PDZ-Scaffolding proteins - Ruhr
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Chapter 7 - Conclusion - Zusammenfassung olfactory receptors of every subfamily. Moreover, co-immunoprecipitations of MUPP1 and important olfactory signaling proteins validated the existence of an olfactory PDZome. Interestingly, we observed odor-dependent translocations of MUPP1 in olfactory sensory neurons. To functionally characterize the PDZ-dependency of olfactory signaling in olfactory neurons, we established a refined patch clamp technique in acute slices of transgenic mOR-EG mice and designed an inhibitory peptide, specific for PDZ proteins. Remarkably, odor-evoked current amplitudes were strongly reduced and adaptation was impaired after uncoupling the PDZ-OR interaction. In conclusion, we confirmed the presence of a MUPP1-mediated olfactory signalosome in olfactory sensory neurons and showed that accurate olfactory signaling is a PDZ-dependent mechanism. The Usher syndrome is the most common form of deaf-blindness, which is induced by a mutation in any of the nine described Usher proteins. These very diverse proteins form a complex network in different ciliary and cilia-like structures, such as photoreceptor cells of the retina and hair cells of the inner ear. In this study, we proved the expression and translation of different Usher-related genes in the murine olfactory epithelium and demonstrated the localization of three Usher proteins in the apical part of olfactory sensory neurons. Remarkably, we describe, for the first time, an impairment in olfactory sensitivity and kinetics in Usher syndrome mouse models, indicating important functions of the Usher interactome in olfactory signaling. 7.2 Zusammenfassung Die olfaktorische Signaltransduktionskaskade, welche eine enorme Diversität an olfaktorischen Rezeptoren aufweist, ist ein hoch komplexes Proteinnetzwerk, welches es Lebewesen ermöglicht tausende verschiedene Duftstoffe wahrzunehmen und zu unterscheiden. Obwohl die meisten Kernkomponenten dieses Signalweges bereits bekannt sind, ist bis heute unklar, wie diese Signalproteine in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. Die vorliegende Arbeit hatte die Aufklärung dieser Problematik zum Ziel und wurde in drei verschiedene Projekte gegliedert: Die Identifizierung und erste Charakterisierung eines möglichen Gerüstproteins im olfaktorischen System; die funktionale Analyse des Gerüstproteins MUPP1 in 144 Chapter 7 - Conclusion - Zusammenfassung olfaktorischen Neuronen; die Bedeutung des Usher Proteinnetzwerks für den Geruchssinn. Die olfaktorische Signaltransduktionskaskade besteht aus verschiedenen Proteinen und ist über diverse Mechanismen feinreguliert. Diese verschiedenen Signalabschnitte müssen in einem dicht gepackten Neuron in raum-zeitlicher Ausrichtung organisiert werden. In der vorliegenden Studie konnten wir MUPP1 als erstes potenzielles Gerüstprotein des olfaktorischen Signalwegs identifizieren. Wir konnten die Expression von MUPP1 im murinen olfaktorischen Epithel nachweisen und zeigen, dass MUPP1 in den Zilien und dendritischen Köpfchen der olfaktorischen Neurone lokalisiert ist. Interessanterweise banden PDZ Domänen 1+2 von MUPP1 spezifisch an den CTerminus des humanen olfaktorischen Rezeptors OR2AG1. Obwohl die Interaktion von den letzten acht Aminosäuren abhing, waren klassische PDZ Bindemotive nicht für alle Interaktionen notwendig. Durch Calcium Imaging Experimente im heterologen System, bei denen siRNA, ein dominant-negatives Peptid, sowie ein mutierter olfaktorischer Rezeptor verwendet wurden, konnten wir eine Funktion von MUPP1 für die Termination der Duftantwort aufzeigen. Zusammengefasst konnten wir MUPP1 als hoch exprimiertes Gerüstprotein im olfaktorischen Epithel identifizieren, sowie erste Hinweise für potenzielle Funktionen im olfaktorischen Signalweg erlangen. Nachdem wir ein vielversprechendes Gerüstprotein (MUPP1) identifiziert hatten, konnten wir über einen großangelegten Peptid-Microarray, unter Verwendung der 13 einzelnen PDZ Domänen von MUPP1 sowie olfaktorischer Rezeptoren aus jeder murinen Rezeptorunterfamilie, vielfältige dynamische MUPP1-OR Interaktionen aufzeigen. Darüber hinaus konnten wir über Co-Immunopräzipitationen von MUPP1 und den wichtigsten Bestandteilen des olfaktorischen Signalwegs die Existenz eines olfaktorischen PDZomes beweisen. Interessanterweise konnten wir eine duftabhängige Translokation von MUPP1 nachweisen. Um die PDZ-Abhängigkeit des olfaktorischen Signalwegs in olfaktorischen Neuronen funktional zu analysieren, haben wir das Patch Clamp Verfahren in akuten Schnitten transgener mOR-EG Mäuse etabliert. Zusätzlich konnten wir ein inhibitorisches Peptid entwickeln, welches spezifisch für PDZ Proteine ist. Bemerkenswerterweise wurden durch das Entkoppeln der PDZ-OR Interaktionen 145 Chapter 7 - Conclusion - Zusammenfassung duftinduzierte Ströme in den Neuronen stark reduziert und zusätzlich die Adaptation signifikant verändert. Die Resultate der vorliegenden Arbeit konnten die Existenz eines MUPP1-vermittelten olfaktorischen Signalosomes in olfaktorischen Neuronen beweisen und zeigen, dass der exakte olfaktorische Signalweg ein komplexer PDZabhängiger Mechanismus ist. Das Usher Syndrom ist die häufigste Form einer kombinierten Hör-Sehbehinderung, welche durch die Mutation eines beliebigen der neun beschriebenen Usher Proteine ausgelöst wird. Diese sehr unterschiedlichen Proteine bilden in verschiedenen ziliären und Zilien-ähnlichen Strukturen, wie den Photorezeptorzellen der Retina oder den Haarzellen des Innenohrs, ein komplexes Netzwerk. In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression und Translation verschiedener Usher-assoziierter Gene im olfaktorischen Epithel der Maus nachgewiesen werden. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass drei der untersuchten Usher Proteine im apikalen Bereich olfaktorischer Neurone lokalisiert sind. In dieser Studie konnte außerdem erstmalig eine signifikante Reduktion der olfaktorischen Sensitivität, sowie Änderungen in der Kinetik in UsherMausmodellen gezeigt werden, was auf eine wichtige Beteiligung des Usher Netzwerks für den olfaktorischen Signalweg hinweist. 146
