Expression von regulatorischen T-Zellen beim genitalen Lichen
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Aus der Dermatologischen Klinik im St.-Josef-Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. P. Altmeyer Expression von regulatorischen T-Zellen beim genitalen Lichen sclerosus Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Doreen Belz aus Potsdam 2013 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: PD Dr. med. T. Gambichler Korreferent: Prof. Dr. med. C. Szliska Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2013 Meinen Eltern gewidmet -in Liebe und Dankbarkeit- Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung-----------------------------------------------------------------------------------4 1.1 Lichen sclerosus----------------------------------------------------------------------------4 1.1.1 Geschichte------------------------------------------------------------------------4 1.1.2 Definition, Manifestation und Lokalisation----------------------------------5 1.1.3 Klinisches Bild-------------------------------------------------------------------6 1.1.4 Ätiologie--------------------------------------------------------------------------9 1.1.5 Diagnose------------------------------------------------------------------------14 1.1.6 Therapie-------------------------------------------------------------------------14 1.2 Histologie----------------------------------------------------------------------------------16 1.2.1 Gesunde Haut-------------------------------------------------------------------16 1.2.2 Histologische Veränderungen beim Lichen sclerosus--------------------17 1.3 Regulatorische T-Zellen------------------------------------------------------------------22 2 Fragestellung und Ziel der Studie-----------------------------------------------28 3 Methodik----------------------------------------------------------------------------------29 3.1 Probanden----------------------------------------------------------------------------------29 3.2 Biopsieentnahme--------------------------------------------------------------------------30 3.3 Ablauf der histologischen Gewebebearbeitung---------------------------------------31 3.4 Zählung der angefärbten Zellen---------------------------------------------------------32 3.5 Statistische Analyse-----------------------------------------------------------------------33 4 Ergebnisse--------------------------------------------------------------------------------39 4.1 CD4-----------------------------------------------------------------------------------------39 4.2 TGF-β1-------------------------------------------------------------------------------------39 4.3 IL-10----------------------------------------------------------------------------------------40 4.4 FOXP3--------------------------------------------------------------------------------------40 4.5 Tabellen und Abbildungen---------------------------------------------------------------42 5 Diskussion---------------------------------------------------------------------------------45 6 Zusammenfassung---------------------------------------------------------------------50 7 Literaturverzeichnis------------------------------------------------------------------51 -1- Abkürzungsverzeichnis LS Lichen sclerosus LP Lichen planus SCC Squamous cell carcinoma, Plattenepithelkarzinom HPV Humanes Papillomvirus CIS Carcinoma in situ CD Cluster of differentiation HLA Humanes Leukozytenantigen ECM Extrazelluläres Matrixprotein FOXP3 Forkhead box protein 3 TReg Regulatorische T-Zelle IFN Interferon CXCR CXC-motif chemokine receptor CXCL CXC-motif chemokine ligand CCR Chemokine receptor CCL Chemokine ligand Th T-Helfer-Zelle miR-155 MicroRNA 155 LSX Lichen simplex VIN Vulväre intraepitheliale Neoplasie UVA-1 Ultraviolet A1 TGF Transforming growth factor IL Interleukin M. Musculus Ig Immunglobulin C3 Complement component 3 C3c Complement component 3 fragment TIA T-cell intracellular antigen GrB Granzyme B mRNA Messenger Ribonukleinsäure IP Interferon-gamma induced protein TNF Tumornekrosefaktor -2- ICAM Intercellular adhesion molecule CD45RB Isoform of CD45 with exon 5 splicing (encodes B determinant) CTLA Cytotoxic T-lymphocyte antigen GITR Glucocorticoid-induced tumor-necrosis-factor-receptor-related protein z.B. Zum Beispiel Nt5e Ecto-5'-nucleotidase IPEX Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, Xlinked CpG Phosphodiesterverbindungen zwischen Cytosin und Guanin TCR T-cell receptor APC Antigen präsentierende Zelle PAMP Pathogen asscociated molecular patterns TLR Toll like receptor IL-2-R Interleukin-2 receptor MHC Major histocompatibility complex JAK-STAT Januskinase-signal transducers and activators of transcription MAPK Mitogen-activated protein kinase WLS Weibliche LS Patienten MLS Männliche LS Patienten HIER Heat-induced antigen (epitope) retrieval LSAB Labeled Streptavidin Biotin ANOVA Analysis of variance Bzw. Beziehungsweise Vs. Versus -3- 1 Einleitung 1.1 Lichen sclerosus 1.1.1 Geschichte Zum ersten Mal wurde der Lichen sclerosus (LS) von François Henri Hallopeau 1887 in seinem Werk „Du lichen plan et particulièrement de sa forme atrophique: lichen plan scléreux“ beschrieben (Hallopeau, 1887). Er beschrieb den LS darin als Variante des Lichen planus (LP). Tatsächlich haben beide Erkrankungen viele Gemeinsamkeiten. Es können ausschließlich genitale Läsionen auftreten, das histologische Bild ist sehr ähnlich, beide zeigen gleichartige Hautveränderungen, weisen das Köbner Zeichen auf und können simultan vorkommen, was auf eine gemeinsame Pathogenese schließen lässt (Grussendorf, 1977; Conelly et al., 1985; Marren et al., 1994; Lessani et al., 1998; Holmes et al., 1998; Sawamura et al., 1998). Zudem konnte in einer Studie gezeigt werden, dass die Anzahl der verschieden exprimierten Gene zwischen dem LS und dem LP nur 10% der unterschiedlich exprimierten Gene zwischen dem LS und gesunden Kontrollen oder dem LP und gesunden Kontrollen beträgt (Terlou et al., 2012). 1976 proklamierte die „International Society for the Study of Vulvovaginal Disease (ISSVD)“ die Änderung des Namens von Lichen sclerosus et atrophicus in Lichen sclerosus, da nicht in allen Fällen eine histologische Atrophie gesichert werden konnte (Friedrich Jr., 1976). Die Sklerose jedoch ist das typische Erkennungsmerkmal des LS und stets vorhanden. Seitdem ist „ Lichen sclerosus“ der offizielle medizinische Terminus, obwohl weiterhin viele Synonyme wie „Weißfleckenkrankheit“, „Morphoeid scleroderma“, „Kartenblattförmige Sklerodermie“, „Lichen plan atrophique“, „Lichen plan scléreux“, „Lichen planus sclerosus et atrophicus“, „Lichen albus“, „White spot disease“, „Ichthyosis“, „Dermatitis lichenoides chronica atrophicans“, „Leukoplakie“, „Dystrophie“, „Kraurosis vulvae“ bei Frauen oder „ Balanitis xerotica obliterans“ bei Männern geläufig sind (Ridley et al., 1989; Meffert et al., 1995). -4- 1.1.2 Definition, Manifestation und Lokalisation Der LS ist eine erworbene, nicht infektiöse, chronisch entzündliche Bindegewebserkrankung, die hauptsächlich Frauen betrifft. Je nach Studie ist eine Frauen-Männer Ratio von 10:1, über 5:1 bis zu 1:1 angegeben (Meffert et al., 1995; Powell und Wojnarowska, 1999). Laut Meffert et al. mag der LS bei Männern aber weitaus häufiger als bisher bekannt vorkommen. Histopathologische Untersuchungen der Vorhaut von Männern, die aufgrund einer Phimose operiert wurden, zeigten ein signifikantes Vorkommen des LS von 3,6-19% (Meffert et al., 1995). Zusätzlich dazu zeigte Chalmers auf, dass 14 von 100 zur Beschneidung vorgestellten Jungen an LS leiden (Chalmers et al., 1984). Dennoch wurden die meisten Studien über den LS an Frauen durchgeführt, was auch eine Erklärung für die stark erhöhte Ratio sein kann. Der LS verläuft in Schüben und ist bis dato nicht heilbar. Er manifestiert sich bei Kindern meist zwischen dem 5.-11. Lebensjahr (Altmeyer und Hoffmann, 2006) und bei Erwachsenen im mittleren Lebensalter. Dabei sind Frauen häufig erst während oder nach der Menopause betroffen, also vorwiegend im 5.-6. Lebensjahrzehnt (Braun-Falco et al., 1984; Altmeyer und Hoffmann, 2006). Kinder sind zwischen 10% (Meffert et al., 1995) und 20% (Reich et al., 2007) der Fälle betroffen. Genitale und seltener extragenitale weißliche Hautverfärbungen sind kennzeichnend für den LS. Das extragenitale Auftreten schwankt je nach Studienlage zwischen 10% (Altmeyer und Hoffmann, 2006) bis zu 20% (Reich et al., 2007). Mischformen genitaler und extragenitaler Hautveränderungen können auftreten, wobei signifikante klinisch-pathologische Unterschiede zwischen beiden Formen bestehen (Carlson et al., 1998a). Bei Frauen sind im Genitoanalbereich die Labien, die Klitoris, die Klitorisvorhaut und der Analbereich betroffen. Bei Männern ist die Beteiligung von Präputium und Glans penis bezeichnend, jedoch ist bisher keine Involvierung des Perianalbereichs, wie bei Frauen, bekannt (Powell und Wojnarowska, 1999). Extragenital manifestiert sich der LS hauptsächlich prästernal, sub- und intermammär, an den Unterarmbeugeseiten, den Handgelenken, den Innenseiten der Oberschenkel, den Schultern, der seitlichen Halspartie, dem Rücken, in der Schlüsselbeingegend und gelegentlich auch an der Mundschleimhaut (Braun-Falco et al., 1984; Macleod et al., 1991; Powell und Wojnarowska, 1999; Altmeyer und -5- Hoffmann, 2006). In seltenen Fällen ist über ein Vorkommen an der Kopfhaut, den Handflächen und den Fußsohlen, dem Skrotum, in der infraorbitalen Region oder in Läsionen der vernarbenden Alopezie und in Acrochordonen berichtet worden (Fabry, 1928; Klenk-Pfeifer, 1974; Petrozzi et al., 1979; Foulds, 1980; Weigand, 1993). Bei Verdacht auf LS sollten daher alle Prädilektionsstellen, auch die Extragenitalen, untersucht werden. Der LS ist eine seltene Erkrankung, obwohl die genaue Anzahl der Erkrankten unbekannt ist. Dies mag zum einen daran liegen, dass der LS auch unter Ärzten recht unbekannt ist und bei Symptomen verschiedene Spezialisten aus der Gynäkologie, der Urologie, der Pädiatrie oder der Dermatologie kontaktiert werden. Diese verwenden je nach Fachgebiet unterschiedliche Untersuchungsmaßstäbe und Terminologie. Zum anderen kann es daran liegen, dass sich viele Menschen schämen, mit einer Erkrankung im Genitalbereich einen Arzt aufzusuchen. Von Beginn der ersten Symptome bis zur Diagnosestellung können nicht selten Monate bis Jahre vergehen. So ist es wahrscheinlich anzunehmen, dass die Dunkelziffer an Erkrankten weit höher als bisher bekannt ist. Die geschätzte Prävalenz in der dermatologischen Praxis wird mit 1:300-1:1000 angegeben (Wallace, 1971). Besonders bei Kindern kann jedoch die wahre Prävalenz nur geschätzt werden, da viele Fälle aus Angst vor Missdeutung als sexueller Kindesmissbrauch nie ärztlich vorgestellt werden. Um die wahre Prävalenz besser definieren zu können, sollte die liberalere Anwendung von Biopsien bei Patienten mit genitalen Beschwerden proklamiert werden. Der LS tritt weltweit auf, jedoch ist er in der weißen Bevölkerung häufiger und bei Farbigen und Asiaten nur sehr selten beschrieben (Braun-Falco et al., 1984; Powell und Wojnarowska, 1999). Dies kann aber zum Teil daran liegen, dass die meisten Studien aus Großbritannien und den USA stammen und so zu einer Verzerrung der Prävalenz führen (Meffert et al., 1995). 1.1.3 Klinisches Bild Klinisch imponiert der genitale LS als rötliche Makulae, die sich später porzellanartig weißlich bis elfenbein verfärben. Zusätzlich kommt es zur atrophischsklerotischen Umwandlung der betroffenen Hautareale. Grundlegend dafür ist eine Modifikation des kollagenen Bindegewebes. Die sich daraus entwickelnde Atrophie führt bei Frauen zur Schrumpfung der Labien und der Klitoris. Dies wurde früher als -6- Kraurosis vulvae bezeichnet. Bei Männern kann durch die sich entwickelnde Atrophie eine Phimose als klinisch bedeutsamstes Zeichen des LS auftreten. Diese Atrophie ist bei beiden Geschlechtern irreversibel. Vereinzelt kann das erste Symptom auch die Verklebung des Präputiums mit der Glans penis (Balanopräputiale Synechie) sein, was zu Schmerzen bei der Retraktion des Präputiums führt. Zudem kann eine sich daraus entwickelnde Balanitis der Grund für sehr schmerzhafte Erektionen sein. Als Hauptsymptom steht jedoch bei beiden Geschlechtern der Pruritus im betroffenen Hautbereich im Vordergrund des LS. Besonders bei Frauen kann ein verstärkter Pruritus auch ohne weitere Symptome vorherrschend sein. Nicht selten entstehen zudem hämorrhagische Blasen, die narbig abheilen. Des Weiteren kann es zu chronisch bestehenden Einblutungen und Rhagaden an den betroffenen Hautstellen kommen. Diese können sich bakteriell oder mykotisch superinfizieren und so zu weiteren Beschwerden führen. Oft überlagern die Beschwerden der Infektionen die Symptome des LS und führen damit zu einer verlängerten Dauer der Diagnosestellung. Ebenso kann es bei beiden Geschlechtern im Spätstadium zu einer Harnröhrenstriktur mit Dysurie, darauf folgender Restharnbildung und Infektion kommen. Bei Frauen kann aufgrund der Atrophie eine Vaginalstenose (Introitusstenose) auftreten, die einen Geschlechtsverkehr durch Dyspareunie stark einschränkt, beziehungsweise unmöglich macht. Zudem kann es infolge der perianalen Atrophien bei Frauen zu starken Defäkationsschmerzen und bei Kindern zur Obstipation kommen. Die extragenitale Form des LS äußert sich als einige Millimeter bis 0,5 Zentimeter große, rundliche, elfenbeinfarbene bis weiß-bläuliche Makulae. Primärveränderungen in Form von erythematösen Papeln sind nur selten beschrieben. Die Makulae können zu größeren atrophischen Arealen konfluieren und sind häufig unregelmäßig konfiguriert. Ältere Herde zeigen eine pergamentartige, oberflächliche Fältelung und typische komedoartige, follikuläre Hyperkeratosen. In seltenen Fällen kann es zur blasigen Epithelabhebung und Hämorrhagien kommen. Der für den genitalen LS typische Pruritus, Indurationen oder andere Beschwerden können hier fehlen (Braun-Falco et al., 1984; Altmeyer und Hoffmann, 2006). Das Köbner-Phänomen ist ebenfalls beschrieben und kann nach Trauma, Wärme, Reibung, Operation oder chronischer Infektion zur Ausprägung Hautveränderungen führen (Meffert et al., 1995; Todd et al., 1994). -7- neuer Bei Kindern sind dieselben Symptome bekannt (Powell und Wojnarowska, 2001). Edmonds et al. entdeckten mit Hilfe der Genexpression, dass der LS bei Kindern dieselbe Entität wie bei Erwachsenen darstellt (Edmonds et al., 2011a). Beim Auftreten im Kindesalter sind in der Literatur jedoch einige Fälle einer spontanen Remission zum Zeitpunkt des Eintretens in die Pubertät beschrieben. Laut einiger Studien besteht dabei die Chance einer Ausheilung von 50% (Meffert et al., 1995) bis über 80% (Altmeyer und Hoffmann, 2006).Von solchen Remissionen wurde in einzelnen Fällen auch bei Erwachsenen berichtet, jedoch gab es weder histologische Untersuchungen zur Diagnosestellung noch eine ärztliche Überprüfung der Remission (Meffert et al., 1995). So gilt der LS weiterhin in der Medizin als nicht heilbare, chronische Erkrankung. Allerdings kann durch den schubweisen Verlauf mit längeren Krankheitspausen ohne sichtbare Symptome das unzutreffende Bild einer Remission vorgespiegelt werden. Der LS besitzt ein sehr geringes aber signifikantes Risiko der Entartung zu einem malignen Hauttumor von ca. 3 - 6% (Altmeyer und Hoffmann, 2006). Dabei sind vor allem Frauen betroffen. Es herrscht Einigkeit darüber, dass eine Entartung weder bei Kindern noch in extragenitalen Läsionen auftritt (Meffert et al., 1995). Beschrieben sind sowohl das Plattenepithelkarzinom (Squamous cell carcinoma, SCC) (Carli et al., 1995; Walkden et al., 1997; Carlson et al., 1998b; Powell und Wojnarowska, 1999; Reich et al., 2007), das Basalzellkarzinom (Thomas et al., 1985), das maligne Melanom (Friedman et al., 1984), als auch das spinozelluläre Karzinom bei Koinzidenz mit Leukoplakien (Braun-Falco et al., 1984). Das Plattenepithelkarzinom wurde bei beiden Geschlechtern nachgewiesen (Bunker und Neill, 2010). Zusätzlich wurden Basenpaarmutationen in vulvären Hautbiopsien bei Frauen nachgewiesen, die an LS erkrankt waren (Carlson et al., 1998c). Leibowitch fand in bis zu 61% der Proben, die er aufgrund eines vulvären SCC untersuchte, Anhalt für einen LS. Ebenso fand er vulväre intraepitheliale Neoplasien Grad III in über 50% der Proben (Leibowitch et al., 1990). Studien, die die Pathomechanismen des humanen Papillomviren (HPV)-unabhängigen Plattenepithelkarzinoms untersuchten, wurden weitestgehend an Frauen durchgeführt. Scurry et al. fanden in LS Biopsien mit Vulvakarzinom eine stark vergrößerte Dicke der Epidermis, Basalzellatypien und Verlust der ödematös-hyalinen Schicht (Scurry et al., 2001). Eine weitere Studie vermutete ein Ungleichgewicht der Allele, welches eine Atypie und tumoröse Entartung bewirkt (Pinto et al., 2000). Darüber hinaus kann oxidativer Stress als -8- mögliche Ursache in Frage kommen (Sander et al., 2004). Besonders die Rolle des Proteins p53 wurde in einigen Studien als Ursache der Kanzerogenese bei LS betrachtet. Tapp et al. fanden heraus, dass onkogenetische Punktmutationen in p53 in gesunder Genitalhaut und LS vorkommen (Tapp et al., 2007). Vor kurzem haben Gambichler et al. mit Hilfe der Immunhistochemie eine signifikante p53 Expression bei LS Patienten mit langer Krankheitsdauer beobachtet (Gambichler et al., 2011). Dagegen konnte eine andere Studie keine veränderte Expression der an der Pathogenese des Plattenepithelkarzinoms beteiligten Gene, inklusive der p53 Gene, feststellen (Edmonds et al., 2011a). Als weitere mögliche Erklärung für die maligne Entartung des LS wird eine zusätzliche HPV Infektion angesehen. Der LS mag dabei eine Grundlage bieten, auf der der onkogenetische Virus dysplastische Veränderungen hervorrufen kann. Dies ist jedoch nicht in allen Fällen nachweisbar (Meffert et al., 1995). Auch Ansink bewies, dass diese Entdeckung nicht signifikant für das Auftreten eines SCC beim LS ist (Ansink et al., 1994). Ferner ist bis heute nicht endgültig geklärt, ob der LS als Grunderkrankung die Entstehung eines Karzinoms begünstigt oder eine maligne Entartung direkt aus dem LS entsteht. Meffert et al. postulierten, dass der LS an sich keine Präkanzerose darstellt, aber die mit ihm verbundenen lokalen Faktoren wie Phimose, schlechte Hygiene und HPV eine Entartung prädisponieren (Meffert et al., 1995). Da das generelle Risiko einer Entartung besteht, sind nach Diagnosestellung lebenslange und regelmäßige ärztliche Kontrollen indiziert (Walkden et al., 1997; McPherson und Cooper, 2010). 1.1.4 Ätiologie Obwohl der LS schon seit mehr als 100 Jahren klinisch bekannt ist, bleibt die Ätiologie unbekannt. Eine multifaktorielle Pathologie ist wahrscheinlich (Wakelin und Marren, 1997). Hormonelle Faktoren können Auslöser des LS sein, da dieser besonders mit Veränderungen im Hormonstatus, wie in der Schwangerschaft, Menopause oder Pubertät, einhergeht. Eine Dysregulation der Sexualhormone (Östrogene und Androgene) scheint eine Rolle zu spielen, wobei dem Östrogen eine protektive Rolle zugeschrieben wird (Marren et al., 1995a). Zudem besteht eine Verminderung der 5-α-Reduktase-Aktivität, worauf es zu einer geringeren Umwandlung von Testosteron in Dihydrotestosteron kommt. So kann auch der erhöhte Testosteronmetabolismus, der in der Menarche auftritt, für die Fälle der -9- spontanen Remission des LS bei Kindern verantwortlich sein (Friedrich und Kalra, 1984). Ebenso kann Stress mittels erhöhter Cortisonausschüttung und Traumata zur Krankheitsverschlechterung führen. Dabei sind verschiedene Trauma wie Wärme und Feuchtigkeit, das Tragen von enger Nylon-Unterwäsche, Fahrradfahren, Operationen, Reibung, Sonnenbrände, Verbrühungen, Bestrahlungstherapie und wiederholte Masturbation beschrieben (Meffert et al., 1995). Zugleich existiert die Theorie der Entstehung des genitalen LS als Koebner Phänomen durch eine chronische, intermittierende Exposition des genitalen Epithels mit Urin unter Okklusion (Bunker, 2010). Eine Studie über die Risikofaktoren des LS zeigte ein signifikant erhöhtes Auftreten bei Nicht-Rauchern als bei Rauchern. Die Autoren vermuten den Androgen erhöhenden Effekt des Rauchens als ursächlichen Grund. Im Vergleich zu gesunden Probandinnen wurden in dieser Studie bei Patientinnen mit LS keine Unterschiede im Bezug auf sexuelle Gewohnheiten, Bildung oder Ernährungsgewohnheiten festgestellt (Sideri et al., 1989). Demgegenüber wird eine infektiöse Genese diskutiert. Besonders eine Borrelieninfektion wird mit dem Auftreten eines LS in Zusammenhang gebracht, konnte jedoch noch nicht bestätigt werden (Powell und Wojnarowska, 1999; Bunker und Neill, 2010). Zudem gibt es einige gegensätzliche Studien (Edmonds et al., 2009; Zollinger et al., 2010) und es wäre undenkbar, alle LS Fälle anhand einer Borrelieninfektion zu erklären, besonders die der sehr jungen Kinder (Meffert et al., 1995). Es existiert nur ein Fall des Auftretens von LS zwischen Sexualpartnern und zwar mit einem Intervall von 10 Jahren (Zapolski-Downar et al., 1987). Die Tatsache, dass der LS nicht zwischen Sexualpartnern übertragen wird, lässt darauf schließen, dass jeder mutmaßlich infektiöse Prozess auf einem nicht sexuell übertragbaren Weg erworben wird. Dennoch wurde das HPV häufig als ursächlich für das Auftreten des LS verdächtigt (Drut et al., 1998; Nasca et al., 2006). Seine Beteiligung am Plattenepithelkarzinom des Penis ist nicht zu leugnen, bis zu 50% des Plattenepithelkarzinoms des Penis sind vom HPV verursacht und weitere 50% vom LS, interessanterweise jedoch mit wenigen Überschneidungen (Campus et al., 1992; Perceau et al., 2003; Prowse et al., 2008). Ebenso wie das Vulvakarzinom tritt das Penisplattenepithelkarzinom in Assoziation mit zwei verschiedenen Läsionen des Penis auf, zum einen mit dem undifferenzierten Carcinoma in situ (CIS) und zum anderen mit dem LS zugehörigem differenziertem CIS. Des Weiteren ist es augenscheinlich, dass der Subtyp des Plattenepithelkarzinoms direkt mit der Gutartigkeit der Läsion im - 10 - Zusammenhang steht (Renaud-Vilmer et al., 2010). Edmonds et al. war es nicht möglich eine signifikante Über- oder Unterexpression der mit HPV assoziierten Gene zu identifizieren (Edmonds et al., 2011a). Auch Kirtischig et al. konnten die Anwesenheit von HPV bei LS wiederlegen (Kirtischig et al., 2005). Ferner konnte die Theorie einer viralen Pathogenese aufgrund der kompletten Abwesenheit von BLymphozyten (CD19, CD21) verworfen werden (Scrimin et al., 2000). Eine Rolle scheint dagegen eine Dysregulation der Zytokine zu spielen (Kovacs, 1991). Ebenso sollen bestimmte humane Leukozytenantigen (HLA) Konstellationen begünstigend für den LS sein, wie HLA-B21, DR-5, DR-7 (Sideri et al., 1988), B40 (Harrington et al., 1981), B44, A29 (Purcell et al., 1990), Aw-30, Aw-31 (Holt et al., 1983). Studien zeigten darüber hinaus einen Zusammenhang mit dem HLA class II Antigen DQ7, das hautspezifische Merkmale aufweist. Ebenso konnte in diesen Studien eine Assoziation mit HLA-DQ8 und DQ9 belegt werden (Friedrich und McLaren, 1984; Marren et al., 1995b; Powell et al., 2000). Eine immunogenetische Studie erbrachte den Beweis der Verbindung mit DRB1*12 und dem Haplotyp DRB1*12/DQB1*0301/04/09/010, was wiederum die Theorie einer autoimmunen Pathogenese stützt (Gao et al., 2005). Zudem ist ein erhöhtes familiäres Auftreten bei Müttern und Töchtern, Geschwistern und gemeinsames Vorkommen bei eineiigen und nicht-eineiigen Zwillingen bekannt (Meffert et al. 1995). All diese Beobachtungen sprechen für eine genetische Disposition des LS. Die Bildung von Immunglobulin G Autoantikörpern gegen das Extrazelluläre Matrixprotein-1 (ECM1) ist in einer englischen Studie bei >75% der Patienten beobachtet worden (Oyama et al., 2003; Oyama et al., 2004). Auch zirkulierende Autoantikörper gegen die Basalmembran und das Kollagen XVII wurden beschrieben (Howard et al., 2004). Ob die Bildung der Autoantikörper bei beiden Studien nun ein primärer, ätiologisch bedeutsamer Prozess, oder eher ein sekundärer Vorgang als Ergebnis der exzessiven lokalen Gewebsschäden ist, bleibt ungeklärt. Ferner gibt es einen Bericht über Immunglobulin- und Komplementablagerungen in der Basalmembran, der eine autoimmunologische Störung in der Pathogenese des LS nahe legt (Dickie et al., 1982). Auch Übereinstimmungen im immunhistochemischen Bereich mit der zirkumskripten Sklerodermie (Morphea), der generalisierten Sklerodermie und der chronischen Bestrahlungsdermatitis weisen auf eine denkbare pathogenetische Verwandtschaft hin (Yates et al., 1985; Tremaine et al., 1990; Carlson et al., 1997; Sawamura et al., 1998; Tournillac et al., 1998). Nur diese drei - 11 - Erkrankungen weisen die für den LS typische Sklerose auf. Von manchen Autoren werden der LS und die Morphea daher auch als Manifestation derselben Erkrankung gesehen, wobei die Morphea eine größere Assoziation mit einer systemischen Erkrankung aufweist (Lewis, 1961; Büchner et al., 1993). Desgleichen kann der LS als Teil des Spektrums der Sklerodermie betrachtet werden (Ackerman et al., 1997). Im Gegensatz dazu glauben viele Forscher, dass es ausreichend klinische und histologische Unterschiede zwischen den beiden Erkrankungen gibt, um zu beweisen, dass sie verschiedene Entitäten sind und gleichzeitig auftretende Läsionen rein zufällig beobachtet werden (Ackerman et al., 1982; Rahbari, 1989). Kürzlich ergab eine retrospektive, multizentrische Studie, die die Koexistenz der lokalisierten Sklerodermie und des LS und untersuchte, einen erstaunlich hohen Prozentsatz von LS bei an Sklerodermie erkrankten Patienten (5,7 %) (Kreuter et al., 2012b). Das simultane Auftreten mit Autoimmunerkrankungen wie der Alopecia areata (kreisrunder Haarausfall), der Vitiligo (Weißfleckenkrankheit), der Hyperthyreose, dem Morbus Basedow, der Hypothyreose, dem Diabetes mellitus Typ I und II, der primären biliären Zirrhose, der Colitis ulcerosa, der Achlorhydrie mit oder ohne perniziöser Anämie, dem Schleimhautpemphigoid und dem narbigen Pemphigoid, den Ekzemen, der atopischen Dermatitis, der Polymyalgia rheumatica, der Psoriasis, der Fasziitis, der Myositis, dem Lupus panniculitis, dem LP oder dem systemischen Lupus erythematodes gibt einen Hinweis auf einen möglichen autoimmunologischen Hintergrund des LS (Meffert et al., 1995; Powell und Wojnarowska, 1999). 22-34% der LS Patienten können dabei an diesen zusätzlichen Autoimmunerkrankungen leiden (Meyrick et al., 1986). Darüber hinaus begünstigen auftretende gewebe- und organspezifische Autoantikörper dieser Autoimmunerkrankungen bei LS Patienten und Verwandten ersten Grades die Assoziation mit einer autoimmunologischen Pathogenese (Goolamali et al., 1974; Powell und Wojnarowska; 1999, Powell und Wojnarowska, 2001). Darunter fallen antimikrosomale Schilddrüsenantikörper, antigastrische Parietalzellantikörper, antinukleäre Antikörper, antiadrenale Cortexantikörper und antimitochondriale Antikörper (Meffert et al., 1995). Meyrick Thomas fand in einer Studie an 350 LS Patientinnen heraus, dass 21,5% von einer oder mehreren Autoimmunerkrankungen betroffen waren und dass 42% Autoantikörper mit einem Titer von über 1:20 aufwiesen (Meyrick et al., 1988). Diese Assoziation mit weiteren Autoimmunerkrankungen ist bei Männern mit LS weit weniger markant als bei Frauen (Lipscombe et al., 1997). Dennoch wurden - 12 - bisher keine LS spezifischen Autoantikörper oder Antigene identifiziert. Zudem konnte noch keine Verbindung zwischen der Schwere der Erkrankung und der Assoziation mit einer Autoimmunerkrankung oder Autoantikörpern festgestellt werden. Ebenso wenig kann das Auftreten des LS bei einer bestehenden Autoimmunerkrankung vorhergesagt werden. Daher kann eine diagnostisch aufwendige Suche nach einer weiteren Autoimmunerkrankung bei einem an LS erkrankten Patienten nicht befürwortet werden (Meffert et al., 1995). Regauer und Beham-Schmid zeigten, dass in von LS betroffenem Gewebe in einem späten Stadium der Erkrankung klonales low-level T-Zell-Infiltrat nachweisbar ist. Sie postulieren daher die Theorie einer lokalen, immunologischen Erkrankung mit reaktiver klonaler Lymphozytenproliferation und stellen sich gegen die früher geäußerte Vermutung einer systemischen neoplastischen Pathogenese (Regauer und Beham-Schmid, 2005). Klonal expandierte T-Zellen wurden in bis zu 49% der LS Proben gefunden, weshalb Lukowsky et al. diese Erkenntnis als Antwort auf ein bisher noch unbekanntes, mit LS assoziiertes, Antigen interpretierten (Lukowsky et al., 2000). Zuletzt veröffentlichten Terlou et al. eine Studie, die eine signifikante TZell Antwort mit erhöhten Werten für CD8+ T-Zellen und FOXP3+ regulatorischen T-Zellen (TRegs) in der Dermis von LS Patienten zeigt (Terlou et al., 2012). Zusätzlich zeigten Sie eine erhöhte Expression an pro-inflammatorischen Zytokinen (IFNγ, CXCR3, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCR5, CCL4 und CCL5) und eine Hochregulation von BIC/microRNA-155 (miR-155), eine MicroRNA, die für die Regulation einer Immunantwort verantwortlich ist. All diese Beobachtungen stützen die Theorie, dass autoimmunologische Mechanismen in der Pathogenese des LS involviert sein können. Andere Autoren konnten dagegen keinen Anhalt für eine autoimmunologische Pathogenese des LS finden (Scrimin et al., 2000; Bushkell et al., 1981). Auch der für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wie der Hashimoto Thyreoiditis und der systemischen Sklerose typische fetale Mikrochimärismus (Bianchi et al., 1997; Artlett et al., 1998; Nelson et al., 1998; Klintschar et al., 2001) scheint beim LS ätiologisch irrelevant zu sein (Regauer et al., 2004). So wurde die autoimmunologische Ätiologie oft diskutiert, konnte jedoch, soweit mir bekannt, in noch keiner Studie endgültig bewiesen werden. Diese Studie ist ein weiterer Beitrag zur Diskussion der Beteiligung des Immunsystems an der Pathogenese des LS. - 13 - 1.1.5 Diagnose Die Verdachtsdiagnose kann anhand der Anamnese und des klinischen Bildes gestellt werden, die Diagnose sichern kann allerdings nur eine Biopsie aus dem betroffenen Hautbereich. Als Differentialdiagnose kommen die zirkumskripte Sklerodermie und der LP in Betracht. Ebenso sind Mischbilder von LS, LP oder Lichen Simplex (LSX) unter Einbeziehung der vulvären intraepithelialen Neoplasie (VIN I-III) bekannt. Alle Differentialdiagnosen sind histologisch vom LS abzugrenzen (Altmeyer und Hoffmann, 2006; Braun-Falco et al., 1984). 1.1.6 Therapie Generell ist die angemessene Therapie vom Schweregrad der Erkrankung und dem Alter des Patienten abhängig. Bei jungen Patienten oder geringer Ausprägung ist eine externe Therapie anzuraten. Dabei ist insbesondere der zum Teil sehr starke Pruritus zu behandeln. Gute Möglichkeiten sind pflegende Externa wie fetthaltige Salben und Öle, topische Calcineurinantagonisten wie Tacrolimus oder Pimecrolimus (Assmann et al., 2003; Boms et al., 2004) und bei stärker ausgeprägtem Juckreiz topische, intraurethrale, intraläsionale oder orale Glukokortikoide (Meffert et al., 1995). Hormonhaltige Präparate, die bei Frauen östrogen- oder progesteronhaltig und bei Männern testosteronhaltig sind, führen nur bedingt zu Erfolg (Sideri at al., 1994). Die Bestrahlungstherapie mit UVA1 verspricht Linderung (Beattie et al., 2005). Intern kann mit Acitretin, Penicillin G, Sulfsalazin oder Chloroquin (Meffert et al., 1995; Altmeyer und Hoffmann, 2006) therapiert werden. Trotzdem reduzieren all diese Behandlungsverfahren nur die Symptome, können aber die Progression der Erkrankung nicht aufhalten (McPherson und Cooper, 2010). Daher ist die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten umso wichtiger. Ein gutes Beispiel eines neu entwickelten Therapieverfahrens ist die Phototherapie, deren antisklerotischer und antiinflammatorischer Effekt durch die Verringerung von TGFβ1 (Transforming Growth Factor-β1) und die Erhöhung von IL-10 (Interleukin-10) verursacht wird (Byun et al., 2011). Bei ausgedehnter Ausprägung mit eventuell fortgeschrittener Genitalatrophie ist eine operative Therapie zu bevorzugen, da diese Atrophie mit nicht-invasiven Maßnahmen nicht mehr rückgängig zu machen ist. Allein eine Abschwächung oder ein zeitweises Anhalten der Progression ist erreichbar. Dabei kommen vor allem die Kryochirurgie (Altmeyer und Hoffmann, - 14 - 2006), der gepulster Farbstofflaser (Greve et al., 1999), die subkutanen Alkoholinjektionen (Powell und Wojnarowska, 1999), die ablative Lasertherapie mittels Carbon Dioxid Laser (Ratz, 1984; Kaufman und Friedrich, 1985; Hackenjos et al., 2000) oder die Zirkumzision zum Einsatz. Besonders mit Hilfe einer Beschneidung können bei Männern die besten Ergebnisse erreicht werden. Zum Teil konnte die Progression des LS sogar gestoppt werden (Campus et al., 1984). Zudem wird eine Psychotherapie aufgrund der in einigen Fällen erheblichen, psychischen Beeinträchtigungen empfohlen. Gleichermaßen können Selbsthilfegruppen hilfreich sein. Der LS kann durch die genitalen Hautveränderungen erhebliche und belastende Auswirkungen auf das soziale und sexuelle Leben der Patienten haben. Außerdem ist ein gutes Arzt-Patienten-Verhältnis unabdingbar (Powell und Wojnarowska, 1999). - 15 - 1.2 Histologie 1.2.1 Normale Haut Die Haut besteht aus der Epidermis (Oberhaut), der Dermis (Cutis, Lederhaut) und der Subkutis. Die Epidermis besteht aus einem verhornenden, mehrschichtigen Plattenepithel. Zu mehr als 90% wird sie von Keratinozyten gebildet, die restlichen 10% machen Melanozyten, Langerhans-Zellen, Merkel-Zellen und T-Lymphozyten aus. Die unterste Schicht, das Stratum basale, umfasst kleine und zylindrische Zellen mit rundem Kern und basophilem Zytoplasma. Darüber befindet sich das Stratum spinosum mit größeren und stärker differenzierten Keratinozyten mit bläschenförmigem Zellkern und sichtbaren Nukleolus. Die nächste, sehr dünne, Schicht wird aus abgeflachten Keratinozyten mit basophilen Stücken in ihrem Zytoplasma gebildet. Daher nennt man diese Schicht auch Stratum granulosum. Die oberste Schicht der Epidermis, das Stratum corneum, besteht aus mehreren Lagen abgestorbener Keratinozyten, den so genannten Hornzellen. An Fußsohlen und Handflächen ist diese Schicht besonders dick und an der Grenze zum Stratum granulosum befindet sich zusätzlich eine dünne Schicht, das Stratum lucidum. In der Dermis befinden sich zum größten Teil eosinophile kollagene Fasern. Darüber hinaus gibt es elastische Fasern, Mukopolysaccharide, Bindegewebszellen (Fibroblasten), Gefäße, Nerven, Lymphbahnen und Entzündungszellen wie Mastzellen, T-Lymphozyten und dendritische Zellen. Die an die Epidermis grenzende Schicht bezeichnet man als Stratum papillare. Sie besteht aus den Papillen, die bis in die Epidermis reichen und einer Bindegewebsschicht, die zur Verbindung der Papillen dient. Hier befinden sich besonders viele Kollagenfaserbündel vom Typ III und Fibroblasten mit ihrem schmalen Zellkern und basophilen Zytoplasmaausläufern. Zudem sind Mastzellen und Lymphozyten mit kleinen, dunklen Zellkernen meist in der Nähe von Blutgefäßen zu finden. Darunter liegt das Stratum reticulare mit dicken Kollagenfaserbündeln vom Typ I und wenigen Fibroblasten. Hier befinden sich die Hautanhangsgebilde, die von einer Schicht lockeren Bindegewebes eingefasst sind. Die Hautanhangsgebilde sind Haarfollikel, Talgdrüsen, Nägel, apokrine und ekkrine Schweißdrüsen. Teilweise sind auch Bündel von glatten Muskelfasern, die zu den Haar- und Talgdrüsenfollikeln als M. arrector pili gehören, eingelagert. In der Genitoanalregion und der Areolarregion gehört dieses Geflecht aus glatten Muskelfasern zum M. - 16 - dartos beziehungsweise dem M. areolaris. Die Subkutis erstreckt sich über die gesamte Fläche unter der Cutis und besteht hauptsächlich aus Fettgewebsläppchen, die durch bindegewebige Septen getrennt werden. Diese Septen sind zum einen mit der Dermis und zum anderen mit der darunter liegenden Faszie verbunden. Das Fettgewebe besteht aus unilokulären Fettzellen, nur an wenigen Körperstellen existiert braunes Fettgewebe mit multilokulären Fettvakuolen. Zudem sind zwischen dem Fettgewebe Gefäße, Nerven und Lymphgefäße vorhanden (Kerl et al., 2003a). 1.2.2 Hautveränderungen beim Lichen sclerosus Zu Beginn der Erkrankung ist eine sogenannte Interface Dermatitis vorherrschend. Diese besteht aus einem bandförmigen, lymphozytären Entzündungsinfiltrat und einer junktionalen Vakuolisierung der Keratinozyten (Kerl et al., 2003b). Die entzündlichen Veränderungen der Interface Dermatitis betreffen alle Schichten der Haut (Farrell et al., 1997). Das allgemeine histologische Bild ist trotz Unterschiede im Alter der Patienten und Lokalisation der Läsionen gleich. Nur durch das Alter der Läsion kann es differieren (Ackerman, 1978; Ackerman, 1984; Hewitt, 1986). Es kommt zu Basalmembranveränderungen, insbesondere im Bereich des Kollagens IV und VII, oder sogar zu Löchern in der Membran, welche Grund oder Effekt der dermalen Entzündungsprozesse sein können (Marren et al., 1997a; Soini et al., 1997). Darüber hinaus fanden Farrell et al. eine erhöhte Färbungsintensität der CD44+ Keratinozyten bei vulvären LS im Gegensatz zu gesunden Proben. Aufgrund der Fähigkeit der CD44+ Keratinozyten als „Homing“ Rezeptor für Lymphozyten vermuten die Autoren dies als wichtigen Mechanismus zur Akkumulation von CD3+, CD4+ und CD8+ Lymphozyten in der Epidermis und an der Basalmembran (Farrell et al., 1999). Im weiteren Krankheitsverlauf kommt es zur Fibrosierung des Stratum papillare der Dermis und kompakter Orthohyperkeratose des Stratum corneum der Epidermis. So erscheint die gesamte Epidermis hyperplastisch. Zudem sind die Reteleisten oft vollständig verstrichen oder aber, wie im Übergang zur Schleimhaut, abgerundet und vergrößert. Dort können Zellatypien mit möglicher Entartung auftreten. In einer Studie konnten in einem Drittel der entnommenen Probebiopsien plattenepithelkarzinomartige Hyperplasien festgestellt werden. Nach Vermutung der Autoren sind diese Hyperplasien durch Kratzen entstanden, was möglicherweise das Entartungsrisiko erhöhen kann (Weber et al., 1987). Der - 17 - indirekte Nachweis der dauernden Makrophagenaktivierung durch Produktion von freien Radikalen mag der Grund für die Verbindung des LS mit einem vulvärem Plattenepithelkarzinom und Basenpaarmutationen sein (Carlson et al., 1998a; Carlson et al., 1998b). Auffällig ist das, teilweise stark ausgeprägte, Ödem im Stratum papillare, das bis zur subepidermalen Blasenbildung führen kann. Ebenso hervorstechend ist die ebenmäßige Verteilung und Schwellung der kollagenen Faserbündel in diesem zellarmen subepidermalen Bindegewebe. Dabei zeigen die Kollagene vom Typ I und III Veränderungen im Faserdurchmesser und massive Abweichungen in der Ausrichtung, die bis zur Desintegration und möglichem Faserverlust führen können (Ackerman, 1978; Romppanen et al., 1987). Jedoch konnte in therapierten Fällen von LS eine Regeneration der Kollagenfasern beobachtet werden (Romppanen et al., 1987). Auch in nichttherapierten und konstanten LS Fällen konnte dieser Zyklus von Degeneration und Regeneration beobachtet werden, was somit das früher benutzte „atrophicus“ in Namen des LS widerlegt (Mann und Cowan, 1973; Daróczy und Török, 1974; Frances et al., 1983; Hewitt, 1986). Die elastischen Fasern sind stark vermindert oder fehlen vollkommen (Romppanen et al., 1987; Rahbari, 1989). Als Grund wird eine erhöhte Aktivität der Amidase, einer Elastase-ähnlichen Protease, angenommen. Die Amidase kann menschliches Hautelastin umsetzten und so zu einer Verminderung der elastischen Fasern führen (Godeau et al., 1982; Frances et al., 1983). Jedoch konnten in einer Studie normale bis erhöhte Mengen an Elastin mittels einer ultrastrukturellen Untersuchung bei vier Fällen von extragenitalem LS gezeigt werden. Die Autoren vermuten eine generelle Modifizierung des Elastins, was zu einer verminderten Anfärbung in vorherigen Studien führte (Mann und Cowan, 1973). Andere ähnliche Studien konnten diese Beobachtung jedoch nicht bestätigen (Daróczy und Török, 1974; Ackerman et al., 1982). Daróczy und Török erbrachten in ihrer Studie den Beweis, dass auch beim LS die für Bindegewebserkrankungen typischen elastischen Fasern mit unregelmäßigem Durchmesser vorliegen (Daróczy und Török, 1974). Spezialfärbungen zeigen stark erhöhte Mengen von Grundsubstanz (Frances et al., 1983) mit Ablagerung von neutralen (Suurmond, 1964) und sauren Mukopolysacchariden (Mihara et al., 1994) in dieser homogenen Zone. Weitere Studien beobachteten im Stratum papillare eine Nervendegeneration und Regeneration (Pawlowski, 1963) und Milien bei 15% der histopathologischen Routineproben (Leppard und Sneddon, 1975). Ferner wurde dort und in der - 18 - Junktionszone eine Ablagerung von IgM, C3 und Fibrin nachgewiesen (Bushkell et al., 1981; Dickie et al., 1982). Perivaskuläres IgG und IgA wurden in 63% der wegen eines LS entnommenen Proben der Vorhaut gefunden (Bale et al., 1987). Scrimin et al. konnten dagegen keinen Anhalt für eine Ablagerung von IgG, IgM oder C3c finden (Scrimin et al., 2000). Die Autoren vermuten in den oben genannten Studien eine zusätzliche Autoimmunerkrankung, die die hohen Antigenablagerungen erklären würde. Jedoch wurden von Scrimin et al. nur 14 vulväre Biopsien untersucht, was die tatsächliche Signifikanz ihrer Ergebnisse bezweifeln lässt. Das Bindegewebe sklerosiert und hyalinisiert in späteren Stadien. In einer Studie wurde gezeigt, dass CD57+ Lymphozyten sowohl in der Dermis als auch in der Epidermis vorkommen und zusammen mit aktivierten Makrophagen die für den LS typische Sklerose verursachen (Carlson et al., 2000). Außerdem erhöht sich die Lymphozytenanzahl mit fortschreitendem Erkrankungsstadium. Darüber hinaus sind die epidermalen CD57+ Lymphozyten der entscheidende Faktor, der den LS von anderen Dermatosen unterscheidet. Die Verbindung der von aktivierten Makrophagen produzierten Zytokine und Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel IL-4 und TGF-β1 mit den CD8+CD57+ Lymphozyten wurde in der Entwicklung der sklerotischen Hautveränderungen beobachtet (D’Angeac et al., 1994; Carli et al., 1997). Diese Faktoren können Fibroblasten zur kontinuierlichen Produktion von Kollagen sowie Kollagenasen und Elastasen anregen (Godeau et al., 1982). Da die dermale Sklerose des LS durch Verlust von elastischen Fasern, Neuformung und Degeneration von Kollagensträngen gekennzeichnet ist, ist dies ebenfalls grundlegend im sklerotischen Umbauprozess des LS (Mihara et al., 1994). Zusätzlich atrophiert die hyperplastische Epidermis und stellenweise treten Hyperkeratosen auf. Soini et al. fanden heraus, dass diese Atrophie mit einer Erniedrigung von proliferierenden Nuklearzellantigen-positiven Basal- und Parabasalzellen assoziiert ist (Soini et al., 1994). In entstandenen Spalträumen zwischen Dermis und Epidermis können sich aufgrund der dilatierten Lymph- und Blutgefäße Teleangiektasien und perivaskuläre Erythrozytenextravasate bilden. Ein perivaskuläres lymphozytisches Infiltrat und eine lymphozytäre Vaskulitis treten häufig beim LS auf, wobei die Vaskulitis besonders während hoher Krankheitsaktivitätsphasen auffällig ist (Regauer, 2005). Der oberflächliche Gefäßplexus wird in die Tiefe verlagert, sodass er scheinbar in der Mitte der Dermis liegt (Ackerman, 1984). Das bandförmige Infiltrat besteht aus CD4+ und CD8+ Lymphozyten in gleichen Anteilen (Carli et al., - 19 - 1991; Farrell et al., 1999), CD68+ aktivierten Makrophagen (Farrell et al., 1999), Plasmazellen und Mastzellen. In Studien wurde nachgewiesen, dass der größte Teil des lichenoiden Infiltrates von T-Zellen gebildet wird, die eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Hauterkrankungen spielen (Farrell et al., 1999; Rotsztejn et al., 1999). Dabei gaben nahezu alle CD8+ Zellen zytotoxische Granula (TIA-1) ab, was möglicherweise die Basalzellzerstörungen verursachen könnte (Lukowsky et al., 2000). Tchórzewski et al. beobachteten jüngst einen erhöhten Anteil von CD4+CD25+ T-Zellen im Infiltrat. Die Tatsache, dass diese TRegs die T-Zell-vermittelte Immunantwort herunterregulieren und selektiv die körpereigene Immunantwort hemmen, lässt den Schluss zu, dass sie einen Beitrag zur Progression des LS leisten (Tchórzewski et al., 2005). Unlängst untersuchten auch Regauer und Beham-Schmid mit immunhistochemischen Methoden das lymphozytäre Infiltrat und fanden γ-δ T-Zellen und zytotoxische T-Zellen (TIA-1 und GrB). Die Gewebezerstörung und die lymphozytäre Vaskulitis können durch die Anwesenheit der zytotoxischen T-Zellen erklärt werden (Regauer und BehamSchmid, 2005). Ebenso wurden zytotoxische T-Zellen (TIA-1+ und GrB+) in der oberen Dermis und der Junktionszone nachgewiesen (Wenzel et al., 2007). Des Weiteren konnte die Aktivierung der T-Zellen durch den Nachweis von mRNA für Granzym B und Perforin gezeigt werden. Ferner wurde in derselben Studie die höchste Frequenz an aktivierten Zellen in frühen Stadien der Krankheit beobachtet. Dies lässt darauf schließen, dass die primären Ereignisse in der Pathogenese des LS T-Zell abhängig sind. (Hunger et al., 2007). In einer 2007 von Wenzel et al. veröffentlichten Studie wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass zytotoxische Lymphozyten, die den Chemokinrezeptor CXCR3 tragen, an der Pathogenese des LS beteiligt sind. Die läsionale Expression des von Interferon induzierbaren Proteins IP10/CXCL10 spielt eine Rolle beim Eintritt von CXCR3+ Zellen in die Haut. Zusätzlich scheint IP10 in perinukleären Granula von infiltrierenden Lymphozyten an pro-inflammatorischen und sich selbst-erhaltenden Mechanismen teilzuhaben. Dies mag einer der Gründe für die chronische Entzündung, die charakteristisch für den LS ist, sein (Wenzel et al., 2007). Ähnliche Beobachtungen wurden für den oralen LS gemacht (Iijiama et al., 2003). Dagegen beobachteten Scrimin et al. bei 14 untersuchten Biopsien erniedrigte CD2, CD3, CD4 und CD8 Lymphozyten. Sie schlossen daraus, dass die LS Läsionen nicht durch eine T-Zell vermittelte Immunantwort gekennzeichnet sein können (Scrimin et al., 2000). Jedoch ist - 20 - wiederrum der Aussagewert der Beobachtung aufgrund der geringen untersuchten Probenanzahl in Frage zu stellen. Die Anwesenheit von Mastzellen könnte die extrazellulären Veränderungen der Matrix, die Entzündung und den damit verbundenen Pruritus erklären (Farrell et al., 1997). Janovski und Ames beobachteten zudem eine Gewebeeosinophilie in 10% der von ihnen untersuchten Proben (Janovski und Ames, 1963). Carli et al. wiesen zusätzlich eine erhöhte Anzahl von CD1a+ Langerhans Zellen unabhängig vom Alter der Läsion und der Menge des Infiltrates in LS Proben nach (Carli et al., 1991). Dabei wirkten diese inaktiven dendritischen Zellen als eine Art Matrix für die effiziente antigenspezifische T-und B-Zell-Interaktion (MacPherson et al., 1999). Das Infiltrat wird in späten Stadien unter die homogenisierte Bindegewebsschicht verlagert. Einige Forscher vermuten einen Zusammenhang der Verlagerung und der Dicke des Infiltrates mit der Krankheitsdauer. Dennoch konnten Studien zur Untersuchung dieser Hypothese keinen Zusammenhang zwischen den histologischen Beobachtungen und der Dauer der Symptome finden (Marren et al., 1997b; Farrell et al., 1999). In einigen Fällen ist es schwer, das, zum Teil sehr dichte, Infiltrat aus Lymphozyten von einem kutanen T-Zell Lymphom zu unterscheiden. In sehr späten Stadien kann es jedoch andererseits komplett durch die Kollagenfasern des Bindegewebes verdrängt werden. So kommt es zur Rückbildung der zellreichen Entzündung und stattdessen zur vollständigen Ausbildung einer Sklerose (Kerl et al., 2003c; Kempf et al., 2011). In einer immunohistochemischen Studie zeigten Ferrell et al., dass das Entzündungsinfiltrat des LS eine erhöhte Immunfärbung für TNF-α, IL-1α, IFN-γ receptor, CD25, CD11a und ICAM-1 aufweist, während die Sklerosezone eine geringe Immunfärbung für IFN-γ receptor, TNF-α, CD11a und ICAM-1 und die die Epidermis eine erhöhte Färbung für ICAM-1 erkennen lässt. Daher vermuten die Autoren, dass die Zytokinantwort beim LS dieselben Charakteristika wie die Immunantwort beim LP und bei chronischen Wunden umfasst (Farrell et al., 2006). - 21 - 1.3 Regulatorische T-Zellen Etwa 5-10% der peripheren T-Zell Population besteht aus TRegs. Sie regulieren die Immunantwort, indem sie die Aktivierung des Immunsystems unterdrücken. Zusätzlich haben sie die Funktion, die Selbsttoleranz des Immunsystems zu steuern und so autoaggressive Immunreaktionen zu hemmen. Die Elimination der Population der TRegs erhöht die Immunantwort auf Autoantigene, Alloantigene und Tumorantigene. Besonders begünstigt sie die Abstoßung von Gewebetransplantaten, das spontane Auftreten von Autoimmunerkrankungen und die Inflammation (Sakaguchi et al., 1995; Zheng et al., 2003; Sakaguchi, 2000). TRegs unterdrücken außerdem die natürlichen Immunantworten gegen Parasiten und Viren und hemmen die Immunität nach Impfungen (Belkaid und Rouse, 2005; Rouse und Souvas, 2004). Allerdings können sie auch Tumore von der Immundetektion abschirmen und erlauben die Progression von latenten Infektionen (Clark, 2010). Man unterscheidet zwischen natürlichen CD4+CD25+ TRegs (Sakaguchi et al., 2001), induzierten IL-10 produzierende TRegs (Sundstedt et al., 2003) und TGF-β1 TRegs (Chen et al., 1994). Besonders in den westlichen Industrieländern wird das erhöhte Auftreten von Autoimmunerkrankungen Zusammenhang gebracht. gehäuft mit einer Ursächlich sind Fehlregulation dabei eine der TRegs in Verminderung von Infektionskrankheiten und der Glaube, Kinder sollten nicht mit Schmutz in Berührung kommen. Die daraufhin erfolgende Verringerung der Aktivierung des Immunsystems geht mit einer reduzierten Aktivierung der TRegs einher. Diese können nun nicht mehr hinreichend autoimmune Vorgänge des Körpers kontrollieren und Autoimmunerkrankungen treten gehäuft auf (Pezzutto et al., 2007). So wurde schon für die Psoriasis eine verringerte suppressive Funktion der TRegs nachgewiesen (Sugiyama et al., 2008). Die natürlichen TRegs verfügen über ein spezifisches Oberflächenantigenmuster, bestehend aus CD25 (α-Kette des IL-2 Rezeptors), niedriger CD45RB-Expression, CTLA-4 (CD152, ein Rezeptor für B7 Moleküle, der auf aktivierten T-Zellen exprimiert wird), αE-Integrin (CD103) und FOXP3. Obwohl einige Studien zeigten, dass CD25 eine entscheidende Rolle als Oberflächenmarker für die TRegs spielt (Takahashi et al., 1998), vermuten andere Studien, dass nur die CD4+ T-Zellen, welche hohe CD25 Spiegel exprimieren, auch eine suppressive Aktivität aufweisen (Baecher-Allan et al., 2001). Ferner zeigt die Zugabe von weiteren Markern wie HLA-DR, dass sogar eine sehr geringe Prozentzahl von CD4+ - 22 - T Zellen (oft <1%) diese suppressive Untergruppe beeinhaltet. Schließlich wurde beobachtet, dass Marker wie CTLA-4 (Cytotoxic T- lymphocyte antigen 4) und GITR (Glucocorticoid-induced tumour-necrosis-factor-receptor-related protein), welche auf TRegs exprimiert werden (Shimizu et al., 2002; Salomon und Bluestone, 2001; McHugh et al., 2002; Kataoka et al., 2005), auch auf deren Effektorzellen exprimiert werden und so die Immunphenotypisierung kompliziert machen (Tang et al., 2004; Ronchetti et al., 2004). Dies erklärt die Schwierigkeit, diese T-Zell Subpopulation anhand seiner Oberflächenmarker zu definieren. CD39 konnte jedoch erfolgreich als Oberflächenmarker für die Isolation von funktionell aktiven TRegs verwendet werden (Mandapathil et al., 2009). 2007 beobachteten Deaglio et al., dass die Oberflächenmarker CD 39 und CD73 auf TRegs eine spezifische biochemische Zeichnung vermitteln, welche durch Adenosinerzeugung gekennzeichnet ist und von funktioneller Relevanz für die Immunregulation ist (Deaglio et al., 2007). Das unterstützten Dwyer et al., deren Befunde ergaben, dass CD39 zusammen mit CD73 ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal der TRegs von anderen ruhenden oder aktivierten T-Zellen darstellt (Dwyer et al., 2007). In den von ihnen untersuchten CD39 negativen Mäusen entwickelten sich spontan Anzeichen von Autoimmunerkrankungen, die mit Th1 Immunabweichungen in Verbindung stehen. Zudem scheinen CD4+CD25+FOXP3+CD39+ TRegs eine wichtige Rolle bei der Hemmung von Th17 Zellen, die pathogenetisch bei vielen Autoimmunerkrankungen sind, zu spielen. Bei der Multiplen Sklerose wurde die Reduzierung dieser Zellen und die darauf folgende Unfähigkeit der Kontrolle der IL-17 vermittelten autoimmunen Entzündungsprozesse beobachtet (Fletcher et al., 2009). Auch beim Lupus erythematodes konnte nachgewiesen werden, dass CD4+CD25+ TRegs verringerte Mengen an FOXP3 mRNA und Proteine exprimieren und die Proliferation und Zytokinsekretion an den CD4+ Effektor T-Zellen kaum unterdrücken (Valencia et al., 2007). Im Kontrast dazu war beim inaktiven Lupus erythematodes die Menge an FOXP3 mRNA und Wirkung an CD4+Effektor TZellen vergleichbar mit gesunden Kontrollen. Die in vitro Aktivierung der CD4+CD25+ TRegs bei Patienten mit aktivem Lupus erythematodes führt zu einer erhöhten FOXP3 mRNA und Proteinexpression und der Wiederherstellung der suppressiven Funktion. Stark erhöhte TNF und verringerte IL-2 Produktion tragen zu diesem Prozess bei. Die Autoren bewiesen damit zum ersten Mal die Reversibilität der CD4+CD25+ TReg Funktion und schlugen Strategien zur Erhöhung dieser Zellen - 23 - vor, die den Patienten mit dieser Autoimmunerkrankung von Vorteil sein können, z.B. niedrig dosierte IL-2 oder TNF blockierende Stoffe. Zhao et al. konnten 2010 die molekularen Mechanismen identifizieren, die für den, von low-dose Cyclophosphamid verursachten, Abbau der TRegs verantwortlich sind (Zhao et al., 2010). Eine weitere Studie identifizierte die Herunterregulation von CD127 (IL-7 Rezeptor) in Kombination mit CD4 und CD25 als hochspezifischen Marker für die Population von TRegs, die eine hohe suppressive Funktion ausweisen (Liu et al., 2006). Aber nur die Expression des x–chromosomal kodierten Forkhead Transkriptionsfaktors FOXP3 ist ausschließlich in der natürlichen TReg Population zu finden und maßgeblicher Faktor für die Entstehung dieser T-Zellen. Zudem dient er als Maß für die Abstammung (lineage specification factor) und verleiht diesen Zellen ihre suppressive Funktion (Hori et al., 2003; Fontenot et al., 2005; Gavin et al., 2007). Diese Feststellung wird von zwei Studien unterstützt, die den Verlust der Supressorfunktion von genetisch markierten T-Zellen beobachteten (Gavin et al., 2007; Lin et al., 2007). Diese T-Zellen transkribieren nach dem gezielten Einbau von green fluorescent protein in den FOXP3 Lokus zwar den FOXP3 Lokus, jedoch exprimieren sie kein FOXP3 Protein mehr. Darüber hinaus führt eine Verringerung der FOXP3 Proteinexpression in den TRegs aufgrund einer induzierten Dysregulation der FOXP3 Gentranskription zu einer deutlichen Dämpfung der Suppressorfunktion (Wan und Flavell, 2007). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen resultiert die FOXP3-Ablation in reifen TRegs durch eine Cre-vermittelte Deletion eines FOXP3 Allels in einem Verlust der Suppressorfunktion (Williams und Rudensky, 2007). Genomweite Analysen der FOXP3 Bindungsstellen mit Hilfe von ex-vivo isolierten Maus-TReg-Zellen oder der FOXP3 transfizierten Hybridomzelllinie zeigten eine relativ kleine Anzahl von FOXP3-regulierten Genen, darunter einige Gene, die putative Effektormoleküle, z.B. CTLA4 und Nt5e (ecto-5'-nucleotidase), kodieren (Marson et al, 2007; Zheng et al, 2007). Eine Studie beobachtete, dass Mutationen in FOXP3, die für die Abwesenheit von TRegs verantwortlich sind, in eine Autoimmunerkrankung, das sogenannte IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked), resultieren (Hori et al., 2006). Dies ist der stärkste Beweisfaktor für die Theorie, dass FOXP3 für die Funktion von TRegs notwendig ist und dass eine intakte FOXP3+ TReg Funktion grundlegend für die Prävention von bestimmten Autoimmunerkrankungen ist. Weiterhin führt der genetische Mangel an FOXP3 zu einer sehr aggressiven und tödlichen - 24 - lymphoproliferativen Autoimmunerkrankung, die mehrere Organe betrifft. Die durch Medikamente induzierte Elimination der TRegs führt in neonatalen und ausgewachsenen Mäusen ebenfalls zu einer ähnlichen Erkrankung (Fontenot und Rudensky, 2005; Kim et al., 2007). Beim Menschen sind Autoimmunerkrankungen durch FOXP3 Mangel von einer Lymphadenopathie, einer Splenomegalie und schweren Erkrankungen der Haut und des Gastrointestinaltrakts, sowie einer fulminanten immunvermittelten Entzündung verschiedener Organe, wie der Leber, dem Pankreas, der Muskeln und der Lunge gekennzeichnet (Brunkow et al., 2001; Wildin und Freitas, 2005). Jedoch begrenzt seine intrazelluläre Lage die Nutzbarkeit für Studien. FOXP3 kann nicht benutzt werden, um menschliche TRegs für funktionelle Studien zu trennen oder für zelluläre Therapie in vivo zu expandieren (Liu et al., 2006). Des Weiteren zeigte eine Studie, dass Il-10 sezernierende TRegs zwar kein FOXP3 exprimieren, jedoch ähnliche regulatorische Funktionen wie natürlich vorkommende CD4+CD25+ TRegs haben (Vieira et al., 2004). Daher ist laut dieser Studie die Expression von FOXP3 keine Voraussetzung für die Aktivität von IL-10 TRegs. Und obwohl weitere Studien die Frage gestellt haben, ob alle TRegs FOXP3+ sind und ob alle FOXP3+T-Zellen TRegs sind, bleibt FOXP3 bis heute der beste und spezifischste Marker für die TReg Population (Ziegler, 2006; Rubtsov et al., 2008). Aktuell haben Lucas et al. herausgefunden, dass nicht die Proteinexpression von FOXP3 oder die FOXP3 mRNA, sondern die Demethylierung von CpG (Phosphodiesterverbindungen zwischen Cytosin und Guanin) Dinukleotiden im ersten Intron des FOXP3 Gens (FOXP3i1) der spezifischste Marker für menschliche TRegs ist (Lucas et al., 2012). Sie zeigten, dass die Demethylierung nicht mit der FOXP3 mRNA oder der FOXP3 Proteinexpression assoziiert war, obwohl sich die Demethylierung bis auf die Promotorregion und die terminale Region des Gens der untersuchten Melanomzellen ausweitete. Somit ist die Analyse der Demythylierung im FOXP3 Gen eine weitere Möglichkeit zur Detektion der TRegs. Nach Aktivation über Autoantigene des T-Zell Rezeptors (TCR) werden die hemmenden Zytokine IL-10 und TGF-β1 ausgeschüttet. Diese löslichen Faktoren werden bei der Suppression in vivo entleert (Assemann et al., 1992; Chen et al., 2005). In vitro sind der vorherrschende Mechanismus der Suppression die Zell-ZellKontakte. Die Oberflächenmoleküle, die für die TReg Zell Suppression benötigt werden, sind hauptsächlich CTLA-4 (Paust et al., 2004, Mellor und Munn, 2004), Chemokinrezeptoren CCR4 und CCR8 (Iellem et al., 2001), Selektine CD62L - 25 - (Salomon et al., 2000), Integrine CD103 (Lehmann et al., 2002) und CD127 (Liu et al., 2006) Kürzlich wurden in einer Studie mit Hilfe von Gen Clustering Experimenten weitere FOXP3-abhängige Suppressionsfunktionen der TRegs beobachtet (Gavin et al., 2007). Obendrein resultiert die Beseitigung des FOXP3 in der verringerten Expression dieser mutmaßlichen Suppressionsgene (Williams et al., 2007). Die Wirkung der TRegs erstreckt sich direkt auf antigen-präsentierende Zellen (APC) und aktivierte T-Zellen. Die induzierten TRegs entwickeln sich durch Induktion aus aktivierten CD4+ T-Zellen (CD25- oder CD25+ natürliche TRegs). Dabei besitzen sie eine variable CD25 Expression und sind spezifisch für Auto- und Fremdantigene. In gleicher Weise wie die natürlichen TRegs sezernieren auch die induzierten TRegs die Zytokine IL-10 und TGF-β1. Im Falle einer Infektion werden die TRegs durch die Infektionserreger aktiviert und setzten daraufhin die Intensität der Immunantwort herunter. Ohne diese Hemmung würden die immunologischen Vorgänge an der Infektionsstelle überhand nehmen und eventuell zu Schäden am eigenen Organismus führen. Bei der Infektionskaskade werden fremde und körpereigene Antigene von der APC aufgenommen und den TZellen präsentiert. Sowohl natürliche als auch induzierte TRegs werden per Chemotaxis zum Infektionsherd gelockt und durch eine Antigenpräsentation der APC aktiviert. Zusätzlich zu dieser Art der Aktivierung können die TRegs auch über pathogen associated molecular patterns (PAMPs), die an die Toll Like Rezeptoren (TLR) auf ihrer Oberfläche binden, aktiviert werden. Zur Regulation einer überschießenden Reaktion hemmen die, durch den TLR aktivierten, APC wiederrum die Aktivität der TRegs. Zusätzlich sind die TRegs in der Lage, ihre Aktivität untereinander zu beeinflussen. Bestimmte Subgruppen der TRegs werden durch CD2 vermittelten Kontakt mit antigenspezifischen T-Zellen aktiviert. Zum Beispiel gehören zu diesen Subgruppen die MHC (Major Histocompatibility Complex) II+ TRegs, welche wiederum die T-Zellen bei der Erzeugung von Zytokinen und der Proliferation hemmen. Eine weitere Subgruppe sind die IL-2-R+ TRegs, welche eine Th2 Antwort hervorrufen, die von den MHC II+ TReg blockiert werden kann (Pezzutto et al., 2007). Bei Autoimmunerkrankungen jedoch können chronisch aktivierte APCs unter dem Einfluss von intrazellulären Signalwegen, wie Phosphatidylinositol 3 Kinase, JAK-STAT, MAPK und nuclear factor κ B Pathways, der Überwachung durch TRegs zu entkommen, was zur Aktivierung von T-Zellen führt, die unempfänglich für die Suppression der TRegs sind. Darüber hinaus können - 26 - APCs und die APC-vermittelten entzündliche Zytokine wie TNF, IL-6, IL-1β und IL-23 die TRegs fehlerhaft machen. Dieses Wissen um die Bedeutung der APC-TReg Interaktionen bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz und der Aberrationen bei Autoimmunerkrankungen bietet eine Basis für therapeutische Ansätze, die gezielt diese Achse des Immunsystems ansprechen (André et al., 2009). - 27 - 2 Fragestellung und Ziel der Studie Der LS ist ein schon seit Jahren bekanntes Krankheitsbild. Dennoch ist die genaue Ätiologie und Pathogenese der Erkrankung weitgehend unbekannt. Insbesondere wird eine mögliche autoimmunologische Pathogenese in der Fachwelt diskutiert. Eine verminderte Aktivität der TRegs konnte in vielen autoimmunologischen Erkrankungen nachgewiesen werden. Damit es im Körper nicht zu einer überschießenden autoaggressiven Reaktion des Immunsystems kommt, benötigen wir TRegs. Sie werden durch IL-10 und TGF-β1 aktiviert, tragen selbst als Oberflächenmarker FOXP3, entwickeln sich aus CD4+ T-Zellen und aktivieren wiederrum CD4+ T-Zellen. Daher haben wir diese vier Marker für unsere Beobachtung ausgewählt. Mit dieser Studie soll geklärt werden, ob beim LS ebenfalls eine verminderte Expression der TRegs vorliegt und damit einhergehend autoimmune Prozesse als pathogenetische Ursache der Erkrankung bezeichnet werden können. Im Einzelnen sollen folgende Fragen beantwortet werden: 1. Wird in Proben der an LS erkrankten Patienten eine signifikant veränderte Expression der IL-10+, TGF-β1+, CD4+ oder FOXP3+ T-Zellen gefunden, die den Schluss einer Autoimmunerkrankung zulassen? 2. Gibt es Differenzen der Immunoreaktivität in der Epidermis und der Dermis bei den Proben der Untersuchungsgruppen im Vergleich zu den Proben der gesunden Kontrollgruppe? 3. Gibt es Unterschiede bei den Patienten mit einer kurzen Krankheitsdauer (<1 Jahr) im Vergleich zu den Patienten mit einer langen Krankheitsdauer (>5 Jahre)? 4. Gibt es Unterschiede zwischen den weiblichen und den männlichen LS Patienten? - 28 - 3 Methodik 3.1 Probanden In dieser Studie habe ich 39 Biopsien von 33 Patienten mit immunhistochemischen Methoden untersucht. Die Probanden waren zwischen 7 und 81 Jahren alt (das arithmetische Durchschnittsalter betrug 52,4 ± 18,7 Jahre). Ein positives Votum mit der Registriernummer 4222-12 der Ethikkomission der Ruhr-Universität Bochum lag bei Untersuchungsbeginn vor. 13 Biopsien stammten von den 12 Patienten der Untersuchungsgruppe 1, bei denen die Erstdiagnose des LS weniger als 1 Jahr vom Entnahmezeitpunkt der Probebiopsie entfernt war. Dabei lag die Erstdiagnose zwischen 6 Wochen und 1 Jahr (Durchschnitt 0,47 Jahre ≈ 6 Monate) vom Biopsiedatum entfernt. Die Probanden waren zwischen 7 und 81 Jahren alt (das arithmetische Durchschnittsalter betrug 52,5 ± 22,48 Jahre). Die Biopsien wurden aus unbehandelten genitalen Hautläsionen entnommen, bei den 6 Frauen aus den Labien und bei den 6 Männern aus dem Präputium. Alle Biopsien wurden zwischen April 2001 und April 2008 nach Einwilligung der Patienten in der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum vorgenommen. 18 Biopsien stammten von den 13 Patienten der Untersuchungsgruppe 2, bei denen die Erstdiagnose des LS mehr als 5 Jahre vom Entnahmezeitpunkt der Probebiopsie entfernt war. Zusätzlich stammten zwei Biopsien von 2 Patientinnen der Untersuchungsgruppe 1, bei denen eine zweite Biopsie mehr als 5 Jahre nach der Erstdiagnose erfolgte. Daher werden diese Biopsien als der Untersuchungsgruppe 2 zugehörig gewertet. In dieser Gruppe lag die Erstdiagnose zwischen 5 und 20 Jahre (Durchschnitt 9,6 Jahre) vom Biopsiedatum entfernt. Die Probanden waren zwischen 31 und 77 Jahren alt (das arithmetische Durchschnittsalter betrug 52,3 ± 15,38 Jahre). Die Biopsien wurden aus unbehandelten genitalen Hautläsionen entnommen, bei den 9 Frauen aus den Labien und in einem Fall oberhalb der Klitoris und bei den 4 Männern aus dem Präputium. Alle Biopsien wurden zwischen November 1999 und Oktober 2008 nach Einwilligung der Patienten in der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum vorgenommen. 8 Biopsien stammten von gesunden Patienten der Kontrollgruppe 3, bei denen aufgrund einer vermuteten dermatologischen Erkrankung eine Probebiopsie - 29 - entnommen wurde, in der sich jedoch kein Anhalt für eine pathologische Veränderungen finden ließ. Diese Biopsien dienen als Kontrolle zu den Biopsien aus pathologisch verändertem Gewebe. Alle Biopsien wurden im Jahre 2009 nach Einwilligung der Patienten in der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum vorgenommen. In einem zweiten Schritt habe ich die LS Biopsien in eine männliche und eine weibliche Subgruppe eingeteilt, um eine Aussage über die Unterschiede zwischen weiblichen und männlichen LS Patienten treffen zu können. Dabei enthielt die Gruppe der weiblichen LS Patienten (WLS) 19 Biopsien von 15 Frauen, die zwischen 7 und 72 Jahren alt waren (das arithmetische Durchschnittsalter betrug 53,9 ± 17,2 Jahre). Die Gruppe der männlichen LS Patienten (MLS) setzte sich aus 12 Biopsien von 10 Männern zusammen, die zwischen 24 und 81 Jahren alt waren (das arithmetische Durchschnittsalter betrug 50,2 ± 21,6 Jahre). 3.2 Biopsieentnahme Jeder Patient wurde vor dem Eingriff über mögliche Komplikationen und den Nutzen der Probeentnahme aufgeklärt und unterschrieb das Einwilligungsformular. Für die Biopsie wurden handelsübliche Rundstanzen (Familie Stiefel, Offenbach) mit einem Durchmesser von 2-6 mm (Standardgröße 4 mm) verwendet. Als Lokalanästhetikum wurde meist Scandicain (Mepivacain) subkutan um die Entnahmestelle injiziert. Danach wurde die Stelle desinfiziert und steril abgedeckt. Nach Ablauf der Einwirkzeit wurde die Haut in Querrichtung gespannt und die Stanze an die Haut gedrückt. Durch leichtes Anpressen und Rotieren wurde die Stanze bis in die Subkutis gedrückt. Das Biopsat wurde mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig entnommen und in einen mit gepuffertem 10%igen Formalin (4% Formaldehyd in Wasser) gefüllten Behälter gegeben. Dabei wurde besonders darauf geachtet, das Gewebe nicht zu quetschen, um die Qualität der histologischen Bewertung nicht zu beeinträchtigen. Nach der Blutstillung durch Kompression erfolgte, je nach Größe der Wunde, ein Verschluss mit sterilen Pflasterstreifen (Steristrips) oder darüber hinaus mit ein oder zwei Einzelknopfnähten (meist 4,0 Nähte). Im Anschluss wurde ein steriler Kompressionsverband auf die Wunde aufgebracht. Die Biopsieentnahme wurde von den Assistenzärzten der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum zwischen 1999 und 2009 vorgenommen. - 30 - 3.3 Ablauf der histologischen Gewebebearbeitung Das formalinfixierte Gewebe wurde nachfolgend in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden senkrecht zur Hautoberfläche verlaufende Schnitte mit Hilfe eines Mikrotoms angefertigt. Die Gewebeschnitte wurden auf Objektträger aufgetragen und angetrocknet. Danach wurde das Paraffin mithilfe von Xylol entfernt. Um die verschiedenen Färbungen anzuwenden, wurde über eine absteigende Alkoholreihe per Isopropylalkohol das Gewebe wieder in eine wässrige Lösung gebracht. Vor der Färbung erfolgte eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung oder auch heat induced epitope retrieval (HIER) mit Dako REAL™ Proteinase K, CodeNr. S2019, verdünnt in Dako REAL™ Proteinase K Diluent, Code-Nr. S2032. Nach diesem Demaskierungs-Arbeitsschritt verblieben die Objektträger 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Pufferlösung. Während dieser Abkühlphase wurde der Dako-Immunfärbeautomat für den Färbedurchlauf vorbereitet. Dazu wurde die endogene alkalische Phosphatase (Dako REAL™ Streptavidin Alkaline Phosphatase) durch Zugabe von einem Tropfen Dako REAL™ Levamisole (501fach konzentrierte und gepufferte Levamisol-Lösung) zu 750 µl Dako REAL™ AP Substrate Buffer (gepufferte Substratlösung mit Konservierungsmittel) blockiert. Im Anschluss wurden je 30 µl Dako REAL™ Chromogen Red 1, Dako REAL™ Chromogen Red 2 und Dako REAL™ Chromogen Red 3 (alle 28fach konzentriert) zugegeben. Diese Fast Red-Chromogene machten die Antikörperreaktion sichtbar. Sodann wurde das Dako REAL™ Detection System, Alkaline Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse mit dem Dako-Immunfärbeautomat verwendet. Das, auf der LSABMethode (markiertes Streptavidin-Biotin) beruhende, Kit wurde in einem DreiSchritt-Verfahren eingesetzt. Zuerst wurde das Gewebe mit einem optimal verdünnten primären Kaninchen- oder Mausantikörper (Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies verdünnt mit Dako REAL™ Antibody Diluent, Code-Nr. S2022), danach mit Dako REAL™ Biotinylated Secondary Antibodies (Biotinylierte Ziege-Anti-Maus- und Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobuline in gepufferter Lösung mit stabilisierendem Protein und Natriumazid) und schließlich mit der vorbereiteten Dako REAL™ Streptavidin Alkaline Phosphatase (an alkalische Phosphatase konjugiertes Streptavidin in gepufferter Lösung mit stabilisierendem Protein und Konservierungsmittel) inkubiert. Es wurden CD4 (Novocastra Loxo, Dossenheim, Germany), FOXP3 (eBioscience, Hatfield, Ireland, UK), Interleukin 10 - 31 - (IL-10, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), und Transforming Growth Factorß1 (TGF-ß1, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) verwendet. Das Substratchromogen führte zu einem kontrastreichen roten Endpunkt am Ort des Zielantigens. Für die Gegenfärbung wurde Dako REAL™ Hematoxylin, Code- Nr.S2020 verwendet, was eine deutliche nukleäre Blaufärbung hervorrief. Für die Fixierung der gefärbten Gewebeschnitte wurden sowohl Fixiermittel auf wässriger als auch auf Basis organischer Lösungsmittel eingesetzt. Die Färbungen wurden von Frau S. Richter, MTA des immunhistologischen Labors des St. Josef-Hospitals Bochum, durchgeführt. 3.4 Zählung der angefärbten Zellen Es wurden von allen 39 Biopsien 4 Schnitte angefertigt und in jedem Schnitt die Zellen angefärbt, die die Antigene Il-10, TGF-β1, CD4 oder FOXP3 exprimierten. Da diese Proteine charakteristisch für TRegs sind, ist auf diese Weise die Anzahl der TRegs in den Hautschnitten sehr gut ermittelbar. So entstanden 156 histologische Schnitte, davon 52 der Untersuchungsgruppe 1, 72 der Untersuchungsgruppe 2 und 32 der Kontrollgruppe 3. In den geschlechtsspezifischen Subgruppen ergaben sich 76 Schnitte der Untersuchungsgruppe WLS, 48 Schnitte der Untersuchungsgruppe MLS und ebenfalls 32 Schnitte der gesunden Kontrollgruppe 3. In jedem der 156 Schnitte habe ich selbstständig die angefärbten Zellen in 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern in der Epidermis und in 5 ebenfalls zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern in der Dermis ausgezählt. Die Zählung erfolgte unter 40facher Vergrößerung mit einem Leica DMLS Type 020-518.500 Mikroskop, Modul M125, ID-Nummer 3159, Leica Microsystems Wetzlar GmbH. In jedem Gesichtsfeld habe ich zuerst 100 T-Zellen gezählt, wobei sowohl gefärbte, als auch ungefärbte Zellen berücksichtigt wurden. In einem zweiten Schritt habe ich von diesen 100 Zellen nur die angefärbten TRegs gezählt und in ein Verhältnis zu den zuerst ermittelten 100 T-Zellen gesetzt. Dieser Wert zeigte mir nun den Prozentanteil der TRegs unter allen T-Zellen an. Diese Schritte habe ich für alle 156 Schnitte je fünfmal in zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern in der Dermis und fünfmal in zufällig ausgewählten Gesichtsferldern der Epidermis wiederholt. Den Mittelwert der Prozentanteile aus allen 5 Gesichtsfeldern der Epidermis habe ich als Ergebniswert der Epidermis und den Mittelwert der Prozentanteile aus allen 5 Gesichtsfeldern der - 32 - Dermis habe ich als Ergebniswert der Dermis bezeichnet. In einem ersten Schritt habe ich diese Ergebniswerte nach der Krankheitsdauer in Gruppe 1 (Krankheitsdauer <1 Jahr), Gruppe 2 (Krankheitsdauer >5 Jahren) und Gruppe 3 (Gesunde Kontrollen) eingeteilt. In einem zweiten Schritt habe ich diese Ergebniswerte nach dem Geschlecht in die Subgruppen WLS, MLS und Gruppe 3 (Gesunde Kontrollen) aufgeteilt. 3.5 Statistische Analyse Die Statistische Analyse wurde mit Hilfe der MedCalc Software (MedCalc, Mariakerke, Belgien) durchgeführt. Die Verteilung der Daten wurde anhand des D’Agostino-Pearson-Test ermittelt. Bei Normalverteilung wurde die univariate ANOVA (nach der englischen Bezeichnung analysis of variance) eingesetzt. Für weitere Paar-Vergleiche nach Feststellung der Signifikanz wurde der posthoc-Test nach Student-Newman-Keuls Korrelationskoeffizienten wurde angewandt. Die mittels Pearson-Korrelationsprozedur der Bestimmung des vorgenommen. Die ANOVA ist ein statistisches Verfahren zur Berechnung des Vergleiches der Mittelwerte für mehr als zwei voneinander unabhängige Stichproben. Sie stellt den Unterschied zwischen den Erwartungswerten und die Varianz innerhalb und zwischen den Stichproben dar. So kann über deren Signifikanz entschieden werden. P Werte von weniger als 0,05 sind statistisch signifikant. Die Voraussetzungen der ANOVA wie Varianzhomogenität, Normalverteilung und voneinander unabhängige Erhebung der Stichproben wurden sichergestellt. Man bezeichnet die unabhängige Variable, die in I Kategorien vorhanden ist, als Faktor und die einzelnen Kategorien als Faktorstufen. Da wir nur die Wirkung eines Faktors auf die unabhängige Variable beobachten, benennen wir sie als einfache (einfaktorielle bzw. univariate) Varianzanalyse. Als Posthoc-Test zur Verminderung des Fehlers 1. Art wurde der Student-NewmanKeuls Test benutzt. Er ähnelt dem Tukey-Test und dient als paarweises Vergleichsverfahren. Zusätzlich eruiert er die Möglichkeit der Signifikanz des Ergebnisses des globalen Tests mit Hilfe der Vergleiche der Mittelwerte, um die signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Faktorstufen zu finden. - 33 - Der Korrelationskoeffizient, auch Pearsons-Korrelation, diente als Maßstab für den linearen Zusammenhang zwischen den einzelnen Faktoren. Die Werte -1 bzw. +1 bezeugen eine vollständige negative bzw. positive lineare Abhängigkeit. Der Wert 0 bedeutet dabei, dass kein Zusammenhang zwischen den Faktoren besteht (Hain, J., 2011; Salkind, N., 2010; Varianzanalyse, Wikipedia.de, 2012; Korrelationskoeffizient, Wikipedia.de, 2012). Die statistische Analyse unter Verwendung der MedCalc Software (MedCalc, Mariakerke, Belgien) wurde von PD Dr. med. T. Gambichler, Doktorvater und Oberarzt in der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum, durchgeführt. Die Ergebnisse der statistischen Analyse habe ich dann selbstständig ausformuliert. Der Probenumfang implizierte 39 Biopsien, davon 13 in der Gruppe des Faktors 1 mit der Krankheitsdauer des LS von weniger als einem Jahr (als einzige Ausnahme betrug der Umfang der Proben des Faktors 1 in der Gruppe der IL-10 positiven Proben nur 12). Darüber hinaus betrug der Umfang 18 Biopsien in der Gruppe des Faktors 2, mit der Krankheitsdauer des LS von mehr als 5 Jahren und 8 Biopsien in der Gruppe des Faktors 3 als gesunde Kontrollproben. Zusätzlich wurden diese 39 Biopsien in eine weibliche und männliche Subgruppe eingeteilt und ergaben so 19 Biopsien in der Gruppe des Faktors WLS, 12 Biopsien in der Gruppe des Faktors MLS (als einzige Ausnahme betrug der Umfang der Proben des Faktors MLS in der Gruppe der IL-10 positiven Proben nur 11) und 8 Biopsien in der Gruppe des Faktors 3 als gesunde Kontrollproben. Bei den CD4 Proben betrug der arithmetische Durchschnittswert der CD4 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors 1 16,6 mit dem 95% Konfidenzintervall von 8,9 bis 24,3 und der Standardabweichung von 12,7. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 2 belief sich auf 18,0 mit dem 95% Konfidenzintervall von 11,0 bis 25,1 und der Standardabweichung von 14,2. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 17,3 mit dem 95% Konfidenzintervall von 10,4 bis 24,2 und der Standardabweichung von 8,3. Die Varianzanalyse zwischen den Gruppen (Einflussfaktor) ergab als Quadratsumme (Sum of squares) 14,5 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 2 einen Mittelwert (Mean square) von 7,3. Die Varianzanalyse innerhalb der Gruppen (andere Schwankungen) belief sich mit der Quadratsumme (Sum of squares) 5828,6 - 34 - und mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 36 auf einen Mittelwert (Mean square) von 161,9. Insgesamt ergab sich so die totale Quadratsumme (Total sum of squares) 5843,1 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 38. Die F-Ratio betrug 0,0449 und das Signifikanzniveau P 0,956. In der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse ergab der arithmetische Durchschnittswert der CD4 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors WLS 12,9 mit dem 95% Konfidenzintervall von 6,6 bis 19,3 und der Standardabweichung von 13,2. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors MLS belief sich auf 24,6 mit dem 95% Konfidenzintervall von 17,8 bis 31,3 und der Standardabweichung von 10,7. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 17,3 mit dem 95% Konfidenzintervall von 10,4 bis 24,2 und der Standardabweichung von 8,3. Die F-Ratio betrug 3,697 und das Signifikanzniveau P 0,035. Bei den FOXP3 Proben betrug der arithmetische Durchschnittswert der FOXP3 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors 1 16,0 mit dem 95% Konfidenzintervall von 11,3 bis 20,8 und der Standardabweichung von 7,9. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 2 belief sich auf 11,0 mit dem 95% Konfidenzintervall von 7,3 bis 14,7 und der Standardabweichung von 7,4. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 3,3 mit dem 95% Konfidenzintervall von 0,8 bis 5,8 und der Standardabweichung von 3,0. Die Varianzanalyse zwischen den Gruppen (Einflussfaktor) ergab als Quadratsumme (Sum of squares) 806,8 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 2 einen Mittelwert (Mean square) von 403,4. Die Varianzanalyse innerhalb der Gruppen (andere Schwankungen) belief sich mit der Quadratsumme (Sum of squares) 1750,3 und mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 36 auf einen Mittelwert (Mean square) von 48,6. Insgesamt ergab sich so die totale Quadratsumme (Total sum of squares) 2557,1 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 38. Die F-Ratio betrug 8,298 und das Signifikanzniveau P 0,001. In der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse ergab der arithmetische Durchschnittswert der FOXP3 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors WLS 14,8 mit dem 95% Konfidenzintervall von 10,9 bis 18,7 und der Standardabweichung von 8,0. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors MLS belief sich auf 10,5 mit dem 95% Konfidenzintervall von 5,8 bis 15,2 und der - 35 - Standardabweichung von 7,3. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 3,3 mit dem 95% Konfidenzintervall von 0,8 bis 5,8 und der Standardabweichung von 3,0. Die F-Ratio betrug 9,573 und das Signifikanzniveau P<0,001. Bei den IL-10 Proben betrug der arithmetische Durchschnittswert der IL-10 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors 1 3,3 mit dem 95% Konfidenzintervall von 1,4 bis 5,3 und der Standardabweichung von 3,1. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 2 belief sich auf 5,1 mit dem 95% Konfidenzintervall von 1,7 bis 8,4 und der Standardabweichung von 6,7. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 12,4 mit dem 95% Konfidenzintervall von 5,7 bis 19,2 und der Standardabweichung von 8,1. Die Varianzanalyse zwischen den Gruppen (Einflussfaktor) ergab als Quadratsumme (Sum of squares) 430,7 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 2 einen Mittelwert (Mean square) von 215,3. Die Varianzanalyse innerhalb der Gruppen (andere Schwankungen) belief sich mit der Quadratsumme (Sum of squares) 1331,5 und mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 35 auf einen Mittelwert (Mean square) von 38,0. Insgesamt ergab sich so die totale Quadratsumme (Total sum of squares) 1762,2 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 37. Die F-Ratio betrug 5,660 und das Signifikanzniveau P 0,007. In der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse ergab der arithmetische Durchschnittswert der IL-10 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors WLS 4,6 mit dem 95% Konfidenzintervall von 1,4 bis 7,8 und der Standardabweichung von 6,6. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors MLS belief sich auf 4,0 mit dem 95% Konfidenzintervall von 1,8 bis 6,2 und der Standardabweichung von 3,2. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 12,4 mit dem 95% Konfidenzintervall von 5,7 bis 19,2 und der Standardabweichung von 6,7. Die F-Ratio betrug 5,328 und das Signifikanzniveau P 0,010. Bei den TGF-β1 Proben betrug der arithmetische Durchschnittswert der TGF-β1 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors 1 13,9 mit dem 95% Konfidenzintervall von 6,9 bis 20,9 und der Standardabweichung von 11,6. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 2 belief sich auf 15,5 mit dem 95% - 36 - Konfidenzintervall von 10,6 bis 20,4 und der Standardabweichung von 9,8. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 10,8 mit dem 95% Konfidenzintervall von 6,3 bis 15,3 und der Standardabweichung von 5,4. Die Varianzanalyse zwischen den Gruppen (Einflussfaktor) ergab als Quadratsumme (Sum of squares) 126,3 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 2 einen Mittelwert (Mean square) von 63,2. Die Varianzanalyse innerhalb der Gruppen (andere Schwankungen) belief sich mit der Quadratsumme (Sum of squares) 3471,6 und mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 36 auf einen Mittelwert (Mean square) von 96,4. Insgesamt ergab sich so die totale Quadratsumme (Total sum of squares) 3597,9 mit dem Freiheitsgrad (Degrees of freedom) von 38. Die F-Ratio betrug 0,655 und das Signifikanzniveau P 0,526. In der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse ergab der arithmetische Durchschnittswert der TGF-β1 positiven dermalen T-Zellen der Gruppe des Faktors WLS 14,5 mit dem 95% Konfidenzintervall von 9,4 bis 19,6 und der Standardabweichung von 10,6. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors MLS belief sich auf 15,4 mit dem 95% Konfidenzintervall von 8,6 bis 22,2 und der Standardabweichung von 10,7. Der Durchschnittswert der Gruppe des Faktors 3 bezifferte sich auf 10,8 mit dem 95% Konfidenzintervall von 6,3 bis 15,3 und der Standardabweichung von 5,4. Die F-Ratio betrug 0,579 und das Signifikanzniveau P 0,566. Die Korrelation zwischen den 12 Proben des IL-10 und des FOXP3 des Faktors 1 (Krankheitsdauer des LS von weniger als 1 Jahr) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von -0,078 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,6 bis 0,5 und ein Signifikanzniveau P von 0,811. Die Korrelation zwischen den 18 Proben des IL-10 und des FOXP3 des Faktors 2 (Krankheitsdauer des LS von mehr als 5 Jahren) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von 0,040 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,4 bis 0,5 und ein Signifikanzniveau P von 0,876. Die Korrelation zwischen den 13 Proben des TGF- β1 und des FOXP3 des Faktors 1 (Krankheitsdauer des LS von weniger als 1 Jahr) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von 0,007 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,5 bis 0,6 und ein Signifikanzniveau P von 0,981. Die Korrelation zwischen den 18 Proben des - 37 - TGF- β1 und des FOXP3 des Faktors 2 (Krankheitsdauer des LS von mehr als 5 Jahren) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von 0,240 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,3 bis 0,6 und ein Signifikanzniveau P von 0,338. Die Korrelation zwischen den 12 Proben des TGF- β1 und des IL-10 des Faktors 1 (Krankheitsdauer des LS von weniger als 1 Jahr) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von 0,081 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,5 bis 0,6 und ein Signifikanzniveau P von 0,803. Die Korrelation zwischen den 18 Proben des TGF- β1 und des IL-10 des Faktors 2 (Krankheitsdauer des LS von mehr als 5 Jahren) ergab einen Korrelationskoeffizienten r von 0,353 mit dem 95% Konfidenzintervall -0,1 bis 0,7 und ein Signifikanzniveau P von 0,150. - 38 - 4 Ergebnisse 4.1 CD4 Wie Tabelle 1 zeigt, fanden sich in den CD4+ gefärbten Schnitten keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Zellzahl der Dermis zwischen Gruppe 1 (Krankheitsdauer weniger als 1 Jahr), Gruppe 2 (Krankheitsdauer über 5 Jahre) und Gruppe 3 (Gesunde Kontrollen). Der P Wert betrug 0,96 (ANOVA). Von allen vier untersuchten Markern fand sich hier die niedrigste Signifikanz. Somit können wir schlussfolgern, dass es weder bei kurzer noch bei langer Krankheitsdauer des LS zu einer erhöhten oder erniedrigten Expression von CD4+ T- Zellen kommt. Bei der Subgruppenanalyse nach dem Geschlecht zeigte sich bei den MLS eine erhöhte Proteinexpression von CD4+ T-Zellen im Vergleich zu den WLS (Tabelle 2). Der P Wert betrug 0,035 (ANOVA). 4.2 TGF-β1 In den TGF-β1 gefärbten Schnitten fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den 3 Gruppen (Tabelle 1). Zwar gab es eine leichte Erhöhung der TGF-β1 Expression in der Dermis der LS Proben, etwas stärker in denen mit der Krankheitsdauer über 5 Jahre, jedoch war diese leichte Erhöhung nicht signifikant (ANOVA, P = 0,526). Es ergaben sich also keine signifikanten Unterschiede zwischen der Expression von TGF-β1 zwischen den LS Proben und den gesunden Kontrollproben. Bei der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse gab es ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen WLS, MLS oder Gruppe 3 (ANOVA, P = 0,566). Weder gab es eine signifikante Korrelation zwischen den Gruppe 1 TGF-β1 und FOXP3 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,008) oder Gruppe 2 TGF-β1 und FOXP3 ( ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,240) noch zwischen den Gruppe 1 TGF-β1 und IL-10 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,081) oder Gruppe 2 TGF-β1 und IL-10 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,353). Daher können wir annehmen, dass es zwischen der Expression von TGF-β1 und FOXP3 bzw. IL-10 keinen bzw. einen nur sehr geringen Zusammenhang gibt. - 39 - 4.3 IL-10 Die IL-10 gefärbten Biopsien wiesen eine statistisch signifikante Verringerung der dermalen Proteinexpression der LS Proben im Vergleich zu den gesunden Kontrollproben auf (Abbildung 1). Der P Wert betrug hier 0,007 und erlaubt damit den Schluss der hohen Signifikanz (Tabelle 1). Die Proben mit der kurzen Krankheitsdauer von unter 1 Jahr (Gruppe 1) zeigten sogar eine noch geringere IL-10 Proteinexpression im Vergleich zu den Proben mit der Krankheitsdauer von über 5 Jahren (Gruppe 2). So können wir schlussfolgern, dass besonders die akute Erkrankung an LS und in verringerten Umfang auch die chronische Erkrankung an LS die Proteinexpression an IL-10 in den T-Zellen unterdrückt. Dies wurde durch die Untersuchung der IL-10+ T-Zellen bei WLS und MLS bekräftigt, wobei besonders die IL-10 Proteinexpression bei MLS statistisch signifikant erniedrigt war (Tabelle 2). Der P Wert betrug hier 0,010 (ANOVA). Jedoch ergab die Korrelation zwischen der Proteinexpression von IL-10 und FOXP3 bzw. TGF-β1 keinerlei signifikanten Zusammenhang. Weder gab es eine signifikante Korrelation zwischen den Gruppe 1 Il-10 und FOXP3 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = -0,078) oder Gruppe 2 IL-10 und FOXP3 ( ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,040) noch zwischen den Gruppe 1 IL-10 und TGF-β1 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,081) oder Gruppe 2 IL-10 und TGF-β1 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r =0,353). 4.4 FOXP3 Besonders die FOXP3 gefärbten Schnitte zeigten eine statistische Signifikanz der Immunoreaktivität in der Dermis im Vergleich zu den gesunden Kontrollen (Abbildung 2). Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, handelte es sich nicht um eine Verringerung wie bei den IL-10+ Schnitten, sondern um eine Erhöhung im Vergleich zu den gesunden Kontrollproben. Hier fand sich von allen vier untersuchten Markern die höchste Signifikanz (ANOVA, P = 0,001). In den Proben mit der kurzen Krankheitsdauer von weniger als einem Jahr (Gruppe 1) ergab sich die höchste Proteinexpression, folgend von den Proben mit der Krankheitsdauer von mehr als 5 Jahren (Gruppe 2). Dies zeigt, dass hauptsächlich die akute Erkrankung an LS und in geringerem Maße auch die chronische Erkrankung an LS die Hochregulierung der FOXP3+ TRegs fördert. In der geschlechtsspezifischen Subgruppenanalyse ergab sich - 40 - eine statistisch signifikante Erhöhung der FOXP3+ T-Zellen bei den WLS, gefolgt von den MLS (Tabelle 2). Der P Wert betrug hier <0,001 und zeigte damit die höchste Signifikanz von allen untersuchten Markern (ANOVA). Doch auch hier gab es keinen signifikanten Zusammenhang in der Korrelation zwischen der Proteinexpression von FOXP3 und IL-10 bzw. TGF-β1. Es zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen den Gruppe 1 FOXP3 und IL-10 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = -0,078) oder Gruppe 2 FOXP3 und IL-10 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,040) noch zwischen der Gruppe 1 FOXP3 und TGF-β1 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,007) oder Gruppe 2 FOXP3 und TGF-β1 (ANOVA, Korrelationskoeffizient r = 0,240). - 41 - 4.5 Tabellen und Abbildungen Tabelle 1: Zeigt die durchschnittliche Zellanzahl der CD4+, FOXP3+, IL-10+ und TGF-ß1+ dermalen Lymphozyten in Gruppe 1 (Krankheitsdauer weniger als 1 Jahr), Gruppe 2 (Krankheitsdauer über 5 Jahre) und Gruppe 3 (Gesunde Kontrollen). CD4 FOXP3 IL-10 TGF-ß1 Gruppe 1 (n=13) 16,6 ± 12,7 16,1 ± 7,1 3,3 ± 3,1 13,9 ± 11,6 Gruppe 2 (n=18) 18 ± 14,2 11 ± 7,4 5,1 ± 7,7 15,5 ± 9,8 Gruppe 3 (n=8) 17,3 ± 8,3 3,3 ± 2,9 12,4 ± 6,7 10,8 ± 5,4 ANOVA StudentNewman-Keuls test, P < 0,05 P = 0,96 P = 0,001 Gruppe 1 und Gruppe 2 vs. Gruppe 3 P = 0,007 Gruppe 1 und Gruppe 2 vs. Gruppe 3 P = 0,53 - 42 - Tabelle 2: Zeigt die durchschnittliche Zellanzahl der CD4+, FOXP3+, IL-10+ und TGF-ß1+ dermalen Lymphozyten in der Gruppe der weiblichen LS (WLS), der Gruppe der männlichen LS (MLS) und Gruppe 3 (Gesunde Kontrollen). CD4 FOXP3 IL-10 TGF-ß1 WLS (n=19) 12,9 ± 13,2 14,8 ± 8,0 4,6 ± 6,6 14,5 ± 10,6 MLS (n=12) 24,6 ± 10,7 10,5 ± 7,3 4,0 ± 3,2 15,4 ± 10,7 Gruppe 3 (n=8) 17,3 ± 8,3 3,3 ± 3,0 12,4 ± 6,7 10,8 ± 5,4 ANOVA StudentNewman-Keuls test, P < 0,05 P = 0,035 WLS vs. MLS P <0,001 WLS vs. MLS und Gruppe 3; MLS vs. Gruppe 3 P = 0,01 WLS und MLS vs. Gruppe 3 P = 0,57 - 43 - (a) (b) Abbildung 1: Immunhistochemische Färbungen von IL-10+ Lymphozyten bei LS (a) und einer gesunden Kontrolle (b). Hier zeigt sich bei LS eine schwächere Färbung der IL-10+ Lymphozyten im Vergleich zur gesunden Kontrolle. (a) (b) Abbildung 2: Immunhistochemische Färbungen von FOXP3+ Lymphozyten bei LS (a) und einer gesunden Kontrolle (b). Im Gegensatz zur gesunden Kontrolle zeigt sich bei LS eine verstärkte dermale Färbung. - 44 - 5 Diskussion Der LS ist eine T-Zell vermittelte, nicht infektiöse, chronisch entzündliche Bindegewebserkrankung, die hauptsächlich in der anogenitalen Region auftritt. Sie ist für die Wissenschaft eine sehr interessante Erkrankung, da sie die drei grundlegenden Prozesse in der Pathologie umfasst. Diese sind Entzündung, Fibrose und tumoröse Entartung. Eine autoimmunologische Pathogenese wurde bisher oft diskutiert, die genaue Ätiologie konnte aber bisher noch nicht geklärt werden. Zur Stützung der Theorie einer Autoimmunerkrankung gibt es einige Hinweise. Erstens haben LS Patienten auch häufig die Diagnose einer weiteren Autoimmunerkrankung wie der Alopecia (Weißfleckenkrankheit), areata der (kreisrunder Haarausfall), Hyperthyreose, dem Morbus der Vitiligo Basedow, der Hypothyreose, dem Diabetes mellitus Typ I und II, der primären biliären Zirrhose, der Colitis ulcerosa, der Achlorhydrie mit oder ohne perniziöser Anämie, dem Schleimhautpemphigoid und dem narbigem Pemphigoid, den Ekzemen, der atopischen Dermatitis, der Polymyalgia rheumatica, der Psoriasis, der Fasziitis, der Myositis, dem Lupus panniculitis, dem LP oder dem systemischen Lupus erythematodes (Meffert et al., 1995, Powell und Wojnarowska, 1999; Cooper et al., 2008). Daneben begünstigen auftretende gewebe- und organspezifische Autoantikörper dieser Autoimmunerkrankungen bei LS Patienten und Verwandten ersten Grades die Assoziation mit einer autoimmunologischen Pathogenese (Goolamali et al., 1974; Powell und Wojnarowska, 1999; Powell und Wojnarowska, 2001). Zweitens tritt der LS häufiger bei Frauen als bei Männern auf, wie bei vielen weiteren Autoimmunerkrankungen (Powell und Wojnarowska, 1999; Moyal-Barraco und Edwards, 2004). Die Assoziation von LS mit organ-spezifischen und nichtorgan-spezifischen Autoimmunerkrankungen wurde bei Frauen gut beschrieben (Baldo et al., 2010a; Baldo et al., 2010b; Bunker und Neill, 2010; Gambichler et al., 2010; Gambichler et al., 2011). So kann es gut möglich sein, dass die Pathogenese des LS bei Frauen eine andere ist als bei Männern (Edmonds et al., 2011b; Oyama et al., 2003; Kreuter et al., 2012a; Regauer et al., 2005; Terlou et al., 2012; Edmonds et al., 2011a). Eine aktuelle Studie von Kreuter et al. hat deutlich gezeigt, dass Männer und Frauen unterschiedliche Prozentsätze an mit LS assoziierten Autoimmunerkrankungen aufweisen (Kreuter et al., 2012a). Beim Vergleich von an - 45 - LS erkrankten Männern mit gesunden Kontrollen war die Prävalenz einer weiteren Autoimmunerkrankung sogar noch geringer als in der Allgemeinbevölkerung. Im Gegensatz dazu fanden die Autoren bei den an LS erkrankten Frauen eine hohe Prävalenz an assoziierten Autoimmunerkrankungen und zirkulierenden Autoantikörpern. Daher scheint die Autoimmunität bei Männern von wesentlich geringerer Bedeutung zu sein. Diese Hypothese wird von unseren Daten unterstützt, die eine stärkere Erhöhung der FOXP3+ T Regs bei Frauen als bei Männern zeigen (ANOVA, P < 0,001). Das steht im Einklang mit einer kürzlich durchgeführten Studie von Edmonds et al. an 329 männlichen Patienten mit LS, die nur bei 23 (7%) der Patienten eine assoziierte Autoimmunerkrankung feststellen konnte (Edmonds et al., 2012). Die Autoren vermuten, dass der Kontakt von Urin mit Genitalepithel der wichtigste Faktor für die Entstehung des LS bei männlichen Patienten sein könnte. Es wäre möglich, dass bei unbeschnittenen männlichen Patienten der Urin aufgrund einer dysfunktionellen naviculomeatalen Klappe aus der Urethra tröpfelt und sich in den inneren Teilen der Vorhaut sammelt. Bei disponierten Patienten würde so der Prozess der Entstehung des LS eingeleitet werden. Dies würde auch die typische Lokalisation des LS bei männlichen Patienten an Glans und Vorhaut und das sehr seltene extragenitale und perianale Auftreten erklären. Zudem wäre dies eine weitere Begründung für die hohe Heilungsrate der männlichen LS Patienten nach Beschneidung (Kreuter et al., 2012a; Edmonds et al., 2012). Die Bildung von Ig G Autoantikörpern gegen das ECM1 ist in einer englischen Studie bei >75% der weiblichen Patienten beobachtet worden (Oyama et al., 2003; Oyama et al., 2004). Außerdem wiesen Edmonds et al. ECM1 Autoantikörper bei männlichen LS Patienten nach (Edmonds et al., 2011b). Dennoch kann laut den Autoren die Präsenz von humoralen ECM1-Autoantikörpern nicht komplett die pathophysiologischen Eigenschaften des LS erklären. Sie bewiesen aber die stärkere autoimmunologische Reaktivität in den Biopsien von Patienten mit einer Krankheitsdauer von über einem Jahr oder einer starken Krankheitsausprägung. Daher halten es die Autoren für möglich, dass die ECM1 verursachte Autoreaktivität eher als Folge der klinischpathologischen Manifestationen als ein initiatives Ereignis auftritt. So postulieren sie, dass die ECM1 Antikörper nicht Teil des ursächlichen Mechanismus der Entstehung des LS sind, sondern eher eine Begleiterscheinung des LS darstellen. Auch zirkulierende Autoantikörper gegen die Basalmembran und das Kollagen XVII wurden beschrieben (Howard et al., 2004). Zusätzlich erbrachten Cooper et al. den - 46 - Beweis der Präsenz von autoreaktiven T-Zellen gegen Bestandteile der Basalmembran beim LS (Cooper et al., 2005). Letztlich wurde der Zusammenhang von LS mit dem HLA class II Antigen DQ 7, das hautspezifische Merkmale aufweist, und eine Assoziation mit HLA-DQ8 und DQ9 enthüllt (Friedrich und McLaren, 1984; Marren et al., 1995b; Powell et al., 2000). Eine immunogenetische Studie erbrachte den Beweis der Verbindung mit DRB1*12 und dem Haplotyp DRB1*12/DQB1*0301/04/09/010, was wiederum die Theorie einer autoimmunen Pathogenese stützt (Gao et al., 2005). Zuletzt veröffentlichten Terlou et al. eine Studie, die die Hintergründe der molekularen und immunologischen Mechanismen im LS aufzeigen sollte (Terlou et al., 2012). Darin erbrachten sie den Beweis einer signifikanten T-Zell Antwort mit erhöhten Werten für CD8+ T-Zellen und FOXP3+ TRegs in der Dermis. Demgegenüber beobachteten sie keine Veränderung der Anzahl der CD4+T-Zellen zu den gesunden Kontrollen. Zusätzlich zeigten sie eine erhöhte Expression an pro-inflammatorischen Zytokinen (IFNγ, CXCR3, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCR5, CCL4 und CCL5) als Indikation für eine zelluläre Th1 Antwort und eine Hochregulation von miR-155, eine MicroRNA, die für die Regulation der Homöostase des Immunsystems verantwortlich ist. Kürzlich erbrachten Gambichler et al. den Beweis der Hochregulierung einiger antimikrobieller Peptide und Proteine (Human beta-defensin-2 und Psoriasin) bei weiblichen LS (Gambichler et al., 2009). Die Autoren spekulieren, dass dies entweder eine angeborene Immunabwehrreaktion oder das Zeichen einer direkten pathogenen Relevanz der antimikrobiellen Peptide sein könnte. All diese Beobachtungen liefern weitere Beweise zur Unterstützung der Theorie einer autoimmunen Pathogenese. Um die Zusammensetzung des zellulären Infiltrates zu bestimmen, habe ich die Anzahl der CD4+, der FOXP3+, der IL-10+ und der TGF-β1+ T-Zellen in der Epidermis und der Dermis gezählt. In der Epidermis fand ich keine Veränderungen der Proteinexpression der LS Proben im Vergleich mit den gesunden Kontrollproben. In der Dermis jedoch beobachtete ich einige interessante und signifikante Veränderungen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Terlou et al. beobachtete auch ich keinen signifikanten Unterschied in der Immunoreaktivität von CD4+ T-Zellen beim LS und gesunden Kontrollen (ANOVA, P = 0,956). Zusätzlich unterschied ich zwischen LS mit kurzer Krankheitsdauer von weniger als einem Jahr und LS mit langer Krankheitsdauer von mehr als 5 Jahren. Doch in keiner Subgruppe des LS - 47 - kam es zu einer erhöhten oder erniedrigten Expression von CD4+ T- Zellen. Auch bei den TGF-β1+ T-Zellen fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen den LS Subgruppen der kurzen und langen Krankheitsdauer und den gesunden Kontrollproben (ANOVA, P = 0,526). Dies korreliert mit den Ergebnissen einer früheren Studie von Gambichler et al., die keinen Unterschied in der TGF-β1 mRNA Expression bei LS im Vergleich zu den gesunden Proben aufweisen konnte (Gambichler et al., 2012) und den Ergebnissen von Terlou et al., die nur eine sehr leichte Hochregulierung der TGF-β2 Zellen, jedoch nicht der TGFβ1 Zellen, bei LS beobachteten (Terlou et al., 2012). Der Mechanismus der Zellsuppression der TRegs wird durch direkten Zellkontakt als auch durch CTLA4, IL10 und TGF-β1 vermittelt. Daher korreliert die Anzahl der TRegs normalerweise positiv mit der IL-10 und TGF-β1 Expression (Valencia und Lipsky, 2007). Demgegenüber fand ich bei den IL-10 gefärbten Schnitten eine statistisch signifikante Verringerung der Proteinexpression gemessen an den gesunden Kontrollen (ANOVA, P = 0,007). Besonders in der LS Subgruppe der kurzen Krankheitsdauer war die Expression von IL-10 stark unterdrückt. Terlou et al. erklärten diese anscheinend sich wiedersprechende Ergebnisse mit früheren Beobachtungen an einem Versuch an Mäusen zur Erkrankung des Lupus erythematodes, dass eine erhöhte micro-RNA-155 Expression die Veränderung des Phänotyps der TRegs zur Folge hat (Terlou et al., 2012; Divekar et al., 2011). Schon eine Studie von Stahl et al. zeigte, dass eine Erhöhung der miR-155 Expression in CD4+ T-Zellen zu einer Verringerung der durch TRegs vermittelten Unterdrückung des Immunsystems führt (Stahl et al., 2009). So kommt es trotz der Erhöhung ihrer Anzahl zu einer verminderten IL-10 Expression, was auf eine Reduzierung der suppressiven Funktion der TRegs hinweisen könnte (Valencia und Lipsky, 2007). Die Erhöhung der Immunoreaktivität der FOXP3+ TRegs entspricht meinen Beobachtungen an den FOXP3 gefärbten Schnitten, die die stärkste statistische Signifikanz in der Proteinexpression der Dermis zeigten (ANOVA, P = 0,001). Hierbei handelt es sich um eine Erhöhung der Expression von FOXP3+ TRegs gegenüber den gesunden Kontrollproben, wobei ebenfalls die LS Subgruppe mit kurzer Krankheitsdauer die stärkste Abweichung von den Gesunden aufwies. Dies korreliert mit den Ergebnissen von Terlou et al., die auch eine signifikante Erhöhung der FOXP3+ TRegs im Vergleich zu den Kontrollen verzeichneten (Terlou et al., 2012). Zugleich kann die suppressive Funktion der TRegs von inflammatorischen - 48 - Mediatoren wie TNF, IFN-γ und IL-6 gehemmt werden. Deren Erhöhung beim LS wurde in einigen Studien beobachtet (Romero und Pincus, 1992; Farrell et al., 2006; Valencia et al., 2006). Außerdem wurden ebenfalls bei anderen Autoimmunerkrankungen wie dem Lupus erythematodes, der rheumatoiden Arthritis, dem Sjögren Syndrom, der Wegener Granulomatose und der Sarkoidose erhöhte Werte der TRegs gefunden (Valencia und Lipsky, 2007; Valencia et al., 2007). Wie schon von Valencia und Lipsky proklamiert, ist tatsächlich das am häufigsten vorgefundene Bild bei Autoimmunerkrankungen entweder die Verringerung der TRegs mit normaler Funktion oder die normale bis erhöhte Anzahl der TRegs mit reduzierter suppressiver Funktion (Valencia und Lipsky, 2007). Alles in allem schlussfolgern wir aus diesen Beobachtungen, dass es trotz der statistisch signifikant erhöhten Immunoreaktivität der FOXP3+ TRegs zu einer Suppression ihrer Funktion und so zu der Verringerung der Expression von IL-10 kommt. Aus diesem Grund können die FOXP3+ TRegs auch keinen stimulierenden Effekt an den CD4+ Effektor T-Zellen ausüben und die Proliferation und Zytokinsekretion der CD4+ Effektor TZellen bleibt aus. So kann es zu einer geschwächten Immuntoleranz gegenüber Autoantigenen und einer darauffolgenden Autoimmunität kommen. Jedoch sollten sich weitere Studien auf die Funktion der TRegs beziehen, da unsere Studie nur eine kleine Anzahl von Proben beinhaltete. Die Gruppengröße konnte nicht einheitlich gestaltet werden und zusätzlich verfügten wir über keine auf Geschlecht und Alter homogen verteilten Gruppen. Zudem wurden keine Doppeloder Dreifach-Färbungen vorgenommen und keine funktionellen oder mechanistischen Studien eingesetzt. Zukünftige Studien sollten über eine angemessene Stichprobengröße verfügen und neuere Methoden zur Detektion der TRegs verwenden, wie z. B. die von Lucas et al. proklamierte Demethylierung des FOXP3 Gens (Lucas et al., 2012). Dennoch stützen unsere Daten die Hypothese einer Autoimmunerkrankung, die durch eine läsionale Erhöhung der TRegs und die Verminderung von IL-10 gekennzeichnet ist. Außerdem deuten die Unterschiede in der Expression der CD4+ und FOXP3+ Lymphozyten bei WLS und MLS auf eine unterschiedliche Pathogenese des LS bei Frauen und Männern hin. - 49 - 6 Zusammenfassung Der LS ist eine chronische Hauterkrankung, die seit 1887 bekannt ist. Dennoch ist die genaue Ätiologie und Pathogenese der Erkrankung weitgehend unbekannt. In letzter Zeit wird ein autoimmunologischer Hintergrund stark diskutiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die Expression der TRegs zu untersuchen, um einen möglichen autoimmunologischen Zusammenhang aufzuzeigen. Um die Zusammensetzung des zellulären Infiltrates zu bestimmen, habe ich die Anzahl der CD4+, FOXP3+, IL-10+ und TGF-β1+ T-Zellen in der Epidermis und der Dermis gezählt. In der Epidermis fand ich keine veränderte Immunoreaktivität im Vergleich mit den gesunden Kontrollproben. In der Dermis beobachtete ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Terlou et al. und Gambichler et al. keinen signifikanten Unterschied der Expression von CD4+ (ANOVA, P = 0,956) und TGF-β1+ T-Zellen (ANOVA, P = 0,526) bei LS und Gesunden (Terlou et al., 2012; Gambichler et al., 2012). Bei den IL-10 gefärbten Schnitten fand sich eine statistisch signifikante Verringerung der Proteinexpression (ANOVA, P = 0,007) und bei den FOXP3 gefärbten Schnitten eine signifikante Erhöhung im Vergleich mit den gesunden Proben (ANOVA, P = 0,001). Dies korreliert mit den Ergebnissen von Terlou et al., die ebenfalls eine Erhöhung der FOXP3+ TRegs verzeichneten (Terlou et al., 2012). Dabei zeigten unsere Daten eine stärkere Erhöhung der FOXP3+ TRegs bei Frauen als bei Männern (ANOVA, P < 0,001). Normalerweise korreliert jedoch die Anzahl der TRegs positiv mit der IL-10 und TGF-β1 Expression, da die Suppression der TRegs durch IL-10 und TGF-β1 vermittelt wird (Valencia und Lipsky, 2007). Die von uns beobachtete Erhöhung der TRegs mit einer verminderten IL-10 Expression weist auf eine Verringerung der suppressiven Funktion der TRegs hin. Daher können die FOXP3+ TRegs auch keinen stimulierenden Effekt an den CD4+ Effektor T-Zellen ausüben und die Proliferation und Zytokinsekretion der CD4+ Effektor T-Zellen bleibt aus. So kann es zu einer geschwächten Immuntoleranz gegenüber Autoantigenen und einer darauffolgenden Autoimmunität kommen. Haupteinschränkung unserer Studie ist allerdings die kleine Fallzahl mit nicht homogen verteilten Gruppen, sowie das Fehlen von Untersuchungen zur TReg Aktivität. Dennoch stützen unsere Daten die Hypothese einer Autoimmunerkrankung und einer unterschiedlichen Pathogenese des LS bei Frauen und Männern. - 50 - 7 Literaturverzeichnis Ackerman, A. (1978). Histologic diagnosis of inflammatory skin diseases. Philadelphia: Lea & Febiger 198-202, 760-5 Ackerman, A., Niven, J., Grant-Kels, J.M. (1982). Differential diagnosis in dermatopathology. Philadelphia: Lea & Febiger 62, 5 Ackerman, A. (1984). The lives of lesions. 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Borrelia in granuloma annulare, morphea and lichen sclerosus: a PCR-based study and review of the literature. J Cutan Pathol. 37(5), 571-7 - 75 - Danksagung Mein größter Dank gilt Herrn PD Dr. med. T. Gambichler, Oberarzt in der dermatologischen Klinik des St. Josef-Hospitals Bochum für die Überlassung des Themas der Promotion und die wundervolle Betreuung während der gesamten Zeit meiner Dissertation. Ohne seine persönliche Unterstützung hätte ich es nie geschafft, diese Dissertation zu vollenden! Weiterhin danke ich Frau Sabine Richter, MTA des immunhistologischen Labors des St. Josef-Hospitals für die unschätzbare Hilfe beim Herraussuchen, Schneiden und Färben der Biopsien. Besonders möchte ich mich für Ihre unendliche Geduld trotz meiner vielen Anrufe und Nachfragen bedanken. Von Herzen Dank an meinen Bruder Christopher Belz für seine erste Korrektur, als auch an meinen Vater Wolfgang Belz und meine Mutter Kerstin Belz für Ihre wertvolle Hilfe während des Schreibens und für Ihre abschließende Korrektur. Ihr habt mich nicht nur während der Zeit der Dissertation, sondern mein ganzes Leben lang unterstützt und es mir so ermöglicht, meine Träume zu realisieren. Lebenslauf DOREEN BELZ PERSÖNLICHE DATEN Name: Doreen Belz Geburtsdatum: 01. Februar 1986 Geburtsort: Potsdam Familienstand: ledig SCHULBILDUNG 2012, Okt Zweites Medizinisches Staatsexamen 2008, Aug Erstes Medizinisches Staatsexamen 2006, Okt Beginn des Medizinstudiums an der Ruhr-Universität Bochum 2005 Abitur 2002 6-monatiger Auslandsaufenthalt mit Schulbesuch in Lille, Frankreich 1996-2005 Gymnasium, Ursulinenschule Köln PRAKTISCHE ERFAHRUNGEN 2012, Apr-Jul 3.PJ Tertial in der Inneren Medizin im Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris 2011-12, Dez-Apr 2.PJ Tertial in der Pädiatrie im Hospital San Pablo, Coquimbo, Chile 2011, Aug-Dez 1.PJ Tertial in der Chirugie im Hospital San Pablo, Coquimbo, Chile 2011, Mär Famulatur in der Allgemeinmedizin, Praxis Dr.BruckhausWalter, Herne 2011, Feb-Mär Famulatur in der Dermatologie, St.Joseph Hospital, Bochum 2011 Beginn meiner Doktorarbeit unter der Leitung von PD Dr. med. Gambichler in der Dermatologie, Bochum 2010-2012 Studentische Aushilfe als Pflege-Bereitschaftsdienst in der Augusta Krankenanstalt, Bochum 2010, Feb-Mär Famulatur in der Pädiatrie, Anästhesie und auf der neonatologischen Intensivstation im Children’s Hospital at Westmead, Sydney, Australien 2009, Sep Famulatur in der Radiologischen Praxis am Mediapark, Köln 2009, Feb-Mär Famulatur in der Pädiatrie und Kinderchirurgie des Kinderkrankenhauses Köln 2006-2010 Studentische Aushilfe bei Esprit, Köln Schildergasse 2006, Jun-Sep Krankenpflegepraktikum im Kinderkrankenhaus Köln 2005-06, Okt-Feb Freiwillige soziale Arbeit mit Straßenkindern in Manila, Philippinen 2005, Jun-Okt Jugendbetreuer im Camp Amerika, Massachusetts, USA
