Praktikum Humanbiologie II (5. Semester) - Uni

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AG Prof. R. Lill, Institut für Zytobiologie
Praktikum Humanbiologie II (5. Semester)
Genetische, biochemische und zellbiologische Untersuchungen
an Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae
Einleitung
Unizelluläre Hefen wie die Bierhefe, Saccharomyces cerevisiae, sind wichtige eukaryotische
Modellorganismen der Zellbiologie und Biochemie. Obwohl Hefen eine größere genetische
Komplexität als Bakterien besitzen (das S. cerevisiae Genom ist 3.5 mal größer als das von E. coli),
erlauben sie die Anwendung vieler genetischer Techniken, die denen bei Bakterien verwendeten
Techniken sehr ähnlich sind und die den schnellen Fortschritt in der Molekularbiologie der
Bakterien ermöglichten. S. cerevisiae wächst schnell, ist leicht transformierbar und es sind eine
Reihe spezieller Plasmidvektoren entwickelt worden, die entweder vom 2 µ Plasmid der Hefe oder
von den Centromer-Regionen eines der 16 Chromosomen abgeleitet wurden und die z.B. die
Komplementation von Mutanten oder die Expression von Fremdgenen in S. cerevisiae ermöglichen.
Dank eines ausgeprägten Hangs zur genetischen Rekombination können einzelne Gene im Genom
von S. cerevisiae gezielt modifiziert oder deletiert werden. Hefen sind sowohl als diploide als auch
als haploide Zellen stabil. Rezessive Mutationen können daher einfach isoliert und ihre Phänotypen
in haploiden Stämmen manifestiert und studiert werden. Das Genom von S. cerevisiae liegt seit
1996 vollständig annotiert vor (früher als E. coli) (Ref. 7). Wesentliche heute gängige Techniken
der Genomanalyse, wie z.B. DNA-Arrays und Two-hybrid-Analysen wurden an Hefe etabliert und
zuerst angewandt.
In diesem Praktikumsteil soll die Hefe S. cerevisiae dazu verwendet werden, einige Eigenschaften
der Mitochondrien zu studieren. Eine der wesentlichen Funktionen der Mitochondrien ist die
Durchführung der oxidativen Phosphorylierung. In Hefen sind Mutanten mit Defekten in der
mitochondrialen Respiration durch ihre Unfähigkeit, auf Medien mit nicht-fermentierbaren
Kohlenstoffquellen (wie z.b. Glyzerin oder Ethanol) zu wachsen, leicht identifizierbar. Solche
Stämme bezeichnet man als pet (petite), da sie auch auf glucosehaltigen Medien nur zu relativ
kleinen Kolonien heranreifen, oder mit- (Ref. 4). Da die Enzymausstattung der Mitochondrien
sowohl in der nukleären als auch in der mitochondrialen DNA kodiert ist, können solche Defekte
durch Schäden in beiden Genomen hervorgerufen werden. Ist die Ursache in einem nukleären Gen
zu finden, so sind die Defekte in der respiratorischen Kette meistens durch Einführen einer
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funktionellen Kopie des Gens in die jeweilige Mutante vollständig revertierbar. Bei Mutanten, die
ihre mitochondriale DNA teilweise (sog. rho- Stämme) oder vollständig verloren haben (sog. rho0
Stämme), ist die mitochondriale Respiration irreversibel geschädigt, da einige Proteinkomponenten
der Atmungskette mitochondrial kodiert sind. Respirationsdefekte rho0 und rho- Mutanten können
nur durch Einschleusen einer neuen Kopie mitochondrialer DNA gerettet werden.
Aufgabenstellung
Der Praktikumsversuch beschäftigt sich mit der phänotypischen Untersuchung des atmungsdefekten
S. cerevisiae Stamm YS10. In diesem Stamm wurde das Gen CYT2 (YKL087C) deletiert und durch
das LEU2 Gen ersetzt. CYT2 codiert für die Cytochrom c1 Hämlyase (CC1HL). Dieses Enzym
katalysiert die kovalente Verknüpfung einer Häm-Gruppe an die Cytochrom c1 Untereinheit des
respiratorischen Komplexes III und ist nuklear kodiert. Die Deletion der CC1HL hat zur Folge, dass
Komplex III nicht funktionell assembliert werden kann, was zu einem Verlust der Atmungsaktivität
des Stammes YS10 führt.
In dem folgenden Versuch soll getestet werden, ob es sich bei dem Stamm YS10 um eine Mutante
mit einem reversiblen oder irreversiblen Atmungsdefekt handelt. Hierzu soll der Stamm durch eine
plasmidlokalisierte Kopie des Wildtyp-Allels komplementiert werden. Die Transformanden werden
anschließend auf ihre Fähigkeit zur Verwertung von fermentierbaren und nicht-fermentierbaren
Kohlenstoffquellen überprüft. Weiterhin soll durch Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten
isolierter Mitochondrien festgestellt werden, ob die Einführung des Gens auf einem Plasmid die
respiratorische Defizienz der Mutante beheben kann.
Teil 1: Transformation und Mating von Saccharomyces cerevisiae
A: Transformation von Hefe
Für die Transformation von Hefen mit DNA hat sich die Lithium-Acetat-Methode durchgesetzt.
Hierbei werden Hefezellen während ihrer logarithmischen Wachstumsphase geerntet, mit LithiumAcetat (LiAc) behandelt und anschließend mit DNA inkubiert. Die eigentliche DNA-Aufnahme
erfolgt durch einen kurzen Hitzeschock bei 42°C. Zur Regeneration werden die Zellen kurz in
Vollmedium inkubiert und zuletzt auf Selektivmedien ausgestrichen. Diese Methode ähnelt der
Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen. Warum die Methode die Kompetenz der
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Zellen zur Aufnahme von DNA erhöht, ist unklar. Die Selektion transformierter Hefemutanten,
anders als bei Bakterien, erfolgt in der Regel durch plasmidvermittelte Stoffwechselauxotrophien
und nicht über Antibiotikaresistenzen.
Versuchsdurchführung
Im Versuch sollen folgende Transformationen durchgeführt werden:
Hefestamm
YS10
YS10
W303
zu transformierendes Plasmid
BS4
pRS316
pRS316
Hefe-Stämme:
Saccharomyces cerevisiae W303
MATα ade2-1, his3-11, 15, leu2-3, 112
(dient als Wildtyp)
trp1-1, ura3-1, can1-100
Saccharomyces cerevisiae YS10
W303, cyt2::LEU2
Plasmide:
Dra
I
BS4: pRS316 mit CYT2 als SmaI-Fragment
pRS316:
siehe Karte
DraI
Pst
I
EcoRV
NcoI
ScaI
ARS/CEN
Dra
I
ScaI
URA3
4000
AmpR
Dra
I Dra
I
Lösungen:
pRS316
100 mM
10 mM
1 mM
HincII
1000
4887bp
3000
2000
PvuII
SacI
10 mg/ml Lachssperma DNA in H2O
LiAc-Lösung
HincII
PvuII
PEG-Lösung
Lithiumacetat
TRIS HCl, pH 7,5
EDTA, pH 8,0
40%
10 mM
1 mM
Polyethylenglycol 4000
TRIS HCl, pH 7,5
EDTA, pH 8,0
KspI
XbaI
SpeI
BamHI
SmaI
AvaI
PstI
EcoRV
EcoRI
HindIII
ClaI
SalI
HincII
XhoI
AvaI
KpnI
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Durchführung
Tag 0 (wird vor dem Praktikum vom Assistenten bereits durchgeführt):
1. Vorkultur: 100 ml YPD-Medium werden mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei
30°C und 150 rpm inkubiert.
Tag 1 (Dienstag)
1. Die über-Nacht-Kultur wird in 50 ml frischem YPD-Medium auf eine OD600 = 0,1 verdünnt
(vom Assistenten bereits durchgeführt). Die Kultur wird bei 30°C und 150 rpm inkubiert bis
eine OD600 = 1 erreicht ist. (Die genaue OD wird vom Assistenten mitgeteilt.)
2. Die Zellen werden für 5 min bei 3000 rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert.
3. Die Zellen werden in 10 ml sterilem dd H2O resuspendiert und anschließend wie oben
abzentrifugiert.
4. Die Zellen werden in 1 ml LiAc-Lösung resuspendiert, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt
und für 2 min bei 7000 rpm und Raumtemperatur abzentrifugiert.
5. Das Pellet wird in 1 ml LiAcetat-Lösung resuspendiert.
6. 10 µl Lachssperma-DNA werden bei 95°C für 3 min denaturiert und anschließend sofort auf Eis
gestellt.
7. 100 µl Zellen werden mit 5 µl denaturierter Lachssperma-DNA und 5 µl (ca. 5 µg) PlasmidDNA gemischt. Anschließend wird der Ansatz für 30 min bei 30°C inkubiert.
8. Der Transformationsansatz wird mit 700 µl PEG-Lösung versetzt, kurz gevortext, bis die Probe
homogen ist und anschließend für 15 min bei 42°C inkubiert.
9. Die Zellen werden für 3 min bei 7000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig mit
einer Pipette abgenommen und verworfen.
10. Die Zellen werden in 1 ml YPD resuspendiert und 1 h bei 30°C inkubiert (Erholungsphase).
11. Anschließend werden die Zellen erneut für 3 min bei 7000 rpm abzentrifugiert, in 500 µl dd
H2O resuspendiert und erneut pelletiert.
12. 400 µl des Überstandes werden verworfen. Das Pellet wird in den restlichen 100 µl
resuspendiert und auf eine Selektiv-Platte (SD minus Uracil) ausplattiert. Es folgt eine
Inkubation bei 30°C für 3-4 Tage.
Tag 4 (Donnerstag oder Freitag)
Die Transformanden werden auf Komplementation getestet. Dazu werden einzelne Kolonien der
Transformationsplatte
auf
Platten
mit
Minimalmedium
mit
Glyzerin
(SGly-Ura)
und
Minimalmedium mit Glucose (SD-Ura) überstrichen und bei 30°C inkubiert. Nach drei bis fünf
Tagen wird das Wachstum der Zellen verglichen.
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B: Ermittlung des Mating Typ von Hefezellen
Hefen kommen als haploide und diploide Zellen vor. Zwei haploide Zellen können sich zu einer
diploiden Zelle vereinigen, sofern beide einem unterschiedlichen Mating Typ (MatA oder Matα)
zugehören. Sollte der Mating Typ einer Hefezelle nicht bekannt sein, so kann dieser durch Mating
mit speziellen Testerstämmen bekannten Mating Typs bestimmt werden. Die Selektion der
entstandenen diploiden Zellen kann oft über Stoffwechselauxotrophien erfolgen.
Im Versuch soll der Mating Typ des Stamms YS10 bestimmt werden. Als Tester stehen zwei Zellen
zur Verfügung, die Leucin auxotroph und, im Gegensatz zu YS10, Tryptophan prototroph sind. Im
Stamm ist das CYT2 Gen durch eine LEU2 Kassette disruptiert worden. Die Zellen sind also
Leucin prototroph. Bei erfolgreichem Mating von YS10 mit dem Tester des komplementären
Mating Typs entstehen also diploide Zellen, die im Gegensatz zu den haploiden Stämmen, auf
Minimalmedium ohne Leucin und Tryptophan wachsen können. Beim Mating mit dem Tester
gleichen Mating Typs entstehen hingegen keine diploiden Zellen.
Hefe-Stämme:
Saccharomyces cerevisiae BY4742
MATα, lys2∆0; his3∆1, leu2∆0; ura3∆0
Saccharomyces cerevisiae BY4741
MATΑ, met15∆0; his3∆1, leu2∆0; ura3∆0
Saccharomyces cerevisiae YS10
W303, cyt2::LEU2 (siehe oben)
Versuchsdurchführung (Parallel zur Hefetransformation)
2. Von den über-Nacht-Kulturen der drei Stämme wird jeweils 1 ml abgenommen, in ein
Eppendorfgefäß überführt und für 5 min bei 3000 rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert.
3. Das Medium wird abgenommen und die Zellen werden in 1 ml sterilem YPD resuspendiert.
4. Anschließend werden je 500 µl YS10 mit je 500 µl BY4741 bzw. BY4742 in je einem
Eppendorfgefäß gemischt und für 1 bis 2 h bei 30°C ohne Schütteln inkubiert.
5. Die Zellen werden für 3 min bei 7000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig mit
einer Pipette abgenommen und verworfen.
6. Anschließend werden die Zellen in 500 µl dd H2O resuspendiert und erneut pelletiert.
400 µl des Überstandest werden verworfen. Die Zellen werden in den restlichen 100 µl
resuspendiert und auf eine Selektiv-Platte (SD -Leu, -Trp) ausplattiert. Nach einer Inkubation bei
30°C für 3-4 Tage werden die Platten inspiziert.
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Medien:
YPD (Hefe-Vollmedium)
SC Platten (Minimalmedium)
1% (w/v)
2% (w/v)
2% (w/v)
1,7 g/L
5 g/L
2% (w/v)
Hefeextrakt
Pepton
Glucose
Yeast-Nitrogen-Base
Ammoniumsulfat
Agar
Kohlenstoffquelle:
2% (w/v)
Glucose (SD-Platten)
3% (v/v)
Glyzerin (SG-Platten)
Supplemente:
40 mg/L
20 mg/L
60 mg/L
80 mg/L
Tryptophan
Histidin
Leucin
Adenine
Teil 2: Präparation von Mitochondrien
Einführung
Für analytische Zwecke können Mitochondrien aus Hefezellen durch Zellaufschluß und
nachfolgende Fraktionierung der Organellen durch differenzielle Zentrifugation gewonnen werden.
Durch Aufschluß mit Glaskugeln in einem isotonischen Puffer wird ein Zellextrakt hergestellt. Die
rasche Durchführung der nachfolgenden Schritte, niedrige Temperaturen (4 °C) und der Zusatz von
Proteaseinhibitoren
(hier
PMSF,
Phenylmethyl-sulfonylfluorid)
verhindern
die
rasche
Proteindegradation. Die Zellkerne und Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei niedriger
Umdrehungszahl entfernt (2500 rpm, 5 min, 4 °C). Anschließend werden die leichteren
Mitochondrien durch Zentrifugation bei höherer Umdrehungszahl (9000 rpm, 12 min, 4 °C)
sedimentiert.
Der übrigbleibende "postmitochondriale"
Überstand
(PMS) enthält
kleine
Membranvesikel des ER und Golgi-Apparats sowie cytosolische Proteine. Die so erhaltenen
Mitochondrien-Fraktionen sind relativ unsauber, können jedoch z.B. für Expressionsanalysen oder
für die grobe Lokalisierung von Proteinen eingesetzt werden.
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Durchführung (Mittwoch)
Hinweis: Zentrifugenbecher sind keine Einmalartikel!
Materialien
•
Glaskugeln, Eis
•
Waschpuffer: 20 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 0.6 M Sorbitol.
•
0,1 M PMSF: gesättigte Lösung aus PMSF in 100 µl Ethanol.
Jede Gruppe präpariert Mitochondrien aus allen drei Hefestämmen.
1. Die Übernacht-Kulturen (jew. 200 ml YPD, OD600=1-2; für YS10 + BS4: Vorkultur SD,
Hauptkultur YPD) werden bei 3000 rpm, 5 min, 20 °C abzentrifugiert.
2. Das Pellet wird in 10 ml Waschpuffer resuspendiert, in ein 15 ml Falcon-Tube überführt und
erneut abzentrifugiert.
3. Das Pellet wird mit 2 ml Waschpuffer versetzt und vollständig resuspendiert (Vortex). Es
werden 20 µl des Proteaseinhibitors Phenylmethylsulfonylchlorid (PMSF), ca. 1 ml Glaskugeln
zugegeben (mit Hilfe eines Eppendorfgefäß abmessen) und für ca. 5 min auf Eis auf dem Kopf
inkubiert.
Alle Schritte von hier ab werden auf Eis durchgeführt, Zentrifugationen bei 4 °C.
4. Die Zellen werden durch dreimaliges Vortexen für 1 min. bei maximaler Geschwindigkeit
aufgeschlossen (über Kopf!). Zwischendurch werden die Proben für jeweils ca. 1 min. auf Eis
abgekühlt.
5. Die Mischung wird bei 2500 rpm, 5 min, 4 °C abzentrifugiert und der Überstand in ein frisches
15 ml Falcon-Tube überführt. Großzügig abnehmen! Es sollten möglichst keine Membranreste
überführt werden. Notfalls erneut zentrifugieren!
6. Der Überstand wird bei 8500 rpm für 12 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand (PMS) wird
verworfen. Das Pellet wird in 100 µl Waschpuffer aufgenommen (Mitochondrien).
7. Die jeweiligen Fraktionen werden in drei Portionen aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei -20 °C gelagert.
8. Bestimmen Sie den Proteingehalt ihrer Proben (siehe unten) und bereiten Sie von jeder
Präparation eine Probe von 100 µg Protein für die SDS-Gelelektrophorese auf.
8
Probenvorbereitung für SDS-Gelelektrophorese
1. Je Probe 100 µg Protein mit H2O auf 100 µl auffüllen, mit 100 µl 25 % Trichloressigsäure
(TCA) versetzen, vortexen, 10 min auf Eis stellen. Anschließend für 10 min bei 10000 rpm
zentrifugieren.
Trichloressigsäure ist ätzend!
2. Überstand absaugen, Pellet mit 1 ml Aceton (-20°C) versetzen, vortexen, 5 min auf Eis
inkubieren.
3. Zentrifugieren: 10 min bei 10000 rpm (4°C).
4. Überstand restlos absaugen, Probe vollständig trocknen lassen.
5. Probe in 30 µl Probenpuffer aufnehmen, 10 min bei RT schütteln.
Verfärbt sich der Indikator im Probenpuffer gelb, befinden sich TCA-Rückstände im Pellet und die
Probe kann sich nicht lösen. Durch die Zugabe von 1-2 µl 2M TRIS können Sie den pH-Wert
berichtigen.
6. Vollständig gelöste Proben 3 min bei 95°C denaturieren. Kurz abzentrifugieren.
Probenpuffer:
2 % SDS, 10% Glycerin, 0,005 % Bromphenolblau, 5 % βMercaptoethanol (frisch!) 62,5 mM TRIS/HCl pH 6,8,
Proteinbestimmung nach Bradford
1. 5 µl der Proben werden 1:10 mit Waschpuffer verdünnt.
2. Je 10 µl der Verdünnungen werden mit 90 µl H2O und 1 ml Bradford-Reagenz (Biorad)
versetzten, 5 min. bei RT inkubiert und anschließend die Absorption der Probe bei 595 nm
gegen Blindprobe (100 µl Waschpuffer plus 1 ml Bradford Reagenz) vermessen. Der
Proteingehalt kann anhand einer Eichkurve abgelesen werden.
3. Sollten einige Absorptionswerte zu gering, zu hoch, oder zweifelhaft ausfallen, sollte die
Proteinbestimmung wiederholt werden.
Eine Gruppe erstellt eine Eichkurve für den Kurs.
Für die weitere Untersuchung werden pro Hefestamm ca. 200 µg Protein benötigt.
9
Teil 3: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Western Blot und
Immunoanfärbung von Proteinen
In diesem Versuchsteil werden die Proteine isolierter Mitochondrien zunächst mittels SDSPolyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt, dann auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und dort die Anwesenheit der Cytochrom c1 Hämlyase (CC1HL) mittels
spezifischer Antikörper nachgewiesen.
Einführung
Die meisten Proteine binden das Detergenz Natrium-Dodecylsulfat (SDS) und bilden negativ
geladene SDS-Protein-Komplexe mit einem konstanten Ladungs-Masse Verhältnis. SDS denaturiert
die Proteine und unterbindet Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die SDS-Proteinkomplexe
verschiedener Proteine unterscheiden sich damit nur noch in ihrer Grösse und haben vergleichbare
hydrodynamische Eigenschaften. Dadurch können die Proteine im elektrischen Feld aufgrund ihrer
Molekularmasse aufgetrennt werden. Diese Technik wird als SDS-PAGE bezeichnet. Die negativ
geladenen SDS-Protein-Komplexe wandern im elektrischen Feld zum Pluspol. Dabei werden sie in
einer porösen Polyacrylamidmatrix wie in einem Molekularsieb nach ihrem Stokes-Radius und
damit nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt.
Anschließend können die aufgetrennten Proteine elektrophoretisch aus dem Gel auf eine Membran
(Nitrocellulose) transferiert werden, um sie einer Antikörperfärbung zugänglich zu machen
(Blotting). Um unspezifische Bindungen von Antikörpern an die Nitrocellulose zu verringern, wird
die Membran anschließend zunächst mit einer Proteinlösungen inkubiert, um alle freien
Proteinbindungsstellen
auf
der
Nitrocellulose
abzusättigen.
Anschließend
wird
die
Nitrocellulosemembran mit einem anti-Antigen-Antikörper („primärer“ Antikörper) inkubiert.
Überschüssiger Antikörper wird abgewaschen und der Blot mit einem anti-IgG-Antikörper
inkubiert. Dieser „sekundäre" Antikörper bindet an den primären Antikörper und ist üblicherweise
an ein Enzym gekoppelt, das leicht über eine Farbreaktion nachweisbar ist (Alkalische Phosphatase,
Peroxidase). Nach weiterem Waschen wird die Position des Antigens mit Hilfe des Enzyms an dem
zweiten Antikörper über eine Farb- oder Chemilumineszenz sichtbar gemacht.
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Ablauf (Mittwoch bis Freitag)
1. Kammer zusammenbauen, Trenn- und Sammelgel gießen, polymerisieren lassen (20 min).
(Mittwoch)
2. Proben vorbereiten und auftragen (30 min) (Donnerstag)
3. Trennung durch Elektrophorese (3h) (Donnerstag)
4. Blotten (1h) (Donnerstag)
5. Immunoanfärbung (3h) (Freitag)
Durchführung
1. Gießen des Gels: (Mittwoch)
1.
Glasplatten und "Spacer" mit dest. Wasser und 70% Ethanol säubern, trocknen,
zusammenklammern und im Gießstand fixieren.
2.
Mit Wasser auf Dichtigkeit testen. Anschließend gut Trocknen (Whatman Papier).
Achtung: Handschuhe anziehen! Acrylamid ist unpolymerisiert und in Lösung ein
Nervengift! Hautkontakt vermeiden, nicht polymerisierte Reste mit Überschuss an
TEMED/APS versetzen und erst nach Polymerisation in den Müll!
3.
Rezeptur für Trenngel zusammengeben, mischen und blasenfrei zwischen die Glasplatten
gießen, mit Isopropanol vorsichtig überschichten und auspolymerisieren lassen.
4.
Isopropanol abgießen, Probenkamm einsetzten und vorbereitetes Sammelgel aufgießen.
14 % Trenngel: (15 ml )
6 % Sammelgel: (5 ml)
7 ml
4.0 ml
3.75 ml
150 µl
30% Acrylamid
H2O
Trenngelpuffer
10 % SDS
1 ml
2.9 ml
1 ml
50 µl
30 % Acrylamid
H2O
Sammelgelpuffer
10 % SDS
100 µl
10 µl
10 % APS
TEMED
100 µl
10 µl
10 % APS
TEMED
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3. Probenauftrag: (Donnerstag)
1. Nach vollständiger Polymerisation des Gels Kamm vorsichtig entfernen.
2. Gelplatten in die Elektrophoresekammern setzen, Kammern mit Laufpuffer auffüllen.
3. In jede Tasche eine Probe vollständig auftragen.
4. 10 µl Molekulargewichtstandard (LMW) auftragen.
5. Elektrophorese mit folgenden Einstellungen: Spannung: 150V, Stromstärke: 30 mA pro Gel.
Der Lauf ist beendet, wenn die blaue Farbe aus dem Gel herausgelaufen ist! Dauer ca. 2 h.
4. Western Blot: (Donnerstag)
1. Schneiden Sie aus einem Bogen Whatman-Filter 4 Stücke in der Größe ihres Gels aus und
tränken sie diese mit Blotpuffer.
2. Zwei davon in die Blotkammer legen, Luftblasen mittels einer sauberen Glaspipette
herausdrücken. (Rollen!)
3. Ein passendes Stück Nitrocellulose ebenfalls in Blotpuffer waschen und blasenfrei auf die
Whatman-Filter legen.
4. Glasplatten aus der Apparatur entnehmen, Klammern und Spacer entfernen, obere Glasplatte
vorsichtig entfernen. Sammelgel entfernen, Trenngel vorsichtig auf die Nitrocellulose legen.
5. Die übrigen zwei Whatman-Filter auf dem Gel platzieren, Blasen herausrollen.
6. Blotkammer schließen und beschweren. Lauf für 1 h bei 250 mA. (RICHTIG POLEN!)
7. Blot kurz mit H2O waschen, 3 min. mit Farbfixierlösung inkubieren. (Ätzend!). Diese Lösung
kann mehrmals benutzt werden, deshalb zurück in die Flasche füllen!!!
8. Überschüssige Farbe mit Wasser abwaschen.
9. Kontrollieren Sie den gleichmäßigen Auftrag der Proteine und den Lauf des Gels.
10. Markieren Sie die Banden des Molekulargewichtsstandards mit Kugelschreiber.
Längenstandard:
11.
66 kDa, 45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 20,1 kDa, 14,4 kDa;
Die Blots werden auf der Höhe des 45 kDa Marker, des 24 kDa und des 20 kDa Markers
horizontal zerschnitten. Der >45 kDa Streifen wird mit Anti-Aco1p (ein Marker für Mitochondrien)
Antikörpern , der 24-36 kDa Streifen mit Anti-CC1HL, der 20 - 24 kDa Streifen mit Anti-Erv2p
(ein Marker fürs ER), und der <20 kDa Streifen mit Anti-YPR094w (ein Kernprotein) Antikörpern
immunodekoriert.
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5. Immunfärbung (Donnerstag & Freitag)
1. Nitrocellulosemembran durch Waschen mit TBST („TRIS-buffered saline“-Puffer + Tween 20)
entfärben.
2. Nitrocellulosemembran über Nacht im Kühlraum mit Blockpuffer inkubieren.
3. Primären Antikörper 1: 1000 in Blockpuffer verdünnen und Blot für mindestens 1h inkubieren.
4. 3x für je 5 min mit TBST waschen.
5. 2. Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper), Peroxidase gekoppelt: 1:10000 in Blockpuffer
verdünnen und Blot für etwa 1 h inkubieren. 3x für je 5 min mit TBST waschen.
6. Blot mit 20 ml DAB Lösung entwickeln, bis die Banden sichtbar werden (30 s bis 5 min).
7. Entwicklung durch Waschen mit dest. Wasser stoppen.
8. Blot trocknen und im Dunkeln aufbewahren.
Lösungen für Immunostaining
TBST:
Blockpuffer:
DAB-Lösung:
20 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,2 % Tween 20
5 % Milchpulver in TBST
20 ml enthalten 12 mg Diaminobenzidin (DAB), 200 µl 3 % NiCl2
und 200 µl 3 % H202. Puffer: 50 mM TRIS pH 7.6.
Erst bei Bedarf ansetzen, H202 und DAB erst zusetzen, wenn es gebraucht wird.
Lösungen für SDS-PAGE und Western Blotting:
30% Acrylamid:
30 % Acrylamid, 0,8 % N,N´-Methylenbisacrylamid
Bodengel:
20 % Acrylamid, 0,375 M TRIS/HCl pH 8,8, 0.1 % SDS
Trenngelpuffer:
1,5 M TRIS/HCl pH 8,8
Sammelgelpuffer:
0,625 M TRIS/HCl pH 6.8
APS-Lösung:
10 % Ammoniumperoxydisulfat in H2O
TEMED wird unverdünnt eingesetzt
25 % Trichloressigsäure;
Probenpuffer:
Laufpuffer:
Blotpuffer:
Farbfixierlösung:
10% SDS-Lösung in Wasser; Aceton (-20°C)
2 % SDS, 10% Glycerin, 0,005 % Bromphenolblau, 5 % βMercaptoethanol (frisch!) 62,5 mM TRIS/HCl pH 6,8,
25 mM TRIS, 192 mM Glycine, 0.1 % SDS
25 mM TRIS, 192 mM Glycine, 0.037 % SDS, 20% Methanol
0,2 % Ponceau S, 3 % Trichloressigsäure
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Teil 4: Charakterisierung der Enzymaktivität mitochondrialer Enzyme
Einführung
Die bekannteste Funktion von Mitochondrien ist die Synthese von ATP durch die oxidative
Phosphorylierung. In diesem komplexen Prozess wird die Energie der Oxidation von Nährstoffen
und Metaboliten durch die Synthese von ATP gespeichert. Der Prozess kann in zwei funktionelle
Bereiche aufgegliedert werden.
1. Die Elektronentransportkette dient zum Aufbau eines Membranpotentials an der inneren
Mitochondrienmembran (oder der bakteriellen Plasmamembran). Dabei werden Elektronen von
reduzierten Substraten wie NADH über verschiedene Stufen auf molekularen Sauerstoff übertragen.
Der Elektronentransport wird an hochmolekularen Proteinkomplexen (Atmungskettenkomplexe I,
III, IV) zum Ausschleusen von Protonen in den Intermembranraum (bzw. das bakterielle
Periplasma) benutzt.
2. Die F1Fo-ATP Synthase nutzt das Membranpotential zur Synthese von ATP aus ADP und
Phosphat. Dabei treibt der Rückfluß von Protonen aus dem Intermembranraum in die Matrix (bzw.
vom bakteriellen Periplasma ins Cytosol) die Phosphorylierung des ADP.
Der gesamte Prozeß kann mit mehreren Methoden (z.B. durch Messung des substratabhängigen O2Verbrauches an der O2-Elektrode oder anhand der NADH-abhängigen ATP-Synthese) verfolgt
werden. Alternativ können die Aktivitäten der einzelnen Atmungskettenkomplexe bestimmt
werden. Darüber hinaus finden in Mitochondrien weitere für die Zelle essentielle katabolische und
anabolische Prozesse statt. Als besonders wichtige Prozesse seien hier der Citratzyklus, die
Fettsäurebiosynthese und die Biosynthese von einigen Vitaminen und Kofaktoren (z.B. Häm)
genannt.
In diesem Versuchsteil sollen die isolierten Mitochondrien hinsichtlich ihrer Aktivität in der
folgenden Teilreaktion der Atmungskette untersucht werden:
Succinat -> (Succinat-Dehydrogenase; Komplex II) - Ubiquinone -> (Ubiquinone-Cytochrom c
Oxidoreduktase, Komplex III) -> Cytochrom c.
Hierbei kann die bei der Reduktion von Cytochrom c entstehende Absorptionszunahme
spektroskopisch verfolgt werden. Mitochondrien, die in diesem Test keine Aktivität zeigen, können
keine oxidative Phosphorylierung durchführen.
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Als Beispiel für Enzyme des Citratzyklus soll die Enzymaktivität der Malatdehydrogenase (MDH)
bestimmt werden. Dieses Enzym katalysiert den letzten Schritt des Citratzyklus:
Malat
NAD+
+
->
Oxalacetat
+
NADH
Im Versuch wird die Reaktion in umgekehrter Richtung gemessen und die mit der Bildung von
NAD+ einhergehende Absorptionsabnahme spektroskopisch verfolgt.
Durchführung (Donnerstag bzw. Freitag)
1. Succinat-Cytochrom c-Oxidoreductase Aktivität
1. Pipettieren Sie in zwei Plastikküvetten:
Probenküvette
Referenzküvette
920 µl
920 µl
Puffer
20 % Malonat
-
12 µl
Cytochrom c-Lösung
50 µl
50 µl
20 % Succinat
12 µl
12 µl
2. Proben
gut
mischen
und
Küvetten
in
die
Proben-
bzw.
Referenzposition
eines
Zweistrahlphotometers stellen.
3. Das Spektrometer bei einer Detektionswellenlänge von 550 nm auf eine Absorption von 0
setzen.
4. In beide Küvetten 50 µg Mitochondrien zugeben, mischen und sofort die Absorptionsänderung
für zwei Minuten bei einer Wellenlänge von 550 nm aufzeichnen.
5. Ermitteln Sie aus der Absorptionsänderung bei 550 nm die spezifische Aktivität ihrer Proben für
die Succinat-Dehydrogenase (d.h. Cytochrom c Reduktion pro Minute und mg Protein. Einheit:
[U/mg]). Der differentielle Extinktionskoeffizient (ε red - ε ox) von Cytochrom c beträgt bei 550
nm 20000 M-1 cm-1 (Lambert-Beer'sches Gesetz).
Lösungen:
Puffer: 50 mM TRIS, pH 8.0; 50 mM NaCl, 1 mM KCN (frisch zugeben).
20 % Natrium-Succinat, pH 7.5; 20 % Natrium-Malonat, pH 7.5;
20 mg/ml Cytochrom c (Pferdeherz)
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2. Enzymaktivität der mitochondrialen Malatdehydrogenase
1. Pipettieren Sie in eine Quarzküvette folgenden Ansatz:
Puffer
930 µl
NADH-Lösung
20 µl
Oxalacetat-Lösung:
10 µl
2. Den Ansatz gut mischen und die Küvette in die Probenposition eines Photometers stellen.
3. Das Spektrometer bei einer Detektionswellenlänge von 340 nm auf eine Absorption von 0
setzen.
4. 25 µg Mitochondrien auf 40 µl mit MDH-Puffer verdünnen und auf Eis stellen. 10 µl 1 %
Triton zugeben und vorsichtig mischen. Sofort weiterverarbeiten!
5. 50 µl der lysierten Mitochondrien zum Ansatz in der Küvette geben, mischen und sofort die
Absorptionsänderung bei 340 nm für zwei Minuten aufzeichnen.
6. Ermitteln Sie aus der Absorptionsänderung die spezifische Aktivität ihrer Proben für die MDH
(NADH-Oxidation pro Minute und mg Protein. Einheit: [U/mg]). Der Extinktionskoeffizient
von NADH beträgt bei 340 nm 6220 M-1 cm-1 (Lambert-Beer'sches Gesetz).
Lösungen:
Puffer:
50 mM TRIS, pH 7,4; 50 mM NaCl
Oxalacetat-Lösung:
5 mg/ml Oxalacetat in MDH Puffer
NADH-Lösung:
10 mg/ml NADH
Teil 5: Fluoreszenzmikroskopie an S. cerevisiae
In diesem Teil soll die Morphologie der Mitochondrien in S. cerevisiae mikroskopisch untersucht
werden. Hierzu wird ein Hefestamm verwendet, der ein Plasmid trägt, das für ein mitochondrial
lokalisiertes GFP codiert (pYES-mt-GFP). Die Mitochondrien können somit ohne weiteres direkt
als grün fluoreszierende Organellen dargestellt werden. Darüber hinaus wird durch Färbung der
zellulären DNA mit 4,6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) die DNA des Zellkerns und der
Mitochondrien sichtbar gemacht.
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Als weiteres soll anhand dieser Zellen demonstriert werden, wie man GFP als einen simplen
Reporter für Genexpression in vivo einsetzen kann. Das GFP Gen auf dem Plasmid pYES-mt-GFP
steht unter Kontrolle des Galaktose-induzierbaren Gal1-10 Promotors. Anzucht des Stamms auf
Medien mit unterschiedlichem Galaktosegehalt sollte daher die Intensität der mitochondrialen
Fluoreszenz der Zellen beeinflussen.
Angaben zum Plasmid:
pYES-mt-GFP:
GFP unter Kontrolle des Gal1-10 Promotors; CEN-Plasmid, URA3
Durchführung
Tag 0: (Kultur animpfen)
Der Stamm W303 [pYES-mt-GFP] wird am Mittwoch (Gruppen 1+2) bzw. Donnerstag (Gruppen
3+4) in jeweils 25 ml SD-Ura, SGal-Ura und SC Minimalmedium mit 1,5% Glucose und 0,5 %
Galaktose (-Ura) inokuliert und bei 30°C und 150 rpm über Nacht inkubiert.
Probenvorbereitung:
ACHTUNG! Das in dem Versuch verwendete DAPI Reagenz ist lichtempfindlich. Der Versuch
sollte daher zügig durchgeführt werden.
1. Je 500 µL Zellen (aus der log-Phase) werden für 5 min bei 3000 rpm abzentrifugiert.
2. Die Zellen werden in 1 ml sterilem dd H2O resuspendiert.
3. Die Suspension wird mit 10 µl DAPI Lösung (10 µg/ml) versetzt und 5 min. bei
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
4. Anschließend werden die Zellen 5 min. bei 3000 rpm geerntet und zweimal mit 1 ml sterilem dd
H2O gründlich gewaschen.
5. Zum Schluss werden die Zellen in 40 µl sterilem dd H2O aufgenommen und mit 40 µl
handwarmer 1%-iger low-melting-point Agarose versetzt.
6. Die Ansätze werden sofort auf einen Objektträger überführt und mit Deckgläsern abgedeckt.
7. Überschüssige Flüssigkeit wird mit einem fusselfreien Papiertuch vorsichtig abgesaugt.
Die Deckgläser werden mit Nagellack fixiert.
Fluoreszenz-Mikroskopie
DAPI: Anregung bei 350 nm
GFP: Anregung 420 nm; Emission 509 nm
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Protokoll
Fassen Sie Ihre Ergebnisse in einem kurzen Protokoll übersichtlich zusammen. Verzichten Sie
hierbei auf die Beschreibung von experimentellen Details und langen Einleitungen. Kommentieren
und interpretieren Sie jedoch Ihre jeweiligen Teilergebnisse. Beantworten Sie hierbei folgende
Fragen: Wie hoch sind die enzymatischen Aktivitäten der Mitochondrien? Wie sauber sind die
Fraktionen? Welches Molekulargewicht hat die Cytochrom c1-Häm-Lyase und die anderen im Blot
analysierten Proteine der Hefe? Zu welchem Schluß kommen Sie nach Ihren Ergebnissen
hinsichtlich des Atmungsdefektes des Hefestamms YS10?
Literatur:
1. Fred Sherman (1998): An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces cerevisiae.
erhältlich über: http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/index.html
2. Keith Wilson and John Walker (1995): Principles and Techniques of Practical Biochemistry.
4th Edition, Cambridge University Press.
3. Christine Guthrie and Gerald R. Fink (1991): Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology.
Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, San Diego.
4. Tzagoloff, A. and Dieckmann, C.L. (1990): PET genes of Saccharomyces cerevisiae.
Microbiological Reviews 54, 211-225.
5. Burke, D., Dawson, D, Staerns, T. (2000): Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
6. Lottspeich, F. and Zorbas, H. (1998): Bioanalytik. Spektrum Verlag, Berlin
7. Das Hefegenom findet man unter
http://www.proteome.com/ oder http://mips.gsf.de/proj/yeast/
http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/
8. Informationen zu Mitochondrien findet man unter
http://mips.gsf.de/proj/medgen/mitop/ oder http://www.gen.emory.edu/mitomap.html
http://www-lecb.ncifcrf.gov/mitoDat/
http://www3.ebi.ac.uk/Research/Mitbase/mitbase.pl