Intrinsische Innervation im Pansen von Wiederkäuern
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Aus dem Veterinär-Physiologischen Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Intrinsische Innervation im Pansen von Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Juliane Münnich aus Frankfurt (Oder) Leipzig, 2009 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Arwid Daugschies Betreuer: PD Dr. Helga Pfannkuche Veterinär-Physiologisches Institut Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Gutachter: PD Dr. Helga Pfannkuche Veterinär-Physiologisches Institut Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Prof. Dr. Johannes Seeger Veterinär-Anatomisches Institut Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Prof. Dr. Korinna Huber Physiologisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der Verteidigung: 2.12.2008 Für meine Familie Inhaltsverzeichnis 1 2 Einleitung ........................................................................................................................... 1 Literaturübersicht ............................................................................................................... 2 2.1 Funktionelle Anatomie des Vormagensystems .......................................................... 2 2.1.1 Einteilung der Wiederkäuer in Ernährungstypen .............................................. 2 2.1.1.1 HOFMANNs-Einteilung der Wiederkäuer in Ernährungstypen .................... 3 2.1.1.1.1 Konzentratselektierer ............................................................................... 3 2.1.1.1.2 Rauhfutterfresser ...................................................................................... 5 2.1.1.1.3 Intermediärtyp .......................................................................................... 7 2.1.1.2 Kritikpunkte an HOFMANNs Theorie............................................................ 7 2.1.1.2.1 Ernährungstyp, Körpergröße und Passagerate ......................................... 8 2.1.1.3 Der Einfluss der physikomechanischen Eigenschaften der Nahrung auf die Wiederkäuerevolution .................................................................................................. 10 2.2 Ablauf und Kontrolle der Vormagenmotorik........................................................... 13 2.2.1 Extrinsische Steuerung der Vormagenmotorik ................................................ 13 2.2.1.1 Steuerung durch den Nervus vagus.............................................................. 13 2.2.1.2 Steuerung durch den Nervus splanchnicus .................................................. 15 2.2.2 Intrinsische Steuerung des Gastrointestinaltraktes.......................................... 15 2.2.2.1 Aufbau und Funktion des Enterischen Nervensystems (ENS)...................... 15 2.2.2.2 Einteilung enterischer Neuronen ................................................................. 17 2.2.2.2.1 Morphologische Klassifizierung ............................................................ 17 2.2.2.2.2 Elektrophysiologische Klassifizierung................................................... 18 2.2.2.2.3 Neurochemische Klassifizierung............................................................ 19 2.2.2.2.4 Verknüpfung morphologischer, elektrophysiologischer und immunhistochemischer Kriterien ............................................................................. 20 2.2.3 Intrinsische Innervation des Wiederkäuervormagens...................................... 23 2.2.3.1 Funktionelle Bedeutung des ENS für die Vormagenfunktion....................... 23 2.2.3.2 Nachweis verschiedener Transmitter im Vormagen .................................... 24 2.2.3.3 Neurochemische Kodierungen und Populationen myenterischer Neurone im Vormagen des Schafes.................................................................................................. 24 2.2.3.4 Regionen- und altersspezifische Innervation des Vormagens von Wiederkäuern ............................................................................................................... 25 2.3 Fragestellung ............................................................................................................ 26 3 Tiere, Material und Methoden.......................................................................................... 27 3.1 Versuchstiere und Organentnahme .......................................................................... 27 3.2 Neurochemische Untersuchungen............................................................................ 28 3.2.1 Gewebekultur ................................................................................................... 28 3.2.2 Immunhistochemische und enzymhistochemische Färbung der Präparate ..... 29 3.2.3 Enzymhistochemie ............................................................................................ 32 3.2.4 Spezifität der Antikörper .................................................................................. 32 3.2.5 Auswertung der Präparate ............................................................................... 33 3.2.6 Statistik der neurochemischen Untersuchungen .............................................. 34 3.2.7 Berechnung der Neuronenpopulationen .......................................................... 35 3.3 Motilitätsuntersuchungen ......................................................................................... 36 3.3.1 Gewebeaufbereitung......................................................................................... 36 3.3.2 Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen ................................ 36 3.3.2.1 Versuchsvorrichtung .................................................................................... 36 3.3.2.2 Elektrische Feldstimulation.......................................................................... 37 3.3.2.3 Dosis-Wirkungsuntersuchungen mit Carbachol .......................................... 39 I 4 5 6 7 8 9 Ergebnisse ........................................................................................................................ 40 4.1 Immun- und Enzymhistochemische Untersuchungen.............................................. 40 4.1.1 Allgemeine Innervationsmerkmale................................................................... 40 4.1.1.1 Gangliendichte ............................................................................................. 40 4.1.1.2 Gangliengröße.............................................................................................. 41 4.1.1.3 Neuronendichte ............................................................................................ 44 4.1.2 Neurochemische Kodierung myenterischer Neurone im Pansen..................... 45 4.1.2.1 Nitrerge und cholinerge Neurone ................................................................ 45 4.1.2.2 Expression von Neuropeptiden..................................................................... 48 4.1.2.2.1 Neuropeptide und NOS .......................................................................... 50 4.1.2.2.2 Neuropeptide und ChAT ........................................................................ 52 4.1.2.2.3 Neuronenpopulationen ........................................................................... 53 4.1.2.3 Weiterführende Anfärbungen ....................................................................... 54 4.1.2.3.1 Somatostatin ........................................................................................... 54 4.1.2.3.2 Calbindin ................................................................................................ 55 4.2 Motilitätsuntersuchungen ......................................................................................... 57 4.2.1 Motilitätsmuster unter basalen Bedingungen .................................................. 57 4.2.2 Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin.................................... 58 4.2.3 Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von L-NAME.................................. 60 4.3 Dosis-Wirkungsuntersuchungen von Carbachol...................................................... 62 Diskussion ........................................................................................................................ 65 5.1 Allgemeine Methodenkritik ..................................................................................... 66 5.2 Allgemeine Innervationsmuster im Vormagen verschiedener Wiederkäuerspezies 68 5.2.1 Neuronendichte und Größe und Dichte myenterischer Ganglien.................... 68 5.3 Neurochemische Kodierung myenterischer Pansenneurone .................................... 71 5.3.1 Cholinerge und nitrerge Neurone .................................................................... 71 5.3.2 Nachweis verschiedener Neuropeptide und neuronaler Marker ..................... 73 5.3.3 Mögliche funktionelle Rückschlüsse aus den Anfärbungen ............................. 74 5.3.3.1 Nitrerge Subpopulationen ............................................................................ 75 5.3.3.2 Cholinerge Subpopulationen........................................................................ 77 5.3.3.2.1 Calbindin ................................................................................................ 79 5.3.3.2.2 Somatostatin ........................................................................................... 80 5.3.4 Grenzen von Studien zur neurochemischen Kodierung ................................... 82 5.4 Motilitätsuntersuchungen ......................................................................................... 84 5.4.1 Allgemeine Methodenkritik .............................................................................. 84 5.4.2 Basale Motilität und Reaktion der Gewebe auf Elektrische Feldstimulation .. 85 5.4.3 Atropin und L-NAME ....................................................................................... 87 5.4.4 Carbachol......................................................................................................... 89 5.5 Abschließende Bemerkungen................................................................................... 91 Zusammenfassung............................................................................................................ 93 Summary .......................................................................................................................... 95 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 97 Danksagung.................................................................................................................... 112 II Abkürzungen Ach Azetylcholin AMCA 7-Amino-4-Methylcumarin-3-Azetat ANOVA analysis of variance (univariate Varianzanalyse) AP endogene Alkalische Phosphatase ATP Adenosintriphosphat AUC area under the curve (Fläche unter der Kurve) Azetyl-CoA Azetyl-Coenzym A BN Bombesin Calb Calbindin cAMP zyklisches Andenosinmonophosphat CCK Cholecystokinin cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat CGRP Calcitonin-Gene-Related Peptide ChAT Cholinazetyltransferase cm/cm² Zentimeter/Quadratzentimeter CM Zirkulärmuskulatur Cy2 Carbocyanin Cy3 Carbomethylindocyanin DYN Dynorphin EFS Elektrische Feldstimulation ENK Enkephalin ENS Enterisches Nervensystem g Gramm GABA Gamma-Amino-Buttersäure GAL Galanin GRP Gastrin-Releasing-Peptide HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure 5-HT 5-Hydroxytryptamin Hz Hertz IgG Immunglobulin G IU Internationale Einheit kg Kilogramm KM Körpermasse l Liter Leu-Enk Leucine-Enkephaline LM Longitudinalmuskulatur III L-NAME NG-Nitro-L-Arginine Methylester Hydrochlorid mA Milliampere Met-Enk Methionine – Enkephaline mg Milligramm ml Milliliter mm Millimeter M/mM Mol/Millimol mN Millinewton MP Plexus myentericus mRNA messenger-Ribonukleinsäure MRT ms whole gut particle mean retention time (mittlere Retentionszeit von Partikeln im Gastrointestinaltrakt) Millisekunden MW Mittelwert µg Mikrogramm µm Mikrometer µmol Mikromol n Anzahl der verwendeten Präparate N Anzahl der Tiere, von denen die verwendeten Präparate stammten N./Nn. Nervus/Nervi NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NADPH-D Nicotinamidadenindinukleotidphosphat - Diaphorase NANC nicht-adrenerg, nicht-cholinerg NFP Neurofilament Protein NK Neurokinin nm Nanometer NMU Neuromedin U NO Stickstoffmonoxid NOS Stickstoffmonoxidsynthase NPY Neuropeptid Y NSE Neuronenspezifische Enolase NT Neurotensin p Signifikanzniveau PACAP PBS pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (hypophysäres Adenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid) phosphat-buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) r² Regressionskoeffizient RNA Ribonukleinsäure IV s Sekunde SD Standardabweichung SGLT-1 Transporter Natrium-abhängiger Glucose-Cotransporter SM Plexus submucosus SNAP S-Nitroso-Azethyl-DL-Penicillamin SOM Somatostatin SP Substanz P Strept-AMCA Streptavidin-7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat t Zeit TK Tachykinine TMMP-Präparate Präparate aus der Tunica muscularis mit myenterischem Plexus TTX Tetrodotoxin VIP Vasoaktives Intestinales Peptid ZNS Zentrales Nervensystem V 1 Einleitung Das Enterische Nervensystem (ENS) ist ein in die Wand des Gastrointestinaltraktes integriertes neuronales Netzwerk. Es stellt eine wichtige Kontrollstation für die Beeinflussung gastrointestinaler Funktionen dar. Zu den vom ENS kontrollierten gastrointestinalen Zielstrukturen gehören das Epithel, Blutgefäße, Teile des lokalen Immunsystems sowie die glatte Muskulatur. Die Kontrolle dieser Gewebe erfolgt über die Ausschüttung von erregenden und hemmenden Neurotransmittern, welche in bestimmten Kombinationen von den enterischen Nervenzellen synthetisiert werden. Die Neurotransmitterkombination, die eine Nervenzelle synthetisiert, bezeichnet man als deren neurochemischen Kode. Dieser korreliert eng mit der Funktion der Nervenzelle und weist sowohl regionen- und speziesspezifische, als auch konservierte (von Spezies und Region unabhängige) Eigenschaften auf. Dies trifft auch auf die Vormägen der Wiederkäuer zu. So konnte bereits beim Schaf eine regionenspezifische Kodierung in verschiedenen Vormagenregionen nachgewiesen werden (RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2003a und b, 2004b). Beispielsweise wird die Schlundrinne vor allem von intrinsischen Nervenzellen versorgt, die hemmende Transmitter wie z.B. Stickstoffmonoxid (NO) synthetisieren, während im Pansen die cholinergen Nervenzellen dominieren (RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2003a). Unter den Wiederkäuerspezies lassen sich verschiedene diätetische Präferenzen feststellen. Dies hat zu einer Einteilung in die drei Ernährungstypen Konzentratselektierer (z.B. Reh, Elch), Rauhfutterfresser (z.B. Rind, Schaf) und einen Intermediärtyp (z.B. Damwild, Ziege) geführt. Die unterschiedliche Nahrungszusammensetzung spiegelt sich auch in verschiedenen Charakteristika der Vormagenverdauung wider - zum Beispiel der Passagezeit und der Relation der einzelnen Vormagenkompartimente zueinander. Bisher gibt es jedoch keine Studien über mögliche Unterschiede der intrinsischen Steuerung der Vormagenfunktionen durch das Enterische Nervensystem zwischen den verschiedenen Wiederkäuerspezies und Ernährungstypen. In der vorliegenden Arbeit sollten daher die Expression erregender und hemmender Neurotransmitter in enterischen Nervenzellen des Pansens von Wiederkäuerspezies verschiedener Ernährungstypen bestimmt, und mögliche Unterschiede zwischen den Spezies und Ernährungstypen aufgezeigt werden. Dafür wurden Proben aus dem ventralen Pansensack von Ziege (Capra hircus), Damwild (Dama dama), Schaf (Ovis aries) und Rind (Bos taurus) untersucht. 1 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionelle Anatomie des Vormagensystems Das Vormagensystem der Wiederkäuer besteht aus den drei Vormagenkompartimenten Pansen (Rumen), Haube (Reticulum) und Psalter (Omasum). Funktionell bilden Pansen und Haube eine Einheit, weshalb sie auch als Retikulorumen bezeichnet werden. Die ständige, intensive Durchmischung der Ingesta im Retikulorumen ist eine wichtige Voraussetzung für effektive mikrobielle Fermentationsvorgänge (KASKE 2000). Dies wird durch die Pansenpfeiler – starke Muskelwülste, die weit in das Lumen des Pansens reichen – ermöglicht. Zugleich erfolgt durch die Pansenpfeiler eine weitere Kompartimentierung des Pansens in Pansenvorhof, dorsalen und ventralen Pansensack und ventralen und dorsalen Blindsack (NICKEL et al. 1995). Der Pansen ist von einem mehrschichtigen, verhornten Epithel ausgekleidet, dessen Oberfläche durch die Ausbildung von Zotten deutlich vergrößert wird und durch welches große Mengen verschiedenster Substrate resorbiert werden. Die Haube ist durch die Hauben-Pansenfalte vom Pansenvorhof (Schleudermagen) getrennt. Die Schleimhaut der Haube bildet papillenbesetzte Leisten, die vier- bis sechseckige Zellen bilden, an deren Boden wiederum kleine Schleimhautfältchen und Papillen zu finden sind. Diese Strukturen sind für Entmischungsvorgänge der Ingesta bedeutsam (LIEBICH 1993). Den anatomischen Engpass für die Passage der Ingesta aus dem Retikulorumen bildet die Hauben-Psalter-Öffnung. Diese wird von den beiden muskulösen Lippen der Schlundrinne umfasst, welche von der dorsal gelegenen Kardia spiralig nach kaudoventral ziehen. Durch reflektorischen Schluss der Schlundrinne gelangt bei Kälbern die aufgenommene Milch unter Umgehung des Retikulorumens direkt in den Labmagen. Der Psalter ist durch zahlreiche, unterschiedlich große Schleimhautfalten (Psalterblätter) gekennzeichnet. Dadurch erfolgt eine enorme Oberflächenvergrößerung – ein Hinweis auf hier ablaufende Resorptionsprozesse (NICKEL et al. 1995). 2.1.1 Einteilung der Wiederkäuer in Ernährungstypen Bei der artenreichen Gruppe der Wiederkäuer handelt es sich um evolutionäre „late comers“ (HOFMANN 1989) – ihre Entwicklung begann erst vor etwa 25 Millionen Jahren. Dabei passten sich die in der Evolution früh entstandenen Wiederkäuer an die Aufnahme und Verwertung von Kräutern, Blüten, Früchten sowie Blattwerk von Büschen und Bäumen als Äsungsquellen an. Der Siegeszug der Gräser über die Erde begann erst viel später im Miozän (vor 10-12 Millionen Jahren), was bedeutet, dass Gräser den ursprünglichen Wiederkäuern als Nahrungsquelle nicht zur Verfügung standen (HOFMANN 2007). Somit konnte eine anatomische und physiologische Adaptation an die effektive Zelluloseverwertung erst in Koevolution mit den Gräsern stattfinden. Trotzdem kann die Wiederkäuerevolution nicht als eine progressive, einer Leiter ähnelnden „Schrittfür-Schritt“ Entwicklung betrachtet werden. 2 Viel eher ist sie mit einem großen Busch (GOULD 1986) zu vergleichen, denn bis heute bestehen unterschiedliche Entwicklungsstufen des „Wiederkäuerbauplans“ nebeneinander – alle waren und sind in verschiedenen Ökosystemen nebeneinander erfolgreich. So existieren Wiederkäuerspezies mit einem Körpergewicht von 3 kg und solche, die über 1000 kg schwer sind, Spezies die in Wüsten ohne Oberflächenwasser überleben oder auf schneebedeckten Bergen. Bestimmte Wiederkäuerspezies leben singulär, zeigen sogar territoriales Verhalten, während andere in riesigen Herden über weite Strecken migrieren (HOFMANN 1989). Manche Spezies bevorzugen Blätter, Knospen und zum Teil sogar Früchte, während andere fast unselektiv große Mengen an Gräsern zu sich nehmen. Dies führte schon früh zu Bemühungen, Wiederkäuer entsprechend ihrer Ernährungsgewohnheiten zu klassifizieren (zum Beispiel TALBOT und TALBOT 1962, LAMPREY 1963, JARMAN 1974). Allerdings war es HOFMANN (1969, 1989), der dem Konzept verschiedener Wiederkäuerernährungstypen zu dem hohen Maß an Aufmerksamkeit verholfen hat, den es noch heute erfährt. Obwohl sein Konzept in der Folgezeit zum Teil heftig diskutiert und in Frage gestellt wurde, konnten neuere Untersuchungen (z.B. CLAUSS et al. 2003a) die grundsätzliche Richtigkeit seiner Hypothesen aufzeigen. Im Folgenden soll deshalb zunächst HOFMANNs Einteilung dargestellt werden und anschließend ein kurzer Abriss über die Hauptkritikpunkte und die Ergebnisse neuerer Forschungen gegeben werden. 2.1.1.1 HOFMANNs-Einteilung der Wiederkäuer in Ernährungstypen HOFMANN (1989) teilte die Wiederkäuer entsprechend ihrer bevorzugten Diät in drei, in einander übergehende Ernährungstypen ein: Konzentratselektierer, Rauhfutterfresser und einen Intermediärtyp (Abbildung 2.1). Seine Einteilung beruhte auf von ihm beobachteten morphologischen Unterschieden des Verdauungssystems, aus denen er Hypothesen über physiologische Differenzen ableitete. Nach HOFMANN ist die Diät der primäre adaptive Faktor in der Wiederkäuerevolution, während das Körpergewicht und die Körpergröße nur sekundäre Faktoren darstellen. 2.1.1.1.1 Konzentratselektierer Etwa 40 % der existierenden Wiederkäuerspezies können nach HOFMANN in die Gruppe der Konzentratselektierer eingeordnet werden. Dazu gehören unter anderem das europäische Reh, der Elch und die Giraffe. Unter ihnen findet sich keine domestizierte Spezies. Konzentratselektierer sind perfekt an die Verdauung leicht fermentierbarer Nahrung, die reich an Zellinhaltstoffen ist, adaptiert. Allerdings finden sich in den von ihnen bevorzugten Kräutern und Blättern, neben einem – gegenüber Gräsern - höheren Gehalt an Protein, auch chemische Repellentien wie Phenole und Tannine (HOFMANN 2007). 3 Abbildung 2.1 Die europäischen Wiederkäuerspezies und ihre Einordnung im System der verschiedenen Ernährungstypen, morphologische Unterschiede des Vormagensystems und Unterschiede des Ernährungsrhythmus (HOFMANN und SCHNORR 1982). Während Konzentratselektierer nahezu kontinuierlich kleine Futtermengen aufnehmen, finden sich bei den Rauhfutterfressern im Tagesverlauf wenige intensive Fressphasen, auf die ausgedehnten Ruhe- und Wiederkauphasen folgen. (von links: Reh, Elch, Ziege, Gemse, Rothirsch, Steinbock, Damwild, Wisent, Mufflon, Schaf, Rind, Auerochse) Konzentratselektierer verfügen über eine frakturierte Verdauung, wobei neben dem Retikulorumen auch der untere Digestionstrakt eine wichtige Rolle spielt (HOFMANN 1989, ROWELL-SCHÄFER et al. 2001). Im Gegensatz zu den Rauhfutterfressern wird die Nahrung nur relativ kurze Zeit im Retikulorumen der mikrobiellen Fermentation unterzogen und dann in den unteren Gastrointestinaltrakt überführt. HOFMANN (1989, 2007) vermutete, dass Konzentratselektierer ihre Schlundrinne sogar als regulären „ruminalen Bypass“ nutzen können, um besonders wertvolle Futterbrocken direkt einer monogastrischen Verdauung zuzuführen. HOFMANN (1989) beobachtete eine Reihe von morphologischen Besonderheiten, die eine selektive Aufnahme von – zum Teil mit antinutritiven Substanzen versehenen, aber hochverdaulichen – Pflanzen und ihre optimale Verdauung ermöglichen. So konnte er bei Konzentratselektierern den längsten frei beweglichen Zungenteil (33 % gegenüber 28 % bei Rauhfutterfresser), der eine selektive Futteraufnahme ermöglicht, feststellen. Desweiteren fand er die größte relative Speicheldrüsenmasse (Konzentratselektierer 0,36 %, Intermediärtyp 0,26 %, Rauhfutterfresser 0,18 % der Körpermasse) und 4 postulierte, dass der Speichelfluss bei Vertretern dieses Ernährungstyps während der Futteraufnahme höher sein muss als bei den Vertretern der anderen Ernährungstypen. Die größere Menge - eines überdies stark proteinreichen, serösen – Speichels hat neben der (bei Aufnahme großer Mengen leichtfermentierbarer Kohlenhydrate wichtigen) Pufferfunktion (DRESCHER-KADEN 1991), auch eine „Spülfunktion“ (die einen schnellen Weitertransport aus dem Retikulorumen ermöglicht) und eine „Entgiftungsfunktion“ für antinutritive Substanzen (HOFMANN 2007). Die Entgiftung der phenolischen Pflanzenschutzstoffe wird durch deren Bindung an unlösliche Proteinkomplexe ermöglicht („tanning effect“), was den hohen Proteingehalt des Speichels von Konzentratselektierern erklärt (HOFMANN 1989). Die aufgenommene Nahrung bildet im Pansen eine Art Brei - eine Schichtung des Panseninhaltes fehlt. Die Pansenzotten sind gleichmäßig an der gesamten Pansenwand ausgebildet (DRESCHER-KADEN 1991). Dadurch wird eine starke Oberflächenvergrößerung erreicht und eine große Resorptionsfläche geschaffen. Das Retikulorumen der Konzentratselektierer weist im Vergleich zu den anderen Ernährungstypen das geringste relative Gewicht, die geringste Subunterteilung, die schwächste Muskelausbildung und die größten Öffnungen zwischen den Vormagenabteilungen auf. Insgesamt sieht HOFMANN (1989) darin eine Anpassung an eine hohe Fermentationsrate und schnelle Passage der aufgenommenen Nahrung. Durch die schnelle Pansenpassage gelangt ein relativ hoher Anteil unverdauter Strukturkohlenhydrate (insbesondere Hemizellulose) in den Dickdarm. Das Zäkum und die Ansa proximales coli sind bei Konzentratselektierern deshalb stärker ausgebildet als bei Rauhfutterfressern. Dadurch ergibt sich eine längere Retentionszeit für die Zellulolyse und eine größere Oberfläche für die Aufnahme von Wasser und Elektrolyten im hinteren Digestionstrakt. 2.1.1.1.2 Rauhfutterfresser Obwohl nur 25 % der Wiederkäuerspezies zur Gruppe der Rauhfutterfresser oder „Graser“ zählen (HOFMANN 1989), wird unser Wissen über die Wiederkäuerphysiologie und –ernährung doch von den Vertretern dieses Typs dominiert. Schließlich sind in diese Gruppe die bedeutendsten Hauswiederkäuer Rind und Schaf einzuordnen. Die Rauhfutterfresser zeigen die stärkste morphologische Adaptation an die Verwertung von strukturkohlenhydratreicher, schwer verdaulicher Nahrung. Dabei handelt es sich insbesondere um Gräser. Da die Verwertbarkeit zellulosereicher Futterbestandteile entscheidend von der Verweilzeit der Ingesta im Retikulorumen abhängt, sind Rauhfutterfresser durch verschiedene anatomische und physiologische Besonderheiten auf eine lange Verweildauer und ein geringes Turnover der Nahrung im Pansen ausgelegt: - Das Vormagenvolumen limitiert die Substrataufnahme. Somit erfordert eine hohe Futteraufnahme eine möglichst große Fermentationskammer. Tatsächlich beträgt das Volumen des Retikulorumens 15-20 % (in Extremfällen 30 %) des Körpergewichts, also 6-12 l bei kleinen Wiederkäuern und oft > 100 l bei Kühen mit hoher Milchleistung (KASKE 2000) und ist somit höher als bei Vertretern der anderen beiden Ernährungstypen (HOFMANN 1989). 5 - Die Möglichkeit große Futtermengen aufzunehmen, spiegelt sich auch im Tagesrhythmus der Rauhfutterfresser wider. Dieser wird durch wenige, ausgedehnte Fressperioden bestimmt, auf die lange Ruhe- und Wiederkauphasen folgen (HOFMANN und SCHNORR 1982, Abbildung 2.1). Durch das ausführliche Wiederkauen werden die Pflanzenteile stark zerkleinert, so dass die ruminalen Mikroben Zugang zu den schwer löslichen Strukturkohlehydraten erhalten. Gleichzeitig werden über einen längeren Zeitraum große Mengen Speichel sezerniert, der durch den hohen Gehalt an Bicarbonat eine wichtige Pufferfunktion erfüllt. - Im Retikulorumen von frei grasenden Rauhfutterfressern findet sich eine deutliche Schichtung der Ingesta, die durch die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften der Futterpartikel (Größe, Form, Dichte) bestimmt wird. Auf einem See aus weitgehend verdauten, kleinen Partikeln hoher Dichte schwimmt eine Matte grobstrukturierten Futters geringer Dichte. Dieses wird regurgitiert, wiedergekaut und dadurch in seiner Größe reduziert. Dorsal befindet sich eine Blase aus Gasen, die während der Fermentation entstehen (vor allem Methan und Kohlendioxid) und regelmäßig über den Ruktus abgegeben werden (SUTHERLAND 1988, KASKE 2000). Die Schichtung der Ingesta im Pansen wird bei Rauhfutterfressern durch die Zottenausbildung reflektiert: lange, dichte Zotten (und damit eine große Resorptionsoberfläche) im ventralen Pansensack und kaum ausgebildete Zotten im dorsalen Pansensack (HOFMANN und SCHNORR 1982, HOFMANN 2007). - Im Pansen der Rauhfutterfresser werden Futterpartikel bis zu einer bestimmten Größe selektiv zurückgehalten (beim Schaf alle Partikel über 0,5 mm), wodurch eine erneute Futteraufnahme limitiert wird (HOFMANN 1989). Das selektive Zurückhalten von Futterpartikeln wird durch die bei Rauhfutterfressern flaschenhalsartige Öffnung zwischen Retikulorumen und Psalter (Ostium reticuloomasi) ermöglicht. Die dargestellten anatomischen und physiologischen Besonderheiten ermöglichen es den Pansenmikroben der Rauhfutterfresser, zellulosehaltige Pflanzenteile bereits im Retikulorumen bis zur Stufe der kurzkettigen Fettsäuren abzubauen. Diese werden großteils im Pansen absorbiert. Dadurch sinkt die Bedeutung von Blind- und Dickdarm für die mikrobielle Aufspaltung und Verwertung schwerverdaulicher Pflanzenteile. Dementsprechend sind diese Darmabschnitte bei Rauhfutterfressern im Vergleich zu Konzentratselektierern weniger ausgebildet (HOFMANN 1989), was sich unter anderem auf die Absorption von Wasser und Elektrolyten auswirkt. Nach HOFMANN (1989) kompensieren Rauhfutterfresser dies durch einen (im Vergleich zu Konzentratselektierern) deutlich größeren und stärker ausgebildeten Blättermagen, in dem bereits ein Großteil der Absorption von Wasser und Elektrolyten erfolgt. 6 2.1.1.1.3 Intermediärtyp Etwa 35 % aller Wiederkäuerspezies sind morphologisch und physiologisch dem Intermediärtyp zwischen Konzentratselektierer und Rauhfutterfresser zuzuordnen (HOFMANN 1989). In diese Gruppe gehören unter anderem die Ziege, das Rotwild und das Damwild, wobei das Damwild zwischen dem Intermediärtyp und den Rauhfutterfressern einzuordnen ist (HOFMANN und SCHNORR 1982). Vertreter des Intermediärtyps bevorzugen eine gemischte Diät, wobei sie Rohfaser so lange und so stark wie möglich meiden. Man findet bei ihnen beeindruckende Kurzzeit- und saisonale anatomische Adaptationen an Veränderungen der Futterqualität (HOFMANN 1989). Vertreter des Intermediärtyps können die Futteraufnahme um das zwei- bis dreifache steigern, wenn das Angebot an leicht verdaulichen Pflanzen den Höhepunkt erreicht. Demgegenüber erfolgt mit zunehmender Lignifizierung der Futterpflanzen entweder eine Umstellung aufs Grasen oder eine vermehrte Aufnahme herunterfallender Früchte und Samen („Herbstmast“) (HOFMANN 1989). So tendieren Hausziegen bei Freilandhaltung zu Zeiten des optimalen Nährstoffangebotes in Ernährungsweise und Magenstruktur zum Konzentratselektierer, bei sinkendem Nährstoffangebot (Vegetationsruhe beziehungsweise Trockenzeit) zum Rauhfutterfresser (HOFMANN und SCHNORR 1982). JACKSON (1977) führte Studien zur Ernährung des Damwildes in New Forest durch. Er stellte fest, dass in der Zeit von März bis September Gräser die Hauptnahrung darstellten, zusammen mit kleinen Mengen Kräutern und Laub. Von September bis in den späten Dezember bildeten Eicheln und Bucheckern nicht unerhebliche Nahrungskomponenten, während im Winter vor allem Brombeersträucher, Heidelbeeren, Gräser, Besenheide, Ilex, Efeu und Nadeln von Koniferen aufgenommen wurden. Jedoch machte der Anteil der Gräser auch in den Wintermonaten über 20 % des gesamten Nahrungsanteils aus und stieg von März bis September auf 57-67 %. 2.1.1.2 Kritikpunkte an HOFMANNs Theorie Ein Kritikpunkt an den Arbeiten von HOFMANN (z.B. 1989, 2007) ist die von ihm gewählte Nomenklatur. Dies bezieht sich insbesondere auf den Begriff „Konzentratselektierer“ (GORDON und ILLIUS 1994, ROBBINS et al. 1995). Blätter haben im Gegensatz zu Gräsern einen höheren Anteil an Zellinhaltsstoffen und enthalten weniger Zellulose. Gleichzeitig ist ihr Gehalt an nichtfermentierbaren Stoffen (wie z.B. Lignin) und an antinutritiven Substanzen höher (DEMMENT und VAN SOEST 1985). Das bedeutet, dass blätterfressende Wiederkäuer zwar mehr leicht fermentierbare und lösliche Pflanzenkomponenten aufnehmen, deren absolute Verdaulichkeit durch die erwähnten antinutritiven Substanzen jedoch gegenüber Gras geringer ist (ROBBINS et al. 1987, HANLEY et al. 1992). Deshalb bevorzugen die genannten Autoren statt des Begriffes „Konzentratselektierer“ die Bezeichnung „Blätterfresser“ oder „Browser“. In der vorliegenden Arbeit wird in Anlehnung an HOFMANN von Konzentratselektierern gesprochen, auch wenn der Autorin die etwas irreführende Bedeutung dieser Bezeichnung klar ist. Ein weiterer Kritikpunkt ist das Fehlen eines Kriterienkataloges oder eines Schemas, das die Klassifizierung der Wiederkäuer entsprechend morphometrischer Daten eindeutig nachvollziehbar 7 machen würde. Denn obwohl HOFMANNs Arbeiten reich an anatomischen Beschreibungen, sowie exzellenten Fotos und Zeichnungen sind, finden sich nur relativ wenige Mess- und Zahlenwerte. Diese werden zudem häufig nur als Spannweiten und nicht als Mittelwerte angegeben. Dadurch erscheint seine Einteilung zum Teil willkürlich. Neuere Arbeiten seiner Befürworter versuchen diesen Mangel an Mess- und Zahlenwerte auszugleichen (z.B. CLAUSS und LECHNER-DOLL 2001, CLAUSS et al. 2003a). Wesentlicher Inhalt des vielleicht wichtigsten Kritikpunktes ist jedoch HOFMANNs Behauptung, dass die Körpergröße einer Spezies keinen Einfluss auf die Diätwahl hat. Wie bereits erwähnt, basierte HOFMANNs Einteilung der Wiederkäuer in die drei Ernährungstypen auf morphologischen Beobachtungen des Gastrointestinaltraktes, der unterstützenden Strukturen und Organe. Als Rückschluss seiner anatomischen Beobachtungen postulierte HOFMANN verschiedene ernährungsphysiologische Strategien für die verschiedenen Ernährungstypen. Er betonte, dass der Ernährungstyp und die Körpergröße einer Spezies in keinem direkten Zusammenhang zueinander stehen und dass die Passagerate der Ingesta primär vom Ernährungstyp abhängt (HOFMANN 1989). Eine statistisch belegte Korrelation der morphometrischen Daten mit dem Ernährungstyp unter Einbeziehung der Körpermasse wurde durch ihn jedoch nicht vorgelegt. Ein anderer Erklärungsansatz für die „ruminant diversification“ fokussiert auf der Körpergröße, dem damit verbundenen Energiebedarf, sowie den dafür erforderlichen Verdauungskapazitäten. Hauptvertreter dieser Argumentationslinie sind ILLIUS und GORDON (ILLIUS und GORDON 1991, GORDON und ILLIUS 1994). Zwar stimmen diese Autoren mit HOFMANN grundsätzlich darin überein, dass bei Wiederkäuern anatomische Adaptationen an die bevorzugte Diät zu finden sind. Allerdings sehen sie als Hauptursache für die Diätwahl (und die daraus resultierenden physiologischanatomischen Anpassungen, sowie die Geschwindigkeit der Ingestapassage) die Körpergröße der Wiederkäuerspezies an. 2.1.1.2.1 Ernährungstyp, Körpergröße und Passagerate Der Hauptstreitpunkt zwischen den Befürwortern und Gegnern von HOFMANNs Theorie war und ist somit die Frage, ob ein Zusammenhang zwischen dem Ernährungstyp und der Geschwindigkeit der Ingestapassage besteht. Während HOFMANN und seine Anhänger diese Frage eindeutig bejahen, betrachten die Gegner die Passagerate als primär durch die Körpergröße und -masse der jeweiligen Spezies bestimmt. Ganz allgemein ist die Geschwindigkeit der Ingestapassage von der gastrointestinalen Kapazität, der Aufnahmemenge und der Verdaulichkeit der Diät abhängig. Eine lange Retentionszeit erhöht die Verdaulichkeit der langsam (schwer) verdaulichen Diätanteile (z.B. Zellwände); limitiert allerdings auch die Futteraufnahmemenge (LECHNER-DOLL et al. 1991). Generell wird davon ausgegangen, dass eine große Körpergröße mit einer langsamen Passage einhergeht (HUME und SAKAGUCHI 1991). Dies würde bedeuten, dass mit steigender Körpergröße des Wiederkäuers die Größe der Fermentationskammer und die Länge des Gastrointestinaltraktes zunehmen, und somit auch die 8 Verdaulichkeit der faserhaltigen Bestandteile. Folgerichtig müsste es sich bei den größten Wiederkäuern um Rauhfutterfresser handeln. Allerdings ist dies nicht der Fall – die Giraffe als größter momentan die Erde bevölkernder Wiederkäuer ist ein Blattfresser/Konzentratselektierer (HOFMANN 1989, CLAUSS et al. 2003b). Dennoch postulierten GORDON und ILLIUS (1994) eine allometrische Beziehung zwischen der Körpermasse (KM in kg) und der „whole gut particle mean retention time“ = MRT (der mittleren Retentionszeit von Partikeln im Gastrointestinaltrakt), allerdings ohne sich dabei auf eine definierte Partikelgröße zu beziehen: (MRT in Stunden) MRT = 15,3* KM0,251 (r²=0,76) Daraus schlussfolgerten GORDON und ILLIUS (1994), dass der Ernährungstyp nicht die Passagerate beeinflusst, (wie dies HOFMANN (1989) postuliert hatte), sondern dass die Passagerate von der Körpergröße abhängig ist. CLAUSS und LECHNER-DOLL (2001) kritisierten an der Gleichung von GORDON und ILLIUS (1994) einen fehlenden Bezug auf eine definierte Partikelgröße, da die MRT mit der Größe der Partikel variiert (FAICHNEY 1975). Tatsächlich führte die Anwendung der Gleichung von GORDON und ILLIUS (1994) zur Unterschätzung der Passagegeschwindigkeit bei Vertretern der Konzentratselektierer (CLAUSS und LECHNER-DOLL 2001). Deshalb berechneten CLAUSS und LECHNER-DOLL (2001) einen „Selektivitätsfaktor“, der angibt wie viel länger Partikel einer bestimmten Größe (<2mm) im Gegensatz zu Flüssigkeiten im Gastrointestinaltrakt verbleiben. Dafür stellten sie folgende Gleichung auf: Selektivitätsfaktor = MRT für Partikel (<2 mm) / MRT für Flüssigkeiten Da die Flüssigkeitspassagerate von der Diät und der Futteraufnahme abhängt, und nicht linear mit dem Körpergewicht steigt (SPALINGER et al. 1993), und Flüssigkeiten im Pansen nicht selektiv zurückgehalten werden, eignet sich die MRT von Flüssigkeiten als Bezugsgröße. CLAUSS und LECHNER-DOLL (2001) errechneten Selektivitätsfaktoren für Rauhfutterfresser von 1,56 - 3,8; für Konzentratselektierer von 1,14 - 1,8 und dazwischenliegende Werte für Vertreter des Intermediärtyps. Dabei ist zu beachten, dass der Selektivitätsfaktor von der Körpermasse unabhängig ist. Das bedeutet, dass Konzentratselektierer Flüssigkeiten und Partikel nicht so lange wie Rauhfutterfresser selektiv zurückhalten können. Dies bestätigt somit einen wichtigen Aspekt von HOFMANNs Theorie und eine Reihe von Beobachtungen, die für eine schnellere Passage der Ingesta durch die Vormägen bei Konzentratselektierern (und Vertretern des Intermediärtyps) gegenüber Rauhfutterfressern sprechen: 9 1. Der geringere Grad der ruminalen Fermentation bestimmter Nährstoffe bei Konzentratselektierern: - Im Dünndarm von Konzentratselektierern und Vertretern des Intermediärtyps findet sich der streng substratinduzierte SGLT-1 Transporter (Natrium-Glukose-Cotransporter). Dieser findet sich bei Rauhfutterfressern ausschließlich bei noch nicht ruminierenden Jungtieren, deren Retikulorumen via Schlundrinne umgangen wird (WOOD et al. 2000, ROWELL-SCHÄFER et al. 2001). - Der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist im Depotfett von Konzentratselektierern am höchsten und nimmt über den Intermediärtyp bis zum Rauhfutterfresser ab (ROWELLSCHÄFER et al. 2001). Dies lässt sich durch die längere Verweilzeit der Ingesta im Retikulorumen von Rauhfutterfressern erklären, während der es zu einer zunehmenden Absättigung der Fettsäuren kommt. - Im Plasma von Konzentratselektierern findet sich ein höherer Gehalt an Vitamin E als bei Rauhfutterfressern bei Gabe derselben Diät (DIERENFELD 1989). Tocopherol (Vitamin E) wird durch ruminale Mikroorganismen abgebaut (ALDERSON et al. 1971). Somit entgeht bei Konzentratselektierern ein höherer Anteil des Tocopherols der Pansenfermentation. 2. Der höhere Anteil großer Partikel (>1mm) im Kot von Konzentratselektierern gegenüber Rauhfutterfressern (HOFMANN 1989, CLAUSS et al. 2003a). Dieser ließe sich durch die weniger selektive Partikelpassage aus dem Retikulorumen von Konzentratselektierern erklären. 3. Der bei Konzentratselektierern gegenüber Rauhfutterfressern aus weniger Spezies bestehenden Ziliatenflora des Vormagens (GIESECKE 1970). Bei der hauptsächlich bei Konzentratselektierern vorkommenden Spezies handelt es sich um eine sich besonders schnell teilende, weshalb vermutet wird, dass andere Ziliatenspezies durch den schnelleren Partikelturnover keine größeren Populationen aufbauen können (HOFMANN 1989, DEHORITY 1994). Im Gegensatz zum Rauhfutterfresser finden sich dafür jedoch amyloitische Bakterien in der Pansenflora von Konzentratselektierern. 2.1.1.3 Der Einfluss der physikomechanischen Eigenschaften der Nahrung auf die Wiederkäuerevolution Bisherige Untersuchungen zur „ruminant diversification“ fokussierten auf die Anpassung der Wiederkäuer an die chemische Zusammensetzung der pflanzlichen Nahrung. CLAUSS et al. (2003a) brachten demgegenüber die physikalisch-mechanischen Charakteristiken der Nahrungsbestandteile in die Diskussion. Dabei konzentrierten sich CLAUSS et al. (2003a) auf die Annahme, dass sich die Evolution der Rauhfutterfresser in spezifischen Adaptationen an die evolutionär jüngere pflanzliche Nahrungsquelle Gras manifestiert hat. 10 Dies stützt sich auch auf die Beobachtung, dass frei umherziehende Konzentratselektierer viel stärker die Aufnahme von Gras vermeiden, als Rauhfutterfresser dies mit Blättern tun (CLAUSS et al. 2003a). Blätter und Gräser unterscheiden sich grundlegend in ihren physikalisch-mechanischen Charakteristiken. Während Blätter im Pansen polygonal brechen und eine homogene Masse bilden, bildet Gras Schichten und schwimmt auf (CLAUSS et al. 2003a) (Abbildung 2.2). Konzentratselektierer kleiner Pansen, dorsal nicht befestigt gleichmäßige Zottenausbildung dünne Pansenpfeiler, wenig ausgebildete Muskelschichten polygonale Partikel Blätter homogene Ingestamasse geringe selektive Partikelretention Rauhfutterfresser großer Pansen, dorsal befestigt ungleichmäßige Zottenausbildung Gras dorsale Gasblase Schwimmschicht aus großen Partikeln geringer Dichte längliche „faserartige“ Partikel stark selektive Partikelretention starke, verhornte Pansenpfeiler, kräftig ausgebildete Muskelschicht kleine Partikel hoher Dichte Pansensee Abbildung 2.2 Unterschiede der Ingestaschichtung bei Konzentratselektierern und Rauhfutterfressern durch differierende physikomechanische Eigenschaften von Blättern und Gräsern. Gräser werden bei der Futteraufnahme zunächst in lange, faserartige Partikel geringer Dichte zerkleinert, die im Pansen auf der flüssigen Phase aufschwimmen. Erst durch mikrobielle Abbauprozesse und weitere mechanische Zerkleinerung (wiederkauen) werden sie zu kleineren Partikeln mit hoher Dichte abgebaut. Diese sinken im Pansen ab und werden durch die Pansenkontraktionen Richtung Haube und Blättermagen weitertransportiert. Blätter brechen demgegenüber polygonal und bilden im Pansen eine homogene Masse. Eine selektive Partikelretention ist so nicht möglich (nach CLAUSS et al. 2003a). Daraus resultiert der Mechanismus der selektiven Partikelretention bei Rauhfutterfressern. Dieser wird durch die Partikeldichte (und die daraus folgenden Flotations- und Sedimentationscharakteristiken), sowie die Schichtung des Panseninhalts (LECHNER-DOLL et al. 1991) bedingt. Größere Partikel haben eine geringere funktionelle Dichte und schwimmen auf der Flüssigphase des Panseninhalts auf. Erst nachdem sie zu geringerer Größe reduziert werden (durch Wiederkauen und mikrobielle Prozesse), erlaubt es ihre physikalische Dichte auf den Boden des Vormagens zu sinken, von wo aus sie während der Kontraktionszyklen aus dem Retikulorumen gewaschen werden. 11 Eine entsprechende Schichtung des Panseninhalts tritt bei Konzentratselektierern nicht auf (HOFMANN 1989 und 2007, RENECKER und HUDSON 1990). Bei Vertretern dieses Ernährungstyps besteht der Panseninhalt großteils aus einer homogenen Masse, in der selektives Absinken, Schweben oder Festhalten von Partikeln unmöglich erscheint (CLAUSS und LECHNER DOLL 2001). Daraus resultiert eine schnellere Passage der Ingesta aus dem Retikulorumen, weshalb größere Partikel und weniger stark fermentierte Nahrung in den unteren Digestionstrakt gelangen. CLAUSS et al. (2003a) sehen in den physikalisch-mechanischen Charakteristiken der bevorzugt aufgenommenen Pflanzen die evolutionsgeschichtliche Ursache - und damit den Hauptgrund - für die morphologischen Adaptationen des Gastrointestinaltraktes von Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen. Solche morphologischen Adaptationen sind beispielsweise die signifikant höhere Vormagenkapazität und die signifikant stärker ausgebildete retikuloruminale Muskulatur der Rauhfutterfresser gegenüber den Konzentratselektierern1. Diese morphologischen Adaptationen erklären, weshalb Konzentratselektierer die Aufnahme von Gras absolut vermeiden und somit als obligate Nicht-Graser (HOFMANN 1989) bezeichnet werden können – es ist ihnen rein anatomisch nur sehr bedingt möglich, Gräser zu verdauen. Zusammenfassend bestätigen neuere Untersuchungen und Erkenntnisse somit den von HOFMANN postulierten Zusammenhang zwischen Ernährungstyp und Passagerate. Dieser wird durch signifikante Unterschiede in der Anatomie des Verdauungstraktes und der Verdauungsphysiologie zwischen den Vertretern der verschiedenen Ernährungstypen bedingt. Ob neben diesen makroskopisch-anatomischen und physiologischen Unterschieden auch Differenzen in der intrinsischen Innervation des Pansens zwischen den Ernährungstypen bestehen, sollte in der vorliegenden Arbeit näher untersucht werden. CLAUSS et al. (2003a) wiesen eine signifikant positive Korrelationen zwischen der Stärke der Pansenpfeiler (als Maß für die Ausprägung der Pansenmuskulatur) beziehungsweise der relativen Vormagenkapazität und dem Grasanteil der natürlichen Nahrung nach. 1 12 2.2 Ablauf und Kontrolle der Vormagenmotorik „Der Wiederkäuer füttert die Mikroben und die Mikroben füttern den Wiederkäuer“ (LEEK 1969). [Übersetzung aus englischem Originaltext] Der Wiederkäuer als Wirt hat keine direkte Kontrolle über die Mikroorganismen in seinem Pansen – jedoch kann er den Fermentationstyp und die Fermentationsrate durch die Futteraufnahme, die Speichelsekretion und die Vormagenmotilität indirekt kontrollieren (LEEK 1969). Eine intakte Vormagenverdauung ist nur möglich, wenn die ständige Durchmischung der Ingesta, die Resorption der Fermentationsprodukte und die Abgabe entstandener Gase über den Ruktus gewährleistet werden (RUCKEBUSCH 1989). Um diese Aufgaben erfüllen zu können, besitzt das Retikulorumen eine spezifische zyklische Motorik. Diese ist durch das Auftreten von A-Zyklen (primären Zyklen) und BZyklen (sekundären Zyklen) gekennzeichnet (LEEK 1969, KASKE 2000). Primäre Zyklen breiten sich von kranial nach kaudal aus und beginnen mit einer biphasischen Haubenkontraktion, die von einer Kontraktion des Pansenvorhofes gefolgt wird. Anschließend kontrahiert der dorsale Pansensack von kranial nach kaudal, danach der ventrale Pansensack. Der Zyklus endet mit einer Kontraktion des ventralen Blindsackes. Die bei diesem Motilitätsmuster ablaufenden Kontraktionen werden als „mixing contractions“ (LEEK 1969, RUCKEBUSCH 1989) bezeichnet, da sie der Durchmischung und Überführung der Ingesta in die Haube dienen. Sekundäre Zyklen beginnen mit einer Kontraktion des ventralen Blindsackes, mit sich anschließender Kontraktion des dorsalen und dann des ventralen Pansensackes. Haube und Pansenvorhof sind nicht beteiligt. Bei diesen B-Zyklen wird die dorsale Gasblase nach kranial zur Kardia geschoben, wodurch das überschüssige Gas über den Ruktus abgegeben werden kann (LEEK 1969, RUCKEBUSCH 1989). Die Regulation der Motorik des Wiederkäuervormagens erfolgt sowohl durch das parasympathische und sympathische Nervensystem (extrinsische Steuerung), als auch durch das Enterische Nervensystem (intrinsische Steuerung) (LEEK 1969). Die Steuerung der zyklischen Vormagenmotorik beruht dabei vorwiegend auf vago-vagalen Reflexen (RUCKEBUSCH 1989). 2.2.1 Extrinsische Steuerung der Vormagenmotorik 2.2.1.1 Steuerung durch den Nervus vagus Die Bestandteile der vago-vagalen Reflexe sind: Rezeptoren (in der Maulhöhle und in der Wand von Vormägen, Labmagen und Duodenum); afferente Nervenfasern die über den Nervus vagus (und zum Teil auch über den N. splanchnicus) projizieren; das paarige, bilaterale Magenzentrum in der Medulla oblongata; efferente Nervenfasern, die vor allem über den N. vagus laufen und die glatte Muskulatur der Vormagenwand als Erfolgsorgan (KASKE 2000). Während Spannungsrezeptoren tief in der glatten Muskulatur vor allem von Haube, Kardia, Hauben-Pansen-Falte und kranialem Pansenpfeiler gelegen sind und auf aktive und passive Dehnung der Wand reagieren, finden sich epitheliale Rezeptoren oberflächlich direkt unterhalb der Basalmembran der Epithelzellen vor allem im Bereich der Haube und im Bereich der Pansenpfeiler. Epitheliale Rezeptoren reagieren neben mechanischen 13 auch auf chemische Reize, wie sie besonders durch Änderung der ruminalen Konzentration kurzkettiger Fettsäuren auftreten (CRICHLOW 1988, CRICHLOW und LEEK 1988). Spannungs- und epitheliale Rezeptoren projizieren über den primär sensorischen N. vagus, dessen Verhältnis zwischen afferenten und efferenten Fasern bei 10:1 liegt (LEEK 1969). Das bilateral symmetrische Magenzentrum liegt im Bereich der dorsalen Vaguskerne in der Medulla oblongata. Insbesondere die A-Zyklen sind letztlich die Folge von Erregungen, die im Magenzentrum gebildet werden und über efferente vagale Fasern zum Vormagen gelangen (KASKE 2000). Da das Reflexzentrum keine spontane Aktivität besitzt, ist für die Bildung efferenter vagaler Erregungen ein ständiger Input durch die gastrointestinalen Rezeptoren nötig (LEEK 1969). Das Reflexzentrum erhält darüber hinaus auch aus anderen Bereichen des Zentralnervensystems und der Körperperipherie Informationen, welche die Vormagenmotilität beeinflussen können (LEEK 1969, KASKE 2000). Das Magenzentrum ist auch an der Steuerung der B-Zyklen beteiligt, jedoch werden diese als vergleichsweise autonom betrachtet. Dies zeigt sich zum Beispiel darin, dass eine experimentelle Dehnung der Haube zwar zu einer erhöhten Frequenz von A-Zyklen führt, die Frequenz der B-Zyklen demgegenüber jedoch abnimmt (KASKE 2000). Die parasympathischen Wurzelzellen finden sich im Magenzentrum (Nucleus parasympathicus) sowie im Nucleus ambigus der Medulla oblongata (KASKE 2000). Deren lange Neurite reichen bis zu den Eingeweideganglien der Bauchhöhle. Am linken und rechten N. vagus werden jeweils ein Kopf-, Hals-, Brust- und Bauchteil unterschieden. Im Brustteil teilen sich rechter und linker N. vagus in jeweils einen dorsalen und einen ventralen Ast, wobei sich die beiden dorsalen und die beiden ventralen Äste nach Durchtritt durch den Hiatus oesophageus vereinigen (NICKEL et al. 1995). Der dorsale Bauchvagus wird auch als „Pansennerv“ bezeichnet, da er insbesondere den Pansen innerviert und nur wenige Fasern an Blätter- und Labmagen abgibt. Demgegenüber innerviert der ventrale Bauchvagus primär Haube, Blätter- und Labmagen („Hauben-Psalter-Labmagen-Nerv“) (NICKEL et al. 1995). Dass die motorischen Efferenzen dieser vago-vagalen Reflexe aus cholinergen Fasern bestehen, die ebenfalls im N. vagus laufen, konnten REID und TITCHEN bereits 1965 nachweisen. Nach Durchtrennung des N. vagus verursachte eine elektrische Stimulation des peripheren Stumpfes frequenzabhängige Kontraktionen der Vormägen. Hohe Frequenzen lösten Kontraktionen von Pansen und Haube aus (primäre Zyklen), während niedrige Frequenzen nur zu Kontraktionen des dorsalen Pansensackes, die sich nach kranial ausbreiteten, führten. Wurden beide Nervi vagi im Halsbereich durchtrennt, erfolgten keine Pansenkontraktionen mehr als Reaktionen auf eine Dehnung der Pansenwand. Gleiches wurde bei intravenöser Applikation von Atropin beobachtet. 14 2.2.1.2 Steuerung durch den Nervus splanchnicus Die Nn. splanchnici beeinflussen die Motilität des Retikulorumens sowohl direkt nerval als auch indirekt neurohumoral über das Nebennierenmark (LEEK 1969). Obwohl am N. splanchnicus keine tonische Aktivität nachweisbar ist, kann es durch Aktivierung vor allem serosaler Rezeptoren, welche auf eine starke Dehnung der Vormagenwand reagieren, zu einer indirekten Hemmung der HaubenPansenmotorik kommen (HOFMANN und SCHNORR 1982, KASKE 2000). Allerdings bleibt eine beidseitige Durchtrennung der Nn. splanchnici ohne Effekt auf die Vormagenmotorik (LEEK 1969, GREGORY 1982), so dass die Bedeutung der sympathischen Innervation für die Vormagenmotorik eher gering zu sein scheint. 2.2.2 Intrinsische Steuerung des Gastrointestinaltraktes 2.2.2.1 Aufbau und Funktion des Enterischen Nervensystems (ENS) Das Enterische Nervensystem stellt einen eigenständigen Teil des vegetativen Nervensystems dar und ist innerhalb der Wand des gesamten Magen-Darm-Kanals vom Ösophagus bis zum Rektum lokalisiert (GABELLA 1990). Es arbeitet weitgehend unabhängig vom Zentralen Nervensystem und steuert gastrointestinale Funktionen wie Motilität, Durchblutung und Sekretion. Seine neuronale Organisation ist dementsprechend komplex (STERNINI 1988). Ganz allgemein ist das ENS für die autonome Regulation elementarer Magen-Darm-Funktionen verantwortlich, während extrinsische Nervenbahnen primär eine Überwachungsfunktion innehaben und nur gelegentlich regulierend und kontrollierend eingreifen (SCHEMANN 2000). Dies zeigt sich auch in der enormen Anzahl enterischer Neurone, die beim Menschen etwa 108 beträgt und damit in etwa der Gesamtzahl der Neurone im Rückenmark entspricht (GABELLA 1990). Dieser gewaltigen Neuronenzahl stehen nur etwa 2000 präganglionäre parasympathische Axone im N. vagus, die zum Darmnervensystem projizieren, gegenüber (JÄNIG 1997). Enterische Neurone sind in zwei Hauptnervenplexūs organisiert. Zum einen ist dies der zwischen Mukosa und Zirkulärmuskulatur gelegene Plexus submucosus (MEISSNER 1857), zum anderen der zwischen Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur lokalisierte Plexus myentericus (AUERBACH 1862). Beide Plexūs spielen eine Rolle bei der Steuerung der Durchblutung. Der Plexus myentericus kontrolliert desweiteren primär die Aktivität der Muskulatur, während der Plexus submucosus die verschiedensten Mukosafunktionen wie Sekretion und Resorption steuert (NEUNLIST et al. 1999). Die Plexūs bestehen aus prominenten Ganglien und Nervensträngen, die diese verbinden und dadurch ein Maschenwerk bilden (GABELLA 1990). Zusätzlich werden die einzelnen Plexūs innerhalb der Darmwand durch vertikal verlaufende Nervenstränge eng miteinander verbunden (GERSHON 1981, SCHILL 1999). Dies ermöglicht es dem ENS die Aktivitäten der Effektoren (z.B. der Mukosa und der Muskulatur) nicht nur getrennt zu steuern, sondern diese auch zu koordinieren. Bei der Propulsion des Darminhaltes erfolgt zum Beispiel zuerst die Sekretion von Wasser, Elektrolyten und Mukus, gefolgt 15 von der propulsiven Kontraktion der Muskulatur. Gleichzeitig wird die Durchblutung erhöht, um die Sekretion von Flüssigkeit und Elektrolyten zu unterstützen (SCHEMANN 2000). Obwohl die Mehrheit der enterischen Nervenfasern intrinsischen Ursprungs ist, finden sich im ENS auch Fortsätze von extrinsischen (parasympathischen und sympathischen) Neuronen, sowie afferente (vor allem von kranio-spinalen sensorischen Ganglien ausgehende) Fasern, welche in Kontakt mit intramuralen Neuronen stehen (STERNINI 1988). Die Nervenzellkörper (Perikarya) sind überwiegend in Ganglien organisiert, wobei die Ganglien des Plexus myentericus die Mehrzahl der Nervenzellkörper des ENS enthalten (STERNINI 1988). Ultrastrukturell stellen sich die myenterischen Ganglien als kompakte Strukturen dar, die dem Zentralen Nervensystem (ZNS) in ihrer generellen Architektur nicht unähnlich sind. Sie bestehen aus eng gepackten Neuronen, die von einer dichten Basallamina umgeben sind und sowohl untereinander, als auch vom umgebenden Gewebe durch Gliazellen – ähnlich den Astroglia im Gehirn - abgeschirmt sind (GERSHON 1981, STERNINI 1988). Der myenterische Plexus selbst ist avaskulär. Auch die außerhalb der Ganglien befindlichen Kapillaren unterscheiden sich von anderen Darmwandkapillaren durch eine fehlende Fensterung, eine dickere Kapillarwand und dichte tight junctions (GERSHON 1981). Somit bilden sie eine der Blut-Hirn-Schranke ähnliche Blut-Plexus-Schranke (STERNINI 1988). Ein wesentliches Merkmal des Enterischen Nervensystems ist die morphologische Variabilität der Neurone, die als Ausdruck der funktionellen Komplexität des ENS gesehen werden kann (SCHILL 1999). Die Bedeutung dieser hochspezialisierten Nervenzelltypen für die Regulation von Verdauungsvorgängen zeigt sich insbesondere dann, wenn das Enterische Nervensystem nur unvollständig entwickelt ist. So geht eine A- oder Hypoganglionose (erworben oder angeboren) eines Darm- oder Vormagensegments mit massiven gastrointestinalen Störungen einher, die unter Umständen nicht mit dem Leben zu vereinbaren sind. Als Beispiele seien hier der Morbus Hirschsprung des Menschen (MIURA et al. 1996, SCHILL 1999), das Overo lethal white foal syndrom (McCABE et al. 1990), die grass sickness des Pferdes (BISHOP et al. 1984, POGSON et al. 1992, DOXEY et al. 1995, MURRAY et al. 1997) und die reduzierte Gangliendichte und Neuronenzahl im Pansen von homozygot grauen und weißen Karakul-Lämmern (GROENEWALD und BOOTH 1992a und b) genannt. 16 2.2.2.2 Einteilung enterischer Neuronen Ähnlich wie im Zentralen Nervensystem, finden sich im Enterischen Nervensystem sensorische Neurone, Interneurone und Motorneurone (FURNESS und COSTA 1989). Neben dieser funktionellen Einteilung können enterische Neurone aufgrund ihrer Struktur (morphologische Kodierung), ihres Gehalts an chemischen Substanzen (chemische Kodierung) und ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften (elektrophysiologische Kodierung) eingeteilt werden (COSTA et al. 1996, LOMAX et al. 1999, BREHMER 1999) (Abbildung 2.3). Abbildung 2.3 Das Enterische Nervensystem besteht aus sensorischen Neuronen, Interneuronen und Motorneuronen. Mit Hilfe dieser Neuronenpopulationen ist es in der Lage, die Effektoren im Gastrointestinaltrakt eigenständig zu steuern. Darüber hinaus kommuniziert das Enterische Nervensystem mit dem Zentralnervensystem (ZNS), wobei die Anzahl der afferenten Bahnen die Anzahl der efferenten Bahnen deutlich übersteigt (GERSHON et al. 1994). 2.2.2.2.1 Morphologische Klassifizierung Die Grundlage für diese Art der Neuronenklassifizierung im Enterischen Nervensystem legte der russische Histologe Alexander S. Dogiel bereits Ende des 19. Jahrhunderts (BREHMER 1999). Seine Kriterien zur Unterscheidung der drei noch heute nach ihm benannten Typen waren Form, Länge und Endigungsweise der Dendriten, sowie die Größe der Nervenzellkörper, ihre Lokalisation innerhalb der Ganglien und die Position ihrer Nucleoli. Dies waren die ersten Bemühungen, eine Korrelation zwischen funktionellen und strukturellen Merkmalen aufzustellen (BREHMER et al. 1999). Dogiel teilte die Neurone in folgende Gruppen ein (aus: BREHMER 1999): Dogiel Typ I Neurone besitzen als prägendes Merkmal „kurze Dendriten“ die „plattgedrückt und lamellenförmig“ enden. Er vermutete eine motorische Funktion, da er einige Axone bis in die Muskulatur verfolgen konnte. Dogiel Typ II Neurone besitzen mehrere lange Fortsätze, die alle das Ursprungsganglion verlassen und über weite Strecken verlaufen. Da Dogiel ihre Fortsätze vereinzelt bis in die Submukosa verfolgen konnte, vermutete er eine sensorische oder sekretomotorische Funktion. Dogiel Typ III Neurone verfügen über Dendriten, die anfangs einen beträchtlichen Durchmesser haben, sich dann immer 17 weiter verästeln und „immer dünner und dünner“ werden. Axone dieses Typs konnte er oft über weite Strecken und durch mehrere Ganglien hindurch verfolgen. Funktionelle Vermutungen zu diesem Typ stellte er nicht an. Während der 80er Jahre des letzten Jahrhunderts erfolgte durch Stach eine morphologische Klassifizierung enterischer Neurone in sechs Typen im Dünndarm des Schweins (BREHMER et al. 1999). Der augenfälligste Fortschritt der Stach`schen Klassifikation bestand darin, dass die Typenunterteilung nicht mehr nur nach Formenmerkmalen der Dendriten erfolgte, sondern auch andere Kennzeichen – vor allem die axonale Projektionsrichtung – als Differenzierungskriterien herangezogen wurden (BREHMER 1999). Da die Typen IV bis VI bisher nur im Dünndarm des Schweins beschrieben wurden, soll an dieser Stelle nicht näher auf sie eingegangen werden. Bei Untersuchungen an Wiederkäuern dominierte im Plexus myentericus des Pansens der Dogiel Typ I, während im Bereich der Schlundrinne vor allem Nervenzellen des Dogiel Typs II zu finden waren (GRAU und WALTER 1957, HOFMANN und SCHNORR 1982). 2.2.2.2.2 Elektrophysiologische Klassifizierung Die messbaren Antworten nach intrazellulärer Stimulation durch depolarisierende Ströme führten zur Einteilung enterischer Neuronen in vier Typen (NISHI und NORTH 1973, HIRST et al. 1974, WOOD 1989). Typ I oder S-Neurone reagieren auf eine Stimulation mit Salven von Aktionspotentialen (NISHI und NORTH 1973, HIRST et al. 1974). HIRST et al. (1974) vermuteten, das es sich zumindest bei einigen Nervenzellen dieses Typs um cholinerge Motorneurone handeln könnte. Demgegenüber besitzen Typ 2 oder AH-Neurone ein negativeres Ruhepotential und zeigen nach einem Aktionspotential eine mehrere Sekunden anhaltende, durch den Einstrom von Kalziumionen bedingte Nachhyperpolarisation (After-Hyperpolarisation). HIRST et al. (1974) vermuteten, das es sich bei diesen Neuronen um sensorische Neurone handeln könnte – aber auch eine Funktion als Interneurone wurde nicht ausgeschlossen. Daneben wurden Neurone gefunden, an denen durch depolarisierende Stimulation kein Aktionspotential ausgelöst werden konnte. Diese wurden als Typ 3 Neurone definiert (NISHI und NORTH 1973). Aktiviert man jedoch die Adenylatcyclase in diesen Neuronen mit Hilfe von Forskolin, kommt es in diesen Zellen zu einem Anstieg von cAMP, in dessen Folge die Zellen zum Teil auf eine Depolarisierung mit Aktionspotentialen antworten (WOOD 1989). Dies widerspricht der Vermutung von NISHI und NORTH, dass es sich bei Typ 3 Zellen um Gliazellen handeln könnte. Als Typ 4 Neurone werden Nervenzellen bezeichnet, die ein den AH/Typ 2 Neuronen ähnliches elektrophysiologisches Verhalten zeigen. Werden diese für Untersuchungszwecke präpariert, so kann man an ihnen zunächst weder synaptische Potentiale, noch somale Aktionspotentiale auslösen. Wartet man jedoch ungefähr 30 Minuten ab bzw. behandelt die Zellen mit Calciumkanalblockern oder Forskolin, so verhalten sie sich großteils wie AH/Typ2 Neurone. Somit scheinen sie ruhende beziehungsweise unbenutzte AH/Typ 2 Neurone darzustellen (WOOD 1989). 18 Die hier beschriebene Einteilung hat bisher allerdings nur für Dünn- und Dickdarm Gültigkeit. Im Magen erfolgt die Einteilung enterischer Neurone aufgrund ihres elektrophysiologischen Verhaltens in tonisch aktive Gastric-I, phasisch aktive Gastric-II und unerregbare Gastric-III-Neurone (SCHEMANN und WOOD 1989a und b). Die elektrophysiologisch signifikanten Unterschiede gegenüber intestinalen Neuronen lassen sich nach SCHEMANN und WOOD (1989a) als eine Anpassung an die verschiedenen Effektorsysteme der entsprechenden Regionen erklären. Diese elektrophysiologische Klassifizierung stammt aus dem Gastrointestinaltrakt monogastrischer Tiere – Befunde zum elektrophysiologischen Verhalten der Nervenzellen im Wiederkäuermagen existieren bisher nicht. 2.2.2.2.3 Neurochemische Klassifizierung Eine weitere Möglichkeit der Klassifizierung enterischer Nervenzellen wird durch die Bestimmung des neurochemischen Kodes ermöglicht (FURNESS 2000, BROOKES 2001a). Unter dem neurochemischen Kode einer Nervenzelle versteht man die Kombination von Neurotransmittern und neuronalen Markern, die je nach Region und Spezies charakteristisch für einen bestimmten Nervenzelltyp ist (COSTA et al. 1996). Bis heute konnten 30 verschiedene Populationen enterischer Nervenzellen auf Grund ihres neurochemischen Kodes charakterisiert werden (SCHEMANN 2000). Enterische Nervenzellen sind in der Lage, mehrere Transmitter und neuronale Marker parallel zu synthetisieren, wobei nicht jede Kombination möglich zu sein scheint. Inzwischen sind etwa 25 verschiedene Transmittersubstanzen bekannt (SCHEMANN 2000). Abhängig von der gastrointestinalen Region und der Spezies treten jedoch nur wenige spezifische Transmitterkombinationen auf (FURNESS 2000, BROOKES 2001a), die bestimmten Gesetzmäßigkeiten folgen. Beispielsweise konnten im myenterischen Plexus aller bisher untersuchten Spezies zwei große Populationen nachgewiesen werden. Die eine Population exprimiert Cholinazetyltransferase (ChAT), ein Enzym welches die Bildung von Azetylcholin aus Cholin und Azetyl-CoA synthetisiert. Die andere Population exprimiert die Stickstoffmonoxidsynthase (NOS), welche Stickstoffmonoxid aus L-Arginin synthetisiert (FURNESS 2000, BROOKES 2001a, PFANNKUCHE et al. 2002a und 2002b). Je nach Lokalisation und/oder Funktion synthetisieren die ChAT-positiven (cholinergen) beziehungsweise NOS-positiven (nitrergen) Neurone weitere Neurotransmitter und neuronale Marker. So unterscheiden sich funktionell verschiedene Nervenzellpopulationen zum Teil nur durch die Expression einer einzelnen Transmittersubstanz, weshalb letztlich nur der detaillierte neurochemische Kode hinreichende Hinweise auf die funktionelle Einordnung einer Nervenzelle liefert (FURNESS 2000, BROOKES 2001a). 19 2.2.2.2.4 Verknüpfung morphologischer, elektrophysiologischer und immunhistochemischer Kriterien Jede Klasse von Neuronen ist durch ein spezifisches Projektionsziel, die Länge und Polarität der axonalen Projektion, die spezifische Neurotransmitterkombination, sowie bestimmte morphologische Charakteristika gekennzeichnet (BROOKES 2001b). Durch Kombination spezieller Untersuchungstechniken ist es möglich, all diese Informationen von einzelnen Nervenzellen zu erhalten. Beispielsweise können die Nervenzellen während (beziehungsweise nach) intrazellulärer Ableitung des transmembranalen Potentials mit Neurobiotin (CLERC et al. 1998) oder Biocytin (LOMAX et al. 1999) gefüllt werden. Beide Stoffe verteilen sich sowohl im Soma, als auch in den Neuriten und können – nachdem sie zum Beispiel mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin sichtbar gemacht wurden – für die morphologische Qualifizierung genutzt werden. So konnte gezeigt werden, dass Neurone mit einem elektrophysiologischem AH/Typ2-Verhalten großteils Dogiel II-Morphologie besitzen, während S/Typ 1 Verhalten häufig mit Dogiel I-Morphologie vergesellschaftet ist (CLERC et al. 1998, LOMAX et al. 1999). Durch die neurochemische Charakterisierung der S/Typ 1 und AH/Typ 2 Nervenzellen konnte desweiteren gezeigt werden, dass AH/Typ 2 Nervenzellen immunreaktiv für ChAT sind und zu großen Teilen das Kalzium-bindende Protein Calbindin (Calb) koexprimieren (IYER et al. 1988, BROOKES et al. 1995, CLERC et al. 1998). Demgegenüber sind S/Typ 1 Zellen entweder für ChAT oder für NOS immunreaktiv und synthetisieren die unterschiedlichsten Neuropeptidkombinationen (BROOKES 2001b). Beispielsweise sind Neurokinine wie Substanz P (SP) in cholinergen Nervenzellen nachweisbar, während das Vasoaktive Intestinale Peptid (VIP) im myenterischen Plexus des Darmes vorwiegend von nitrergen Nervenzellen synthetisiert wird (BROOKES 2001a und b). Einen indirekten Hinweis auf die Funktion dieser verschiedenen Nervenzellpopulationen erhält man durch Betrachtung der spezifischen Wirkungen der Neurotransmitter auf die Zielgeweben des Gastrointestinaltraktes. So löst sowohl die Applikation von SP, als auch von Azetylcholin an der glatten Muskulatur eine Kontraktion aus (DUNCAN 1954, PATON und VANE 1963), weshalb S/Typ I Neurone, die diese beiden Substanzen synthetisieren, als exzitatorische Motorneurone zu fungieren scheinen. Auf der anderen Seite relaxieren VIP und NO die glatte Muskulatur (FAHRENKRUG et al. 1978, DESAI et al. 1991, SYNNERSTAD et al. 1998) – und gelten somit als Marker inhibitorischer Motorneurone (VITTORIA et al. 2000). Demgegenüber wirkt VIP am Epithel – ebenso wie Azetylcholin – prosekretorisch (NEUNLIST und SCHEMANN 1998, SYNNERSTADT et al. 1998). Folgerichtig konnten submuköse Nervenzellen im Darm und myenterische Nervenzellen im Magen, die die Kombination ChAT und VIP synthetisieren, als exzitatorische Sekretomotorneurone identifiziert werden (NEUNLIST und SCHEMANN 1998, REICHE und SCHEMANN 1999). 20 Bisher wurde das ENS des Meerschweinchens am detailliertesten erforscht. Unter Nutzung aller oben genannter Methoden und Möglichkeiten konnte hier für den Dünndarm bereits eine nahezu vollständige „Kartierung“ der vorhandenen Neuronenklassen aufgestellt werden. FURNESS (2000) unterschied 14 Typen auf Grund ihrer Funktion, Morphologie, Projektion, primärer Neurotransmitter und ihres neurophysiologischen Verhaltens. Im Folgenden sind die Ergebnisse dieses Autors in Form einer Abbildung und einer Tabelle dargestellt, um einen Einblick in die Komplexität des Enterischen Nervensystems zu ermöglichen (Abbildung 2.4, Tabelle 2a). Abbildung 2.4 Neuronentypen im Dünndarm des Meerschweinchens (FURNESS 2000). 1. aszendierendes Interneuron 2. myenterisches, primär afferentes Neuron 3. viszerofugales Neuron 4. exzitatorisches Motorneuron, LM 5. inhibitorisches Motorneuron, LM 6. exzitatorisches Motorneuron, CM 7. inhibitorisches Motorneuron, CM 8. deszendierendes Interneuron (lokale Reflexe) 9. deszendierendes Interneuron (sekretomotorische Reflexe) 10. deszendierendes Interneuron 11. submuköses primär afferentes Neuron 12. nicht-cholinerges Sekretomotor/vasodilatatorisches Neuron 13. cholinerges Sekretomotor/vasodilatatorisches Neuron 14. cholinerges Sekretomotor (nichtvasodilatatorisches) Neuron LM: Longitudinalmuskulatur; MP: Plexus myentericus; CM: Zirkulärmuskulatur; SM: Plexus submucosus; Muc: Mucosa 21 Tabelle 2a Neuronentypen im Dünndarm des Meerschweinchens (nach FURNESS 2000). Primäre Transmitter sind fett markiert. Abkürzungen: AP, endogene Alkalische Phosphatase; BN, Bombesin; CCK, Cholecystokinin; CGRP, Calcitonin Gene-Related Peptide; ChAT, Cholinazetyl-Transferase; CM, Zirkulärmuskulatur; DYN, Dynorphin; ENK, Enkephalin; GABA, Gamma-Amino-Buttersäure; GAL, Galanin; LM, Longitudinalmuskulatur; MP, Plexus myentericus; NFP Neurofilament Protein; NK, Neurokinin; NOS, Stickstoffmonoxid-Synthase; NPY, Neuropeptid Y; PACAP, pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide; MP, Plexus myentericus; SM, Plexus submucosus; SOM, Somatostatin; TK, Tachykinine (z.B. Substanz P); VIP, Vasoaktives Intestinales Peptid; 5-HT, Serotonin, ±: ein Teil der Nervenzellpopulation synthetisiert diesen Neurotransmitter/neuronalen Marker. 1. aszendierendes Interneuron 2. myenterisches, primär afferentes Neuron 3. viszerofugales Neuron 4. exzitatorisches Motorneuron, LM 5. inhibitorisches Motorneuron, LM 6. exzitatorisches Motorneuron, CM 7. inhibitorisches Motorneuron, CM 8. deszendierendes Interneuron (lokale Reflexe) 9. deszendierendes Interneuron (sekretomotorische Reflexe) 10. deszendierendes Interneuron (wandernde myoelektrische Komplexe) 11. submuköses, primär afferentes Neuron 12. nicht-cholinerges Sekretomotor/vasodilatatorisches Neuron 13. cholinerges Sekretomotor/vasodilatatorisches Neuron 14. cholinerges Sekretomotorneuron (nichtvasodilatatorisch) Morphologie (Dogiel Typ) I II Neurochemischer Kode Plexus ChAT/Calretinin/TK ChAT/Calbindin/TK/NK3 Rezeptor MP MP I oder „simple cells“ (Subtyp von Dogiel I) I oder „simple cells) ChAT/BN/VIP/CCK/ENK MP ChAT/Calretinin/TK MP I oder „simple cells“ NOS/VIP/GABA MP I MP I Kurz: ChAT/TK/ENK/GABA Lang: ChAT/TK/ENK/NFP Kurz: NOS/VIP/PACAP/ENK/NPY/GABA Lang : NOS/VIP/PACAP/DYN/BN/NFP ChAT/NOS/VIP±BN±NPY MP I ChAT/5-HT MP I ChAT/SOM MP II ChAT/TK/Calbindin SM Filamtöse Zellen VIP/GAL SM Filamentöse Zellen ChAT/Calretinin/DYN SM Filamentöse Zellen ChAT/NPY/CCK/SOM/CGRP/DYN SM I 22 MP 2.2.3 Intrinsische Innervation des Wiederkäuervormagens 2.2.3.1 Funktionelle Bedeutung des ENS für die Vormagenfunktion Die extrinsisch vermittelte elektrische Aktivität der Vormagenmuskulatur kann durch beidseitige Vagotomie aufgehoben werden (RUCKEBUSCH 1989). Eine Lähmung des N. vagus beim Hoflundsyndrom geht mit einer retikuloruminalen Stase einher (KUIPER und BREUKINK 1987). Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass der N. vagus bei der zentralen Steuerung der Vormagenmotorik eine entscheidende Rolle spielt. Experimente an vagotomierten Wiederkäuern konnten jedoch auch die Bedeutung der intrinsischen Innervation für die Steuerung der Vormagenmotilität belegen: So führte GREGORY (1982) eine beidseitige Thoraxvagotomie bei Schafen durch, die er vor und nach der Operation durch intragastrale Infusionen von Flüssignährstoffen ernährte. Bereits einen Tag nach der Operation konnte eine geringe Motilität des Retikulorumens festgestellt werden, die bis etwa zwei Wochen nach dem Eingriff zunahm und durch Kontraktionen, die fast simultan am ganzen Pansen abliefen, gekennzeichnet war. Im Gegensatz zu gesunden Schafen wurden weder A- noch BZyklen beobachtet, auch fehlte die Modulation der retikuloruminalen Motilität durch taktile Stimulation, sowie durch Stimulation von Rezeptoren im Maul- und Speiseröhrenbereich. Später wurde der Einfluss von Dehnung, Temperatur sowie taktiler und chemischer Stimuli auf die Vormagenmotilität von chronisch vagotomierten Schafen untersucht (GREGORY 1984). Dabei konnte gezeigt werden, dass die Motilität bei diesen Tieren vorrangig über die Dehnung der Pansenwand und somit über den Füllungsgrad gesteuert wurde und eine Hemmung der Motilität – ebenso wie bei gesunden Tieren - durch eine hohe intraruminale Konzentration von flüchtigen Fettsäuren bei niedrigem pH-Wert auftrat. Einen weiteren Hinweis auf die funktionelle Bedeutung der intrinsischen Innervation für die Vormagenmotilität geben die Untersuchungen von GROENEWALD und BOOTH (1992a und b), die zeigten, dass bei homozygot grauen (und etwas weniger stark ausgeprägt auch bei weißen) Karakullämmern die Anzahl und Größe myenterischer Ganglien in Pansen und Haube im Vergleich zu heterozygoten grauen und schwarzen Karakullämmern deutlich vermindert ist. Die von der genetischen Mutation betroffenen homozygot grauen und weißen Lämmer leiden unter schweren Motilitätsstörungen, die unter anderem mit einem fehlenden Schlundrinnenreflex verbunden sind. Als Folge dieser Funktionsstörung sterben die Tiere noch während der Saugperiode (GROENEWALD und BOOTH 1992b), wobei im Sektionsbild insbesondere der gedehnte, dünnwandige und milchgefüllte Pansen auffällt. 23 2.2.3.2 Nachweis verschiedener Transmitter im Vormagen In allen Vormagenbereichen konnte bisher sowohl ein submuköser, als auch ein myenterischer Plexus nachgewiesen werden (GRAU und WALTER 1957, TEIXEIRA et al. 1998). Dabei exprimieren die in den Plexūs lokalisierten Nervenzellen und Nervenfasern eine Reihe von Neurotransmittern und neuronalen Markern, die bereits vom Monogastrier bekannt sind: Im Vormagen des Schafes wurden ChAT, NOS, Calbindin, VIP, SP (PFANNKUCHE et al. 2002a, 2003a, 2004c), CGRP, Methionine–Enkephaline (Met-Enk), NPY, NT (GROENEWALD 1994), Leucine-Enkephaline (Leu-Enk) (KITAMURA et al. 1986, YAMAMOTO et al. 1994) und SOM (GROENEWALD 1994, VERGARA-ESTERAS et al. 1990) nachgewiesen. YAMAMOTO et al. (1994) fanden GAL-reaktive Nervenzellen im Plexus myentericus des Omasums des Schafes. Im Vormagen von Rindern konnten neben NOS, VIP, SP und SOM (SOM nur in der Schlundrinne, nicht im Reticulorumen) auch Leu-Enk (KITAMURA et al. 1986 und 1987) und GAL (VITTORIA et al. 2000) nachgewiesen werden. PFANNKUCHE et al. (2002b) wiesen im Labmagen von Rindern NOS und ChAT nach. Im Ziegenvormagen wurden bisher SP und Calbindin in Nervenzellkörpern und Calretinin, sowie CGRP in Nervenfasern des myenterischen Plexus nachgewiesen (LEE und NAM 2006). 2.2.3.3 Neurochemische Kodierungen und Populationen myenterischer Neurone im Vormagen des Schafes Detaillierte Untersuchungen zur neurochemischen Kodierung im Vormagen von Wiederkäuern wurden bisher lediglich für das Schaf durchgeführt (PFANNKUCHE 2002a, 2003b und 2004c, RÖSCH 2003). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen kurz dargestellt werden: Auch im Vormagen von Schafen gehören alle myenterischen Neurone entweder einer cholinergen (ChAT-positiven) oder einer nitrergen (NOS-positiven) Population an (PFANNKUCHE et al. 2002a). Im Pansen des adulten Schafes war ChAT häufig mit SP kolokalisiert, während NOS mit dem Vasoaktivem Intestinalen Peptid kolokalisiert war (PFANNKUCHE et al. 2002a). Demnach ergaben sich für den Pansen folgende Neuronenpopulationen: ChAT/SP, ChAT/- und NOS/VIP. In der Haube von Mast- und Sauglamm wurden dieselben Neuronenpopulationen nachgewiesen (RÖSCH 2003). Zusätzlich konnte in der Schlundrinne und in der Haube des Schafes die Existenz einer weiteren, rein nitrergen (NOS/-) Population aufgezeigt werden (PFANNKUCHE et al. 2003a). Durch den Nachweis von Calbindin gelang es, weitere enterische Subpopulationen in Pansen und Haube zu differenzieren (RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2004c): So wiesen etwa 10 % der rein cholinergen Population des Pansens die Kodierung Calbindin/ChAT auf. Desweiteren fanden sich vereinzelt Neurone mit der Kodierung Calbindin/NOS. Demgegenüber war der Anteil Calbindin-positiver Neurone mit unter 1 % der Gesamtneuronenpopulation in der Haube geringer als im Pansen. Allerdings war der Anteil der Neurone mit der Kodierung Calbindin/NOS in der Haube deutlich höher als im Pansen. 24 2.2.3.4 Regionen- und altersspezifische Innervation des Vormagens von Wiederkäuern Die intrinsische Innervation des Retikulorumens weist einzigartige Charakteristiken auf, die vermutlich direkt mit der speziellen Motorik und Entwicklung der Vormägen korreliert sind (PFANNKUCHE et al. 2002a, 2003a und b, 2004a und b). So ist die Vormagenverdauung streng alters- beziehungsweise nahrungsabhängig. Das Retikulorumen wird bei nicht-ruminierenden Wiederkäuern in der Saugphase komplett mit Hilfe der Schlundrinne umgangen, welche es ermöglicht, die aufgenommene Milch direkt in den Labmagen zu schleusen (RUCKEBUSCH 1989). Demgegenüber ist die Schlundrinne beim adulten Wiederkäuer nahezu bedeutungslos. Auch die spezifische Pansenmotorik entwickelt sich erst mit Einsetzen der Rumination (RUCKEBUSCH 1989). Diese Veränderungen spiegeln sich auch in der intrinsischen Innervation von Retikulorumen und Schlundrinne wider. So zeigen beispielsweise die absolute Anzahl und die relativen Anteile von Neuronen einer bestimmten Kodierung eine Abhängigkeit von der untersuchten Vormagenregion (Schlundrinne, Haube, Pansen) und dem Alter des Tieres (Sauglamm, Mastlamm, adultes Schaf): beispielsweise finden sich im myenterischen Plexus der Schlundrinne des Lammes vor allem nitrerge Nervenzellen, während in Haube und Pansen cholinerge Nervenzellen dominieren (PFANNKUCHE et al. 2003a, RÖSCH 2003). Im Pansen des Schafes kommt es zu einer altersabhängigen relativen Zunahme der Neuronenpopulation mit der Kodierung NOS/VIP (16 % beim Sauglamm, 24 % beim Mastlamm, 29 % beim adulten Schaf; PFANNKUCHE et al. 2003b). Demgegenüber sinkt der relative Anteil rein cholinerger Neurone (ChAT/-) ab (20 % beim Sauglamm, 13 % beim Mastlamm, 5 % beim adulten Schaf), während die Population ChAT/SP bei allen Altersgruppen stabil bleibt (PFANNKUCHE et al. 2003b). Die prozentuale Zunahme von NOS/VIP immunreaktiven Neuronen scheint eine Anpassung an die erhöhte Volumenaufnahme mit dem Beginn der Rauhfutteraufnahme und beginnender Rumination zu sein (PFANNKUCHE et al. 2003b). Als Ursache für die Abnahme des prozentualen Anteils rein cholinerger Neurone wird zum einen eine erst im Laufe der Entwicklung beginnende SP Synthese diskutiert, zum anderen scheint auch ein entwicklungsbedingter Verlust der rein cholinergen Nervenzellen möglich (RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2003b). Die Funktion rein cholinerger Nervenzellen ist nicht im Detail bekannt, jedoch konnte nachgewiesen werden, dass sie nicht zur Pansenmuskulatur projizieren (PFANNKUCHE et al. 2002a). Eine weitere Besonderheit des Retikulorumens stellt das – im Gegensatz zum Säuremagen (einhöhliger Magen und Labmagen) – Fehlen peristaltischer Wellen dar. Somit scheint eine polarisierte Innervation aus aszendierenden cholinergen und deszendierenden nitrergen Nervenzellen im Retikulorumen nicht notwendig zu sein. Tatsächlich konnte an Schafen gezeigt werden, dass die Pansenmuskulatur nicht durch polarisierte Projektionen myenterischer Nervenzellen innerviert wird (PFANNKUCHE et al. 2002a). Dies unterscheidet die intrinsische Innervation des Pansens von allen anderen bisher untersuchten Regionen des Gastrointestinaltraktes. 25 2.3 Fragestellung Bisher lagen fast ausschließlich Daten über die neurochemische Kodierung und die Nervenzellpopulationen im Vormagen von Schafen vor. Demgegenüber existierten über die Neurotransmitterexpression im Pansen anderer Wiederkäuerspezies nur vereinzelte Befunde. Beim Schaf konnte eine Veränderung der intrinsischen Innervation in Abhängigkeit vom Alter und somit von der Art der Ernährung (Milch versus Rauhfutter) gezeigt werden. Die Ernährung von Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen unterscheidet sich zum Teil erheblich, so dass auch hier Unterschiede der intrinsischen Innervation zu vermuten waren. Somit ergaben sich folgende Fragen: Spiegeln sich Unterschiede in der Diätwahl der verschiedenen Ernährungstypen auch in Unterschieden der intrinsischen Vormageninnervation wider? Zeigen sich mögliche Unterschiede der intrinsischen Innervation auch in Unterschieden der in-vitro Motilität? Zur Beantwortung dieser Fragen wurden Proben aus dem myenterischen Plexus des Pansens von Ziege, Damwild (beide Intermediärtyp), Schaf und Rind (beide Rauhfutterfresser) untersucht. Neben den allgemeinen Innervationsmerkmalen Gangliengröße, Gangliendichte und Neuronendichte, wurde die neurochemische Kodierung der Neurone vergleichend zwischen den Ernährungstypen und zwischen den verschiedenen Spezies innerhalb eines Ernährungstyps untersucht. In einem letzten Schritt wurden in-vitro Motilitätsmessungen an Pansenmuskelstreifen von Schafen (Rauhfutterfresser) und Ziegen (Intermediärtyp) durchgeführt. 26 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Versuchstiere und Organentnahme Als Versuchstiere wurden jung adulte (1-4 Jahre alte) Schafe, Ziegen, Rinder und Damtiere beiderlei Geschlechts verwendet. Bei den insgesamt 25 Schafen (Merinokreuzungen 50-80 kg) handelte es sich um Tiere des VeterinärPhysiologischen Instituts der Universität Leipzig. Die Fütterung erfolgte mit Heu ad libitum, zusätzlich wurde pro Tier und Tag etwa 200 g eines pelletierten Kraftfutters für Schafe zugefüttert. Die Tiere wurden im Schlachthaus auf dem Fakultätsgelände im Rahmen anderer institutseigener Versuche geschlachtet. Die insgesamt 20 Ziegen (Weiße Deutsche Edelziege und Bunte Deutsche Edelziege) stammten von einem Milchziegenhof aus der Umgebung. Die Fütterung erfolgte mit Heu (etwa 400 g/Tier und Tag), plus einer leistungsabhängigen Gabe eines pelletierten Kraftfutters für Milchziegen (bis zu 2,2 kg pro Tier und Tag). Stroh konnte ad libitum aufgenommen werden. Die Pansenproben wurden auf dem Ziegenhof im Rahmen der regelmäßig stattfindenden Hausschlachtungen gewonnen. Die Damwildproben (von insgesamt 29 Tieren) wurden im Lehr- und Versuchsgut Oberholz der Universität Leipzig anlässlich der jährlichen Schlachtungen gewonnen. Die Tiere wurden dort in großen Gattern gehalten. Im Sommer erfolgte keine Zufütterung und die Tiere ernährten sich ausschließlich vom natürlichen Aufwuchs in den Gehegen. Im Winter wurde je nach Witterungslage Heu oder Anwelksilage von denselben Flächen zugefüttert. Ausgangs des Winters erfolgte bei den hochtragenden Tieren zusätzlich eine Zufütterung mit etwa 100 g Getreide oder Mischfutter für Rinder pro Tier und Tag. Die Proben von den insgesamt 13 Rindern (Holstein-Friesian und Schwarzbuntes Milchrind) stammten von einem regionalen Schlachthof. Dabei handelte es sich um Milchkühe und Schlachtbullen. Über die Fütterung der aus verschiedenen Betrieben stammenden Tiere ist nichts bekannt. Alle Tiere wurden durch Bolzenschuss betäubt und durch anschließendes Entbluten getötet. Das komplette Vormagensystem wurde innerhalb einer Stunde (beim Damwild innerhalb von 2 Stunden) nach der Tötung entnommen. Von jedem Tier wurde mit Hilfe einer Schere ein circa 7x7 cm großes Stück aus der medialen Wand des ventralen Pansensackes entnommen. Von jeweils 3 bis 4 Tieren aller untersuchten Spezies wurde zusätzlich ein circa 5x5 cm großes Gewebestück aus dem dorsalen Blindsack des Pansens entnommen. Die Gewebestücke wurden unmittelbar nach der Entnahme mit kalter, carbogen (95 % O2, 5 % CO2) begaster Krebslösung gewaschen und anschließend in steriler, carbogenbegaster und gekühlter (5°C) 27 Krebslösung1 ins Labor transportiert. Der Transport ins Labor dauerte maximal 2,5 Stunden. Die für die Motilitätsuntersuchungen entnommenen Gewebestücke stammten aus dem ventralen Pansensack von jeweils 10 Schafen und Ziegen und wurden ebenso behandelt, jedoch wurde der Krebslösung kein Nifedipin zugesetzt. 3.2 Neurochemische Untersuchungen 3.2.1 Gewebekultur Die für die Gewebekultur verwendeten Bestecke, Petrischalen und Gefäße wurden zuvor drei Stunden bei 180°C im Heißluftschrank sterilisiert. Das Kulturmedium wurde steril filtriert. Im Labor wurden die Gewebestücke erneut mit frischer steriler, carbogenbegaster Krebslösung gewaschen. Anschließend wurden die Stücke geteilt. Eine Hälfte wurde für die Kulturperiode vorbereitet. Hierzu wurden die Gewebe einzeln, mit dem Epithel nach oben weisend, in sterile Petrischalen verbracht. Der Boden dieser Petrischalen war mit einem Silikonelastomer (Sylgard, WPI) bedeckt, so dass die Gewebestücke mit Präpariernadeln aufgespannt werden konnten. Um während der nun folgenden Präparation die Vitalität der Gewebe zu erhalten, wurden die Petrischalen mit Krebslösung gefüllt. Mit Pinzette und Irisschere konnten nun unter einem Binokular Epithel und epitheliales Bindegewebe von der darunter liegenden Zirkulärmuskulatur abpräpariert werden. Während des Präparierens wurde die Krebslösung in der Petrischale alle 10 Minuten gegen frische, carbogenbegaste Lösung ausgetauscht. Nach der Präparation wurden die Gewebe sechsmal für jeweils 10 Minuten in steriler Krebslösung gewaschen. Anschließend wurden die Gewebestücke in sterilen Petrischalen, deren Boden mit Sylgard ausgegossen war, aufgespannt. Um eine beidseitige Umspülung des Gewebes mit Kulturmedium zu gewährleisten, wurden unter die vier Ecken und vier Seitenränder der Gewebestücke insgesamt acht, etwa 2 mm hohe Sylgard-Quader gesetzt. Im Anschluss wurden die aufgespannten Präparate erneut dreimal für je 10 Minuten mit Krebslösung gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden 40 ml Dulbeccos Modified Eagles Kulturmedium (DMEM F-12, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in jede Petrischale gegeben. Dem Medium (pH 7,4) waren 10 % hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum, 100 µg/ml Streptomycin, 100 IU/ml Penicillin, 20 µg/ml Gentamicin, 1,24 µg/ml Amphotericin B, 2,1 mg/ml NaHCO3 und 1µmol Nifedipin (alle Chemikalien von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt. Zusammensetzung der Krebslösung in mM: 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2,5 CaCl2, 11,5 Glucose und 1µmol Nifedipin; pH 7,4 (alle Chemikalien von Sigma, Deisenhofen, Deutschland). Zur Herstellung der Krebslösung wurden die entsprechenden Mengen NaCl, KCl, NaH2PO4 und NaHCO3 mit Aqua bidest angesetzt und anschließend 20 Minuten bei 121°C autoklaviert. Es wurden steril filtrierte Glucose-, MgCl2- und CaCl2- Stammlösungen hergestellt, die erst nach dem Autoklavieren zugefügt wurden, um ein Ausfällen der Substanzen zu verhindern. Die Krebslösung wurde vor ihrer Verwendung auf 5 °C gekühlt und mit Carbogen begast. 1 28 Das Medium wurde zwei Stunden vor seiner Verwendung im Brutschrank (37°C, 5 % CO2) äquilibriert. Dem Medium wurde ebenfalls 40 µmol Colchizin zugesetzt. Colchizin verhindert den axonalen Transport und die Abgabe von Neuropeptiden, wodurch sich diese im Soma der Nervenzellen anreichern und somit später besser immunhistochemisch dargestellt werden können (EKBLAD et al. 1996). Nachdem die einzelnen Petrischalen mit Silikontrichtern abgedeckt worden waren, wurden sie in den Brutschrank gestellt. In diesem befanden sich die Schalen auf einem Horizontalrüttler, der die Schalen permanent mit einer Frequenz von circa 1 Hz bewegte. Die Kultivierung der Präparate erfolgte bei 37°C und 5 % CO2 über einen Zeitraum von 24 Stunden. Nach der Kulturperiode wurden die Gewebe in aufgespanntem Zustand mit Zambonis Fixativ (0,1 M Phosphatpuffer mit 4 % Paraformaldehyd und 5,6 % Pikrinsäure) für 24 Stunden bei 4°C fixiert. Die fixierten Präparate wurden anschließend dreimal für 10 Minuten mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen und bis zur weiteren Bearbeitung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: 0,1 M Phosphatpuffer; 0,88 % NaCl, pH 7,4), die 0,1 % NaN3 enthielt, aufbewahrt. Der zweite Teil der Gewebestücke (sowie alle Gewebestücke des dorsalen Blindsackes) wurden direkt nach ihrer Entnahme (also ohne Kulturperiode) für 24 Stunden bei 5°C mit Zambonis Fixativ in aufgespanntem Zustand fixiert. Dazu musste das Epithel der Rinderpräparate zuvor abpräpariert werden, da aufgrund der Schichtdicken sonst kein Aufspannen möglich gewesen wäre. Die Behandlung nach der Fixierung dieser Präparate erfolgte wie oben beschrieben. 3.2.2 Immunhistochemische und enzymhistochemische Färbung der Präparate Um die neurochemische Kodierung der myenterischen Neurone zu untersuchen, musste zunächst der myenterische Plexus isoliert werden. Das fixierte Gewebe wurde hierzu in einer mit PBS gefüllten Petrischale aufgespannt. Unter einem Binokular wurden mit einer Pinzette Serosa, Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur entfernt und so der myenterische Plexus freigelegt. Die Plexuspräparate wurden mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz gefärbt, um verschiedene Neurotransmitter, deren Syntheseenzyme, sowie verschiedene neuronale Marker darzustellen. Für die Darstellung von Neuropeptiden wurden mit Colchizin vorbehandelte Präparate verwendet. Die unmittelbar nach ihrer Entnahme fixierten Gewebe wurden für Untersuchungen genutzt, bei denen ausschließlich neuronale Enzyme in Kombination mit dem Marker HuC/D nachgewiesen werden sollten. Zur Anfärbung wurden die Präparate zunächst für eine Stunde in PBS/NaN3, das 4 % Pferdeserum und 0,5 % Triton X-100 enthielt, bei Zimmertemperatur vorinkubiert. TritonX-100 führt zu einer Permeabilisierung der Zellmembran, wodurch eine Bindung der Antikörper an die intrazellulär gelegenen anzufärbenden Antigene ermöglicht wird. Der Zusatz des Pferdeserums diente zum Besetzen unspezifischer Bindungsstellen. Die für die Vorinkubation verwendete Lösung wurde auch für die folgende Inkubation mit den primären und sekundären Antikörpern genutzt. 29 Im Anschluss an die Vorinkubation wurden die Gewebe für 36 Stunden mit den primären Antikörpern (Tabelle 3a) bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach erfolgte eine dreimalige Waschung mit PBS (jeweils 10 Minuten), um ungebundene Primärantikörper zu entfernen. Als nächstes erfolgte eine fünfstündige Inkubation mit den sekundären Antiköpern, die gegen die Spezies, aus der die zuvor verwendeten Primärantikörper gewonnen worden waren, gerichtet waren. Da die Primärantikörper aus verschiedenen Spezies stammten (Maus, Meerschweinchen, Ratte, Kaninchen), führte dies zu einer spezifischen Markierung der primären Antikörper. Die Sekundärantikörper waren mit den Fluoreszenzfarbstoffen Carbocyanin CyTM2 bzw. CyTM 3 markiert (Tabelle 3b). Einige der verwendeten Sekundärantikörper (Esel-anti-Meerschweinchen, Esel-anti-Maus) waren mit Biotin gekoppelt. Bei Färbungen, in denen einer dieser Antikörper verwendet wurde, musste ein zusätzlicher Inkubationsschritt durchgeführt werden. In diesen Fällen erfolgte nach Inkubation mit den Primärantikörpern und Waschung eine fünfstündige Inkubation mit den Biotin-markierten Antikörpern. Nach nochmaliger (3x10 minütiger) Waschung mit PBS schloss sich eine weitere fünfstündige Inkubation mit den übrigen sekundären Antikörpern und dem Fluorophor Streptavidin-7Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat (Strept-AMCA) an. Durch das Strept-AMCA wurde das Biotin sichtbar gemacht. Nach nochmals dreimal zehnminütigem Waschen wurden die Präparate auf Objektträger aufgezogen und mit Glyzerollösung (80 % Glyzerol, 0,1 % NaN3, 0,5 M NaHCO3/Na2CO3) eingedeckt. Mit Hilfe dieses Färbeprotokolls wurden bis zu drei Antigene zugleich dargestellt (z.B. VIP/SP/NPY). Bei einem Teil der Präparate erfolgte nach fotographischer Dokumentation und Auszählung ein erneutes Färben, zumeist mit dem Antikörper gegen HuC/D1, 2. Dazu wurde die Lage der Präparate auf der Unterseite der Objektträger mit einem wasserfesten Stift markiert. Bei der Auszählung wurden die Ganglien fotografiert und ihre Koordinaten wurden dokumentiert. Anschließend wurden die Präparate ausgedeckt und dreimal für jeweils zehn Minuten mit PBS gewaschen. Die erneute Färbung erfolgte danach nach dem gleichen Schema wie bereits oben erwähnt. Durch die Markierung auf den Objektträgern war es möglich, die Präparate ein zweites Mal in gleicher Lage aufzuziehen und mit Hilfe der Koordinaten und Fotos konnten dieselben Ganglien zweifelsfrei erneut aufgesucht und ausgewertet werden. : Der Antikörper gegen HuC/D wurde als genereller Neuronenmarker verwendet. Bei HuC/D handelt es sich um ein RNA-bindendes Protein, welches in Kern und Zytoplasma von Nervenzellen exprimiert wird (DALMAN et al. 1992, LIN et al. 2002, CHIOCCHETTI et al. 2004, PHILLIPS et al. 2004, BOYER et al. 2005). Durch die fehlende Markierung von Nervenzellfortsätzen wird die quantitative Auswertung erleichtert. 2 : Durch die Ermittlung der Gesamtzahl der enterischen Neurone in den entsprechenden Präparaten mit HuC/D war es möglich, die relativen Anteile der ein bestimmtes Antigen exprimierenden Neurone an der Gesamtpopulation exakt zu bestimmen. Vor diesem zusätzlichen Färbeschritt erfolgte die fotographische Dokumentation, da nach diesem „Überfärben“ mit dem Cy3 markierten HuC/D, die im ersten Färbeschritt bereits mit Cy3 markierten (z.B. nitrergen oder SPergen) Neuronen nicht mehr sicher zu differenzieren waren. 1 30 Tabelle 3a Verwendete primäre Antikörper und Antisera. ** Verdünnung in PBS/NaN3, das 4 % Pferdeserum und 0,5 % Triton X-100 enthielt. Antikörper Herkunft Verdünnung Hersteller (Tierart) ** Anti-CholinazetylKaninchen 1:1000 P3YEB Transferase (ChAT) Prof. Dr. M. Schemann, Deutschland AntiMaus 1:40 610308 StickstoffmonoxidTransduction Laboratories, USA Synthase (NOS) Anti-Substanz P (SP) Ratte 1:1000 10-S15 Fitzgerald, USA Anti-Vasoaktives Meerschweinchen 1:1000 GHC7161 Intestinales Polypeptid Peninsula, USA (VIP) Anti-Calbindin D-28k Kaninchen 1:2000 CB-38 Swant, Bellinzona, Schweiz Anti-Somatostatin-14 Kaninchen 1:1000 T-4102 IgG Peninsula, USA Anti-Neuropeptid Y Kaninchen 1 :1000 T-4453 (NPY) IgG Peninsula, USA Anti-HuC/HuD Maus 1:200 A-21271 Neuronales Protein; MoBiTec, Göttingen, Deutschland monoklonal Tabelle 3b Verwendete sekundäre Antikörper. * Bezug über Dianova, Hamburg - Deutschland ** Verdünnung in PBS/NaN3, das 4 % Pferdeserum und 0,5 % Triton X-100 enthielt. *** Sekundäre Antikörper, die in einem weiteren Schritt mit AMCA-konjugiertem Streptavidin (Code: 016-150-084* Jackson ImmunoResearch, USA) markiert wurden. Antikörper Fluorophor Verdünnung Hersteller ** Esel-anti-Kaninchen Cy2 1:200 Code: 711-225-152* IgG (Jackson ImmunoResearch, USA) Esel-anti-Maus IgG Cy3 1:500 Code: 715-165-151* (Jackson ImmunoResearch, USA) Esel-anti-Ratte IgG Cy3 1:500 Code: 712-165-153* (Jackson ImmunoResearch, USA) Esel-anti-Maus mit Strept - AMCA 1:50 Code: 715-065-150* Biotin *** (Jackson ImmunoResearch, USA) Esel-antiStrept - AMCA 1:50 Code: 706-065-148* Meerschweinchen mit (Jackson ImmunoResearch, USA) Biotin *** 31 3.2.3 Enzymhistochemie Bei einem weiteren Teil der Präparate wurde der immunhistochemische Nachweis bestimmter Transmitter/Syntheseenzyme mit der NADPH-Diaphorase Färbung kombiniert. Das Enzym NADPHDiaphorase findet sich in hoher Konzentration in nitrergen Nervenzellen. Durch Umsetzung von 4Nitrotetrazoliumblau werden die Zellsomata dunkelblau markiert. Vor der Durchführung der NADPHDiaphorase-Färbung wurden die immunhistochemisch angefärbten Präparate zunächst am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet und fotographisch dokumentiert , anschließend ausgedeckt und 1 dreimal zehn Minuten mit PBS gewaschen. Für die NADPH-Diaphorase-Färbung wurde zunächst Phosphatpuffer mit 1 N NaOH-Lauge auf pH 8 eingestellt und 0,5 % Triton X zugegeben. Anschließend erfolgte die Zugabe von ß-NADPH-D (N1630 Sigma Steinheim) (0,5 mg/10 ml) und 4-Nitrotetrazoliumblau (N-6876 Sigma Steinheim) (1mg/10ml). Die Plexuspräparate wurden in die frisch hergestellte Färbelösung gegeben und bei 37°C im Wärmeschrank für 30 min bis 3 Stunden inkubiert. Der Färbevorgang wurde durch dreimaliges Waschen mit PBS abgebrochen, wenn makroskopisch eine ausreichende Färbung der Nervenzellen sichtbar war. Anschließend wurden die Präparate erneut auf Objektträger aufgezogen, mit Glyzerollösung eingedeckt und ausgewertet. 3.2.4 Spezifität der Antikörper Die Spezifität der verwendeten Antikörper wurde an Plexuspräparaten aller untersuchten Spezies überprüft. Dafür wurden die entsprechenden Antikörper mit 1µmol und 10 µmol VIP, SOM, SP und NPY Antigen (ChAT mit 2,5µg/ml Antigen) für 24 Stunden bei 4°C präinkubiert und anschließend dem normalen Färbeprotokoll unterzogen. Dabei konnte in keinem Präparat eine positive Immunreaktivität nachgewiesen werden. Die Spezifität des NOS-Antikörpers wurde mittels NADPH-Diaphorase-Reaktion nachgewiesen. Hierbei wurden jeweils 3 Präparate pro Spezies zunächst mit dem Antikörper gegen NOS gefärbt. Nach fotographischer Dokumentation wurden die Präparate erneut mittels NADPH-Diaphorase Reaktion gefärbt (Abbildung 3.1). Dabei wurden zu über 99 % dieselben Neurone erneut markiert (von 600 ausgewerteten Neuronen pro Spezies kodierten bei Schaf und Ziege je 1 Zelle = 0,17 % und beim Damwild 5 Zellen = 0,83 % für NOS, ohne NADPH-D positiv zu sein; sowie beim Schaf 4 Zellen = 0,66 % und bei Damwild und Rind je 2 Zellen = 0,33 % nur für NADPH-D, ohne NOSpositiv zu sein). Um die Spezifität der sekundären Antisera nachzuweisen, wurden diese ohne primäre Antikörper in der üblichen Verdünnung verwendet. Dabei wurde bei keinem Präparat der untersuchten Spezies eine Markierung beobachtet. In diesem Fall war die fotographische Dokumentation nötig, da nach enzymhistochemischer Markierung bei den nitrergen Neuronen die immunhistochemisch fluoreszenzmarkierten Antigene (NOS, NPY und VIP) nicht mehr sichtbar waren. 1 32 Abbildung 3.1: Myenterisches Ganglion aus dem Pansen eines Schafes. Im oberen Bild erfolgte die immunhistochemische Darstellung der nitrergen Neurone mit dem Antikörper gegen NOS. Im unteren Bild ist dasselbe Ganglion nach enzymhistochemischer Färbung mittels NADPH-Diaphorasereaktion dargestellt. NOS und NADPH-D markieren dieselben Neurone. NADPH-D 3.2.5 Auswertung der Präparate Die Auswertung der Immunfluoreszenzfärbungen erfolgte mit einem Epifluoreszenzmikroskop (IX 50, Olympus, Japan). In Tabelle 3c sind die dabei verwendeten Filterblöcke dargestellt. Tabelle 3c Filterblöcke zur Sichtbarmachung der verwendeten Fluorophore. Die Angaben zu den Filtern stammen von der Firma Olympus, Hamburg bzw. Chroma Technology, Brattelboro, USA. Die Wellenlängenbereiche für Anregungsfilter, Dichroitischen Spiegel und Emissionsfilter sind in Klammern unter den Firmenbezeichnungen angegeben. Filterblock Anregungsfilter Dichroitischer Emissionsfilter Farbstoff Spiegel UM41007 HQ 545/30x 565DCLP HQ 610/75M Cy 3 (530-560 nm) (565 nm) (575-645 nm) (orange) U-MNIBA BP 470-490 DM505 D520 Cy 2 (470-490 nm) (505 nm) (510-530 nm) (grün) U-MWU BP 330-385 DM400 BP 460-490 AMCA (330-385 nm) (400 nm) (460-490 nm) (blau) Die Auswertung der NADPH-D Färbung erfolgte mit Auflicht am Epifluoreszenzmikroskop. Durch nur geringes Aufblenden war es teilweise möglich, die NADPH-D gefärbten Neurone zugleich mit den immunhistochemisch markierten Neuronen darzustellen (z.B. Abbildung 4.4). Die Auswertung der Immunfluoreszenzfärbungen erfolgte direkt am Mikroskop und mit Hilfe eines computergestützten Bildanalysesystems. Aufnahmen von Ganglien und Neuronen wurden mit einer digitalen Schwarzweiß-Videokamera (Pieper FK 7512-IQ Maryland, USA) angefertigt. Als Software zur Bearbeitung und weiteren Auswertung der Aufnahmen wurden die Programme Scion Image 33 (Frederick, Maryland, USA) und Paint Shop Pro 7.04 (Jasc Software Inc., Eden Prairie, Minnesota, USA) verwendet. Zur Bestimmung der neurochemischen Kodierung der myenterischen Neurone wurden die Präparate mäanderförmig durchmustert und die ersten zwanzig Ganglien jedes Präparates ausgewertet. Bei dieser Auswertung wurden die einzelnen Neurone dieser Ganglien auf ihre Immunreaktivität für die verschiedenen Neurotransmitter und neuronalen Marker überprüft und gezählt. Jedes ausgewertete Ganglion wurde mit Hilfe der digitalen Schwarzweiß-Videokamera mit jeder Färbung fotografiert. Die Position der Ganglien im Präparat wurde mit Hilfe eines x-y Olympus Sensor Control Displays (SCD) dokumentiert. Die Umrisse der Präparate wurden auf der Unterseite der Objektträger mit einem wasserfesten Stift markiert. So war es bei sich gegebenenfalls anschließenden weiteren Färbungen möglich, dieselben Ganglien erneut aufzusuchen und auszuwerten. Um Kolokalisationen von Transmittern und Neuropeptiden feststellen zu können, wurden pro Färbung bei je 3 Präparaten pro Tierart je 200 Nervenzellen auf Kolokalisationen entsprechend der verwendeten Antikörper untersucht. Durch die Bestimmung dieser Kolokalisationen war es möglich, bestimmte Neuronenpopulationen zu identifizieren. Wenn hierbei nur unter 1 % der Gesamtneurone eine bestimmte Kolokalisation aufwies, wurden diese nicht als separate Population gewertet. Als Gangliendichte wurde die Anzahl der Ganglien auf einer definierten Plexusfläche bezeichnet. Die Bestimmung der Gangliendichte erfolgte mit Hilfe von Millimeterpapier und einer Schablone, mit der eine Fläche von 1 cm² auf den Objektträgern markiert wurde. Alle Ganglien, die sich innerhalb der Ränder dieser markierten Fläche befanden, beziehungsweise den linken oder unteren Rand der Markierung berührten, wurden gezählt. Ganglien, die den rechten oder oberen Rand berührten, wurden nicht mitgezählt. 3.2.6 Statistik der neurochemischen Untersuchungen Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms Sigma Stat 2.0. Für jedes einzelne Präparat wurden die Gangliengrößen (= Anzahl HuC/D-positiver Neurone pro Ganglion), sowie die Anzahl der mittels der verwendeten Antikörper markierten Neurone als Medianwerte bestimmt. Aus den Medianwerten der einzelnen Präparate wurden Mittelwerte (MW) mit Standardabweichungen (SD) für die entsprechenden Anfärbungen für jede untersuchte Spezies berechnet. Die prozentualen Anteile der Populationen wurden für jedes Präparat anhand der Medianwerte errechnet und anschließend wurden daraus Mittelwerte und Standardabweichungen für die Spezies bestimmt. Die einzelnen Populationsgrößen wurden auf statistische Unterschiede innerhalb der Tierarten und zwischen den Spezies mittels Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A = Tierart, Faktor B = Population) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test untersucht. Unterschiede wurden als statistisch signifikant bewertet, wenn p<0,05 war. 34 Die Innervationsdichte (d.h. die Anzahl von Neuronen pro cm²) wurde durch Multiplikation von Gangliendichte (Ganglien pro cm²) und mittlerer Gangliengröße (= Anzahl HuC/D positiver Neurone pro Ganglion) für die Präparate berechnet, bei denen diese beide Werte bestimmt worden waren. Anschließend wurden daraus Mittelwerte und Standardabweichungen für die einzelnen Spezies errechnet und als mittlere Neuronendichte bezeichnet. Gangliendichte, Gangliengröße und Neuronendichte wurden auf signifikante Unterschiede zwischen den Spezies mittels One-Way-ANOVA-Test mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test untersucht. Diese drei Parameter wurden auf signifikante Unterschiede zwischen ventralem Pansensack und dorsalem Blindsack innerhalb der Spezies mittels t-Test getestet. Auch hier wurden Unterschiede als statistisch signifikant bewertet, wenn p<0,05 war. Für die neurochemischen Untersuchungen wurden Präparate von insgesamt 11 Ziegen, 15 Schafen, 10 Rindern und 15 Tieren Damwild verwendet. Die Anzahl der jeweils verwendeten Präparate, sowie die Anzahl der Tiere, von denen diese stammten, ist im 4. Kapitel zusammen mit den entsprechenden Ergebnissen für die jeweiligen Färbungen angegeben. 3.2.7 Berechnung der Neuronenpopulationen Nach Berechnung der relativen Anteile der mit den Antikörpern gegen ChAT, NOS, NPY, VIP, und SP markierten Neurone an der mit HuC/D markierten Gesamtneuronenpopulation wurden - mit Hilfe der aus den Kolokalisationsuntersuchungen gewonnenen Erkenntnisse - die Neuronenpopulationen berechnet. Dabei entsprach der relative Anteil der Population mit der Kodierung NOS/NPY/VIP dem Anteil der VIP-positiven Neurone an der Gesamtpopulation, da VIP stets mit NPY und NOS kolokalisiert war. Der relative Anteil der Population mit der Kodierung NOS/NPY entsprach dem Anteil der nitrergen, NPY-positiven Zellen, die nicht mit VIP kolokalisiert waren und konnte somit durch Subtraktion der VIPergen von der nitrergen/NPYergen Population berechnet werden. Der relative Anteil der SPergen Neuronen entsprach dem Anteil der Population ChAT/SP, da SP stets mit ChAT kolokalisiert war. Schließlich konnte durch Subtraktion der SPergen von den cholinergen Neuronen der Anteil der rein cholinergen Population ChAT/- berechnet werden. Die Berechnungen erfolgten aus den relativen Anteilen der Neuropeptide/Syntheseenzyme und wurden für die entsprechenden Präparate einzeln durchgeführt. Anschließend wurden aus den so ermittelten Zahlen Mittelwerte und Standardabweichungen für die verschiedenen Tierarten berechnet. Die Populationen wurden auf statistische Unterschiede innerhalb der Tierarten und zwischen den Spezies mittels Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A = Tierart, Faktor B = Population) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test untersucht. Unterschiede wurden als statistisch signifikant bewertet, wenn p<0,05 war. 35 3.3 Motilitätsuntersuchungen 3.3.1 Gewebeaufbereitung Das Gewebe für die Motilitätsuntersuchungen stammte aus dem ventralen Pansensack von Schafen und Ziegen. Es wurde in kalter, carbogenbegaster Krebslösung ins Labor gebracht und anschließend flach in mit Sylgard beschichteten Petrischalen aufgespannt. Zur Herstellung der TMMP-Präparate1 wurden das Epithel und das subepitheliale Bindegewebe unter einem Binokular mit Hilfe einer feinen Irisschere vorsichtig abpräpariert. Um das Gewebe vital zu erhalten, wurde die Krebslösung alle 10 Minuten gewechselt. Anschließend wurden etwa 1,5 x 2,5 cm große Stücke aus dem Gewebe herausgeschnitten. Dabei wurde auf eine parallel zur Zirkulärmuskulatur ausgerichtete Schnittrichtung geachtet. 3.3.2 Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen 3.3.2.1 Versuchsvorrichtung Die Versuchsvorrichtung bestand aus einem Wasserbad, zwei Paar Platinstimulationselektroden, einem Impulsstimulator, vier Organbädern (Volumen 60 beziehungsweise 80 ml), vier isometrischen Kraftaufnehmern (MLT 0201 Sensitive Isometric Tranducer 0-25 g; AD-Instruments) und einer Messbrücke (Quad Bridge ML-118, AD-Instuments), die an einen Analog-Digital Wandler (Power Lab 4/25 ADDi ML 845, AD-Instruments) und an ein computergestütztes Analysesystem (Chart v5.2 for Windows, AD-Instruments) angeschlossen waren. Die vier doppelwandigen Organbäder hatten verschließbare Abläufe und waren nach oben hin offen, so dass ein Austausch der Lösungen während des Versuchs erfolgen konnte. Die Organbäder wurden beständig mit Carbogen begast und auf 37 °C gehalten. In den Organbädern befand sich eine Pufferlösung folgender Zusammensetzung (in mM/l): NaCl 70, KCl 4,7; NaHCO3 25; NaH2PO4*H2O 1,2; CaCl2*2H2O 2,5; MgCl2*6 H2O 1,2; Na-D-Gluconat 39, Glucose*H2O 10, HEPES 5; pH 7,4). Zur Messung der mechanischen Aktivität wurden, wie oben beschrieben, TMMP-Präparate aus dem ventralen Pansensack verwendet. Diese wurden an den kurzen Seiten mit Plastikclips versehen (Abbildung 3.2). Am unteren Plastikclip befand sich ein kleiner Ring, mit dem das untere Gewebeende fest an einem Haken im Organbad befestigt werden konnte. Der obere Clip wurde über einen Perlonfaden (Stärke 0,15 mm) an einem Kraftaufnehmer befestigt. Die Gewebestücke wurden auf etwa 30 mN vorgespannt. Die verwendeten Präparate bestanden aus den beiden Muskelschichten der Tunica muscularis und dem dazwischenliegenden myenterischen Plexus, sowie der Serosa. Da die Präparate dem Verlauf der Zirkulärmuskulatur folgend zugeschnitten und eingespannt wurden, konnten so die Aktivität und die Reaktionen der Zirkulärmuskulatur näher untersucht werden. 1 36 Die Kraftaufnehmer dienten der Umwandlung der mechanischen Aktivität in elektrische Signale. Die elektrischen Signale wurden über eine Messbrücke, die an einen Analog-Digitalwandler und einen Computer angeschlossen war, verstärkt und auf einem Monitor dargestellt. Messwerte wurden alle 250 ms erhoben und graphisch dargestellt. Nach Einbringen der Gewebe in die Organbäder und gegebenenfalls Positionierung der Stimulationselektroden folgte eine Äquilibrierungsphase von 45 bis 120 Minute. Die Dauer dieser Phase (in der alle 30 Minuten ein Wechsel der Pufferlösung erfolgte) richtete sich nach der Zeit, die die einzelnen Präparate benötigten, bis die tonische (und zum Teil auch phasische) Aktivität der Gewebestreifen ein konstantes Level erreichte. Die Ausmessung und Auswertung der aufgezeichneten Kurven erfolgte mit Hilfe des Programms Chart v5.2 for Windows (AD-Instruments). Für die anschließende statistische Auswertung wurde das Programm Sigma Stat 2.0 verwendet. Abbildung 3.2: Versuchsaufbau für die Motilitätsuntersuchungen. 3.3.2.2 Elektrische Feldstimulation Zur elektrischen Feldstimulation (EFS) wurden flache Platinelektroden verwendet, die an einem separaten Stativ befestigt waren. Die Elektroden wurden so positioniert, dass sie sich beidseits jeweils auf Höhe der Mitte des Gewebestreifens befanden, ohne diesen jedoch zu berühren (Abbildung 3.2). Die Elektroden wurden über einen Impulsstimulator angesteuert. Die Stimulation erfolgte mit einer Frequenz von 20 Hz über 10 s bei 200 mA. Nach der Äquilibrierungsphase wurden die Gewebe jeweils dreimal im Abstand von fünf Minuten stimuliert. Nach weiteren fünf Minuten erfolgte die Zugabe von L-NAME (NG-Nitro-L-arginine methylester Hydrochlorid; N-5751, Sigma, Deisenhofen Deutschland; Endkonzentration im Organbad 100 µmol) 37 beziehungsweise Atropin (A-0257; Sigma, Deisenhofen, Deutschland, Endkonzentration im Organbad 4 µmol), an die sich eine 15 minütige Äquilibrierungsphase anschloss. Diese wurde von drei weiteren Feldstimulationen, jeweils im Abstand von fünf Minuten, gefolgt. Bei L-NAME handelt es sich um ein substituiertes Argininanalogon, welches die Stickstoffmonoxidsynthese kompetitiv inhibiert und in Folge dessen die Bildung und Freisetzung von NOS aus den nitrergen Zellen hemmt (REES et al. 1990). Durch Atropin werden muskarinerge Rezeptoren blockiert (JÄNIG 1997). Für die Auswertung wurde zunächst der basale Tonus vor Beginn der Feldstimulationen bestimmt. Auf die Feldstimulationen reagierten die Gewebe (außer nach Zugabe von Atropin) mit Kontraktionen. Es wurde jeweils die maximale Kontraktionsamplitude nach jeder Feldstimulation bestimmt, sowie die Fläche unter der Kurve (AUC) bis zum Wiedererreichen des basalen Tonus (Abbildung 3.3). Für jedes Tier wurden die Werte der Kontrollstimulationen mit den Werten nach Zugabe der Substanzen mittels gepaarten t-Tests verglichen. Unterschiede wurden als statistisch signifikant bewertete, wenn p<0,05 war. Anschließend wurden für jedes Präparat aus den drei Werten der Stimulationen nach L-NAME- bzw. Atropinzugabe Mittelwerte berechnet, aus denen der prozentuale Anstieg bzw. Abfall zu dem jeweiligen Mittelwert der drei Kontrollstimulationen berechnet wurde. Aus den Werten der einzelnen Präparate wurden wiederum die Mittelwerte und Standardabweichungen für die beiden Spezies berechnet und mittels Mann-Whitney Rank Summentest (bei nicht normalverteilten Werten) bzw. t-Test (bei normalverteilten Werten) verglichen. Unterschiede wurden als statistisch signifikant Kontraktionskraft [mN] bewertet, wenn p<0,05 war. Amplitude Zeit [min:s] 38 Abbildung 3.3 Beispiel für eine Kontrollstimulation bei der Ziege. Die gestrichelte Linie markiert den Beginn der Stimulation. Die Amplitude wurde von Höhe der Basallinie (hier etwa 16 mN) bis zum höchsten Punkt der Kurve gemessen. Die Fläche unter der Kurve (AUC = gestreifte Fläche) wurde von Beginn der Kontraktion bis zum Wiedererreichen der Basallinie bestimmt. Die 3.3.2.3 Dosis-Wirkungsuntersuchungen mit Carbachol TMMP-Präparate für die Dosis-Wirkungsuntersuchungen wurden entsprechend den Gewebestücken für die Feldstimulation vorbereitet und eingespannt. Nach der Äquilibrierungsphase erfolgte alle fünf Minuten die Zugabe einer Carbachol-Stammlösung (10 mM beziehungsweise 1 mM Carbachol in Aqua bidest; Carbachol C-4382, Sigma, St. Louis, USA). Die Endkonzentrationen im Organbad betrugen 0,01; 0,1; 1; 10 und 100 µmol/l. Die Zugabe wurde unterbrochen, wenn die Kontraktionen des Gewebes so stark wurden, dass sie außerhalb des Messbereiches (>250 mN) gelangten. Carbachol gehört zur Gruppe der direkt wirkenden Parasympathomimetika und aktiviert (wie Azetylcholin) direkt cholinerge Rezeptoren. Im Vergleich zu Azetylcholin (Ach) ist Carbachol resistenter gegen die Hydrolyse durch die Cholinesterase und hat dadurch eine längere Wirkdauer, wodurch es für unsere Untersuchungen geeigneter als Ach war. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm Chart v5.2 for Windows (AD-Instruments). Zunächst wurde der basale Tonus vor Zugabe von Carbachol bestimmt. Dieser wurde als Basis für die folgenden Amplitudenmessungen benutzt. Es wurde jeweils die maximale Amplitude, die bei der entsprechenden Carbacholkonzentration auftrat, bestimmt. Aus diesen Werten wurden für jede Konzentration Mittelwerte berechnet und mittels t-Test auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies überprüft. Unterschiede wurden als statistisch signifikant bewertet, wenn p<0,05 war. 39 4 Ergebnisse 4.1 Immun- und Enzymhistochemische Untersuchungen 4.1.1 Allgemeine Innervationsmerkmale Bei allen untersuchten Spezies konnte in beiden Pansenlokalisationen (ventraler Pansensack und dorsaler Blindsack) ein myenterischer Plexus nachgewiesen werden. Die Plexūs bestanden aus in Ganglien angeordneten Nervenzellen und dazwischenliegenden interganglionären Fasersträngen (Abbildung 4.1). Die Gangliengröße variierte stark. So konnten bei allen untersuchten Spezies sowohl sehr kleine, aus nur zwei bis drei Nervenzellen bestehende Ganglien, als auch sehr große, mehrere hundert Neurone enthaltende Ganglien gefunden werden (siehe auch Punkt 4.1.1.2). Abbildung 4.1 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens eines Schafes. Zweifachfärbung HuC/D und NADPH-D. Auf der oberen Abbildung wurden die Neurone des Ganglions mit dem generellen Neuronenmarker HuC/D markiert. Auf der unteren Abbildung ist dasselbe Ganglion nach enzymhistochemischer Markierung mittels NADPH-DiaphoraseReaktion abgebildet. Neben den NADPHD positiven, nitrergen Neuronen (schwarz mit hellem Kern, heller Pfeil), sind hier auch die interganglionären Faserstränge (schwarze Pfeile) sichtbar. Schaf HuC/D 100 µm HuC/D und NADPH-D 4.1.1.1 Gangliendichte Die Gangliendichte bezeichnet die Anzahl der Ganglien einer definierten Plexusfläche (1 cm²). Neben den Proben aus dem ventralen Pansensack wurden von jeder Spezies auch 3-4 Präparate aus dem dorsalen Blindsack untersucht (Tabelle 4a). Das Damwild zeigte mit 14,6±3,3 Ganglien/cm² im ventralen Pansensack und 12,5±1,9 Ganglien/cm² im dorsalen Blindsack die mit Abstand höchste Gangliendichte, während das Rind in beiden Lokalisationen die geringste Gangliendichte aufwies (5,9±1,1 bzw. 6,2±2,6 Ganglien/cm²). Die Gangliendichten von Ziege und Schaf waren in beiden Lokalisationen vergleichbar und lagen zwischen denen von Damwild und Rind. Innerhalb der Tierarten bestanden bezüglich der Gangliendichte keine signifikanten Unterschiede zwischen ventralem Pansensack und dorsalem Blindsack. 40 Tabelle 4a Gangliendichte im ventralen Pansensack und im dorsalen Blindsack des Pansens von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b, c: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies (One-Way-ANOVA-Test mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Die Gesamtzahl der Ganglien/cm² im ventralen Pansensack und dorsalen Blindsack wurde innerhalb jeder Spezies mittels t-Test verglichen. Dabei fanden sich keine signifikanten Unterschiede (p>0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen diese Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind Gesamtzahl der Ganglien pro cm² im ventralen Pansensack Gesamtzahl der Ganglien pro cm² im dorsalen Blindsack 10,3±3,0 a n=12 N=7 7,3±4,5 ab n=3 N=3 14,6±3,3 b n=12 N=12 12,5±1,9 a n=4 N=4 8,4±2,1 a n=12 N=11 9,7±4,9 ab n=4 N=3 5,9±1,1 c n=12 N=8 6,2±2,6 b n=4 N=3 4.1.1.2 Gangliengröße Die mittlere Gangliengröße (d.h. die Anzahl der Nervenzellen pro Ganglion) differierte zwischen den untersuchten Spezies (Tabelle 4b). Dabei wies das Rind mit 73±6 Neuronen/Ganglion im ventralen Pansensack bzw. 64±21 Neuronen/Ganglion im dorsalen Blindsack in beiden untersuchten Lokalisationen signifikant größere Ganglien als das Damwild (51±20 bzw. 28±6 Neurone/Ganglion) auf. Im ventralen Pansensack waren auch die Ganglien von Ziege und Schaf signifikant kleiner als die Rinderganglien. Innerhalb der untersuchten Spezies fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der mittleren Gangliengröße im dorsalen Blindsack und im ventralen Pansensack. Tabelle 4b Gangliengröße im ventralen Pansensack und im dorsalen Blindsack des Pansens von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies (One-Way-ANOVA-Test mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Mittels t-Test wurden innerhalb jeder Spezies die Werte von ventralem Pansensack und dorsalem Blindsack verglichen. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (p>0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen diese Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind Anzahl der Neurone/Ganglion im ventralen Pansensack Anzahl der Neurone/Ganglion im dorsalen Blindsack 57±19 a n=24 N=11 36±16 ab n=4 N=4 41 51±20 a n=23 N=15 28±6 a n=3 N=3 45±18 a n=21 N=15 36±23 ab n=4 N=4 73±6 b n=22 N=10 64±21 b n=3 N=3 Die Gangliengröße wies bei allen Spezies eine weite Streuung auf. Deshalb wurde die Häufigkeit von Ganglien einer bestimmten Größe bei den verschiedenen Spezies verglichen. Dafür wurden alle pro Tierart ausgewerteten Ganglien nach ihrer Größe in Gruppen zusammengefasst, wobei der Abstand von Gruppe zu Gruppe 10 Neurone betrug. Alle Ganglien mit über 400 Neuronen/Ganglion bildeten ebenfalls eine Gruppe. Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Ganglien variierte zwischen den untersuchten Spezies. Deshalb wurden die prozentualen Anteile der Ganglien einer bestimmten Größe an den pro Tierart insgesamt ausgewerteten Ganglien berechnet (Abbildung 4.2). Auffällig war, dass bei allen untersuchten Spezies die kleineren Ganglien dominierten. So bestanden weit über die Hälfte aller Ganglien aus bis zu 100 Neuronen (Ziege 66 %, Damwild 71 %, Schaf 72 % und Rind 59 %). Der Anteil der Ganglien einer bestimmten Größe war von der Tierart abhängig (Two-Way-ANOVA Test, p<0,05). Die größten Unterschiede (verglichen mittels Student-Newman-Keul-Test) ergaben sich bei den Gruppen mit 10 bis 90 Neuronen (Abbildung 4.2, Tabelle 4c). Der Anteil sehr großer Ganglien (>400 Neurone/Ganglion) war bei Rind und Schaf (4,2±3,4 % und 3,3±3,7 %) höher als bei Damwild und Ziege (1,5±2,3 % und 1,3±2,4 %). Allerdings stammte das größte in dieser Studie ausgewertete Ganglion von einer Ziege und bestand aus 761 Neuronen. Tabelle 4c Prozentuale Anteile der Ganglien einer bestimmten Größe an der Gesamtganglienzahl (Mittelwerte ± Standardabweichungen). Aufgeführt sind nur die Gangliengrößen, bei denen zwischen den Spezies signifikante Unterschiede festgestellt werden konnten. a, b, c, d: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies innerhalb einer Gangliengröße (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p=0,996; Faktor B (Gangliengröße) p<0,001; Faktor A x Faktor B p<0,001) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen diese Präparate gewonnen wurden. Ziege % Damwild % Schaf % Rind % Neurone/Ganglion n=24 N=9 n=23 N=14 n=23 N=14 n=22 N=9 1-10 („10“) 15,3±7,9 11,7±5,6 19,7±11,7 9,1±5,5 a b c d 11-20 („20“) 12,5±7,5 14,1±5,7 17,1±6,5 9,1±3,1 a a b c 21-30 („30“) 10,1±5,2 10,9±6,5 8,7±5,1 7,3 ±4,8 ab a ab b 31-40 („40“) 5,1±2,8 6,8±5,6 8,7±4,9 8,3±3,1 a ab b b 81-90 („90“) 6,1±4,4 3,4±4,0 1,8±2,9 2,4±1,6 a b b b 42 35 Ziege relativer Anteil an der Gesamtganglienzahl ]%] 30 25 20 15 10 5 25 20 15 10 5 290 330 370 >400 330 370 >400 250 210 Neurone/Ganglion 35 Schaf relativer Anteil an der Gesamtganglienzahl [%] 30 25 20 15 10 5 0 Rind 30 25 20 15 10 5 250 210 170 130 90 10 370 330 >400 Neurone/Ganglion 290 250 210 170 130 90 50 10 0 50 relativer Anteil an der Gesamtganglienzahl [%] 35 290 Neurone/Ganglion 170 130 10 90 0 >400 370 330 290 250 210 170 130 90 50 10 0 Damwild 30 50 relativer Anteil an der Gesamtganglienzahl [%] 35 Neurone/Ganglion Abbildung 4.2 Verteilung der Ganglien nach ihrer Größe im ventralen Pansensack von Ziege, Damwild, Schaf und Rind. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der Ganglien einer bestimmten Größe an der Gesamtzahl der ausgewerteten Ganglien je Tierart (Mittelwerte ± Standardabweichungen). x-Achse: Anzahl der Neurone pro Ganglion in 10er Gruppen. y-Achse: Prozentualer Anteil der Ganglien einer Größe an der Gesamtganglienanzahl. n: Anzahl der ausgewerteten Präparate; N: Anzahl der Tiere von denen die Präparate stammten; m: Anzahl der insgesamt ausgewerteten Ganglien pro Tierart. In Klammern ist jeweils das größte ausgewertete Ganglion pro Tierart aufgeführt. Ziege: n=24; N=9; m=478 (761) Damwild: n=23; N=14; m=460 (545) Schaf: n=23; N=14; m=457 (620) Rind: n=22; N=9; m=437 (747) 43 4.1.1.3 Neuronendichte Auch bei der mittleren Neuronendichte (d.h. bei der Anzahl von Nervenzellen pro cm²) zeigten sich Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies (Tabelle 4d). So fanden sich im ventralen Pansensack vom Damwild mit 664±194 Neuronen und bei der Ziege mit 584±295 Neuronen signifikant mehr Neurone pro Quadratzentimeter als beim Schaf mit 289±132 Neuronen. Im dorsalen Blindsack zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Spezies. Zwischen den beiden untersuchten Lokalisationen konnte nur beim Damwild ein signifikanter Unterschied zwischen ventralem Pansensack und dorsalem Blindsack aufgezeigt werden. Tabelle 4d Mittlere Neuronendichte im ventralen Pansensack und im dorsalen Blindsack des Pansens von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Spezies innerhalb einer Lokalisation (One-Way-ANOVA-Test mit angeschlossenem StudentNewman-Keul-Test, p<0,05). */**: Eine verschiedene Anzahl von Sternen markiert signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Lokalisationen ventraler Pansensack und dorsaler Blindsack (t-Test, p<0,05) innerhalb einer Spezies. Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen diese Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind Anzahl der Neurone/cm² im ventralen Pansensack Anzahl der Neurone/cm² im dorsalen Blindsack 584±295 a * n=10 N=6 271±255 * n=3 N=3 44 664±194 a * n=9 N=9 400±134 ** n=4 N=4 289±132 b * n=11 N=11 390±303 * n=4 N=4 432±238 ab * n=9 N=8 457±299 * n=3 N=3 4.1.2 Neurochemische Kodierung myenterischer Neurone im Pansen 4.1.2.1 Nitrerge und cholinerge Neurone Für das Schaf wurde bereits gezeigt, dass alle myenterischen Neurone entweder einer ChAT-positiven oder einer NOS-positiven Population zugeordnet werden können (PFANNKUCHE et al. 2002a und 2002b). Mittels Dreifachfärbung wurde untersucht, ob dies auch auf die anderen hier untersuchten Spezies zutrifft. Die Gewebe von je vier Tieren pro Spezies wurden zunächst mit Antikörpern gegen die Cholinazetyltransferase (ChAT) und die Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) gefärbt (Abbildung 4.3) und nach Auszählung und fotographischer Dokumentation mit dem Antikörper gegen HuC/D gefärbt und erneut ausgezählt1. Im Folgenden werden Neurone, die sich mit dem Antikörper gegen die Cholinazetyltransferase markieren ließen als cholinerg und Neurone, die sich mit dem Antikörper gegen die Stickstoffmonoxidsynthase markieren ließen, als nitrerg bezeichnet. Alternativ erfolgte zuerst eine Färbung gegen ChAT und HuC/D, an die – wiederum nach Auszählung und fotographischer Dokumentation - eine NADPH-Diaphorase Färbung zur Markierung nitrerger Neurone angeschlossen wurde. In jedem Präparat wurden 300 Neurone auf ihre Immunreaktivität für ChAT oder NOS (beziehungsweise ihre Markierung mittels NADPH-D) untersucht. Bei allen untersuchten Tierarten waren nahezu alle Neurone entweder cholinerg oder nitrerg kodiert (siehe Abbildung 4.3). Lediglich bei Schaf und Ziege war jeweils 1 Zelle (=0,01 %) und beim Damwild waren 4 Zellen (=0,33 %) sowohl für ChAT, als auch für NOS immunreaktiv. Ziege NOS 100µm ChAT Abbildung 4.3 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens einer Ziege. Zweifachfärbung ChAT und NOS. Mit den Antiköpern gegen ChAT und NOS werden verschiedene Neuronenpopulationen markiert. Cholinerge Zellen (dünner Pfeil) sind nicht gleichzeitig auch nitrerg und nitrerge Zellen (Blockpfeil) sind nicht gleichzeitig auch cholinerg kodiert. Obwohl sowohl die primären Antikörper gegen NOS, als auch gegen HuC/D von der Maus stammten, konnte HuC/D „über“ NOS gefärbt werden. Dies war möglich, da durch die fotographische Dokumentation genau nachvollzogen werden konnte (und wurde), welche Neurone durch NOS gefärbt wurden und welche durch HuC/D. Die Existenz einer NOS-positiven, jedoch HuC/D negativen Population wurde in Vorversuchen, in denen eine NADPH-D Färbung nach der HuC/D-Färbung durchgeführt wurde, ausgeschlossen. 1 45 Desweiteren wurde bei je 3 Präparaten pro Tierart überprüft, ob die Summe der cholinergen und nitrergen Neurone zusammen der Anzahl aller Neurone (markiert durch HuC/D) entspricht (Abbildung 4.4). Pro Präparat wurden dazu 300 Neurone ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass bei 900 ausgewerteten Zellen pro Tierart beim Schaf 7 Zellen (=0,77 %), beim Damwild 2 Zellen (=0,22 %) und bei Ziege und Rind je 5 Zellen (=0,55 %) ausschließlich für HuC/D kodierten, ohne zugleich für ChAT oder NOS zu kodieren. Aus den Befunden kann zusammenfassend geschlossen werden, dass alle Neurone in den untersuchten Präparaten entweder einer cholinergen oder einer nitrergen Population zugeordnet werden konnten. Somit konnte beispielsweise die cholinerge Population berechnet werden, wenn die HuC/D-positive und die nitrerge Population bekannt waren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Markierung der nitrergen Neurone mit anschließender Berechnung der cholinergen Population bevorzugt, da ein großer Teil der weiterhin verwendeten primären Antikörper, ebenso wie der ChAT-Antikörper, vom Kaninchen stammte. HuC/D Ziege NADPH-D und HuC/D ChAT 100 µm Abbildung 4.4 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens einer Ziege. Im vorliegenden Beispiel erfolgte zunächst eine Zweifachfärbung mit Antikörpern gegen HuC/D (links) und ChAT (Mitte). Nach fotographischer Dokumentation und Auszählung wurde das Präparat ausgedeckt und mittels NADPH-Diaphorasereaktion erneut gefärbt (rechts). Im linken Bild wurden alle Nervenzellen dieses Ganglions mit dem generellen Neuronenmarker HuC/D markiert. Diese lassen sich in eine cholinerge Population (mittleres Bild) und eine nitrerge Population (im rechten Bild mit Pfeilen markierte dunkle Zellen mit hellem Kern) differenzieren. Die Pfeile im mittleren Bild markieren die Ganglienareale, in denen mittels NADPH-Diaphorasereaktion nitrerge Neurone (rechtes Bild, Pfeile) nachweisbar waren. Bei allen untersuchten Spezies war die Mehrzahl der Neurone cholinerg kodiert (Tabelle 4e). Bei Damwild, Schaf und Rind fanden sich sogar signifikant mehr cholinerge als nitrerge Neurone pro Ganglion. Die Anzahl nitrerger Neurone unterschied sich signifikant zwischen den Spezies. Die höchste Anzahl nitrerger Neurone/Ganglion konnte bei Rind und Ziege nachgewiesen werden, die niedrigste beim Schaf. Pro Ganglion konnte die höchste Anzahl cholinerger Neurone beim Rind, die niedrigste bei der Ziege detektiert werden. 46 Tabelle 4e Anzahl nitrerger und cholinerger Neurone pro Ganglion im Pansen von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Anzahl nitrerger bzw. cholinerger Neurone pro Ganglion zwischen den Spezies. */**: Eine verschiedene Anzahl von Sternen markiert signifikante Unterschiede der Anzahl cholinerger und nitrerger Neurone pro Ganglion innerhalb einer Spezies. (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p<0,001; Faktor B (Anzahl der Neurone) p=0,009; Faktor A x Faktor B p=0,055) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind n=15 N=9 n=13 N=8 n=14 N=9 n=13 N=9 Anzahl nitrerger Neurone pro 23,4±5,3 20,4±8,4 13,4±5,3 23,7±8,4 Ganglion a ab b a * * * * Anzahl cholinerger Neurone 28,8±10,4 33,6±13,3 32,6±11,6 41,3±15,5 pro Ganglien a ab ab b ** ** ** * Auch die relativen Anteile cholinerger und nitrerger Neurone wiesen eine speziesabhängige Größe auf. So war bei der Ziege die Dominanz cholinerger Neurone mit 52±11 % signifikant geringer ausgeprägt als beim Schaf (71±9 %). Die relativen Anteile der nitrergen und cholinergen Populationen von Damwild und Rind lagen zwischen denen der anderen beiden Spezies (Tabelle 4f). Der relative Anteil cholinerger Neurone war bei allen untersuchten Tierarten signifikant höher als der nitrerge Anteil. Tabelle 4f Relative Anteile der nitrergen und cholinergen Neuronenpopulationen im Pansen von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Populationsgrößen zwischen den Tierarten. */**: Eine verschiedene Anzahl von Sternen markiert signifikante Unterschiede zwischen der Größe der nitrergen und der cholinergen Population innerhalb einer Spezies. (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p<0,001; Faktor B (Anteile der Neuronenpopulationen) p=0,876; Faktor A x Faktor B p<0,001) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind n=15 N=9 n=13 N=8 n=14 N=9 n=13 N=9 Relativer Anteil nitrerger 44,4±9,8 38,4±10,2 29,5±8,2 36,9±11,2 Neurone (%) a ab b ab * * * * Relativer Anteil cholinerger 52,4±11,4 61,6±10,9 71,5±9,2 62,1±13,3 Neurone (%) a b c b ** ** ** ** Unterschiede bestanden desweiteren in der Verteilung der nitrergen Neurone innerhalb der Ganglien. Bei Damwild und Schaf fanden sich die nitrergen Neurone fast immer über die gesamte Ganglienfläche verteilt, während sie bei Rind und Ziege zumeist in Gruppen am Rand der Ganglien zu finden waren (Abbildung 4.5). 47 Ziege 100 µm Rind NADPH-D Damwild 100 µM 100 µM NADPH-D Schaf NADPH-D 100 µM NADPH-D Abbildung 4.5 Ganglien aus dem myenterischen Plexus des Pansens von Ziege, Rind, Damwild und Schaf. Die Präparate wurden zunächst gegen HuC/D gefärbt (helle Zellen) und anschließend wurden mittels NADPH-Diaphorasereaktion die nitrergen Neurone markiert (dunkle Zellen mit hellem Kern). Bei Damwild und Schaf (untere Reihe) waren die nitrergen Zellen diffus in den Ganglien verteilt, während sie bei Ziege und Rind (obere Reihe) vornehmlich in Gruppen am Rand der Ganglien zu finden waren. 4.1.2.2 Expression von Neuropeptiden In diesem Ansatz wurden die Expression der Neuropeptide NPY, VIP und SP, sowie ihre Kolokalisationen untereinander und mit ChAT und NOS untersucht. Alle drei Neuropeptide konnten in myenterischen Nervenzellen aller untersuchten Spezies nachgewiesen werden. In Tabelle 4g sind die absolute Anzahl peptiderger Nervenzellen pro Ganglion, sowie deren relativer Anteil entsprechend für die einzelnen Neuropeptide aufgeschlüsselt. Die höchste Expression konnte für SP festgestellt werden, wobei beim Rind die höchste absolute Anzahl SPerger Neurone pro Ganglion nachgewiesen werden konnte. Die absolute Anzahl, sowie die relativen Anteile von NPY- und VIP- immunreaktiven Neuronen waren speziesabhängig signifikant niedriger als die absolute Anzahl und der relative Anteil SP-positiver Nervenzellen. Beim Vergleich der Neuropeptidexpression zwischen den Spezies zeigte sich, dass der relative Anteil der NPY und VIP exprimierenden Neurone beim Schaf signifikant geringer als bei Ziege und Damwild war. 48 Tabelle 4g Expression von VIP, NPY und SP in myenterischen Neuronen des Pansens von Ziege, Damwild, Schaf und Rind. Dargestellt wurden die absolute Anzahl und die relativen Anteile (%) der Neuropeptid-exprimierenden Neurone (Mittelwerte ± Standardabweichungen). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Populationsgrößen zwischen den Spezies. +/++: Eine verschiedene Anzahl von Kreuzen markiert signifikante Unterschiede zwischen der absoluten Anzahl der Neuropeptid-exprimierenden Neurone/Ganglion innerhalb einer Spezies. (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p<0,001; Faktor B (Anzahl Neuropeptid-exprimierender Neurone) p<0,001; Faktor A x Faktor B p=0,637) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). */**: Eine verschiedene Anzahl von Sternen markiert signifikante Unterschiede zwischen den relativen Anteilen Neuropeptid-exprimierender Neurone innerhalb einer Spezies. (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p=0,031; Faktor B (relativer Anteil Neuropeptidexprimierender Neurone) p<0,001; Faktor A x Faktor B p<0,001) mit angeschlossenem StudentNewman-Keuls-Test, p<0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind VIP absolut VIP relativ (%) 25,6±5,0 + n=7 N=4 NPY absolut NPY relativ (%) n=9 N=7 25,3±5,2 + n=9 N=5 SP absolut SP relativ (%) 40,4±9,2 a * 19,1±6,5 + n=11 N=7 41,5±7,2 a * 36,9±12,4 a + 59,3±8,5 ** 36,4±9,7 a * 13,3±6,0 + n=7 N=4 19,6±6,5 + n=8 N=5 n=11 N=5 38,1±7,1 a * 31,1±16,6 a + 58,4±10,9 ** 49 25,7±5,2 b * 24,3±11,0 + n=6 N=5 12,8±6,0 + n=9 N=6 n=11 N=8 27,0±4,5 b * 30,0±15,7 a ++ 67,1±6,8 ** 32,9±9,5 ab * 25,5±9,8 + n=11 N=8 n=12 N=7 36,8±11,9 a * 47,7±18,1 b ++ 64,2±8,3 ** 4.1.2.2.1 Neuropeptide und NOS Bei allen untersuchten Spezies waren NPY und NOS kolokalisiert (Abbildung 4.6). Die Anzahl der Zellen, die nur für NPY, jedoch nicht für NOS kodierten, betrug von 600 ausgewerteten Zellen pro Tierart 5 Zellen (= 0,85 %) beim Schaf, je 4 Zellen (= 0,67 %) bei Damwild und Ziege und 3 Zellen (= 0,5 %) beim Rind. Die Anzahl der Zellen, die für NOS kodierten, ohne auch zugleich NPY-positiv zu sein, betrug je 3 Zellen (= 0,5 %) bei Schaf und Ziege und je 2 Zellen (= 0,33 %) bei Damwild und Rind. Schaf NOS 100 µm NPY Abbildung 4.6 Zweifachfärbung NOS und NPY im myenterischen Plexus des Pansens (Schaf). Antikörper gegen NOS (linke Abbildung) und NPY (rechte Abbildung) markieren dieselben Zellen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass über 99 % der VIP-positiven Neurone NOS exprimierten. Ebenso war die überwiegende Mehrzahl NOS-positiver Neurone auch immunreaktiv für VIP. Nur ein geringer Teil der nitrergen Zellen exprimierte kein VIP (Abbildung 4.7). Damwild NOS VIP 50 µm Abbildung 4.7 Zweifachfärbung NOS und VIP im myenterischen Plexus des Pansens (Damwild). Alle VIP-positiven Zellen (rechte Abbildung) sind auch NOS-positiv (linke Abbildung), während einige nitrerge Zellen kein VIP koexprimieren (Pfeile). 50 Die Anzahl der Zellen, die für VIP kodierten, ohne gleichzeitig auch für NOS zu kodieren betrug von 600 ausgewerteten Zellen pro Tierart je 1 Zelle (= 0,17 %) für Schaf und Rind, 5 Zellen (= 0,83 %) für die Ziege und 0 % für das Damwild. Beim Schaf kodierten 7 Zellen (= 1,17 %), bei Damwild und Ziege je 6 Zellen (= 1 %) und beim Rind 9 Zellen (= 1,5 %) nur für NOS, ohne auch für VIP zu kodieren. VIP war außerdem mit NPY kolokalisiert, wobei nicht alle NPY-positiven Zellen VIP koexprimierten (Abbildung 4.8). Schaf NPY VIP 50 µm Abbildung 4.8 Zweifachfärbung NPY und VIP im myenterischen Plexus des Pansens (Schaf). Antikörper gegen NPY (linke Abbildung) und VIP (rechte Abbildung) markieren größtenteils dieselben Zellen. Allerdings sind einige NPY-positive Zellen nicht auch VIP-positiv (Pfeile). Von 600 untersuchten Zellen pro Spezies waren bei Schaf, Damwild und Ziege jeweils 2 VIP-positive Zellen (= 0,33 %) und beim Rind keine VIP positive Zellen nicht auch gleichzeitig NPY positiv, während bei Schaf und Ziege je 9 Zellen (= 1,5 %), beim Damwild 16 Zellen (= 2,7 %) und beim Rind 13 Zellen (= 2,2 %) für NPY positiv waren, ohne gleichzeitig für VIP zu kodieren. Aus den dargestellten Kolokalisationen von NOS, VIP und NPY ergaben sich die beiden folgenden nitrergen Populationen: eine kleinere Population mit der Kodierung NOS/NPY und eine große Population mit der Kodierung NOS/NPY/VIP (Abbildung 4.9). Damwild NOS VIP NPY 50 µm Abbildung 4.9 Dreifachfärbung NOS, NPY und VIP im myenterischen Plexus des Pansens (Damwild). Da VIP (rechts) immer mit NPY (Mitte) und NOS (links) kolokalisiert ist, haben VIP-positive Neurone die Kodierung NOS/NPY/VIP. Daneben existiert eine kleine Population mit der Kodierung NOS/NPY (Pfeile). 51 4.1.2.2.2 Neuropeptide und ChAT Substanz P wurde von keiner der beiden nitrergen Populationen koexprimiert (Abbildung 4.10 und 4.11). Daraus folgt, dass eine Kolokalisation von SP mit ChAT vorlag. Ziege NOS 100 µm SP Abbildung 4.10 Zweifachfärbung NOS und SP im myenterischen Plexus des Pansens (Ziege). Durch die Antikörper gegen NOS (dünne Pfeile) und SP (Blockpfeil) werden verschiedene Neuronenpopulationen markiert. Von je 600 untersuchten Zellen pro Spezies waren nur je zwei (= 0,33 %) (Schaf, Rind) beziehungsweise je 5 Zellen (= 0,83 %) (Ziege, Damwild) zugleich für SP und NOS immunreaktiv. Bei 600 untersuchten Zellen pro Spezies waren beim Schaf 3 Zellen (= 0,5 %), beim Damwild 5 Zellen (= 0,83 %), beim Rind 1 Zelle (= 0,17 %) und bei der Ziege 0 Zellen (= 0 %) zugleich für NPY und SP kodiert. Schaf NPY SP 100 µm Abbildung 4.11 Zweifachfärbung NPY und SP im myenterischen Plexus des Pansens (Schaf). Antikörper gegen NPY (dünne Pfeile) und SP (Blockpfeile) markieren verschiedene Zellen. Da VIP stets mit NPY koexprimiert wurde, konnte eine Kolokalisation von VIP mit SP ausgeschlossen werden. Somit waren alle SPergen Neurone der cholinergen Population zuzuordnen und wiesen die Kodierung ChAT/SP auf. Zusätzlich zu dieser Population existierte eine kleine, rein cholinerge Population mit der Kodierung ChAT/-. 52 4.1.2.2.3 Neuronenpopulationen Wie in den vorherigen Abschnitten dargelegt, konnten bei allen untersuchten Spezies zwei nitrerge (NOS/NPY/VIP und NOS/NPY) und zwei cholinerge (ChAT/SP und ChAT/-) Neuronenpopulationen detektiert werden (Tabelle 4h). Die Population mit der Kodierung ChAT/SP machte dabei bei allen untersuchten Spezies den signifikant größten Anteil aus. Die zweitgrößte Population hatte – ebenso bei allen untersuchten Spezies – die Kodierung NOS/NPY/VIP und war signifikant größer als die beiden kleinen Populationen NOS/NPY und ChAT/-. Bei den beiden großen Populationen bestanden speziesspezifische Unterschiede. So war die Population mit der Kodierung NOS/NPY/VIP beim Schaf signifikant kleiner als bei der Ziege, während die Population ChAT/SP beim Schaf einen signifikant höheren Anteil als beim Damwild ausmachte. Tabelle 4h Prozentuale Anteile der Hauptneuronenpopulationen im Pansen von Ziege, Damwild, Schaf und Rind (Mittelwerte ± Standardabweichungen; zur Berechnung siehe Punkt 3.2.7). a, b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Populationsgrößen zwischen den Spezies. */**/***: Eine verschiedene Anzahl von Sternen markiert signifikante Unterschiede der Populationsgrößen innerhalb einer Spezies. (Two-Way-ANOVA-Test (Faktor A (Tierart) p=0,393; Faktor B (Neuronenpopulation) p<0,001; Faktor A x Faktor B p=0,005) mit angeschlossenem Student-Newman-Keul-Test, p<0,05). Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Ziege Damwild Schaf Rind NOS/NPY/VIP % n=7 N=5 NOS/NPY % n=8 N=5 ChAT/SP % n=7 N=5 ChAT/- % n=7 N=5 40,4±9,2 a * 2,1±2,1 ** 59,4±4,8 ab *** 4,0±5,1 ** n=6 N=5 n=5 N=4 n=11 N=6 n=11 N=6 35,0±10,4 ab * 2,1±3,6 ** 58,4±10,9 a *** 1,6±1,3 ** 53 n=6 N=6 n=6 N=6 n=11 N=10 n=11 N=10 25,7±5,7 b * 0,7±0,8 ** 67,1±6,8 b *** 4,6±4,6 ** n=6 N=5 n=6 N=5 n=10 N=9 n=10 N=8 32,9±9,5 ab * 3,9±6,8 ** 64,2±8,9 ab *** 5,4±5,4 ** 4.1.2.3 Weiterführende Anfärbungen Zur weiteren Differenzierung der Neuronenpopulationen wurden zusätzlich Antikörper gegen Calbindin (Calb) und Somatostatin (SOM) verwendet. 4.1.2.3.1 Somatostatin Im myenterischen Plexus von Damwild und Schaf konnten sowohl Nervenzellkörper, als auch Nervenfasern mit Antikörpern gegen SOM angefärbt werden. Dagegen fanden sich im myenterischen Plexus von Ziege und Rind (je N=3) nur Somatostatin-positive Nervenfasern (Abb. 4.12). Abbildung 4.12 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens einer Ziege (Somatostatin). Im Pansen von Rind und Ziege konnten zwar SOM-positive Nervenfasern (Pfeile), jedoch keine SOM-positiven Nervenzellen nachgewiesen werden. Ziege SOM 50 µm Antikörper gegen Somatostatin wurden bei Präparaten von 4 Schafen und 5 Tieren Damwild (je 1 Präparat pro Tier) verwendet. Es konnten dabei insgesamt 357 SOM-positive Zellen beim Damwild und 883 SOM-positive Zellen beim Schaf nachgewiesen werden. Die absolute Anzahl SOM-positiver Neurone pro Ganglion betrug 1,6±1,0 beim Schaf und 1,2±1,4 beim Damwild, während der relative Anteil 3,4±2,4 % (Schaf) bzw. 2,8±3,2 % (Damwild) betrug (Mittelwerte ± Standardabweichungen). An drei der Damwild- und vier der Schafpräparate wurden die Kolokalisationen von SOM mit SP und NOS untersucht. Von den dabei untersuchten 70 SOM-positiven Zellen des Damwilds, waren 52 (74 %) mit SP kolokalisiert. Beim Schaf konnten 883 SOM-positive Zellen ausgewertet werden, wobei 749 (85 %) mit SP kolokalisiert waren. Bei beiden untersuchten Spezies konnte keine Kolokalisation von SOM mit NOS festgestellt werden (Abbildung 4.13). Daraus lässt sich schließen, dass bei Damwild und Schaf die SOM-positiven Neurone der cholinergen Population zuzuordnen sind und überwiegend die Kodierung ChAT/SP/SOM aufweisen. 54 Schaf NOS SOM 50 µm Abbildung 4.13 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens eines Schafes. Zweifachfärbung NOS und SOM. Somatostatin-positive Nervenzellen (dünne Pfeile) konnten nur im Pansen von Schaf und Damwild nachgewiesen werden und waren nicht mit NOS (Blockpfeil) kolokalisiert. 4.1.2.3.2 Calbindin Das Vorhandensein von Calbindin in myenterischen Neuronen wurde bei jeweils 4 Präparaten (je N=4) pro Spezies mittels Drei- bzw. Vierfachfärbung untersucht. Neben dem Antikörper gegen Calbindin wurden Antikörper gegen HuC/D, SP und NOS verwendet. Da der Anteil Calbindinpositiver Neurone bei allen untersuchten Spezies nur einen sehr geringen Anteil der Gesamtneurone ausmachte, werden die Ergebnisse abweichend von denen der anderen Anfärbungen dargestellt. Auch bei den mit dem Antikörper gegen Calbindin gefärbten Präparaten, wurden pro Präparat 20 Ganglien ausgezählt. Die Anzahl der Calbindin-positiven Neurone PRO PRÄPARAT (d.h. in 20 Ganglien) betrug für das Schaf 18±10, die Ziege 21±3, das Damwild 36±12 und für das Rind 125±71 (Mittelwerte ± Standardabweichungen). Der relative Anteil der Calbindin-positiven Neurone an der Gesamtpopulation unterschied sich nicht signifikant zwischen den Spezies und betrug bei der Ziege 1,0±1,5 %, beim Damwild 0,9±1,8 %, beim Schaf 0±0 %1 und beim Rind 2,9±1,6 %. Calbindin-positive Neurone fanden sich fast ausschließlich in Ganglien, die aus mehr als 10 Neuronen bestanden. Calbindin-positive Neurone fanden sich bei den vier untersuchten Schafpräparaten in 7, 4, 6 und 6 von 20 Ganglien (d.h. in 6±1 Ganglien pro Präparat, gegenüber 14±5 (Rind), 9±3 (Damwild) und 9±3 Ganglien bei der Ziege (Mittelwerte ± Standardabweichungen). Da zur Berechnung der relativen Anteile der Calbindin-positiven Neurone zunächst Medianwerte (=Calbindin-positive Neurone pro Ganglion) für jedes Präparat (siehe Punkt 3.2.6.) berechnet wurden, und diese (auf Grund der geringen Anzahl von Ganglien, die Calbindin-positive Neurone enthielten) beim Schaf immer 0 waren, ergab sich daraus für das Schaf als - aus den Medianwerten berechnetem - Mittelwert 0±0. 1 55 Abbildung 4.14 Ganglion aus dem myenterischen Plexus des Pansens eines Rindes. Zweifachfärbung Calbindin und SP. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten Spezies, konnte beim Rind bei etwa 60 % der Calbindinpositiven Zellen eine Kolokalisation mit SP aufgezeigt werden (dünne Pfeile). Die restlichen Calbindin-positiven Zellen (Blockpfeil) waren nicht mit SP kolokalisiert. Bei jeweils 3 Präparaten pro Tierart wurde die Kolokalisation von Calbindin mit SP und NOS untersucht. Dabei waren 53±20 % (Ziege), 54±20 % (Damwild), 80±22 % (Schaf) und 37±25 % (Rind) der Calbindin-positiven Neurone weder mit SP noch mit NOS kolokalisiert und hatten somit die Kodierung ChAT/Calb. Eine Kolokalisation mit SP und somit die Kodierung ChAT/SP/Calb konnten bei 36±3 % (Ziege), 18±19 % (Schaf), 23±17 % (Damwild) und 60±24 % (Rind) der Calbindin-positiven Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 4.14). Neurone, die neben Calbindin auch für NOS kodierten, machten mit 6±10 % (Ziege), 21±21 % (Damwild), 2±4 % (Schaf) und 3±6 % (Rind) den geringsten Anteil der Calbindin positiven Neurone aus. Calbindin scheint bei den untersuchten Wiederkäuerspezies somit vorrangig in einer Population mit der Kodierung ChAT/Calb±SP vorzukommen. 56 4.2 Motilitätsuntersuchungen Motilitätsuntersuchungen wurden an TMMP-Präparaten aus dem ventralen Pansensack von Schafen und Ziegen durchgeführt. Diese beiden Spezies wurden gewählt, da sich die verfügbaren Tiere in Größe und Gewicht stark ähnelten. Gleichzeitig konnten bei den neurochemischen Untersuchungen die größten Unterschiede zwischen diesen beiden Spezies festgestellt werden und beide Spezies gehören verschiedenen Ernährungstypen an. Es wurden die Reaktionen der Gewebe auf die Elektrische Feldstimulation vor und nach cholinerger Blockade durch den muskarinergen Antagonisten Atropin untersucht. Entsprechende Untersuchungen erfolgten desweiteren nach nitrerger Blockade mit L-NAME. Zusätzlich wurden DosisWirkungsuntersuchungen mit Carbachol durchgeführt. 4.2.1 Motilitätsmuster unter basalen Bedingungen Für die Untersuchung der basalen Motilität und die Reaktionen auf Elektrische Feldstimulationen wurden Präparate von jeweils zehn Schafen und Ziegen untersucht. In die Auswertung konnten neun Ziegenpräparate von fünf Tieren und elf Schafpräparate von acht Tieren einbezogen werden. Gründe für ein Nichteinbeziehen von Präparaten in die Auswertung waren insbesondere eine fehlende Stimulierbarkeit der Präparate mittels Elektrischer Feldstimulation (7 Präparate von 4 Ziegen und 7 Präparate von 5 Schafen) und das Nichteinstellen eines stabilen Basaltonus während der Äquilibrierungsphase (3 Präparate von 2 Ziegen und 2 Präparate von 2 Schafen). Nach Einbringen in das Organbad und während der Äquilibrierungsphase zeigte ein Teil der Präparate Phasen von Spontanmotilität (3 Ziegen- und 2 Schafpräparate von den später in die Untersuchung eingegangenen Präparaten). Diese war durch kontinuierlich auftretende, phasische Kontraktionen unterschiedlicher Stärke gekennzeichnete. Bei zwei Ziegenpräparaten trat die Phase der Spontanmotilität direkt nach dem Einbringen in das Organbad auf, während sie bei den anderen Ziegen- und den 2 Schafpräparaten erst nach etwa 20 Minuten begannen. Nach 20 bis 50 Minuten verschwand die Spontanmotilität noch während der Äquilibrierungsphase. Dafür stellte sich ein stabiler Basaltonus ein. Bei allen Präparaten, die in die Auswertung der Feldstimulationen einbezogen wurden, wurden vor Zugabe von Atropin beziehungsweise L-NAME drei Kontrollstimulationen im Abstand von jeweils 5 Minuten durchgeführt. Die Antwort auf die Stimulationen unter basalen Bedingungen war in allen Fällen eine Kontraktion (Abbildungen 4.15 und 4.16). Die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Kontraktionsamplituden und Flächen unter den Kurven (AUC) nach Kontrollstimulation sind in Tabelle 4i dargestellt. Weder die maximale Amplitude, noch die AUC der Kontrollstimulationen unterschieden sich zwischen den beiden untersuchten Spezies signifikant. 57 Tabelle 4i Mittlere Kontraktionsamplitude und mittlere Fläche unter der Kurve (AUC) nach Elektrischer Feldstimulation unter basalen Bedingungen bei TMMP-Präparaten aus dem ventralen Pansensack von Ziege und Schaf (Mittelwerte ± Standardabweichungen) (Berechnung siehe Punkt 3.3.2.2). Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Spezies bestand nicht (Mann-Whitney Rank Summentest, p>0,05). Die Anzahl der insgesamt untersuchten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Amplitude nach EFS (mN) AUC nach EFS (MW±SD) (MW±SD) Ziege n=9 N=5 61,7±62,4 562,5±581,8 Schaf 4.2.2 n=11 N=8 48,8±41,6 368,5±342,1 Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin In die Auswertung der Reaktion der Gewebe auf die Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin wurden Proben von 4 Ziegen und 7 Schafen einbezogen. Nach Zugabe von Atropin und einer Äquilibrierungsphase von 15 Minuten wurden die Präparate dreimal im Abstand von jeweils 5 Minuten stimuliert. Dabei zeigte sich bei allen untersuchten Präparaten eine Verringerung beziehungsweise ein Verschwinden der Kontraktionsamplitude nach der Atropinzugabe (Abbildung 4.15). Dabei konnte für alle untersuchten Tiere (7 Präparate von 6 Schafen und 4 Präparate von 4 Ziegen) ein signifikanter Abfall der Kontraktionsamplitude und der Fläche unter der Kurve nach Atropinzugabe festgestellt werden (p<0,05, gepaarter t-Test für jedes der Tiere). In Tabelle 4j sind die mittleren prozentualen Veränderungen der Amplituden und AUC nach Atropinzugabe aufgeführt (zur Berechnung siehe Punkt 3.3.2.2). Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Spezies bestand nicht. Tabelle 4j Höhe der Kontraktionsamplitude und Fläche der AUC nach Atropinzugabe. Ausgedrückt als prozentualer Anteil an den korrespondierenden Kontrollstimulationen (Mittelwerte ± Standardabweichungen). Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Spezies bestand nicht (Mann-Whitney Rank Summentest, p>0,05). Die Anzahl der insgesamt untersuchten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Fläche der AUC nach Höhe der Kontraktionsamplitude Atropinzugabe nach Atropinzugabe (als % der AUC nach (als % der Kontrollamplitude) Kontrollstimulation) (MW±SD) (MW±SD) n=4 Ziege 8,4±11,4 1,2 ±2 N=4 n=7 Schaf 2,2±1,2 0,3±0,3 N=6 58 Kontraktionskraft [mN] Kontraktionskraft [mN] Zeit [min:s] Kontraktionskraft [mN] Zeit [min:s] Zeit [h:min:s] Abbildung 4.15 Reaktion von TMMP-Präparaten von Ziege (obere Reihe) und Schaf (untere Reihe) auf Elektrische Feldstimulation vor und nach Atropinzugabe. Jeweils links ist eine Kontrollstimulation, rechts die Antwort auf eine EFS nach Atropinzugabe abgebildet. Nach Atropinzugabe waren keine bzw. nur noch schwache Kontraktionen auslösbar. Die gestrichelte Linie markiert den Beginn der Feldstimulation. x-Achse: Zeit in Stunden:Minuten:Sekunden; y-Achse Kontraktionskraft in mN. 59 4.2.3 Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von L-NAME In die Auswertung wurden Gewebestücke aus dem Pansen von 5 Ziegen und 4 Schafen einbezogen. Nach Zugabe von L-NAME und einer 15 minütigen Äquilibrierungsphase wurden die Präparate je dreimal im Abstand von 5 Minuten elektrisch feldstimuliert. Hierbei zeigten alle untersuchten Präparate eine höhere Kontraktionsamplitude als vor Zugabe von L-NAME (Abbildung 4.16). Zum Teil wurden die initial ausgelösten Kontraktionen von einigen kleineren Kontraktionen gefolgt. Bei 4 Präparaten von 4 Ziegen und bei 4 Präparate von 4 Schafen war die Zunahme der Kontraktionsamplitude und der AUC nach L-NAME Zugabe signifikant (p<0,05, gepaarter t-Test für jedes Tier). Bei einem Ziegenpräparat war der Unterschied nicht signifikant. In Tabelle 4k sind die mittleren prozentualen Veränderungen der Amplituden und AUC nach LNAME Zugabe gegenüber den Kontrollstimulationen aufgeführt (zur Berechnung siehe auch Punkt 3.3.2.2). Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Spezies bestand nicht (t-Test, p>0,05). Tabelle 4k Anstieg der Kontraktionsamplituden und Zunahme der AUC nach L-NAME-Zugabe. Ausgedrückt als prozentualer Anstieg gegenüber den korrespondierenden Kontrollstimulationen (Mittelwerte ± Standardabweichungen). Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden untersuchten Spezies bestand nicht (t-Test, p>0,05). Die Anzahl der insgesamt untersuchten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. Prozentualer Anstieg der Prozentuale Zunahme der AUC Kontraktionsamplitude nach L-NAME Zugabe nach L-NAME-Zugabe (MW±SD in %) (MW±SD in %) Ziege n=5 243,9±122,1 259,1±136,0 N=5 Schaf n=4 367,1±153,1 556,5±148,7 N=4 60 Kontraktionskraft [mN] Kontraktionskraft [mN] Zeit [h:min:s] Kontraktionskraft [mN] Kontraktionskraft [mN] Zeit [h:min:s] Zeit [h:min:s] Zeit [h:min:s] Abbildung 4.16 Reaktion von TMMP-Präparaten aus dem ventralen Pansensack von Ziege (obere Reihe) und Schaf (untere Reihe) auf Elektrische Feldstimulation vor und nach Zugabe von L-NAME. Jeweils links ist eine Kontrollstimulation, rechts die Antwort auf eine EFS nach Zugabe von L-NAME abgebildet. Nach Zugabe von L-NAME führten die EFS zu deutlich stärkeren Kontraktionen. Die gestrichelte Linie markiert den Beginn der Feldstimulation. x-Achse: Zeit in Stunden:Minuten:Sekunden; y-Achse Kontraktionskraft in mN. 61 4.3 Dosis-Wirkungsuntersuchungen von Carbachol Zur Bestimmung der Dosis-Wirkungskurve von Carbachol wurden 13 Präparate von 10 Ziegen und 15 Präparate von 10 Schafen untersucht. Nach Äqulibrierung der Präparate und Bestimmung des Basaltonus erfolgte alle 5 Minuten die Zugabe von Carbachol, wobei die Endkonzentrationen im Organbad 0,01; 0,1; 1; 10 und 100 µmol/l betrugen. Die Gewebe reagierten auf die Zugabe von Carbachol mit deutlichen Kontraktionen (Abbildung 4.17, Kontraktionskraft [mN] Tabelle 4l). Zeit [h:min:s] Abbildung 4.17 Reaktion eines TMMP-Präparates aus dem ventralen Pansensack eines Schafes auf Zugabe steigender Konzentrationen von Carbachol. Die Reaktion zeigte sich durch Zunahme des Muskeltonus und durch steigende Kontraktionskraft. x-Achse: Zeit in Stunden:Minuten:Sekunden; y-Achse Kontraktionskraft in mN. Die Zugabe wurde unterbrochen, wenn die Kontraktionen des Gewebes so stark wurden, dass diese außerhalb des Messbereiches (>250 mN) gelangten. Gewebe, das bereits bei einer Carbacholkonzentration von 0,1 µmol/l so heftig kontrahierten, dass es außerhalb des Messbereichs gelangte, wurde nicht mit in die Auswertung einbezogen. Dies betraf 6 Präparate von 5 Ziegen und 6 Präparate von 3 Schafen (Tabelle 4l). Es wurde jeweils die höchste Kontraktionsamplitude bei jeder verwendeten Carbacholkonzentration bestimmt. Aus diesen Werten wurden die Mittelwerte mit Standardabweichungen (Abbildung 4.18 und Tabelle 4l) der beiden Spezies ermittelt und mittels t-Test verglichen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kontraktionsamplituden bei gleicher Carbacholkonzentration zwischen den untersuchten Spezies festgestellt werden (p>0,05). 62 Anstieg der Kontraktionsamplitude [mN] Dosis-Wirkungskurve Carbachol 250 200 150 100 50 0 0,01 0,1 1 10 100 Carbacholkonzentration [µmol/l] Ziege Schaf Abbildung 4.18 Dosis-Wirkungskurve Carbachol für TMMP-Präparate aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege (Mittelwerte ± Standardabweichungen). (Zahlenwerte und Angaben zur Anzahl der jeweils ausgewerteten Präparate sind in Tabelle 4l angegeben). Tendenziell schien die Ziege jedoch auf steigende Carbacholkonzentrationen mit stärkeren Kontraktionen als das Schaf zu reagieren. Dies zeigte sich darin, das bei der Ziege bereits 4 von 7 Präparaten bei Zugabe von 10 µmol Carbachol außerhalb des Messbereichs gerieten, während es beim Schaf nur 2 von 9 Präparaten waren und bei der Ziege nur 2 von 7 Präparaten bei der Endkonzentration von 100 µmol Carbachol im Messbereich blieben, während es beim Schaf 4 von 9 Präparaten waren (Tabelle 4l). 63 Tabelle 4l Basaltonus und maximale Kontraktionsamplituden von (Zirkulär-)TMMP-Präparaten aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege nach Zugabe steigender Carbacholkonzentrationen. Die Zahlenwerte (in mN) stellen jeweils die Differenz zwischen dem Basaltonus und der maximal gemessenen Kontraktionskraft bei der entsprechenden Carbacholkonzentration dar. Überschritt die maximal gemessene Kontraktionskraft den Messbereich, wurde die Messung abgebrochen (a.M. = außerhalb des Messbereichs). Zwischen den Spezies konnten keine signifikanten Unterschiede des Basaltonus und zwischen den Kontraktionsamplituden bei gleicher Carbacholkonzentration (0,01 µmol/l bis 10 µmol/l) festgestellt werden (t-Test, p>0,05). Fettgedruckt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen für die beiden untersuchten Tierarten dargestellt. Die Anzahl der insgesamt ausgewerteten Präparate wird durch n angegeben. N entspricht der Anzahl der Tiere, von denen die Präparate gewonnen wurden. * Der Mittelwert und die Standardabweichung für 100 µmol/l wurden beim Schaf aus den 4 vorhandenen Messwerten berechnet. ** Die Standardabweichung konnte für die Ziege für die Carbacholkonzentration von 100 µmol/l nicht berechnet werden, da hier nur zwei Messwerte vorlagen. Anstieg der mittleren Kontraktionsamplitude (in mN) bei einer Carbacholkonzentration von Basaltonus (mN) 0,01 0,1 1 10 100 µmol/l µmol/l µmol/l µmol/l µmol/l Schaf 1 45,0 7,4 17,0 70,0 112,4 129,6 Schaf 2 68,0 5,7 8,1 66,9 99,3 103,1 Schaf 3 (n=2) 52,1 4,4 14,7 76,6 105,8 a.M./51,7 Schaf 4 (n=2) 81,3 4,0 4,7 51,1 102,9 a.M./43,4 Schaf 5 36,4 2,2 12,2 172,9 a.M. a.M. Schaf 6 106,4 2,3 3,2 63,1 176,3 a.M. Schaf 7 31,7 1,4 14,1 145,2 a.M. a.M. Schafe 60,1±26,8 3,9±2,2 10,6±5,3 92,3±47,0 119,4±32,2 81,9±41,3* (MW±SD) n=9 N=7 n=9 N=7 n=9 N=7 n=9 N=7 n=7 N=5 n=4 N=4 Ziege 1 30,9 1,1 26,3 170,9 a.M. a.M. Ziege 2 52,8 7,4 7,4 197,5 a.M. a.M. Ziege 3 (n=2) 71,5 7,25 43,9 208,7 a.M. a.M. Ziege 4 66,3 3,5 4,1 86,8 164,8 a.M. Ziege 5 37,7 2,4 13,9 50,3 78,9 137,9 Ziege 6 34,1 6,1 9,3 22,6 70,9 107,4 Ziegen 48,9±17,0 4,6±2,7 17,5±15,1 122,8±79,8 104,9±52,0 122,6 ** (MW±SD) n=7 N=6 n=7 N=6 n=7 N=6 n=7 N=5 n=3 N=3 n=2 N=2 64 5 Diskussion In dieser Studie wurde die intrinsische Innervation des Pansens bei Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen untersucht. Dazu erfolgten immun- und enzymhistochemische Untersuchungen zur nervalen Kodierung an Präparaten des myenterischen Plexus von Damwild, Schaf, Ziege und Rind; sowie Motilitätsuntersuchungen an TMMP-Präparaten aus dem ventralen Pansensack von Schafen und Ziegen. Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Bei allen untersuchten Spezies konnte ein ganglionierter Plexus myentericus nachgewiesen werden. 2. Die Gangliendichte unterschied sich zwischen den untersuchten Spezies. Das Damwild wies die höchste, das Rind die geringste Gangliendichte auf. 3. Die Gangliengröße differierte zwischen den untersuchten Spezies. Die höchste mittlere Gangliengröße fand sich beim Rind. Auch der Anteil der Ganglien einer bestimmten Größe war speziesabhängig. 4. Bei keiner der untersuchten Spezies bestanden signifikante Unterschiede bezüglich der Gangliendichte und –größe zwischen den beiden untersuchten Lokalisationen ventraler Pansensack und dorsaler Blindsack. 5. Die Neuronendichte (Neurone/cm²) im ventralen Pansensack war bei Ziege und Damwild (Intermediärtypen) signifikant höher als beim Schaf (Rauhfutterfresser). Zwischen ventralem und dorsalem Pansensack differierte die Neuronendichte nur beim Damwild signifikant. 6. Alle Neurone konnten entweder einer cholinergen oder einer nitrergen Population zugeordnet werden. Die Kodierung der myenterischen Neurone war bei allen untersuchten Spezies überwiegend cholinerg. Die Verteilung der nitrergen Neurone in den Ganglien variierte zwischen den Spezies. 7. Die Ausprägung der exzitatorischen und inhibitorischen Innervation korrelierte bei den kleinen Wiederkäuerspezies mit dem Ernährungstyp. Dabei war der relative Anteil cholinerger Neurone beim Schaf (Rauhfutterfresser) signifikant höher als bei Damwild und Ziege (beide Intermediärtyp). Der relative Anteil nitrerger Neurone war bei der Ziege signifikant höher als beim Schaf. 8. Auch bezüglich der Neuropeptidexpression bestanden Unterschiede zwischen den Spezies. Der relative Anteil der VIP und NPY exprimierenden Neurone war bei Ziege und Damwild signifikant höher als beim Schaf. Der Anteil SP exprimierender Neurone differierte zwischen den untersuchten Wiederkäuern nicht. 9. Bei allen untersuchten Spezies konnten zwei große Neuronenpopulationen mit der Kodierung ChAT/SP und NOS/NPY/VIP, sowie zwei kleine Neuronenpopulationen mit der Kodierung ChAT/und NOS/NPY nachgewiesen werden. 10. Somatostatin-positive Neurone konnten im myenterischen Plexus von Damwild und Schaf nachgewiesen werden. Somatostatin war nicht mit NOS kolokalisiert, weshalb SOM-positive Neurone der cholinergen Population zugeordnet werden konnten. 65 11. Calbindin konnte nur in einem kleinen Teil der Neurone nachgewiesen werden. Es war größtenteils mit ChAT kolokalisiert. 12. Mittels Elektrischer Feldstimulation ließen sich an Zirkulärmuskel-(TMMP)-präparaten aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege Kontraktionen auslösen. 13. Atropin reduzierte die durch Elektrische Feldstimulationen auslösbaren Kontraktionen signifikant. Somit waren die Kontraktionen vorrangig cholinerg bedingt. Durch den NO-Synthesehemmer L-NAME wurden die durch Elektrische Feldstimulationen ausgelösten Kontraktionen signifikant verstärkt. 14. Carbachol wirkte dosisabhängig motilitätssteigernd. 15. Es konnten bei diesen Untersuchungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich der in-vitro Motilität zwischen Schaf und Ziege aufgezeigt werden. 5.1 Allgemeine Methodenkritik Die Methode der immunhistochemischen Klassifizierung enterischer Neurone beruht auf der Nutzung von Antikörpern gegen neuronale Marker wie Neurotransmitter, Rezeptoren, Zytoskelettproteine oder Enzyme (SAYEGH und RITTER 2003). Dabei ergibt sich das Problem, dass enterische Neuropeptide vorrangig in Axonen und Terminalen zu finden, und somit in den Nervenzellsomata oftmals zu gering konzentriert sind, um immunhistochemisch nachgewiesen zu werden. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte in unmittelbar nach der Probenentnahme fixiertem Pansengewebe von Rind, Schaf, Damwild und Ziege keine ausreichende Darstellung der Neuropeptide erreicht werden. Deshalb wurde das Gewebe für die Neuropeptiddarstellung unter Colchizinzusatz kultiviert. Der Zusatz von Colchizin zum Kulturmedium führt zu einer Blockade des axonalen Transports von Neuropeptiden und somit zu deren Anreicherung im Zellsoma (EKBLAD et al. 1996). Diese „chemische Axotomie“ ermöglicht eine verbesserte immunhistochemischen Darstellung der Neuropeptide (COSTA et al. 1986). Allerdings ist bekannt, dass der Zusatz von Colchizin auch zu einer veränderten Neuropeptidexpression führen kann. EKBLAD et al. (1996) wiesen beispielsweise einen durch Colchizin bedingten Anstieg von VIP-synthetisierenden, myenterischen und submukösen Neuronen bei der Ratte nach. Demgegenüber blieb die Anzahl der Neurone, die immunreaktiv für NOS oder NPY waren, trotz der Colchizinbehandlung unverändert. Diesbezügliche Untersuchungen liegen für Wiederkäuer bisher nicht vor. Da in der vorliegenden Arbeit jedoch die Gewebe aus allen Lokalisationen und von allen untersuchten Spezies mit Colchizin behandelt wurden, kann von einer Vergleichbarkeit der ermittelten Werte ausgegangen werden. In dieser Arbeit wurde die Methode des Mehrfachlabelings genutzt, die bei verschiedenen Spezies und Geweben seit Jahren etabliert ist (z.B. ACCILI et al. 1995 im Jejunum von Hund und Mensch, SANG und YOUNG 1996 im Darm der Maus, LI und FURNESS 1998 im Ileum des Meerschweinchens, HENS et al. 2000 im Dünndarm des Schweins und PFANNKUCHE et al. 2003a in Schlundrinne und Haube des Schafes). Durch die simultane Verwendung mehrerer primärer Antikörper, die von 66 verschiedenen Spezies stammen, wird die Bestimmung von Kolokalisationen und daraus resultierend die Unterscheidung von Neuronenpopulationen erst möglich. Bei der Verwendung der sekundären Fluorochrome wurde darauf geachtet, dass diese keine Überschneidungen in ihren Emissionsspektren aufwiesen (siehe Punkt 3.2.5). Um weitere Informationen zu gewinnen, wurden die Gewebe zum Teil nach ihrer Auswertung und fotographischen Dokumentation erneut gefärbt. Auch diese Methode wurde bereits etabliert (z.B. REICHE und SCHEMANN 1999, MICHEL et al. 2000, PFANNKUCHE et al. 2003a). Die auf diese Weise gewonnenen Daten waren mit den durch Einfach- oder Zweifachfärbung gewonnenen Werten vergleichbar. Zusätzlich erfolgte eine Überprüfung der Färbungen mit Hilfe der fotographischen Dokumentation. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die mittels zweimaliger Färbung gewonnenen Daten keinen größeren Fehler als die mittels einmaliger Färbung gewonnenen Werte aufwiesen. Die mit NOS immunhistochemisch und/oder mit NADPH-D enzymhistochemisch markierten Neurone wurden als nitrerge Population gewertet. Dies stützt sich auf Vorversuche, in denen gezeigt werden konnte, dass NOS und NADPH-D dieselben Nervenzellen markieren. Auch das deckt sich mit Ergebnissen von anderen Spezies wie Ratte, Hamster, Maus, Katze, Schwein, Rind und Mensch (BELAI et al. 1992, EKBLAD et al.1994, WARD et al. 1994, VANDEN BERGHE et al. 1999, VITTORIA et al. 2000). Nach Berechnung der relativen Anteile der mit den Antikörpern gegen ChAT, NOS, NPY, VIP, und SP markierten Neurone an der mit HuC/D markierten Gesamtneuronenpopulation wurden - mit Hilfe der aus den Kolokalisationsuntersuchungen gewonnenen Erkenntnisse - die Neuronenpopulationen berechnet (siehe Punkt 3.2.7). Die Population mit der Kodierung ChAT/- ergab sich nach Abzug der nitrergen und SPergen Neurone von der mittels HuC/D ermittelten Gesamtneuronenzahl, beziehungsweise durch Abzug der SPergen Neurone von den cholinergen Neuronen. Somit erfolgte die Berechnung der rein cholinergen Population nur bei Präparaten mit der Dreifachfärbung HuC/D, NOS und SP, sowie bei Präparaten, die sowohl mit dem Antikörper gegen ChAT, als auch gegen SP und HuC/D angefärbt worden waren. Dementsprechend wurde die rein cholinerge Population nicht bei allen insgesamt mit den Antikörpern gegen ChAT oder SP markierten Präparaten bestimmt. Dies erklärt den vermeintlich höheren Anteil SPerger Neurone bei Rind und Ziege in Tabelle 4g gegenüber dem Anteil cholinerger Neuronen in Tabelle 4f. Von Ratten ist bekannt, dass die Aufnahme hoher Energiemengen zu einem Verlust enterischer cholinerger Neurone, und somit zu einem relativ höheren Anteil nitrerger Neurone führt (COWEN et al. 2000). Ob ein solcher direkter Einfluss des Energiegehalts bzw. der Zusammensetzung der Diät auch bei adulten Wiederkäuern besteht (und in welchem Zeitraum sich dieser manifestiert), ist bisher 67 völlig unklar. Sollte ein solcher Einfluss beim adulten Wiederkäuer jedoch bestehen, so könnten die in dieser Arbeit erhobenen Daten dadurch beeinflusst worden sein. Dies gilt insbesondere für die Rinderdaten, da es sich bei den verwendeten Tieren um Milchkühe und Mastbullen einer Hochleistungsmilchrasse handelte, die (um eine entsprechende Leistung erbringen zu können) sehr energie-(und damit konzentrat-)reich gefüttert werden müssen. Demnach würden die bei den Rindern erhobenen Daten vorrangig den genetischen Einfluss auf die intrinsische Innervation bei der heute üblichen (Milchvieh-)Fütterung reflektieren, und nicht den Ernährungstyp Rauhfutterfresser bei ernährungstypgerechter Fütterung (siehe auch Punkt 5.3.1). Bei den untersuchten kleinen Wiederkäuern dürfte ein möglicher direkter diätetischer Einfluss auf die intrinsische Innervation demgegenüber deutlich geringer ausgefallen sein. Auch wenn nur wenige Angaben über die Fütterung der verwendeten Tiere vorliegen, scheinen die Schafe und das Damwild doch annähernd ernährungstypgerecht gefüttert worden zu sein. Die verwendeten Ziegen wurden deutlich Kraftfutter(und damit Konzentrat-)reicher als die Schafe und das Damwild ernährt, wodurch auch hier zumindest eine Annäherung an eine ernährungstypgerechte Fütterung gegeben war. Die Methodenkritik zur angewandten Methode der Elektrischen Feldstimulation und zu den Motilitätsuntersuchungen mit Carbachol erfolgt im zweiten Teil dieses Kapitels in Verbindung mit der Diskussion der entsprechenden Ergebnisse. 5.2 Allgemeine Innervationsmuster im Vormagen verschiedener Wiederkäuerspezies Durch die mit dem Antikörper gegen HuC/D durchgeführte Färbung wurden alle Neurone dargestellt. So konnten zunächst allgemeine Innervationsmerkmale wie die Größe und Dichte der Ganglien untersucht werden. Das RNA-bindende Protein HuC/D gilt als spezifischer Neuronenmarker (GRAUS et al. 1985, LIN et al. 2002) und wurde bereits in verschiedenen Studien zur Markierung enterischer Neurone verwendet (z.B. LIN et al. 2002, PHILLIPS et al. 2004). Sein Vorteil gegenüber dem in einigen anderen Untersuchungen (z.B. KITAMURA et al. 1986, RÖSCH 2003) verwendeten Marker Neuronenspezifische Enolase (NSE) besteht darin, dass mittels HuC/D nur die Somata, nicht jedoch die Nervenzellfortsätze angefärbt werden. Dies erleichtert die quantitative Auswertung. 5.2.1 Neuronendichte und Größe und Dichte myenterischer Ganglien In diesem Teil der Arbeit wurden die Parameter Gangliengröße (Anzahl der Neurone/Ganglion), Gangliendichte (Anzahl der Ganglien/cm²) und Neuronendichte (Anzahl der Neurone/cm²) zusätzlich zum ventralen Pansensack auch im dorsalen Blindsack untersucht. Diese zweite (räumlich weit vom ventralen Pansensack entfernte) Lokalisation wurde gewählt, um Informationen über die enterische Innervation an verschiedenen Stellen des Pansens zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass die Gangliengröße und –dichte zwischen ventralem Pansensack und dorsalem Blindsack nicht differiert. Auch die Neuronendichte zeigte bei Rind, Schaf und Ziege keine 68 signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Lokalisationen. Nur beim Damwild konnte im dorsalen Blindsack eine – im Vergleich zum ventralen Pansensack - signifikant geringere Neuronenzahl pro cm² gefunden werden. Bei Rind, Schaf und Ziege scheint die enterische Innervation somit – zumindest quantitativ – gleichmäßig im Pansen ausgebildet zu sein. Von anderen Spezies ist bekannt, dass die enterische Innervation nicht nur zwischen verschiedenen gastrointestinalen Bereichen, sondern durchaus auch innerhalb eines Abschnittes des Gastrointestinaltraktes variieren kann. Beispielsweise unterscheidet sich bei Lämmern die Gangliengröße und –dichte zwischen ventralem Pansensack, Haube und Schlundrinne (RÖSCH 2003). Im Meerschweinchenmagen bestehen Unterschiede in den Populationsgrößen der cholinergen Nervenzellen zwischen Korpus und Antrum (SCHEMANN et al. 1995, VANDEN BERGHE et al. 1999). Ursachen für die erwähnten Unterschiede könnten in den unterschiedlichen Funktionen der genannten Abschnitte des Gastrointestinaltraktes begründet sein. Solche funktionellen Unterschiede scheinen innerhalb des Pansens entweder nicht vorhanden zu sein, oder in der Innervationsdichte nicht reflektiert zu werden. Allerdings ist bemerkenswert, dass der einzige signifikante Unterschied der allgemeinen Innervationsmerkmale bei einem Vertreter des Intermediärtyps (Damwild) zu finden war. Nach HOFMANN und SCHNORR (1982) ist der Pansen bei Vertretern dieses Ernährungstyps (gegenüber dem stark gekammerten Pansen der Rauhfutterfresser) nur wenig differenziert. Somit wären Unterschiede in der enterischen Innervation eher bei Schaf oder Rind zu erwarten gewesen. Da im dorsalen Blindsack die Kodierung der Neurone jedoch nicht näher untersucht wurde und auch Daten zu anderen Pansenteilen bisher fehlen, sollte dies Anlass für weiterführende Untersuchungen sein. Die Größe der Ganglien zeigte bei allen untersuchten Spezies eine große Variationsbreite von 2 bis über 700 Neuronen pro Ganglion. Insgesamt fanden sich mehr kleine und mittelgroße Ganglien. Auffällig war der relativ hohe Anteil sehr großer Ganglien (mit >400 Neuronen) beim Rind, welches mit 73±6 Neuronen/Ganglion auch die höchste mittlere Gangliengröße der untersuchten Spezies aufwies. Demgegenüber fand sich beim Schaf die geringste mittlere Gangliengröße mit 45±18 Neuronen/Ganglion. Allerdings fanden sich beim Schaf mit 3,3 % mehr sehr große Ganglien als bei Damwild (1,5 %) und Ziege (1,3 %). Die Ursache für die geringste mittlere Gangliengröße bei gleichzeitig hohem Anteil sehr großer Ganglien beim Schaf liegt darin begründet, dass bei dieser Spezies die (signifikant) höchsten Anteile kleiner Ganglien (19,7 % der Ganglien des Schafen bestanden aus 1-10 Neuronen und 17,1 % aus 11-20 Neuronen) nachgewiesen werden konnten. GABELLA postulierte 1990, dass ein Zusammenhang zwischen der (mittleren) Gangliengröße und der Körpergröße bestehe. Dabei stützte er sich auf vergleichende Untersuchungen am Dünndarm von Mäusen, Meerschweinchen und Schafen. Auch in der vorliegenden Studie konnte die höchste mittlere Gangliengröße beim Rind, der größten untersuchten Spezies, gefunden werden. Demgegenüber waren die mittleren Gangliengrößen von Schaf, Damwild und Ziege signifikant geringer. GABELLA (1990) 69 fand desweiteren heraus, dass die Gesamtzahl der myenterischen Neurone weder zur Größe des Tieres, noch zur Länge des Dünndarms oder zur Masse der Muskulatur proportional ist. Allerdings fand er beim Schaf (dessen Gesamtpopulation myenterischer Neurone bei den untersuchten Spezies am höchsten war, während die Neuronendichte gleichzeitig am geringsten war), dass sich die Neurone in großen, zum Teil aus mehreren hundert Neuronen bestehenden Ganglien fanden – während bei der Maus genau das Gegenteil der Fall war. Zunächst schien die vorliegende Untersuchung dies zu bestätigen – konnte doch beim Rind die höchste mittlere Gangliengröße und die geringste Gangliendichte nachgewiesen werden. Erwartungsgemäß hätten die entsprechenden Werte für die – in Größe und Gewicht durchaus vergleichbaren – untersuchten kleinen Wiederkäuerspezies auch untereinander vergleichbar sein sollen, bei einer geringeren mittleren Gangliengröße und einer höheren Gangliendichte als den beim Rind gefundenen Werten. Allerdings fanden sich bei den kleinen Wiederkäuerspezies nicht unerhebliche Unterschiede. Auffällig war hier insbesondere die extrem hohe (14,6±3,3 Ganglien/cm²) Gangliendichte des Damwildes. Die Unterschiede der Innervationsdichte werden bei Betrachtung der mittleren Anzahl der Neurone/cm² (d.h. der Neuronendichte) besonders deutlich. Diese wurde durch Multiplikation von mittlerer Gangliendichte (Ganglien/cm²) und mittlerer Gangliengröße (Neurone/Ganglion) ermittelt. Die mittlere Neuronenzahl pro cm² war demnach beim Damwild mit 664±194 Neuronen pro cm² doppelt so hoch wie beim Schaf, das über durchschnittlich 289±132 Neurone/cm² verfügte. Auch die Ziege hatte mit 584±295 Neuronen/cm² eine signifikant höhere Neuronendichte als das Schaf, während die Neuronendichte des Rindes mit 432±238 Neuronen/cm² zwischen denen der anderen Spezies lag. Somit scheinen (zumindest im Pansen) weitere Faktoren als die Körpergröße und –masse eine Rolle für die Innervationsdichte zu spielen. Die Gangliengröße und –dichte des Vormagens ist altersabhängigen Veränderungen unterworfen. So wiesen in der Arbeit von RÖSCH (2003) die Ganglien im Pansen von Mastlämmern nur 1/3 der Größe (Neurone/Ganglion) der Ganglien von Sauglämmern auf. Allerdings fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den von RÖSCH (2003) an Mastlämmern und von PFANNKUCHE et al. (2003b) und mir ermittelten Werten der Gangliengrößen im Pansen adulter Schafe. Wenngleich die Alterungsprozesse im myenterischen Plexus des Vormagens noch wenig untersucht sind, scheint sich damit die Annahme von PFANNKUCHE et al. (2003b) zu bestätigen, dass die größten Veränderungen beim Übergang vom nicht-ruminierenden Jungtier zum ruminierenden adulten Wiederkäuer stattfinden und durch die – beim Wiederkäuer einzigartigen – Veränderungen der Funktion und damit auch der Morphologie des Vormagensystems bedingt sind. Bei den vorliegenden Untersuchungen wurden nur Proben von ruminierenden, sich in ihrer Altersstruktur stark ähnelnden Tieren verwendet, weshalb altersbedingte Veränderungen der Innervationsdichte keine Rolle gespielt haben dürften. 70 Daraus ergibt sich die Frage, warum das Damwild (und in etwas geringerem Maße auch die Ziege) über eine so extrem hohe, und das Schaf über eine so geringe Innervationsdichte in den untersuchten Pansenlokalisationen verfügt. So fanden sich beim Schaf beispielsweise signifikant mehr sehr kleine (aus 1-10 und 11-20 Neuronen bestehende) und mehr sehr große (aus >400 Neuronen zusammengesetzte) Ganglien als bei Damwild und Ziege (als Vertreter des Intermediärtyps), während sich bei diesen mehr mittelgroße Ganglien als beim Schaf fanden. Eine mögliche Antwort wäre eine differierende Organisation und Verschaltung des myenterischen Plexus, die zumindest bei den kleinen Wiederkäuern mit dem Ernährungstyp zu korrelieren scheint. 5.3 Neurochemische Kodierung myenterischer Pansenneurone 5.3.1 Cholinerge und nitrerge Neurone Zur Untersuchung der neurochemischen Kodierung wurden alle mit HuC/D markierten myenterischen Neurone zunächst in den frischfixierten Präparaten auf das Vorkommen der Syntheseenzyme ChAT und NOS (bzw. der NADPH-Diaphorase) überprüft. Bei der Cholinazetyltransferase (ChAT) handelt es sich um das Syntheseenzym für den exzitatorischen Transmitter Azetylcholin. Die Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) ist das Syntheseenzym für den inhibitorischen Transmitter Stickstoffmonoxid (NO). Vom Pansen des Schafes, dem Labmagen des Rindes, sowie aus dem Gastrointestinaltrakt monogastrischer Spezies ist bereits bekannt, dass alle myenterischen Neurone einer cholinergen oder einer nitrergen Population angehören (SCHEMANN et al. 1995, COSTA et al. 1996, VANDEN BERGHE et al. 1999, LOMAX und FURNESS 2000, BROOKES 2001a, PFANNKUCHE et al. 2002a und 2002b). Diese strikte Trennung der Neurone in eine inhibitorische nitrerge und eine exzitatorische cholinerge Population scheint ein allgemeines Prinzip im myenterischen Plexus des ENS zu sein und konnte auch für den Pansen der untersuchten Spezies bestätigt werden. In der vorliegenden Untersuchung wurden speziesspezifische Unterschiede bezüglich der Verteilung der nitrergen Neurone in den myenterischen Ganglien festgestellt. Bei den Untersuchungen fiel auf, dass diese bei den einzelnen Spezies charakteristische Verteilungsmuster innerhalb der Ganglien zeigten. So fanden sich die nitrergen Neurone beim Rind – und weniger ausgeprägt bei der Ziege – in Clustern angeordnet am Rand der Ganglien, während sie bei Schaf und Damwild diffus über die Ganglien verteilt erschienen. Die Anordnung nitrerger Neurone in Clustern wurde bereits für das Rind beschrieben (VITTORIA et al. 2000) und findet sich auch bei Ratte und Meerschweinchen (EKBLAD et al. 1994). Ob durch die unterschiedliche Anordnung der nitrergen Neurone in den Ganglien andere Verschaltungswege entstehen oder ob es sich hier um einen Zufallsbefund ohne funktionelle Konsequenzen handelt, bleibt zu ermitteln. 71 Bei allen untersuchten Spezies war der Anteil der cholinerg kodierten Neurone an der Gesamtneuronenpopulation höher als der Anteil der nitrerg kodierten Neurone. Auch dies ist bereits aus weiten Teilen des Gastrointestinaltraktes von Monogastriern und zum Teil auch von Rind und Schaf bekannt (STEELE et al. 1991, SCHEMANN et al. 1995, VANDEN BERGHE et al. 1999, PFANNKUCHE et al. 2002b). Die relativen Anteile der nitrerg (und somit inhibitorisch) und cholinerg (exzitatorisch) kodierten Neurone an der Gesamtpopulation variierten zwischen den untersuchten Spezies. Dabei fiel insbesondere der signifikant höhere Anteil nitrerger Neurone bei der Ziege (44±10 %) gegenüber dem Schaf (30±8 %) auf. Korrespondierende Unterschiede fanden sich auch bei den mit NOS kolokalisierten Neuropeptiden NPY und VIP. Es liegt nahe, hier einen Einfluss des Ernährungstyps und somit der mechanischen Eigenschaften des bevorzugten Futters zu sehen. Das Schaf – als Rauhfutterfresser – nimmt besonders große Mengen schwer verdaulicher Faser auf. Diese muss über lange Zeit im Retikulorumen verbleiben, um durch Wiederkauen und ständige starke, mixende Kontraktionen und mikrobielle Aktivitäten zerkleinert und nutzbar gemacht zu werden. Wiederkäuer, deren Nahrung eher aus faserärmeren Pflanzen und Blättern besteht (wie die Ziege - und in geringerem Maße auch das Damwild (HOFMANN 1989)), brauchen diese aufwendige Vormagenverdauung nicht in dem Maße, da bei ihnen ein nicht unerheblicher Teil der Verdauung im hinteren Gastrointestinaltrakt stattfindet. Dadurch sind sehr starke, mixende Kontraktionen nicht nötig, weshalb die cholinerge Population längst nicht so stark ausgeprägt zu sein braucht. Folgt man dieser Argumentation, so wäre auch beim Rind – als klassischem Rauhfutterfresser (HOFMANN 1989) – ein hoher Anteil cholinerger Neurone (und ein dementsprechend geringer Anteil nitrerger Neurone) zu erwarten. Bei der vorliegenden Untersuchung war der relative Anteil nitrerger Neurone mit 37±11 % jedoch ohne signifikanten Unterschied zu den Werten der anderen Spezies, während der absolute Anteil nitrerger Neurone pro Ganglion mit 24±8 signifikant höher als beim Schaf war. Letzteres relativiert sich allerdings, wenn die differierende mittlere Gangliengröße mit in Betracht gezogen wird. Ein der oben begonnenen Argumentation weiter folgender Erklärungsansatz wäre, dass Rinder schon seit vielen Jahren nicht mehr „rauhfutterfressergerecht“ ernährt werden. Dies steht im Zusammenhang mit der Selektion auf hohe Milch- und Mastleistungen (HOFMANN 2007). Diese hohen Leistungen sind wiederum, insbesondere zu Laktationsbeginn und in der Intensivmast, nur durch die Fütterung von großen Mengen an Konzentrat zu erreichen (DIRKSEN 2002). Somit erscheint es möglich, dass es hierdurch zu einem Selektionsdruck Richtung Konzentratverdaulichkeit gekommen ist, bei der es auch zu Veränderungen der enterischen Innervation kam. In dieser Studie wurden Schwarzbunte Milchrinder und Holstein-Friesian (bzw. Schlachtbullen dieser Rasse) verwendet. Um einen Züchtungs- bzw. Anpassungseffekt näher zu untersuchen, müssten in weiteren Studien neben solchen klassischen Milchvieh- (und damit auf Konzentratverwertung gezüchteten) Rassen auch sehr ursprüngliche Rassen, wie z.B. Highland-Rinder untersucht werden. 72 Ein weiterer Erklärungsansatz für den höheren Anteil nitrerger Neurone bei den Vertretern des Intermediärtyps - und insbesondere bei den verwendeten Rindern - im Vergleich zum Rauhfutterfresser Schaf wäre ein möglicher direkter diätetischer Einfluss auf die enterischen Neurone (siehe auch 5.1 Allgemeine Methodenkritik). So wurde bei Ratten gezeigt, dass die Anzahl enterischer cholinerger Neurone bei ad libitum gefütterten Tieren gegenüber restriktiv gefütterten Tieren deutlich abnimmt, während die Anzahl nitrerger Neurone stabil bleibt (COWEN et al. 2000). Dieser Effekt wurde lange ausschließlich mit Alterungsprozessen in Verbindung gebracht (SANTER und BAKER 1988, GABELLA 1989), konnte von COWEN et al. (2000) jedoch bereits bei sehr jungen, ad libitum gefütterten Tieren nachgewiesen werden. Daraus schlussfolgerten COWEN et al. (2000), dass die Diät – und hierbei insbesondere der Energiegehalt – einen direkten Einfluss auf das Ausmaß des Neuronenverlustes hat. Der diätetisch- und altersbedingte Neuronenverlust betrifft insbesondere cholinerge Neurone. Demgegenüber sind nitrerge Neurone unempfindlicher gegenüber diätetischen und altersbedingten Einflüssen, weshalb ihr relativer Anteil an der Gesamtneuronenpopulation ansteigt. Als Ursache für diese Unempfindlichkeit vermuteten COWEN et al. (2000) bessere Abwehrmechanismen der nitrergen Neurone gegenüber freien Radikalen. Ein ähnlicher Einfluss der Nahrung auf die Anzahl cholinerger und nitrerger myenterischer Neurone wäre auch bei Wiederkäuern denkbar und würde den höheren relativen Anteil nitrerger Neurone bei Ziegen und intensiv gefütterten Rindern gegenüber den Rauhfutter fressenden Schafen erklären. Da zur Wirkung der aktuell gefütterten Diät auf die intrinsische Innervation adulter Wiederkäuer bisher jedoch keine Untersuchungen vorliegen, bleibt dieser Einfluss spekulativ. Auch ein Einfluss der neuronalen Organisation auf die Anteile der nitrergen und cholinergen Nervenzellen wäre denkbar. Wie oben erwähnt, fanden sich im myenterischen Plexus von Schaf und Damwild die nitrergen Neurone locker in den Ganglien verteilt. Bei der Ziege und beim Rind fanden sie sich in Gruppen, vornehmlich am Rand der Ganglien. Eine Hypothese wäre, dass daraus eine andere Verschaltung innerhalb der Ganglien resultiert und diese beiden letztgenannten Spezies mehr nitrerge Neurone „brauchen“, um die erforderliche Menge inhibitorischer Transmitter bereitstellen zu können. 5.3.2 Nachweis verschiedener Neuropeptide und neuronaler Marker Die Signalübertragung enterischer Neurone erfolgt polychemisch. Das bedeutet, dass individuelle enterische Neurone mehr als eine Transmittersubstanz synthetisieren und nutzen (FURNESS et al. 1995). Somit synthetisieren auch ChAT- bzw. NOS-positive Nervenzellen, je nach Lokalisation und/oder Funktion, weitere Neurotransmitter und neuronale Marker. Durch den histochemischen Nachweis dieser Substanzen ist es möglich, den neurochemischen Kode (d.h. die von einer Nervenzelle synthetisierte Neurotransmitterkombination) der enterischen Neurone zu bestimmen, wodurch auch Rückschlüsse auf die Funktion dieser Neurone möglich werden (COSTA et al. 1996, FURNESS 2000, BROOKES 2001a). 73 Deshalb wurden die Neurone im weiteren Verlauf der Untersuchungen auf ihre Immunreaktivitiät für die Neuropeptide und neuronalen Marker SP, VIP, NPY, SOM und Calbindin überprüft. Das generelle Vorkommen dieser und anderer Neurotransmitter und neuronaler Marker im Vormagen von Wiederkäuern wurde bereits in früheren Studien an Schafen und Rindern belegt (siehe Punkt 2.2.3.2). Diesbezügliche Untersuchungen lagen bisher kaum oder gar nicht für Ziege und Damwild vor. Ebenso wurden detaillierte Untersuchungen zu den Kolokalisation von Neurotransmittern, –peptiden und deren quantitativen Anteilen bisher lediglich für Pansen, Haube und Schlundrinne von Lämmern und adulten Schafen durchgeführt (PFANNKUCHE et al. 2002a, RÖSCH 2003). In der vorliegenden Untersuchung konnte bei allen untersuchten Spezies eine Immunreaktivität myenterischer Neurone für HuC/D, NOS, ChAT, VIP, NPY, SP und Calbindin nachgewiesen werden. Eine Immunreaktivität für SOM konnte bei allen untersuchten Spezies in neuronalen Fortsätzen nachgewiesen werden, SOM-positive Nervenzellsomata konnten jedoch nur bei Damwild und Schaf gefunden werden. Durch Kolokalisationsuntersuchungen war es möglich, mit Hilfe der verwendeten Antikörper folgende Neuronenpopulationen nachzuweisen: ChAT/SP, ChAT/-, NOS/NPY/VIP und NOS/NPY. Die cholinerge Population konnte durch den Nachweis von Calbindin und Somatostatin noch weiter subdifferenziert werden. Auf Grund der Kolokalisationen der Neuropeptide mit ChAT und NOS spiegeln sich die quantitativen Differenzen der cholinergen und nitrergen Innervation in der Neuropeptidexpression und in der Größe der einzelnen Neuronenpopulationen zwischen den Wiederkäuerspezies wider. Besonders deutlich wird dies bei der NPY und VIP-Expression. So ist der Anteil, der NPY und VIP exprimierenden Neurone bei der Ziege signifikant höher als beim Schaf. Das führt folgerichtig dazu, dass die Population mit der Kodierung NOS/NPY/VIP bei der Ziege signifikant größer als beim Schaf ist. In der SP-Expression spiegeln sich die quantitativen Differenzen der cholinergen und nitrergen Innervation nicht ganz so deutlich wider. Doch konnte beim Schaf die – im Vergleich zu den anderen untersuchten Spezies – größte Population mit der Kodierung ChAT/SP nachgewiesen werden. 5.3.3 Mögliche funktionelle Rückschlüsse aus den Anfärbungen „Sub-Populationen myenterischer Neurone basieren auf der Kolokalisation putativer Transmitter und neuronaler Marker und ihrer wahrscheinlichen Funktionen“ (SANG und YOUNG 1996). [Übersetzung aus englischem Originaltext] Enterische Neurone können funktionell in Sensorische Neurone, Motorische Neurone und Interneurone (GERSHON et al. 1994) eingeteilt werden. Sie unterscheiden sich in ihrer neurochemischen Kodierung, ihren Projektionen und ihrem elektrophysiologischem Verhalten. Obwohl in dieser Studie nur eine limitierte Anzahl von Antikörpern verwendet, und keine Untersuchungen zur Projektion und zum elektrophysiologischem Verhalten durchgeführt wurden, kann auf Grund der beobachteten Kolokalisationen zum Teil auf funktionelle Gegebenheiten geschlossen werden. Dies stützt sich zum einen auf funktionelle Untersuchungen, bei denen die 74 Wirkung der nachgewiesenen Substanzen und Marker auf gastrointestinale Gewebe untersucht wurde. Zum anderen konnte auf Daten von anderen Spezies zurückgegriffen werden, bei denen eine funktionelle Zuordnung entsprechend der neurochemischen Kodierung bereits möglich ist. Im Folgenden werden die möglichen funktionellen Rückschlüsse getrennt für die nitrergen und cholinergen Populationen dargestellt. 5.3.3.1 Nitrerge Subpopulationen Bei den untersuchten Wiederkäuerspezies Rind, Schaf, Ziege und Damwild konnten mit Hilfe der verwendeten Antikörper zwei nitrerge Populationen detektiert werden. Diese hatten die Kodierung NOS/NPY/VIP und NOS/NPY. NO (dessen Syntheseenzym die Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) ist) ist der nicht-adrenergen, nichtcholinergen (NANC) inhibitorischen Innervation im Gastrointestinaltrakt von Säugetieren zuzuordnen (SUZUKI et al. 1994). Stickstoffmonoxid bewirkt an der glatten Muskulatur des Darms eine direkte und eine indirekte Hemmung der Motorik. Die direkte Hemmung erfolgt über eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration durch Erhöhung der Aktivität der löslichen Guanylatzyklase. Durch cGMP wird die Calciumfreisetzung aus den intrazellulären Speichern gehemmt, was wiederum zu einer Muskelrelaxation führt (NAKATSU und DIAMOND 1987). Die indirekte Wirkung von NO beruht auf der Hemmung der Freisetzung der Muskelkontraktionen auslösenden Substanz P (GUSTAFSSON et al. 1990). Somit findet sich NO zum einen in inhibitorischen Motorneuronen, die eine direkte Verbindung zur glatten gastrointestinalen Muskulatur haben, zum anderen aber auch in Interneuronen, die exzitatorische Nervenimpulse modulieren (VITTORIA et al. 2000, PORTER et al. 2002). Eine mögliche Funktion nitrerger Neurone als inhibitorische Muskelmotorneurone wird durch die Beobachtung nitrerger Nervenendigungen in der glatten Wandmuskulatur des Gastrointestinaltraktes des Rindes und der Vormägen des Schafes untermauert (VITTORIA et al. 2000, PFANNKUCHE et al. 2002a, 2002b und 2004b). Für eine Funktion niterger Neurone als Interneurone spricht der Nachweis nitrerger Nervenendigungen an myenterischen und submukösen Nervenzellkörpern des Rindes (VITTORIA et al. 2000). Desweiteren fanden VITTORIA et al. (2000) nitrerge Nervenendigungen in der Wand boviner gastrointestinaler Blutgefäßen, was auch auf eine Beeinflussung der gastrointestinalen Durchblutung durch nitrerge Neurone hindeutet. Von Hund, Meerschweinchen, Opossum, Ratte und Mensch ist bekannt, das die Relaxation der gastrointestinalen Muskulatur durch mehr als einen Neurotransmitter erfolgt (SANDERS und WARD 1992, FURNESS et al. 1995). Neben NO wirken VIP, Adenosintriphosphat (ATP) und PACAP als inhibitorische Neurotransmitter auf die gastrointestinale Muskulatur, wobei ihre Bedeutung und ihr Anteil zwischen Spezies und gastrointestinalen Regionen variieren (FURNESS et al. 1995). Auch bei den untersuchten Wiederkäuerspezies wurde eine Kolokalisation von NOS mit VIP nachgewiesen. Bei VIP handelt es sich um einen inhibitorischen Neurotransmitter, dessen 75 Hauptaufgabe im Gastrointestinaltrakt die Relaxation von vaskulärer und nichtvaskulärer glatter Muskulatur ist (LI und RAND 1990). Im Meerschweinchenmagen konnte ein funktioneller Synergismus von NO und VIP aufgezeigt werden: NO erhöht präsynaptisch die Freisetzung von VIP und verstärkt die Wirkung von VIP auf parietale glatte Muskelzellen; während VIP zugleich die Produktion von NO in diesen Zellen erhöht (GRIDER et al. 1992). Folgerichtig konnten bisher bei allen untersuchten Spezies und in allen untersuchten Regionen des Gastrointestinaltraktes Neurone mit der Kodierung NOS/VIP als inhibitorische Muskelmotorneurone identifiziert werden (FURNESS und COSTA 1979, BROOKES et al. 2001a, AIMI et al. 1993, EKBLAD et al. 1994, WARD et al. 1994, SANG und YOUNG 1996, LOMAX und FURNESS 2000, VITTORIA et al. 2000). Dies gilt auch für den Pansen des Schafes, wo mittels retrogradem DiITracings bei allen nitrergen, zur Muskulatur projizierenden myenterischen Neuronen die Kodierung NOS/VIP nachgewiesen werden konnte (PFANNKUCHE et al. 2002a). VIP gilt darüber hinaus als einziger konstanter Marker sekretomotorischer Neurone (FURNESS et al. 1995) und wird von Sekreto- und Vasomotorneuronen synthetisiert (EKBLAD et al. 1985, NEUNLIST et al. 1999). Deshalb scheint es wahrscheinlich, dass es sich bei einem Teil der in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen VIP exprimierenden Neurone um Vasomotorneurone handelt, da im Pansen vermutlich keine Sekretomotorneurone existieren (PFANNKUCHE et a. 2002a). Bei den Untersuchungen zur neurochemischen Kodierung zeigte sich, dass NOS stets mit NPY kolokalisiert war. Das Neuropeptid Y gilt im myenterischen Plexus des Meerschweinchenmagens als inhibitorischer Transmitter, dessen Wirkung auf der Hemmung der präsynaptischen Freisetzung von Azetylcholin beruht (SCHEMANN und TAMURA 1992). Bei in-vitro Studien führte NPY zu einer starken Relaxation der Muskulatur des Meerschweinchenmagens (SCHEMANN et al. 1995). Inhibitorische, zur Zirkulärmuskulatur projizierende Motorneurone sind im Dünndarm von Maus und Meerschweinchen NOS/VIP±NPY kodiert (COSTA et al. 1992, FURNESS et al. 1995, SANG und YOUNG 1996, BROOKES 2001a). Es ist somit zu vermuten, dass die hier nachgewiesenen Neurone mit der Kodierung NOS/NPY großteils auch zur Pansenmuskulatur projizieren und als Muskelmotorneurone fungieren. Im Gastrointestinaltrakt des Meerschweinchens findet sich zusätzlich eine cholinerge, NPY exprimierende Population (SCHEMANN et al. 1995, BROOKES 2001a). Eine solche Population konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht detektiert werden. Zusammenfassend scheint es sich bei den beiden nitrergen Neuronenpopulationen überwiegend um inhibitorische Muskelmotorneurone zu handeln, wobei auch eine Funktion als Interneurone und Vasomotorneurone nicht ausgeschlossen werden kann. Unklar bleibt jedoch, ob zwischen den beiden hier detektierten nitrergen Populationen funktionelle Unterschiede bestehen. Dies könnte durch Tracinguntersuchungen abgeklärt werden. 76 5.3.3.2 Cholinerge Subpopulationen Bei allen untersuchten Wiederkäuerspezies wurde eine große cholinerge Population mit der Kodierung ChAT/SP und eine kleine cholinerge Population mit der Kodierung ChAT/- nachgewiesen. Zusätzlich koexprimierte ein Teil der cholinergen Neurone Calbindin oder Somatostatin. Azetylcholin, dessen Syntheseenzym die Cholinazetyltransferase (ChAT) ist, gilt als primärer Transmitter exzitatorischer Neurone, welche die gastrointestinale Muskulatur innervieren (FURNESS et al. 1995). Die exzitatorische Wirkung von Azetylcholin auf die Vormagenmuskulatur wurde durch in-vitro Studien belegt, bei denen die Zugabe von Ach auf isolierte Vormagenmuskelstreifen (DUNCAN 1954), ebenso wie die elektrische Stimulation von Pansen-und Haubenmuskelstreifen, Kontraktionen auslöste, welche durch Atropinzusatz hemmbar waren (TANEIKE und OHGA 1975). Cholinerge Muskelmotorneurone setzen zusätzlich Tachykinine frei, die direkt exzitatorisch auf die Muskulatur wirken und deren Wirkung vor allem nach Blockade muskarinerger Rezeptoren zu Tage tritt. Tachykinine stellen eine Gruppe folgender eng verwandter Peptide dar: SP, Neurokinin A, Neurokinin B, Neuropeptid K und Neuropeptid Gamma (FURNESS et al. 1995). Als Tachykininmarker wird zumeist SP verwendet. SP konnte bereits im Vormagen von Schafen (GROENEWALD 1994, RÖSCH 2003, PFANNKUCHE 2004a), Ziegen (LEE und NAM 2006), sowie in Schlundrinne, Pansen und Haube von Rindern (KITAMURA et al. 1986) nachgewiesen werden. VEENENDAAL et al. (1982) bestätigten die erregende Wirkung von SP auf die Pansenmuskulatur mit Hilfe von in-vitro Versuchen an Pansenmuskelstreifen der Ziege. Eine Kolokalisation von ChAT und SP ist von monogastrischen Spezies (z.B. STEELE et al. 1991, FURNESS et al. 1995, BROOKES 2001a) und vom Vormagensystem des Schafes bekannt (PFANNKUCHE et al. 2002a und 2003b). In der vorliegenden Untersuchung stellten Neurone mit der Kodierung ChAT/SP bei allen untersuchten Spezies die signifikant größte detektierte Population dar. Vermutlich handelt es sich bei dieser Population großteils um exzitatorische Muskelmotorneurone. Dies stützt sich auf Untersuchungen von PFANNKUCHE et al. (2002a) und RÖSCH (2003), die mittels retrogradem DiI-Tracings bei cholinergen, zur Muskulatur projizierenden ovinen myenterischen Vormagenneuronen die Kodierung ChAT/SP nachweisen konnten. Aber auch weitere Funktionen scheinen für die ChAT/SP-Population denkbar. Beispielsweise wurden beim Rind SP immunreaktive Nervenfasern im Epithel von Pansen und Haube gefunden (KITAMURA et al. 1989). Obwohl SP positive Zellkörper in der Mukosa dieser Vormagenkompartimente nachweisbar waren, konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die intraepithelialen Fasern auch von myenterischen oder extrinsischen Neuronen stammten (KITAMURA et al. 1989). KITAMURA et al. (1989) vermuteten eine sensorische Funktion dieser Nervenfasern, da SP häufig in sensorischen Nerven des Gastrointestinaltraktes nachgewiesen werden konnte und freie, intraepitheliale Nervenfasern oft sensorische Funktionen besitzen (BORNSTEIN et al. 1989). Mögliche Reize für die SPergen Fasern könnten chemische oder mechanische Stimuli am Epithel sein (KITAMURA et al. 1989). 77 Für die Existenz von intrinsischen sensorischen Neuronen sprechen auch die Ergebnisse funktioneller Untersuchungen, die an vagotomierten Schafen durchgeführt wurden. Hier wurde gezeigt, dass die Vormagenmotorik durch niedrige pH-Werte gehemmt und durch taktile Stimulation des Epithels gesteigert werden kann (GREGORY 1984). Desweiteren war beim vagotomierten Schaf die Motilität des Retikulorumens vom Grad seiner Dehnung abhängig (GREGORY 1984). So war bei geringer Füllung des Pansens keine Aktivität der Muskulatur vorhanden. Erst mit Erreichen eines gewissen Schwellenwertes war eine Muskelaktivität nachweisbar, die sich mit steigendem Volumen verstärkte (GREGORY 1984). Daraus kann geschlossen werden, dass in der Muskulatur außer motorischen Fasern auch sensorische intrinsische Nervenfasern existieren müssen. Ob alle von PFANNKUCHE et al. (2002a) und RÖSCH (2003) beobachteten und zur Muskulatur projizierenden ChAT/SP exprimierenden Neurone tatsächlich motorische Funktionen besitzen, oder ob sie eventuell auch sensorische Funktionen haben, bleibt somit zu klären. Neben der Population mit der Kodierung ChAT/SP wurde auch eine kleine, rein cholinerge Population detektiert, die die Kodierung ChAT/- aufwies. Der in der vorliegenden Arbeit ermittelte relative Anteil der rein cholinergen Neurone des Schafes entspricht mit 4,6±4,6 % in etwa den von PFANNKUCHE et al. (2003b) im Pansen adulter Schafe ermittelten Werten (5±4 %) und ist gegenüber den von PFANNKUCHE et al. (2003b) ermittelten Anteilen bei Saug- (19±3 %) und Mastlämmern (13±4 %) deutlich geringer. Als Ursache für die altersbedingte Abnahme der rein cholinergen Population diskutierte RÖSCH (2003) zum einen den Verlust einer bestimmten Anzahl rein cholinergen Neurone, zum anderen die Möglichkeit einer erst im späteren Alter (mit beginnender Rumination) einsetzenden SP-Synthese in diesen Neuronen. So konnte bei einem Teil der rein cholinergen Neurone beim Sauglamm eine Projektion zur Pansenmuskulatur nachgewiesen werden (PFANNKUCHE et al. 2004b), die beim adulten Schaf nicht (mehr) zu finden war (PFANNKUCHE et al. 2002a). Bei dieser rein cholinergen, zur Pansenmuskulatur projizierenden Population des Sauglamms, könnte es sich um jene rein cholinergen Neurone handeln, die erst im späteren Alter mit der SP-Synthese beginnen. Dies wirft die Frage nach der möglichen Funktion der rein cholinergen, nicht zur Muskulatur projizierenden Population der adulten Wiederkäuer auf. Im Meerschweinchenmagen existiert eine rein cholinerge Neuronenpopulation, die zu anderen Ganglien bzw. zur Mukosa projiziert und bei der eine Funktion als Sekretomotorneurone oder Interneurone vermutet wird (REICHE und SCHEMANN 1999, REICHE et al. 2000, BROOKES 2001a). Allerdings existieren im Pansen – im Gegensatz zur glandulären Region des Meerschweinchenmagens – vermutlich keine Sekretomotorneurone (PFANNKUCHE et al. 2002a). Klarheit könnten auch hier Tracinguntersuchungen bringen. Aber auch der Nachweis weiterer neuronaler Marker und Neurotransmitter könnte weiterreichende funktionelle Rückschlüsse ermöglichen. Beispielsweise konnte die rein cholinerge Population im myenterischen Plexus des 78 Schafpansens durch den Nachweis von Calbindin in die beiden Subpopulationen ChAT/- und ChAT/Calb differenziert werden (PFANNKUCHE et al. 2004c). 5.3.3.2.1 Calbindin Bei Calbindin handelt es sich um ein Calcium-bindendes Protein, dessen Nachweis bei kleinen Labornagern zur Differenzierung funktionell verschiedener Klassen myenterischer Neurone verwendet werden kann. Beispielsweise wird Calbindin in afferenten neuronalen Subpopulationen des Dünn- und Dickdarms von Meerschweinchen exprimiert (FURNESS et al. 1998, BROOKES 2001), während es sich bei Calbindin-positiven Neuronen im Magen derselben Spezies um Interneurone handelt (REICHE et al. 2000). Bei Schafen konnte Calbindin fast ausschließlich in cholinergen Neuronen nachgewiesen werden, wodurch eine weitere Subunterteilung der cholinergen Populationen möglich wurde (CHIOCCHETTI et al. 2004, PFANNKUCHE et al. 2004c). An Kryostatschnitten des Schafpansens konnte gezeigt werden, dass sich Calbindin-positive Nervenzellsomata ausschließlich im myenterischen Plexus finden, während Calbindin-immunreaktive Nervenfasern außerhalb des Plexus myentericus vor allem in der Lamina propria der Pansenzotten nachweisbar sind (PFANNKUCHE et al. 2004c). Daraus schlussfolgerten PFANNKUCHE et al. (2004c), dass im Schafpansen Neurone mit der Kodierung ChAT/Calb möglicherweise eine sensorische oder sekretomotorische Funktion erfüllen. Auch im Vormagen der Ziege wird für Calbindin-positive Neurone eine Funktion als intrinsische, primär afferente beziehungsweise sensorische Neurone diskutiert (LEE und NAM 2006). Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass KITAMURA et al. (1986) beim Rind eine Funktion SPimmunreaktiver Neurone als intrinsische, primär afferente Neurone vermuteten. Dies deckt sich mit der Beobachtung, dass über die Hälfte der Calbindin-immunreaktiven Pansenneurone des Rindes mit SP kolokalisiert waren. Hierbei handelt es sich um eine Besonderheit des Rindes, da bei den anderen untersuchten Wiederkäuerspezies der Anteil der Neurone mit der Kodierung ChAT/Calb deutlich höher als der Anteil der Neurone mit der Kodierung ChAT/Calb/SP war. Die zusätzliche Expression von SP durch Calbindin-exprimierende Neurone variiert auch bei anderen Spezies und Lokalisationen. Im Ileum des Meerschweinchens ist Calbindin beispielsweise immer mit SP kolokalisiert (BROOKES 2001a), im Duodenum und Jejunum derselben Spezies findet sich diese Kolokalisation nicht (STEELE et al. 1991, CLERK et al. 1998). Eine Koexpression von SP besteht auch bei der Mehrzahl (88±6 %) der Calbindin-immunreaktiven myenterischen Neurone im Ileum juveniler Schafe (CHIOCCHETTI et al. 2004), nicht jedoch im Kaninchenileum (DÉNES und GÁBRIEL 2004). Im Schafileum konnte außerdem eine Altersabhängigkeit der zusätzlichen Tachykininexpression beobachtet werden. So koexprimierten beim adulten Schaf nur noch 49±15 % der Calbindin-immunreaktiven myenterischen Neurone SP (CHIOCCHETTI et al. 2004). Bisher konnte die Bedeutung der zusätzlichen Tachykininexpression Calbindin-positiver Neurone nicht geklärt werden. 79 Insgesamt fiel bei der vorliegenden Untersuchung der, im Vergleich zum Gastrointestinaltrakt von Monogastriern (FURNESS et al. 1998, REICHE et al. 2000), nur geringe Nachweis Calbindinexprimierender Neurone im Wiederkäuervormagen auf. Dabei könnte es sich um ein Pansen- bzw. Vormagenspezifisches Phänomen handeln. Dafür spricht, dass sich die in dieser Arbeit im Schafpansen ermittelten Werte in etwa mit den von PFANNKUCHE et al. (2004c) bei derselben Spezies ermittelten Werten decken, während CHIOCCHETTI et al. (2004) im myenterischen Plexus des Schafileums mit demselben Antikörper bei etwa 25 % der myenterischen Neurone Calbindin nachweisen konnten. Auffällig war auch der (gegenüber dem bei den kleinen Wiederkäuern gefundene) höhere Anteil Calbindin-positiver Neurone beim Rind. Ein Erklärungsansatz hierfür wäre, dass der verwendete Antikörper beim Rind ein besseres Bindungsvermögen als bei den kleinen Wiederkäuern aufwies. Unterschiede im Bindungsvermögen der Calbindin-Antikörper wurden bereits von REICHE et al. (1999) beim Meerschweinchen beschrieben. Eine andere Erklärung wäre, dass Calbindin vorrangig in mittelgroßen und großen Ganglien nachgewiesen wurde - und das Rind über signifikant mehr große Ganglien als die kleinen Wiederkäuer verfügt. 5.3.3.2.2 Somatostatin Im Pansen von Schaf und Damwild koexprimierten einige cholinerge Neurone Somatostatin. Ihr Anteil an der Gesamtpopulation betrug 3±2 % (Schaf) und 3±3 % (Damwild). Ein Großteil der Somatostatin-positiven Neurone (74 % beim Damwild und 85 % beim Schaf) koexprimierte zusätzlich SP und hatte somit die Kodierung ChAT/SOM±SP. Erste Untersuchungen zur Somatostatinexpression im Wiederkäuervormagen lagen bisher für Rind und Schaf (KITAMURA et al. 1986, VERGARA-ESTERAS et al. 1990, GROENEWALD 1994), nicht jedoch für Damwild und Ziege vor. Beispielsweise konnten im myenterischen Plexus des Retikulorumens von Lämmern und adulten Schafen SOM-positive Neurone nachgewiesen werden (VERGARA-ESTERAS et al. 1990, GROENEWALD 1994), während im myenterischen Plexus des Rinderpansens nur der Nachweis von SOM-positiven Nervenfasern gelang (KITAMURA et al. 1986). Die eigenen Untersuchungen bestätigen diese Befunde. KITAMURA et al. (1986) detektierten SOM-positive Nervenzellsomata jedoch im myenterischen Plexus der Schlundrinne von Rindern, was für eine lokalisationsabhängige Somatostatin-Expression spricht. Solche lokalisationsabhängigen Unterschiede finden sich auch im myenterischen Plexus des Menschen, wo SOM-positive Somata nicht im Magen, dafür jedoch in Dünn- und Dickdarm nachgewiesen werden können (KEAST et al. 1984). Bei Somatostatin handelt es sich um ein zyklisches Tetradecapeptid, dass ursprünglich aus dem Hypothalamus des Schafes isoliert wurde und dort die Sekretion von Wachstumshormon hemmt (BRAZEAU et al. 1973). Mit Hilfe von Antisera wurde SOM zudem immunhistochemisch in parakrinen Zellen im (vornehmlich vorderen) 80 Gastrointestinaltrakt verschiedener Spezies nachgewiesen (ALUMETS et al. 1977), sowie in Nervenfasern und Neuronen außerhalb des Zentralnervensystems (ACCILI et al. 1995, COSTA et al. 1996, BROOKES 2001a). Als parakrine Substanz (z.B. in den D-Zellen in der Mukosa des Drüsenmagens) moduliert Somatostatin die Aktivität spezifischer benachbarter Zellen; vor allem im Magen und Pankreas (YAU 1989). Demgegenüber inhibiert neuronales Somatostatin die Darmmotorik durch Unterdrückung der Freisetzung von Azetylcholin aus myenterischen Neuronen (FURNESS und COSTA 1979, YAU et al. 1983) und durch Stimulation enterischer inhibitorischer Nervenzellen (FURNESS und COSTA 1979). Funktionelle Untersuchungen Somatostatin-exprimierender Neurone liegen bisher vor allem für das Meerschweinchen vor. Bei dieser Spezies findet sich Somatostatin mit ChAT kolokalisiert in deszendierenden Interneuronen und mit ChAT/NPY/NMU/CCK/CGRP kolokalisiert in viscerofugalen Neuronen (BROOKES 2001a). Allerdings konnten COSTA et al. (1996) im Ileum des Meerschweinchens neben den auch bei BROOKES (2001a) beschriebenen Interneuronen, zur Mukosa projizierende Neurone mit dem Kode NPY/CCK/SOM/CGRP/ChAT nachweisen. Für diese wurde eine Funktion als Sekretomotorneurone vermutet. Dies deckt sich mit den Beobachtungen von STEELE et al. (1991), die im Meerschweinchendünndarm eine Klasse deszendierender Interneurone mit der Kodierung ChAT/SOM beschrieben, sowie zur Mukosa projizierende Sekretomotorneurone mit der gleichen Kodierung. Im Jejunum von Mensch und Hund finden sich die Fasern SOM-exprimierender submuköser und myenterischer Neurone vor allem in Ganglien, weshalb ACCILI et al. (1995) dort eine Rolle als Interneurone vermuteten. Demgegenüber hielten VERGARA-ESTARAS et al. (1990) eine Funktion Somatostatin-exprimierender Neurone als Interneurone beim Schaf für unwahrscheinlich, da die von ihnen detektierten SOM-positiven Fasern im Vormagen überwiegend in den Muskelschichten verliefen und somit eher die Muskeltätigkeit zu modulieren schienen. Die Funktion Somatostatin-exprimierender Neurone im Wiederkäuervormagen bleibt somit weiterhin unklar und sollte durch weiterführende Kolokalisations- und Tracinguntersuchungen näher untersucht werden. Möglicherweise kann dadurch auch die Frage, ob das Fehlen SOM-positiver Nervenzellsomata im myenterischen Plexus des Pansens von Rind und Ziege zu funktionellen Differenzen in der enterischen Innervation im Vergleich zu Schaf und Damwild führt, geklärt werden. 81 5.3.4 Grenzen von Studien zur neurochemischen Kodierung „Viele Substanzen, einschließlich Transmitter und ihre Syntheseenzyme und Nichttransmitter (wie z.B. Neurofilament-Proteine) ergeben den chemischen Kode von Neuronen, durch den ihre Funktionen und Projektionen identifiziert werden können.“ (FURNESS et al. 1995) [Übersetzung aus englischem Originaltext] Dieses Zitat verdeutlicht den engen Zusammenhang zwischen der neurochemischen Kodierung und der Funktion enterischer Neurone. Es besagt, dass man – bei Kenntnis des vollständigen neurochemischen Kodes eines Neurons – eine Aussage über dessen Funktion und Projektion treffen kann. Allerdings ist zu bedenken, dass der neurochemische Kode sowohl zwischen verschiedenen Spezies, als auch zwischen gastrointestinalen Regionen einer Spezies variiert und somit alle Studien, die den neurochemischen Kode enterischer Neurone untersuchen, immer nur für die Spezies und die Region des Gastrointestinaltraktes Gültigkeit haben, an der sie durchgeführt wurden (COSTA et al. 1996, BROOKES 2001a). Denn obwohl bestimmte Analogien zwischen Spezies und gastrointestinalen Regionen vorhanden sind, finden sich auch Unterschiede. Beispielsweise sind Somatostatin und SP in enterischen Neuronen des submukösen Plexus im Jejunum des Hundes immer kolokalisiert, beim Mensch jedoch nie (ACCILI et al. 1995). Eine Immunreaktivität für SOM und NPY findet sich im Dünndarm des Meerschweinchens in absteigenden Verschaltungen, im Meerschweinchendickdarm jedoch in aufsteigenden Verschaltungen (BROOKES 2001b). Inzwischen ist es beim Meerschweinchen möglich, den meisten enterischen Neuronen auf Grund ihrer Kodierung und Morphologie bestimmte Funktionen zuzuordnen (z.B. COSTA et al. 1996, FURNESS 2000, BROOKES 2001). Dabei konnten einzelne Neuronenpopulationen häufig erst durch den Nachweis zusätzlicher Transmitter und neuronaler Marker, sowie durch die Ermittlung ihrer Projektion mit Hilfe von Tracinguntersuchungen differenziert werden. Im Vergleich zum Meerschweinchen-ENS steht die Erforschung des Wiederkäuer-ENS erst am Anfang. Deshalb ist davon auszugehen, dass bei Verwendung weiterer neuronaler Marker und Transmitter eine weitere Subdifferenzierung der in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen Neuronenpopulationen möglich sein wird. Zusätzlich spielen auch das Alter, der gesundheitliche Zustand und wahrscheinlich auch die Fütterung der Versuchstiere eine Rolle. So gilt es als gesichert, dass enterische Neurone ihre Kodierung zum Teil während der Entwicklung verändern und dass Veränderungen mit zunehmender Alterung der Individuen möglich sind (GABELLA 1989, RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2003b). Um die letztgenannten Einflüsse möglichst gering zu halten, wurden in der vorliegenden Arbeit nur Proben von gesunden, jung adulten Tieren verwendet. Trotzdem kann ein gewisser Einfluss der Fütterung (und der Züchtung und somit Genetik) insbesondere bei den verwendeten Rindern nicht ausgeschlossen werden. Dies wurde bereits unter Punkt 5.3.1 diskutiert. Besonderheiten der Wiederkäuervormägen, wie die Abwesenheit polarisierter Projektionen myenterischer Neurone (PFANNKUCHE et al. 2002a), lassen zudem weitere wiederkäuerspezifische 82 Besonderheiten wahrscheinlich erscheinen. Insbesondere durch Tracinguntersuchungen sind weitere Ergebnisse zu erwarten, die zusätzliche Puzzleteile für das Verständnis des Enterischen Nervensystems der Vormägen liefern werden. Schlussendlich können zwar durch Kenntnis der Kodierungen und Projektionen der einzelnen Neuronenpopulationen die Bauteile der enterischen Schaltkreise aufgedeckt werden. Ihr eigentliches Zusammenspiel kann jedoch nur mit Hilfe funktioneller Untersuchungen vollständig erforscht werden. 83 5.4 Motilitätsuntersuchungen 5.4.1 Allgemeine Methodenkritik Die bei den Untersuchungen zur neurochemischen Kodierung festgestellten Differenzen insbesondere der cholinergen und nitrergen Innervation – ließen die Vermutung zu, dass sich diese auch in Unterschieden der in-vitro Motilität niederschlagen müssten. Mit Hilfe der durchgeführten funktionellen Untersuchungen gelang es jedoch nicht, signifikante Motilitätsunterschiede zwischen Schaf und Ziege aufzuzeigen. Ein Grund dafür ist vermutlich die starke Variabilität der Ergebnisse, die wiederum zu teils enormen Standardabweichungen führte und einen direkten Speziesvergleich extrem erschwerte. So konnte beispielsweise für die individuellen Präparate nachgewiesen werden, dass signifikante Unterschiede bezüglich der Reaktion auf Atropin und L-NAME zu den vorher durchgeführten Kontrollstimulationen bestanden. Durch die starken Unterschiede in den Kontraktionsamplituden – die häufig selbst bei zwei Präparaten eines Individuums auftraten – ergaben sich jedoch numerisch stark variierende Werte. Dies betraf sowohl die Schaf-, als auch die Ziegenpräparate. Eine Erklärung für die starken interindividuellen Unterschiede wären mögliche Unterschiede in der Behandlung und Aufarbeitung der Proben. Allerdings wurden die Probenentnahme und Präparationen während der ganzen Versuchsreihe durch dieselben Personen durchgeführt und die Versuchsbedingungen wurden weitestgehend konstant gehalten. Außerdem würde dies nicht die beobachteten Unterschiede zwischen Präparaten desselben Individuums erklären, da die Gewebe bis unmittelbar vor dem Zuschneiden und Einspannen völlig identisch behandelt wurden und es sich bei den Präparaten zumeist um direkt aneinandergrenzende Pansenstücke handelte. Eine andere mögliche Erklärung wären Unterschiede in der intrinsischen Innervation. Auch dort traten teilweise Schwankungen der Anteile und der Anzahl von Neuronen einer bestimmten Kodierung zwischen den Präparaten auf. Diese Schwankungen waren zumeist durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein eines besonders großen Ganglions in den einzelnen Präparaten bedingt. Somit wäre ein solcher Einfluss – insbesondere da die für die Motilitätsuntersuchungen verwendeten Präparate von eher geringer Größe waren – zumindest denkbar. In weiteren Untersuchungen könnte dieser Einfluss durch die Verwendung größerer Präparate minimiert werden. Obwohl Schaf und Ziege deutliche Differenzen in der intrinsischen Innervation zeigten, konnten signifikante Unterschiede der in-vitro Motilität nicht aufgezeigt werden. Möglicherweise lag dies auch an der Verwendung von Zirkulärmuskel-(TMMP)-präparaten. Durch retrograde Tracingstudien mit dem Marker DiI ist bekannt, dass die Longitudinalmuskulatur des Schafpansens eine - im Vergleich zur Zirkulärmuskulatur – stärker ausgeprägte inhibitorische Innervation aufweist (PFANNKUCHE et al. 2002a). Bei den Versuchen von PFANNKUCHE et al. (2002a) war das Verhältnis der cholinergen zu den nitrergen, zur Zirkulärmuskulatur projizierenden Neuronen 5:1 gegenüber 2:1 bei den zur Longitudinalmuskulatur projizierenden myenterischen Neurone. Dies deckt sich mit den Untersuchungen von VASSILEVA et al. (1978), die nach EFS an Zirkulärmuskelstreifen des 84 Schafpansens nur kontraktile Antworten beobachteten, während sich an Longitudinalmuskelstreifen nach EFS sowohl kontraktile, als auch relaxierende Antworten auslösen ließen. Solche Untersuchungen wurden bisher noch nicht an Ziegenpräparaten durchgeführt. Es bleibt abzuwarten, ob das Verhältnis der cholinergen zu den nitrergen, zu den beiden Muskelschichten projizierenden Neuronen bei Ziege und Schaf vergleichbar ist, oder ob hier Spezies- und gegebenenfalls auch Ernährungstyp-spezifische Differenzen auftreten. Somit wäre es möglich, dass Unterschiede der in-vitro Motilität von Schaf und Ziege erst bei weiterführenden Untersuchungen an Longitudinalmuskel-(TMMP)-präparaten zu Tage treten. 5.4.2 Basale Motilität und Reaktion der Gewebe auf Elektrische Feldstimulation Die in-vivo Motilität des Retikulorumens wird entscheidend durch das im Hirnstamm gelegene Magenzentrum über vago-vagale Reflexe gesteuert (siehe auch Punkt 2.2.1.1). Allerdings spielt auch hier das Enterische Nervensystem eine wichtige Rolle. Dies zeigt sich insbesondere darin, dass es nach Vagotomie innerhalb von 1 bis 3 Wochen zur Rückkehr der Motilität des Retikulorumens kommt (DUNCAN 1954, GREGORY 1982). Bereits GREGORY (1982) postulierte, dass diese intrinsische cholinerge Motorik auf der Aktivität des myenterischen Plexus beruht und die Physiologischerweise vorhandene Motilität des Vormagens durch das Zusammenspiel zentraler extrinsischer und lokaler intrinsischer Nerven entsteht. So können beim gesunden Wiederkäuer durch das Enterische Nervensystem vermittelte Änderungen des Vormagenmuskeltonus die Aktivität extrinsischer sensorischer Nervenendigungen beeinflussen, und darüber die durch das Magenzentrum kontrollierte Vormagenmotorik modulieren (RUCKEBUSCH 1989). Alle Motilitätsmuster, die bei in-vitro Untersuchungen unter basalen Bedingungen auftreten, werden als basale Motilität bezeichnet. Pansen-TMMP-Präparate zeigen neben einem basalen Tonus zum Teil auch spontane Kontraktionen. Diese spontanen Kontraktionen werden auch als Spontanmotilität bezeichnet. Über das Auftreten von Spontanmotilität in Vormagenpräparaten in-vitro liegen widersprüchliche Angaben vor. In der vorliegenden Arbeit zeigte ein Teil der Präparate Phasen von Spontanmotilität, die jedoch noch während der Äquilibrierungsphase verschwanden. Dafür stellte sich ein stabiler Tonus ein. Demgegenüber beobachtete PFANNKUCHE (2004a) bei Motilitätsuntersuchungen an Schafpansenpräparaten regelmäßig eine wellenartig ablaufende Spontanmotilität, die über den gesamten Versuchsablauf anhielt. Dabei hatten die von ihr verwendeten Präparate eine Größe von 25 cm², gegenüber den von mir verwendeten, nur etwa 3,8 cm² großen Stücken. Eine Theorie wäre, dass die Größe der Pansenpräparate vorrangig bestimmt, ob spontane phasische Kontraktionen auftreten oder nicht. So ist bekannt, dass die myenterischen Ganglien großer Spezies wesentlich weiter auseinander liegen, als die Ganglien kleinerer Tiere (GABELLA 1987). Da sich der Versuchsaufbau zur Untersuchung der in-vitro Motilität im Pansen stark an Experimenten mit kleinen Labornagern orientiert, hat dies zur Folge, dass die verwendeten Gewebestücke zumeist relativ klein 85 sind. Somit besteht die Gefahr, dass bei in-vitro Untersuchungen die für die Generierung intrinsischer Reflexe notwendigen Neurone gar nicht im Präparat enthalten sind. Geht man beim Schaf von durchschnittlich 8 Ganglien/cm² und 45 Neuronen/Ganglion aus, so wären bei PFANNKUCHES Untersuchungen etwa 200 Ganglien (und damit etwa 9000 Neuronen) gegenüber gut 30 Ganglien (und damit etwa 1368 Neuronen) in der vorliegenden Arbeit, in den einzelnen Präparaten vorhanden gewesen. Allerdings konnte bei eigenen Vorversuchen mit etwa 6 bis 7 cm² großen Präparaten keine reproduzierbar und kontinuierlich auftretende Spontanmotilität beobachtet werden. Die Versuche von WONG und McLEAY (1988) an Vormagenmuskelstreifen von Schafen sprechen gegen die primäre Bedeutung der Präparategröße für das Auftreten oder Nichtauftreten von Spontanmotilität. Die von ihnen verwendeten Präparate waren mit 20-30 mm * 2-3 mm relativ klein. Trotzdem konnte in der überwiegenden Anzahl der Präparate Spontanmotilität beobachtet werden. Allerdings trat diese vorrangig bei Begasung mit 100 % O2 und einem pH-Wert von 7,8 auf. Bei Carbogenbegasung und einem niedrigeren pH-Wert zeigten deutlich weniger Präparate spontane Kontraktionen. Desweiteren stellten die Autoren eine Abhängigkeit von der Pansenregion, aus der die Proben entnommen worden waren, fest. So schien der kraniale Anteil des ventralen Pansensackes die stärkste Spontanmotilität zu zeigen, während insbesondere der dorsale Pansensack sehr inaktiv war. Dies deckt sich auch mit den Beobachtungen von RUCKEBUSCH (1983), der nur bei 15-20 % der Muskelstreifen aus dem dorsalen Pansensack von Schafen Spontanmotilität nachweisen konnte und den Untersuchungen von KENDALL und McLEAY (1996), die an Proben aus dem dorsalen Pansensack keine Spontanmotilität feststellen konnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Präparate aus der seitlichen Wand des ventralen Pansensackes verwendet. Ob auch zwischen kranialem Anteil und der seitlichen Wand des ventralen Pansensackes Unterschiede in der Spontanmotilität bestehen, bleibt zu klären. Intrinsische Innervationsmuster sind für das jeweilige Organ bzw. die jeweilige Region des Gastrointestinaltraktes, die Spezies und den Entwicklungsstand des Individuums (ruminierend versus nicht-ruminierend) spezifisch. Spezielle Motilitätsformen im Gastrointestinaltrakt werden wahrscheinlich durch den neurochemischen Kode und die Projektionscharakteristika der enterischen Nervenzellen gewährleistet. Eine Besonderheit des Wiederkäuers ist das Fehlen der neuroanatomischen Basis zur Generierung peristaltischer Wellen im Retikulorumen (PFANNKUCHE et al. 2002a). Dies konnte auch in funktionellen Studien im Retikulorumen gezeigt werden, bei denen zwar eine tonische und phasische Motorik an der Vormagenmuskulatur abgeleitet werden konnte (VASSILEVA et al. 1978, WONG und McLEAY 1988), jedoch keine gerichtete Peristaltik zu beobachten war (RUCKEBUSCH 1989). Obwohl das Retikulorumen der Wiederkäuer somit eine Sonderstellung einnimmt (PFANNKUCHE et al. 2002a), sind auch im Pansen nerval vermittelte Muskelantworten auf die Aktivitäten cholinerger und nitrerger Nervenzellen zurückzuführen. So 86 zeigten die untersuchten Pansenpräparate nach nervaler Aktivierung durch Elektrische Feldstimulation Motilitätsänderungen, die aus erregenden und hemmenden Komponenten bestanden. Elektrische Feldstimulation (EFS) dient zur Auslösung und gezielten Untersuchung nerval vermittelter Muskelaktivität. In Versuchen am Schafpansen (PFANNKUCHE 2004a) lösten die (den in der vorliegenden Arbeit entsprechenden) verwendeten Stimulationsparameter Tetrodotoxin-sensitive Antworten aus. Tetrodotoxin (TTX) blockiert schnelle Natriumkanäle an Nervenzellen (NARAHASHI et al. 1964) und kann somit zur Blockade der Weiterleitung von Aktionspotentialen eingesetzt werden. Daraus kann geschlossen werden, dass (bei Verwendung der entsprechenden Stimulationsparameter) ausschließlich nervale Strukturen durch die EFS aktiviert werden. Allerdings werden damit (neben hemmenden und erregenden enterischen Motorneuronen) auch extrinsische sympathische und parasympathische, in der Wand des Gastrointestinaltraktes verlaufende Nervenfasern stimuliert. Befunde anderer Autoren zeigen jedoch, dass der Einfluss extrinsischer Nervenfasern auf die nerval vermittelte EFS-Antwort vernachlässigt werden kann. Beispielsweise führte Phentolamin (ein α-adrenerger Antagonist) an Pferdedarmpräparaten zu keiner wesentlichen Änderung der EFS-Antwort und beeinflusste auch die basale Motilität nicht (KÖHN 2000). KÖHN schlussfolgerte daraus, dass bei in-vitro Präparaten kein signifikanter Sympathikotonus besteht. Im Verhältnis zur Anzahl enterischer Nervenfasern ist die Anzahl parasympathischer Nervenfasern extrem gering (KIRCHGESSNER und GERSHON 1989) und scheint schon deshalb für die nerval induzierten Antworten bei dem hier verwendeten Versuchsaufbauch keine entscheidende Rolle zu spielen. Außerdem hätte eine Aktivierung parasympathischer Nerven wahrscheinlich keinen direkten Einfluss auf die Motilität der gastrointestinalen Muskulatur, da diese (zumindest beim Monogastrier) überwiegend im Enterischen Nervensystem umgeschaltet werden (SCHEMANN und GRUNDY 1992). Zusammenfassend basieren die Reaktionen auf Elektrische Feldstimulationen somit im Wesentlichen auf einer Aktivierung des ENS und der daraus resultierenden Ausschüttung von hemmenden und erregenden Transmittern. 5.4.3 Atropin und L-NAME Die TMMP-Präparate aus dem Pansen von Schaf und Ziege reagierten auf Elektrische Feldstimulationen mit deutlichen Kontraktionen. Daraus kann geschlossen werden, dass hierbei die Ausschüttung erregender Transmitter dominierte. Nach Blockade der erregenden Komponente mit Atropin konnten nur noch sehr geringe Kontraktionen ausgelöst werden. Die ausgeprägte Atropinsensitivität der erregenden Komponente zeigt, dass Azetylcholin den primären Überträgerstoff der nerval vermittelten, kontraktilen Muskelantwort bei den untersuchten Schaf- und Ziegenpansenpräparaten darstellte. Entgegen den Beobachtungen von PFANNKUCHE (2004a) am Schafpansen, konnte nach Zugabe von Atropin keine nerval vermittelte Relaxation demaskiert werden. Dies könnte durch die etwas differierenden Versuchsbedingungen, und hier insbesondere durch die Größe der verwendeten Präparate bedingt sein. So wurden bei den Untersuchungen von PFANNKUCHE (2004a) im 87 Durchschnitt fast siebenmal so viele Neurone wie in der vorliegenden Arbeit stimuliert. Deshalb wäre es möglich, dass die Ausschüttung inhibitorischer Transmitter bei den eigenen Versuchen nicht stark genug war, um eine entsprechende Relaxation auszulösen. Ebenso wäre es möglich, dass die von PFANNKUCHE (2004a) verwendete Versuchsanlage eine höhere Sensitivität gegenüber auch geringen Motilitätsänderungen aufwies, bzw. dass diese auf Grund der Präparategröße deutlicher ausfielen. Neben der Reaktion der Präparate auf Elektrische Feldstimulationen nach Blockade der erregenden Komponente, wurde auch die Reaktion nach Blockade der hemmenden Komponente untersucht. Dafür wurde L-NAME, ein kompetitiver Hemmstoff der Stickstoffmonoxidsynthase, verwendet. Nach Zugabe von L-NAME lösten die Elektrischen Feldstimulationen signifikant stärkere Kontraktionen der TMMP-Präparate aus, als dies unter basalen Bedingungen der Fall war. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass bei Schaf und Ziege die Reaktion der TMMPPansenpräparate auf EFS unter basalen Bedingungen neben einer cholinergen auch eine nitrerge Komponente beinhaltet. Die Wirkung von NO auf die Vormagenmuskulatur von Rindern wurde von SCHNEIDER und EADES (1998) in-vitro untersucht. Bei den Versuchen der genannten Autoren an mit Scopolamin (einem muskarinergem Cholinrezeptorantagonisten) vorbehandelten TMMPPräparaten, wurde die durch EFS ausgelöste Relaxation durch die Gabe von L-NAME abgeschwächt, trat jedoch nach zusätzlicher L-Arginin-Zugabe (dem Substrat der NOS) wieder auf. Daraus schlussfolgerten SCHNEIDER und EADES (1998), dass NO als Neurotransmitter der NANCinhibitorischen, nerval induzierten Relaxation in TMMP-Präparaten aus dem bovinen Vormagen fungiert. Die aufgeführten Versuche zeigen, dass Azetylcholin und Stickstoffmonoxid zumindest in-vitro einen deutlichen Einfluss auf die Pansenmotilität haben. Da die durch die EFS ausgelösten Kontraktionen jedoch nicht vollständig durch Atropin unterdrückt werden konnten, scheint zumindest eine weitere Transmittersubstanz beteiligt zu sein. Dabei könnte es sich um SP handeln, das bei in-vitro Versuchen einen direkten kontraktilen Effekt auf Vormagenmuskelstreifen hatte (VEENENDAAL et al. 1982) und bei Tracinguntersuchungen an Schafpansenpräparaten in cholinergen, zur Muskulatur projizierenden Neuronen nachgewiesen werden konnte (PFANNKUCHE et al. 2002a, RÖSCH 2003). Auf der anderen Seite spricht die Tatsache, dass VIP bei in-vitro Untersuchungen einen direkt relaxierenden Effekt auf Vormagenmuskelstreifen hatte (DENAC et al. 1987) und von nitrergen Neuronen koexprimiert wird, für eine Rolle dieses Peptids als Transmitter in inhibitorischen motorischen Neuronen des Pansens. Diese konnte mit dem gewählten Versuchsaufbau jedoch nicht aufgezeigt werden. Während NO in-vitro einen deutlichen Einfluss auf die Pansenmotilität hat, scheint es bei der Regulierung der Pansenkontraktionen beim gesunden Schaf in-vivo eher von untergeordneter Rolle zu sein. So zeigten ONAGA et al. (2001), dass die intravenöse Gabe von L-NAME weder den basalen Tonus des intraruminalen Pansendrucks, noch die Amplitude der Pansenkontraktionen beeinflusste. 88 Lediglich die Kontraktionsfrequenz wurde leicht vermindert. Dieser Effekt verschwand nach LArginingabe und war somit NO spezifisch. Auf der anderen Seite führte die intravenöse Gabe von S-Nitroso-Azethyl-DL-Penicillamin (SNAP, einem NO-Donor) zu einer dosisabhängigen Verminderung der Kontraktionsamplitude und –frequenz, wobei dieser Effekt auch unter adrenerger Blockade anhielt. Daraus schlussfolgerten ONAGA et al. (2001), dass zwar exogen zugeführtes NO hemmend auf die Pansenmotilität wirkt, endogenes NO jedoch nicht an den Regulationsmechanismen des basalen Tonus und der regulären phasischen Pansenkontraktionen beteiligt ist. Die Reaktion auf exogenes NO spricht jedoch für eine Beteiligung des nitrergen Regulationssystems an krankhaften Veränderungen der Vormagenmotilität. Dafür sprechen auch die Untersuchungen von GEISHAUSER et al. (1998) an Muskelstreifen aus dem Labmagen von gesunden und an Labmagenverlagerung leidenden Kühen. Dabei hatte L-NAME keinen Effekt auf die Reaktion der Labmagenmuskelstreifen gesunder Kühe auf EFS, während es bei den Labmagenmuskelstreifen der erkrankten Kühe erst nach L-NAME Zugabe wieder zu normalen Reaktionen auf die EFS kam. Eine ähnliche Beteiligung von NO wäre auch bei mit Vormagenstase einhergehenden Erkrankungen wie z.B. der Pansenazidose denkbar. Somit bleibt festzuhalten, dass die Frequenz, Amplitude und Form der zyklischen Kontraktionen von Pansen und Haube in-vivo zentral kontrolliert werden (RUCKEBUSCH 1989). Allerdings kann durch das ENS (über die Veränderung des Vormagenmuskeltonus) die Aktivität von sensorischen extrinsischen Pansennerven moduliert, und dadurch die über das Magenzentrum kontrollierte Vormagenmotorik modifiziert werden (SCHNEIDER und EADES 1998). Dies ist eine mögliche Erklärung für die vermutete Schlüsselrolle des ENS bei der Pathogenese von mit Vormagen/Labmagenstase einhergehenden Erkrankungen und stellt sicherlich einen interessanten Ansatz für die Behandlung dieser Motilitätsstörungen dar. 5.4.4 Der Carbachol muskarinerge Agonist Carbachol führte im Schaf- und Ziegenpansen zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der kontraktilen Antwort. Zwar konnte zwischen den beiden Spezies bei gleicher Carbacholkonzentration kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontraktionsamplituden festgestellt werden, doch schien die Pansenmuskulatur der Ziege eine höhere Sensitivität für Carbachol aufzuweisen. Dies zeigte sich darin, dass ein höherer Anteil der verwendeten Ziegenpräparate bereits vor Erreichen der Endkonzentration von Carbachol derartig starke Kontraktionen entwickelte, dass diese außerhalb des Messbereichs gelangten, was zu einem Abbruch des jeweiligen Versuches führte. Ursache könnten Unterschiede in der Expression der cholinergen Rezeptoren zwischen den untersuchten Spezies sein. Carbachol aktiviert muskarinerge Rezeptoren direkt. Diese finden sich im Gastrointestinaltrakt vorrangig auf enterischen Neuronen, an Nervenfasern und Axonterminalen, auf intramuralen endokrinen Zellen, sowie direkt auf Effektorzellen (glatte Muskelzellen, Drüsenzellen, Epithelzellen) (GOYAL 1988). Es existieren verschiedene Rezeptorsubtypen (M1 bis M5), die sich in 89 ihrer Wirkung unterscheiden. Zum Beispiel gelten neuronale M1-Rezeptoren, die sich auf myenterischen und submukösen Neuronen finden, als stimulierend, während neuronale M2Rezeptoren an Axonterminalen zu finden sind und hemmend wirken. Im Gegensatz dazu wirken muskuläre M2- und M3-Rezeptoren wiederum stimulierend (GOYAL 1988, EGLEN 2001). Zusätzlich konnten beispielsweise M1-Rezeptoren sowohl auf cholinergen, als auch auf nitrergen Nervenzellkörpern des myenterischen und submukösen Plexus im Meerschweinchenileum und humanen Colon nachgewiesen werden, sowie präsynaptisch auf nitrergen und cholinergen Nervenfasen in der Zirkulärmuskulatur des menschlichen Colons, und scheinen somit sowohl die nitrerge, als auch die cholinerge Neurotransmission zu beeinflussen (HARRINGTON et al. 2007). Das bedeutet, dass die Expression und Verteilung der muskarinergen Rezeptortypen die Reaktion der Gewebe auf Azetylcholin und andere muskarinerge Agonisten beeinflusst. Über die Expression der verschiedenen muskarinergen Rezeptortypen beim Wiederkäuer und insbesondere im Wiederkäuervormagen ist wenig bekannt. Allerdings wiesen ONTSOUKA et al. (2007) eine signifikant geringeres mRNA-Level für M2 und M3-Rezeptoren im Muskelgewebe des Ileums im Vergleich zur Muskulatur von Labmagen, Blinddarm und Dickdarm bei Milchkühen nach. Demnach unterscheidet sich die Rezeptorausstattung regional. Dies lässt auch Unterschiede der Rezeptorexpression zwischen den untersuchten Spezies möglich erscheinen, die zu einer erhöhten Carbacholsensitivität des Ziegengewebes geführt haben könnten. Allerdings traten auch bei den Dosis-Wirkungsuntersuchungen von Carbachol zum Teil hohe Abweichungen innerhalb der untersuchten Spezies und zum Teil sogar zwischen zwei Präparaten ein und desselben Tieres auf. Auch hier könnten die verschiedenen Reaktionen von der Gangliendichte und –größe (und damit der im Präparat vorhandenen Neuronenzahl) abhängen, wie dies bereits unter Punkt 5.4.2 diskutiert wurde. Unter diesem Gesichtspunkt wäre für folgende Untersuchungen zu überlegen, den myenterischen Plexus aus den verwendeten Präparaten nach Abschluss der Motilitätsuntersuchungen zu isolieren und immun- bzw. enzymhistochemisch die Innervationsdichte (und gegebenenfalls auch den Anteil cholinerger bzw. nitrerger Neurone) zu bestimmen. Durch dieses Vorgehen wäre es möglich, einen solchen Einfluss auszuschließen oder zu bestätigen. Ein anderer Ansatz wäre, auch hier auf größere Gewebestücke zurückzugreifen. Letztlich bleibt anzumerken, dass die Untersuchung weiterer (Zwischen-) Konzentrationen von Carbachol, die Verwendung einer größeren Probenzahl und Untersuchungen zur Rezeptorexpression notwendig sein werden, um abschließende Aussagen über Unterschiede Carbacholsensitivität von Schaf und Ziege treffen zu können. 90 und Gemeinsamkeiten der 5.5 Abschließende Bemerkungen Im Vergleich zu kleinen Labornagern liegen Untersuchungen über das ENS der Wiederkäuer bisher nur in sehr geringem Umfang vor. Detaillierte Daten über die neurochemische Kodierung und die Anteile der enterischen Neuronenpopulationen beschränken sich dabei größtenteils auf das Schaf (GROENEWALD 1994, RÖSCH 2003, PFANNKUCHE et al. 2002a, 2003a und b, 2004 a und b) und das Rind (KITAMURA et al. 1986, TEIXEIRA et al. 1998, VITTORIA et al. 2000, PFANNKUCHE et al. 2002b). Die Ziege und das Damwild standen bisher nicht im Fokus der Untersuchungen. Die große Vielfalt der Unterordnung Ruminantia und die Unterschiede in dem von ihnen bevorzugtem Futter, die sich auch in makroskopisch-anatomisch wahrnehmbaren Differenzen zeigen (HOFMANN 1989), warfen die Frage nach möglichen Unterschieden in der intrinsischen Innervation auf. Denn dass der intrinsischen Innervation des Vormagens eine nicht zu unterschätzende Bedeutung zukommt, zeigen sowohl Versuche an vagotomierten Wiederkäuern (GREGORY 1982), als auch die fatalen Folgen bei einer Minderausbildung des ENS in den Vormägen (GROENEWALD und BOOTH 1992 a und b). In der vorliegenden Arbeit konnten mit den verwendeten Antikörpern bei allen untersuchten Wiederkäuerspezies (mit Ausnahme der SOM-Immunreaktivität) dieselben Neuronenpopulationen nachgewiesen werden. Daraus kann geschlossen werden, dass die basalen, die Motilität des Retikulorumens kontrollierenden myenterischen Schaltkreise bei Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen genetisch konserviert sind. Allerdings konnten zwischen den untersuchten Spezies auch Unterschiede in der enterischen Innervation aufgedeckt werden. So unterschieden sich die mittlere Dichte und Größe der Ganglien, wobei zunächst ein Zusammenhang mit der Körpergröße (das Rind als größte untersuchte Wiederkäuerspezies wies die geringste Gangliendichte und die größten Ganglien auf) zu bestehen schien. Bei Betrachtung der Neuronendichte fiel jedoch auf, dass diese bei den kleinen Wiederkäuern des Intermediärtyps signifikant höher als bei dem kleinen Rauhfutterfresser Schaf war. Nach HOFMANN (1989) finden sich bei Vertretern des Intermediärtyps die stärksten Kurzzeit- und saisonalen anatomischen Adaptationen an die Veränderungen der Futterqualität. Somit könnte eine höhere Neuronenzahl eine höhere Flexibilität und Anpassungsfähigkeit der enterischen Vormageninnervation - und damit auch der Motorik - an die jahreszeitlich wechselnden Verdauungserfordernisse ermöglichen. Desweiteren unterschieden sich die Ausprägung der cholinergen und nitrergen Innervation, sowie der kolokalisierten Neuropeptide. So schien der Pansen des kleinen Rauhfutterfressers Schaf im Vergleich zu den untersuchten Vertretern des Intermediärtyps unter stärkerer cholinerger Kontrolle zu stehen. Cholinerge Neurone wirken primär erregend (kontraktionsfördernd) auf die glatte Muskulatur des Gastrointestinaltraktes, während nitrerge Neurone hemmend auf die gastrointestinale Motilität wirken. Daraus folgt, dass die Pansenmuskulatur des kleinen Rauhfutterfressers Schaf unter stärkerer exzitatorischer Kontrolle als die Pansenmuskulatur der untersuchten Intermediärtypen steht. Dies 91 könnte als eine Anpassung an die physikomechanischen Eigenschaften der von Rauhfutterfressern bevorzugten Nahrungsquelle Gras interpretiert werden. Die Fermentation dieses Futters erfordert starke mixende Kontraktionen. Diese bedürfen vermutlich einer stärker ausgebildeten cholinerge Innervation. Allerdings gelang es bisher nicht, diese Hypothese auch durch Unterschiede der in-vitro Motilität an ovinen und caprinen Pansen-TMMP-Präparaten zu untermauern. In scheinbarem Widerspruch zu dieser Hypothese steht die nur gering ausgeprägte cholinerge Dominanz bei den untersuchten Rindern. Ursächlich könnte dies jedoch auf die Verwendung von Proben von Milchkühen und Mastbullen von auf hohe Milchleistung gezüchteten Rassen (Holstein Friesian und Schwarzbuntes Milchrind) bedingt sein. Eine hohe Milch- bzw. Mastleistung wird nur durch die Gabe großer Mengen energiereichen Futters erreicht (DIRKSEN 2000). Somit wäre durch die Selektion auf hohe Leistung - und damit auch auf Konzentratverdaulichkeit – ein genetischer Einfluss auf die intrinsische Innervation bei den verwendeten Rinderrassen denkbar. Aber auch ein direkter Einfluss der Diät auf die intrinsische Panseninnervation erscheint zumindest denkbar, da von Labornagern bekannt ist, dass die Aufnahme hoher Energiemengen zu einem Verlust enterischer cholinerger Neurone - und somit zu einem relativ höheren Anteil nitrerger Neurone - führt (COWEN et al. 2000). Ob ein solcher direkter diätetischer Einfluss auch bei adulten Wiederkäuern auftritt ist bisher nicht bekannt. Deshalb sollte neben einem möglichen genetischen Einfluss, auch der Einfluss der Fütterung nicht außer Acht gelassen werden. Klarheit könnte hier neben vergleichenden Untersuchungen an Extensiv- und Hochleistungsrinderrassen auch die Untersuchung des Einflusses von bestimmten Fütterungsregimen auf die enterische Panseninnervation bringen. Abschließend bleibt zu bemerken, dass in Zukunft bei Verwendung zusätzlicher Antikörper, dem Anwenden von Tracingverfahren und weiterführenden Motilitätsuntersuchungen das Aufdecken weiterer Unterschiede der enterischen Innervation zwischen den Ernährungstypen zu erwarten ist. 92 6 Zusammenfassung Juliane Münnich Intrinsische Innervation im Pansen von Wiederkäuern verschiedener Ernährungstypen Veterinär-Physiologisches Institut, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2008 96 Seiten, 25 Abbildungen, 16 Tabellen, 168 Literaturangaben Schlüsselworte: Enterisches Nervensystem, Motilität, Vormagen, ChAT, NOS, myenterischer Plexus, neurochemische Kodierung Wiederkäuer können entsprechend ihrer Ernährungsgewohnheiten in Rauhfutterfresser, Konzentratselektierer und Intermediärtypen eingeteilt werden (HOFMANN 1989). Diese verschiedenen Ernährungstypen spiegeln sich in anatomischen Unterschieden des gesamten Gastrointestinaltraktes, insbesondere jedoch in der Vormagenanatomie wider. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die intrinsische Innervation des Pansens von Wiederkäuern des Rauhfutterfresser- und Intermediärtyps näher zu charakterisieren und mögliche Unterschiede zwischen diesen beiden Ernährungstypen aufzuzeigen. Dafür wurden im ersten Teil der Arbeit die Expression des generellen Neuronenmarkers HuC/D, der Syntheseenzyme Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) und Cholinazetyltransferase (ChAT), sowie der Neuropeptide und der neuronalen Marker Neuropeptid Y (NPY), Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP), Somatostatin (SOM) und Calbindin (Calb) an Häutchenpräparaten (whole mounts) des myenterischen Plexus aus dem Pansen der Rauhfutterfresser Schaf und Rind und der Intermediärtypen Ziege und Damwild immunhistochemisch untersucht. Desweiteren wurden die Parameter Gangliengröße (Neurone/Ganglion), Gangliendichte (Ganglien/cm² Plexusfläche) und Neuronendichte (Neurone/cm² Plexusfläche) der genannten Spezies tierartlich vergleichend erfasst. Beim Rind fanden sich mit 73±6 Neuronen/Ganglion (Mittelwert ± Standardabweichung) signifikant größere Ganglien als bei den kleinen Wiederkäuern Ziege (57±19), Damwild (51±20) und Schaf (45±18). Demgegenüber war die mittlere Gangliendichte beim Rind mit 6±1 Ganglien/cm² Plexusfläche signifikant geringer als bei Schaf (8±2) und Ziege (10±3), die wiederum eine signifikant geringere Gangliendichte als das Damwild mit 15±3 Ganglien/cm² Plexusfläche aufwiesen. Die Neuronendichte war im ventralen Pansensack von Damwild und Ziege (664±194 bzw. 584±295 Neuronen/cm² Plexusfläche) signifikant höher als beim Schaf (289±132). Die Neuronendichte des Rindes lag mit 432±238 Neuronen/cm² Plexusfläche zwischen den Werten der anderen Spezies. Alle untersuchten myenterischen Neurone waren entweder cholinerg oder nitrerg kodiert. Der relative Anteil nitrerger Neurone pro Ganglion war bei der Ziege (44±10 %) signifikant höher als beim Schaf (30±8 %). Dementsprechend war der relative Anteil cholinerger Neurone beim Schaf signifikant höher als bei der Ziege. Neben den Anteilen unterschied sich auch die Verteilung der nitrergen Neurone in den myenterischen Ganglien. Bei Rind und Ziege waren diese in Clustern am Rand der Ganglien angeordnet, während sie bei Schaf und Damwild locker über die Ganglienfläche verteilt erschienen. 93 Mit Hilfe von Kolokalisationsuntersuchungen konnten bei allen untersuchten Spezies folgende Hauptneuronenpopulationen nachgewiesen werden: ChAT/SP>NOS/NPY/VIP>>ChAT/- und NOS/NPY. Dabei war die cholinerge Hauptpopulation ChAT/SP beim Schaf mit 67±7 % aller myenterischen Neurone signifikant stärker ausgeprägt als beim Damwild (58±11 %), während die nitrerge Hauptpopulation NOS/NPY/VIP bei der Ziege mit 40±9 % signifikant stärker als beim Schaf (26±6 %) ausgeprägt war. SOM und Calbindin fanden sich nur in einer sehr geringen Anzahl (vornehmlich cholinerger) Neurone, wobei SOM–positive Somata nur bei Damwild und Schaf nachgewiesen werden konnten. Im myenterischen Plexus von Rind und Ziege fanden sich ausschließlich Somatostatin-positive Nervenfasern. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Reaktionen von Zirkulärmuskelstreifen aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege auf Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin bzw. L-NAME (NG-Nitro-L-Arginine Methylester Hydrochlorid), sowie die Reaktionen auf steigende Konzentrationen von Carbachol funktionell untersucht. Bei beiden Spezies führte Atropin zu verminderten, L-NAME zu verstärkten Kontraktionen als Reaktion auf Elektrische Feldstimulationen. Der muskarinerge Agonist Carbachol führte im Schaf- und Ziegenpansen zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Motilität. Die Ergebnisse der neurochemischen Untersuchungen lassen auf eine stärkere cholinerge (und somit exzitatorische Kontrolle) des Pansens des Rauhfutterfressers Schaf im Vergleich zu Ziege und Damwild (Intermediärtypen) schließen. Die mikrobielle Fermentation grob strukturierten Rauhfutters erfordert starke, mixende Pansenkontraktionen. Es ist zu vermuten, dass ein höherer Anteil cholinerger myenterischer Neurone auch stärkere Pansenkontraktionen ermöglicht. Somit wäre die starke Ausprägung der cholinergen Innervation im Pansen des Rauhfutterfressers Schaf als eine Anpassung an die physikomechanischen Eigenschaften der bevorzugten Nahrungsquelle Gras zu sehen. Allerdings gelang es in der vorliegenden Arbeit nicht, diese Hypothese durch Unterschiede der in-vitro Motilität an ovinen und caprinen Pansenmuskelstreifen zu untermauern. In scheinbarem Widerspruch zu dieser Hypothese stand auch die nur gering ausgeprägte cholinerge Dominanz bei dem untersuchten großen Rauhfutterfresser Rind. Allerdings könnte diese genetisch bedingt sein, da es sich bei den untersuchten Proben um Material von auf hohe Milchleistung (und damit Konzentratverdaulichkeit) gezüchteten Rinderrassen handelte. Auch ein direkter diätetischer Einfluss auf die intrinsische Panseninnervation scheint in diesem Zusammenhang denkbar. Diese Annahme gründet sich auf Untersuchungen an kleinen Labornagern, bei denen die Aufnahme hoher Energiemengen zu einem Verlust enterischer cholinerger Neurone – und somit zu einem relativ höheren Anteil nitrerger Neurone führt. Deshalb sollte bei allen untersuchten Spezies neben einem möglichen genetischen Einfluss auch der Einfluss der Fütterung nicht außer Acht gelassen werden. Klarheit könnte hier neben vergleichenden Untersuchungen an Extensiv- und Hochleistungsrinderrassen auch die Untersuchung des Einflusses von bestimmten Fütterungsregimen auf die enterische Panseninnervation bringen. 94 7 Summary Juliane Münnich Intrinsic ruminal innervation in ruminants of different feeding types Institute of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2008 96 pages, 25 figures, 16 tables, 168 references Keywords: enteric nervous system, motility, forestomach, choline acetyl transferase, nitric oxide synthase, myenteric plexus, neurochemical code According to their feeding habits, ruminants can be classified as grazers, intermediate type and concentrate selectors (HOFMANN 1989). The different feeding types are related to distinct anatomical properties of their gastrointestinal system, in particular their forestomach. The aim of this study was to analyze and compare the intrinsic ruminal innervation from animals of different feeding types. Myenteric plexus preparation (whole mounts) from the rumen of goats, fallow deer (intermediate type), cattle and sheep (grazer) were analyzed regarding the expression of the following antigens: Hu-protein (HuC/D), choline acetyl transferase (ChAT), nitric oxide synthase (NOS), vasoactive intestinal peptide (VIP), neuropeptide Y (NPY), substance P (SP), somatostatin (SOM) and calbindin (Calb). In addition, the parameter ganglion size (neurons/ganglion), ganglion density (ganglia/cm² of myenteric plexus) and neuron density (neurons/cm² of myenteric plexus) were examined and compared between the species. Myenteric ganglia of cattle contained the largest number (p<0.05) of neurons (73±6; mean ± standard deviation) when compared to that of the small ruminant species goat (57±19), fallow deer (51±20) and sheep (45±18). Ganglion densitiy (ganglia/cm² of myenteric plexus) was highest (p<0.05) in fallow deer (15±3 ganglia/cm²) and lowest in cattle (6±1 ganglia/cm²); whereas the ganglion density in sheep (8±2 ganglia/cm²) and goat (10±3 ganglia/cm²) were between the other species. Neuron density (neurons/cm² of myenteric plexus) in fallow deer (664±194) and goat (584±295) were significantly higher than in sheep (289±132 neurons/cm²). Neuron density in cattle (432±238 neurones/cm²) was intermediate between the other species. All myenteric neurons were either NOS or ChAT positive. The proportion of NOS-positive neurons was significantly higher in goats (44±10 %) compared to sheep (30±8 %), while the proportion of cholinergic neurons was significantly higher in sheep compared to goats. The distribution of NOSpositive neurons in the myenteric ganglia differed between the species. In goats and cattle nitrergic neurons were clustered in groups at the margins of the ganglia. In contrast, in sheep and fallow deer, the nitrergic neurons were similarly distributed over the surface of the ganglia. Additional analysis of the different neuropeptides and their colocalisation revealed the following subpopulations: ChAT/SP>NOS/NPY/VIP>>ChAT/- and NOS/NPY in all species. The cholinergic population ChAT/SP was significantly larger in sheep (67±7 % of all myenteric neurons) than in fallow deer (58±11 %), while the nitrergic population NOS/NPY/VIP was signifcantly larger in goats 95 (40±9 %) than in sheep (26±6 %). Expression of Calb and SOM was detected only in minorities of (mainly cholinergic) neurons. SOM immunoreactive somata were only found in preparations from fallow deer and sheep. In cattle and goats, SOM was exclusively found in enteric nerve fibres. The response of circular muscle strips from the ventral sac of the rumen of sheep and goats to electric field stimulation after addition of L-NAME (NG-Nitro-L-Arginine Methylester Hydrochlorid) or atropine was investigated in the second part of this study. Furthermore the response of the muscle strips to rising concentrations of carbachol was investigated. Atropine diminished and L-NAME increased the contractions after electric field stimulation in both species. Carbachol increased the contraction activity of the muscle strips in a dose-dependend manner. No significant differences of the in-vitro motility between both species were detected. The data suggest that, although most subpopulations of neurons are present in all species investigated, the rumen of sheep (grazer) is under stronger cholinergic control than the rumen of goat and fallow deer (intermediate type). Microbial fermentation of low quality roughage requires strong mixing patterns of the rumen. It seems likely that prominent cholinergic innervation enables stronger mixing contractions in grazers and could consequently be viewed as an adaptive response to physiomechanical characteristics of their prefered feed, grass. However, we did not succeed in supporting this hypothesis through the examination of in-vitro motility of ovine and caprine ruminal muscle strips. The cholinergic dominance was not as strong in cattle (grazer) as it was in sheep (grazer). Differences may be due to the use of high performance dairy breeds in this study. To achieve increased levels of performance, these breeds are fed with high amounts of concentrate. Thus, genetic selection prefers animals who can digest and tolerate high amounts of concentrate which could have lead to morphologic (and genetic) adaptations in dairy cows. On the other hand their could be an direct effect of the diet as well. In small rodents, a high input of energy leads to a loss of cholinergic neurons. This dietary adaptation may occur in ruminants as well. Therefore, it seems plausible that there is a genetic influence or a direct diet influence on the enteric innervation of the rumen. Further investigations with different cattle breeds (dairy cows versus beef breeds) and with ruminants fed differring diets are required to analyse the influence of breeding and feeding on the rumen enteric nervous system. 96 8 Literaturverzeichnis Accili EA, Dhatt N, Buchan AMJ. Neural somatostatin, vasoactive intestinal polypeptide and substance P in canine and human jejunum. Neurosci Lett. 1995;185:37-40. Aimi Y, Kimura H, Kinoshita T, Minami Y, Fujimura M, Vincent SR. Histochemical localization of nitric oxide synthase in rat enteric nervous system. Neuroscience 1993;53(2):553-60. Alderson NE, Mitchell GE, Little CO, Warner RE, Tucker RE. Preintestinal disappearance of vitamin E in ruminants. J Nutr. 1971;101:655-60. Alumets J, Sundler F, Hakanson R. 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Besonders danken möchte ich Frau Petra Philipp für die Hilfe, die gute Laune, Unmengen an Süßigkeiten und das „Umtopfen“ zu nächtlichen Stunden. … Frau Berger vom Landratsamt Torgau-Oschatz für die Unterstützung bei der Gewinnung der Rinderproben, Herrn Küchler vom Lehr- und Versuchsgut Oberholz für die Damwildproben und Herrn Siegel aus Gimmel für die Ziegenproben. … Anja, Christina, Kathrin und Malte – für Unterkunft, Verpflegung und eine schöne Zeit in Leipzig. … Bent – der mich immer wieder motivierte, alle (und es waren einige…) Computerprobleme souverän löste und ohne den ich diese Arbeit wahrscheinlich weder begonnen, noch erfolgreich beendet hätte ;-) … meinen Eltern für die seelische, moralische, logistische und (nicht zuletzt auch) finanzielle Unterstützung. … meinem Bruder für die Überlassung des Laptops. … dem Team der Tierarztpraxis Prejawa aus Frankfurt (Oder) für das Verständnis und die flexiblen Arbeitszeiten, ohne die eine Dissertation neben der „richtigen“ Arbeit nicht möglich ist. … dem Team der Kleintierklinik Dr. Frahm aus Wasbek für das Verständnis und die Unterstützung während der Schreibphase (die dann doch länger andauerte als ursprünglich geplant…). … der Familie Frahm aus Wasbek für Verpflegung, Kaffee, Kuchen, aufmunternde Worte und einiges an Druckerpapier. 112
