugerzellen -> Nahrung im Ueberfluss -> Wachstumsfaktoren kritisch
-> Eintritt in G0 -> Variabilität in Zellzyklus verschiedener Zelltypen
z.B.
Neuronen, Muskelzellen
teilen sich nie
Leberzellen
ca. 1x im Jahr
Epithelzellen, Darm
2x pro Tag
Diese Angaben aber variabel -> abhängig von Umständen (z.B. Verletzungen)
-> Variation im Zellzyklus in Säugerzellen zwischen M und G1
aber S-Phase bis Mitose sehr konstant (ca 12-24 h)
G1 checkpoint spezifische Kontrolle
U. Albrecht
Zellteilung: Mitogene stimulieren G1-Cdk und G1/S-Cdk Aktivitäten
+ Max -> heterodimer formation to activate target genes.
U. Albrecht
Abnormale Proliferationssignale führen zu Zellzyklusstop oder Zelltod
Krebsfördernde Gene = Onkogene
z.B. Ras, Myc
Mutationen in diesen Genen
->Ueberproliferation
in Experiment jedoch nicht
beobachtet -> Checkpoints -> abnormale Proliferation wird erkannt
-> wie dies genau geschieht ist
nicht bekannt. Assoziation mit
p19ARF
Krebs entsteht nur dann, wenn auch Schutzmechanismus inaktiviert wird.
d.h. mehrere Mutationen müssen akkumulieren z.B. in Ras + p53 oder Myc + p19ARF
U. Albrecht
Zellwachstum: Wachstumsfaktoren stimulieren Zellwachstum
Beispiel für Signaltransduktion von äusserem
Signal zum Zellkern.
1. aktivierte Kinase
2. aktivierte Kinase
early response und
delayed reesponse genes.
U. Albrecht
Wahrscheinlichkeit in G0 einzutreten wächst mit der Anzahl von Zellteilungen einer Zelle:
Zellalterung - Senescence
Zellproliferation:
1) Umgebung
2) Langzeitgeschichte der Zelle
Dies gilt für somatische Zellen, Stammzellen sind davon ausgenommen
z.B. Fibroblasten (Mensch) -> embryonal -> 50 Teilungen
40 - Jährig -> 40 Teilungen
80 - Jährig -> 30 Teilungen
Teilungsfähigkeit korreliert mit Alter.
Verschiedene Erklärungen für Zellalterung:
1)
2)
3)
Akkumulation von Mutationen (Replikation unpräzise)
Mechanismus der vor Krebs schützen soll da alte Zellen sterben
Telomere am Ende der Chromosomen werden verkürzt durch jede Zellteilung
Nur in Stammzellen Telomerase welche die Verkürzung repariert.
Alterung der Zelle jedoch nicht strikt vorprogrammiert, da aus derselben Population
einige sich mehr teilen können als andere.
U. Albrecht
Aufheben der replikativen Zellalterung durch Expression von Telomerase
Menschliche Zellen haben ein eingebaute Limitation für Teilung
Fibroblasten teilen sich 25-50 mal -> dann nicht replikativer Zustand
= replikative Senescence
Telomere -> werden bei jeder Replikation verkürzt
-> Telomerase behebt Verkürzung
Aber im Menschen Telomerase in meisten Zellen inaktiviert = Schutz
vor unendlicher Replikation (Krebszellen haben Telomerase re-aktiviert)
U. Albrecht
2. Programmierter Zelltod - Apoptosis
Multizellulärer Organismus -> Kontrolle der Zellteilung und des Zelltodes
-> ungebrauchte Zellen sterben
Entwickelndes Nervensystem: mehr als die Hälfte der Zellen stirbt
Erwachsener Mensch: billionen von Zellen sterben im Knochenmark und im Darm jede Stunde
Wozu ist dieser massive Zelltod gut?
U. Albrecht
1) im entwickelnden Organismus
Ausbildung der Finger in der entwickelnden Mauspfote durch Apoptose
Die Pfote wurde mit Farbstoff behandlet der
spezifisch Zellen in Apoptose grün färbt.
Die apoptotischen Zellen erscheinen als leuchtend
grüne Punkte zwischen den Fingern.
Dieser Zelltod eliminiert das Gewebe zwischen
den sich entwickelnden Fingern.
U. Albrecht
in der Qaulquappe des Frosches stirbt der Schwanz während der
Entwicklung ab
U. Albrecht
entwickelndes Nervensystem:
Regulation der Zellzahl -> Anzahl Nervenzellen = Anzahl Zielzellen
Kompetition der Zellen (Neuronen) für Ueberlebendsfaktoren welche von Zielzellen sezerniert werden.
U. Albrecht
2) im erwachsenen Organismus
Zelltod um Zellteilung auszugleichen damit die Zellzahl konstant bleibt.
-> sonst würden Gewebe und Organe wachsen oder schrumpfen.
Leber -> entfernen eines Teils
-> wächst nach (Proliferation wird angeregt)
-> Behandlung von Ratten mit Pentobarbital
-> induziert Zellwachstum in der Leber
-> Leber vergrössert sich
-> absetzen von Pentobarbital
-> Leber apoptosis -> Ausgangsgrösse
Regulation der Todes und Geburtsrate von Zellen wichtig für mehrzellige
Organismen
U. Albrecht
Zelltod - Nekrose oder Apoptose
in Kulturschale
NeKrose:
Zelle platzt und schüttet den
Inhalt in die Umgebung ->
Inflammation dies geschieht z.B.
bei Verletzungen
im Gewebe
Apoptose:
Zelle stirbt kontrolliert. Inhalt gelangt nicht in die Umgebung -> Nachbarzellen werden
nicht beschädigt.
Zytoskelet kollabiert, Nuklearmembran löst sich auf, DNA fragmentiert -> Zelloberfläche
verändert sich -> Signal für Phagocytose durch benachbarte Zellen -> Zellinhlat
wird recycliert.
U. Albrecht
U. Albrecht
Maschinerie der Apoptose
Proteolytische Kaskade durch Caspasen
Caspasen = Proteasen mit Cys in aktivem Zentrum
-> spaltet Zielproteine an Asparaginsäure Resten
=> Name Caspasen
Caspasen werden synthetisiert als Procaspasen
aktiviert durch andere Caspasen
=> amplifizierende proteolytische Kettenreaktion
Zielproteine: nukleäre Lamine
DNAsen
=> effizienter Selbstzerstörungsmechanismus
-> vergleichbar einem Zustand im Zellzyklus
-> alles oder nichts Entscheid
-> irreversibel
U. Albrecht
Die Caspase - Kaskade in Apoptosis
Jede Zelle hat Quelle für Selbstzerstörung
in sich in Form der Procaspase
Wie werden sie aktiviert ?
-> Adaptorproteine die initiator Procaspasen
in einen Komplex aggregieren.
2 möglichkeiten der Aktivierung:
1)
jede Procaspase kleine Aktivität -> in
Komplex -> reicht um sich gegenseitig
zu aktivieren -> Lawine
2)
Aggregation -> Konformationsänderung
-> Aktivierung der Procaspasen
-> Amplifikation des Death Signals
U. Albrecht
Die Aktivierung von Procaspasen kann von aussen induziert werden
Death Rezeptoren: z.B. Fas Killer Lymphocyten -> Fas - Ligand -> binden an Zellen
mit Fas
U. Albrecht
Aktivieren der Apoptose von innen
= intrinsischer Pathway
bei Zellschädigungen oder Stress (z.B. Radikale) -> initiation des Selbstzerstörungsprogramms
-> wichitges Organell in diesem Zusammenhang sind die Mitochondrien.
DNA Beschädigung kann auch Apoptose induzieren -> p53 aktiviert transkription von Genen
deren Produkte das Entrinnen von Cytochrom C aus dem Mitochondrium begünstigen.
=> Bcl-2 family members
U. Albrecht
Bcl-2 = anti-apoptotic
p53 = pro-apoptotic
U. Albrecht
Wie survival Faktoren Apoptose unterdrücken
siehe Neuronale apoptose