Biochemie_Breitling_Stryer_Kap28_1

Vertretung durch Frank Breitling (Institut für
Mikrostrukturtechnik (IMT), Campus Nord;
www.imt.kit.edu/529.php)
Vorlesungsdoppelstunde am 26.06.2014
Basis der Vorlesung:
Stryer, Biochemie, 6. Auflage, Kapitel 28
Replikation, Rekombination und Reparatur von DNA
Genauigkeit der DNA-Replikation
Mittelalterliche Bücher
mussten genau kopiert
werden.
DNA-Polymerase beim kopieren der
beiden Gegenstränge (DNA Replisome
image by Drew Berry, the Walter and Eliza
Hall Institute).
DNA-Replikation
Jeder Strang einer Doppelhelix (blau) kann
für die Synthese eines neuen
komplementären Stranges (rot) als Matrize
dienen (Semikonservative Replikation).
Genauigkeit der Kopierrate: etwa ein
Fehler pro 103 bis 104 kopierten Basen;
Genauigkeit nach Korrekturlesefunktion:
etwa ein Fehler pro 106 bis 107 kopierten
Basen;
Genauigkeit nach der Reparatur von
fehlgepaarten Basen: etwa ein Fehler pro
109 bis 1010 kopierten Basen.
Replikation, Schädigung und Reparatur von DNA
Beim Replikationsvorgang können Fehler auftreten (schwarze Punkte).
Weitere Defekte wie etwa Modifizierung von Basen, Quervernetzung sowie
Einzel- und Doppelstrangbrüche (gelb) werden durch anschließende DNAschädigende Reaktionen in die DNA eingeführt. Viele dieser Fehler werden
erkannt und in der Folge repariert.
B-Form und A-Form
der DNA
DNA kann verschiedene
Formen annehmen:
Die Kalottenmodelle von
jeweils zehn Basenpaaren
der DNA in A- und B-Form
lassen die rechtsgängige
Helixstruktur erkennen. Die
B-Form ist länger und
schmaler als die A-Helix.
Die Kohlenstoffatome des
Molekülrückgrats sind weiß
dargestellt. (Zeichnung
nach 1BNA.pdb und
1DNZ.pdb.)
Faltung der
Zuckerringe
In der A-DNA liegt das 3'-Kohlenstoffatom oberhalb der ungefähren Ebene,
die durch die vier anderen NichtWasserstoffatome des Zuckermoleküls
definiert wird. Diese Form heißt C-3'endo. In der B-DNA befinden sich die
Riboseeinheiten in der C-2'-endoForm, bei der C-2' außerhalb der
Ebene liegt.
Die Seiten der großen und kleinen Furche
Da die beiden glykosidischen Bindungen einander nicht diametral gegenüber
stehen, hat jedes Basenpaar zwei Seiten: eine größere, welche die große
Furche definiert, und eine kleinere auf der Seite der kleinen Furche. Die
Furchen sind von potenziellen Donoren (blau) und Akzeptoren (rot) für
Wasserstoffbrücken gesäumt.
Große und kleine Furche in der BForm der DNA
Man folge der großen Furche (orange)
und der schmaleren kleinen Furche
(gelb). Die Kohlenstoffatome im
Molekülrückgrat sind weiß dargestellt.
Die Grundstruktur der DNA zeigt sehr
klar, dass z.B. DNA-bindende Proteine
„messen“ können welche DNASequenz vorliegt.
Die Propellerverdrehung
Die 3D-Struktur von DNA ist überraschend vielfältig. Kristallstrukturdaten zeigten z.B., dass bei einigen kristallisierten DNA-Molekülen die
Basen eines DNA-Basenpaares nicht in einer Ebene liegen (sind nicht
coplanar angeordnet), sondern sind wie die Blätter eines Propellers
gegeneinander verdreht sind. Diese Propellerverdrehung verstärkt die
Basenstapelung in jedem Strang.
Die Z-DNA
DNA-Oligomere wie dCGCGCG nehmen unter bestimmten
Bedingungen eine andere Konformation an. Diese wird als Z-DNA
bezeichnet, weil die Phosphatgruppen im Molekülrückgrat
zickzackförmig angeordnet sind. (Zeichnung nach 131D.pdb.)
Vergleich der Struktureigenschaften von A-, B- und Z-DNA
StrukturEigenschaften
A
B
Helixtyp
Z
Gestalt
am breitesten
Höhe pro Basenpaar
Helixdurchmesser
Drehsinn
Konformation der glykosidischen Bindung
Anzahl der Basen pro
Helixwindung
Ganghöhe
Neigung der Basenpaare
zur Helixachse
Große Furche
Kleine Furche
0,23 nm
2,55 nm
rechtsgängig
anti
zwischen Aund Z-Typ
0,34 nm
2,37 nm
rechtsgängig
anti
11
10,4
0,38 nm
1,84 nm
linksgängig
abwechselnd
anti und syn
12
2,53 nm
11°
3,54 nm
1°
4,56 nm
9°
eng und sehr tief breit und tief
sehr breit und
eng und
flach
ziemlich tief
am schmalsten
flach
sehr eng und tief
Die Verwindungszahl
Das Schema zeigt die Zusammenhänge
zwischen Verwindungszahl (linking number, Lk),
Verdrehung (twist, Tw) und Windung (writhe,
Wr) in einem ringförmigen DNA-Molekül.
Topoisomere
Entspannte und negativ superspiralisierte DNA in einer elektronenmikroskopischen Aufnahme.
Struktur der
Topoisomerase I
Topoisomerasen entwinden
DNA, oder – im Gegenteil –
führen Superspiralen ein.
Dargestellt ist die Struktur
des Komplexes aus DNA
und einem Fragment einer
Typ-I-Topoisomerase des
Menschen. Die DNA liegt in
einem zentralen Hohlraum
innerhalb des Enzyms.
Mechanismus der Topoisomerase I
Nachdem die Topoisomerase I an die DNA gebunden hat, greift ein Tyrosin (Y)
ein Phosphat an, sodass ein Strang der DNA gespalten wird. Anschließend
vollführt der geschnittene Strang kontrollierte Drehungen um den anderen
Strang. Abgeschlossen wird die Reaktion durch Wiederverbinden des
gespaltenen Stranges. Der Vorgang führt dazu, dass sich ein
superspiralisiertes Plasmid ganz oder teilweise entspannt.
Topoisomerasen vom Typ 1 entwinden die DNA.
Bei Typ 1-Topoisomerasen wird ein Strang der Doppelhelix
reversibel gespalten
Die Hydroxylgruppe des Tyrosins 723 greift eine Phosphatgruppe in
einem Strang des DNA-Rückgrats an und bildet eine
Phosphodiesterbindung zwischen Enzym und DNA. Dabei wird die
DNA gespalten und es entsteht eine freie 5‘-Hydroxylgruppe.
Struktur der Topoisomerase II
Dargestellt ist eine zusammengesetzte
Struktur der Topoisomerase II aus der
aminoterminalen, ATP-bindenden
Domäne der Topoisomerase II aus E. coli
(grün) und dem carboxyterminalen
Abschnitt der Topoisomerease II aus Hefe
(gelb). Wie man leicht erkennen kann,
haben beide Einheiten eine
Dimerstruktur. Man beachte den
Hohlraum in der Mitte eines jeden
Fragments des Dimers. (Zeichnung nach
1EI1.pdb und 1BJT.pdb.)
Topoisomeren des Typs II führen
Superspiralisierungen in die DNA ein.
Dabei verbrauchen sie Energie in Form
von ATP.
Mechanismus der
Topoisomerase II
Die Topoisomerase II bindet zunächst an einen DNA-Doppelstrang,
der als G-Segment (für gate = Tor) bezeichnet wird. Die beiden
N-terminalen Domänen binden ATP und rücken dadurch näher zusammen. Diese
Konformationsänderung hat zur Folge, dass beide Stränge des G-Segments gespalten
werden, während gleichzeitig ein weiterer DNA-Doppelstrang, das T-Segment,
gebunden wird. Das T-Segment wandert dann durch die Lücke im G-Segment und
verlässt das Enzym an der Unterseite. Durch die Hydrolyse des ATP kehrt das Enzym
mit dem immer noch gebundenen G-Segment in den Ausgangszustand zurück.
Die Topoisomerase II der Bakterien dient als Angriffspunkt
für mehrere Antibiotika
Novobiocin blockiert die Bindung des ATP an die bakterielle
Topoisomerase II (= Gyrase), Naldixinsäure und Ciprofloxacin hemmen
die Spaltung und Wiederverbindung der DNA-Ketten.
Die Struktur der DNAPolymerase
Die erste DNA-Polymerase,
deren Struktur man aufklärte, war
das so genannte KlenowFragment der DNA-Polymerase I
aus E. coli. Ihre Polymeraseeinheit ähnelt wie die anderer
DNA-Polymerasen einer rechten
Hand mit Fingern (blau),
Handfläche (gelb) und Daumen
(rot). Zum Klenow-Fragment
gehört außerdem auch eine
Exonucleasedomäne, die falsche
Nucleotide entfernt. (Zeichnung
nach 1DPI.pdb.)
Der Wirkmechanismus der
DNA-Polymerase
An der Polymerasereaktion sind zwei
Metallionen (in der Regel Mg2+) beteiligt. Das eine geht eine koordinative Bindung zur 3'-Hydroxylgruppe
des Primers ein, während das andere
nur mit dem dNTP wechselwirkt. Die
Phosphatgruppe des Nucleosidtriphosphats bildet eine Brücke
zwischen den beiden Metallionen. Die
Hydroxylgruppe des Primers greift die
Phosphatgruppe an, sodass eine neue
O–P-Bindung entsteht.
Primer: Das zu verlängernde
Anfangssegment eines Polymers, von
dem die Elongation abhängt.
Die komplementären Formen der Basen bewirken die
Spezifität der Replikation
Das Basenanalogon rechts besitzt die gleiche Form wie Adenosin, aber chemische Gruppen, die in Basenpaaren Wasserstoffbrücken ausbilden, wurden
durch bestimmte Gruppen (rot) ausgetauscht, die keine Wasserstoffbrücken
bilden können. Dennoch zeigen die Untersuchungen, dass dieses Analogon,
wenn es sich in der Matrize befindet, den Einbau von Thymidin bei der DNAReplikation bewirkt.
Die Seiten der großen und kleinen Furche
Da die beiden glykosidischen Bindungen einander nicht diametral gegenüber
stehen, hat jedes Basenpaar zwei Seiten: eine größere, welche die große
Furche definiert, und eine kleinere auf der Seite der kleinen Furche. Die
Furchen sind von potenziellen Donoren (blau) und Akzeptoren (rot) für
Wasserstoffbrücken gesäumt.
Wechselwirkungen an der kleinen Furche dienen der DNAPolymerase als „Messlatte“
DNA-Polymerasen wirken gegenüber den Basenpaaren in der kleinen Furche
als Donoren für zwei Wasserstoffbrücken. An den betreffenden Positionen
stellen alle Watson-Crick-Basenpaare Wasserstoffbrückenakzeptoren bereit.
Als Beispiel ist hier das AT-Basenpaar abgebildet.
Selektive Form
Die Bindung eines Desoxynucleosidtriphosphats (dNTP) an die DNA-Polymerase löst eine Konformationsänderung aus. Dabei entsteht eine enge Tasche für
das Basenpaar, das aus dem dNTP und seinem Partner im Matrizenstrang
besteht. Diese Konformationsänderung ist nur dann möglich, wenn es sich bei
dem dNTP um den Watson-Crick-Partner der Base in der Matrize handelt.
Warum gibt es ähnliche Konformationsänderungen bei allen Enzymen, die in
irgendeiner Form NTPs oder dNTPs hydrolisieren?
Die Funktion des Primers
Als Primer der DNA-Replikation dient ein kurzes RNA-Stück, das von einer
Primase, einer RNA-Polymerase, synthetisiert wird. Die Primer-RNA wird zu
einem späteren Zeitpunkt der Replikation ausgeschnitten.
Okazaki-Fragmente
An der Replikationsgabel werden beide DNA-Stränge gleichzeitig in 5'→3‚
Richtung synthetisiert. Der Leitstrang wird kontinuierlich zusammengesetzt,
der Folgestrang in Form kurzer Teile, die man Okazaki-Fragmente nennt.
Die DNA-Ligase-Reaktion verknüpft die Okazaki-Fragmente
miteinander
Die DNA-Ligase katalysiert die Verknüpfung eines DNA-Stranges, der
eine freie 3'-OH-Gruppe besitzt, mit der freien 5'-Phosphatgruppe eines
anderen. Bei Eukaryoten und Archaea wird ATP dabei zu AMP und PPi
gespalten, um die Reaktion anzutreiben. In Bakterien stammt die
Energie aus der Spaltung von NAD+ zu AMP und
Nicotinamidmononucleotid (NMN).
Struktur einer Helikase
Die bakterielle Helikase
PcrA enthält vier Domänen:
A1, A2, B1 und B2. Zur A1Domäne gehört eine
P-Schleife-NTPase-Falte
(violett unterlegt; P-Schleife
grün dargestellt). Die B1Domäne hat insgesamt eine
ähnliche Struktur, ihr fehlt
aber die P-Schleife und sie
bindet keine Nucleotide.
Einzelsträngige DNA bindet
an die Domänen A1 und
B1 in der Nähe der
Berührungsflächen zu A2
und B2.
(Zeichnung nach
3PJR.pdb.)
Die Trennung der DNA-Stränge erfordert spezifische
Helikasen und die Hydrolyse von ATP
Anfangs binden die Domänen A1 und B1 von PcrA einzelsträngige DNA.
Nachdem ATP gebunden wurde, schließt sich die Spalte zwischen den beiden
Domänen und die Domäne A1 gleitet an
der DNA entlang. Durch die Hydrolyse des ATP öffnet sich die Spalte und zieht
die DNA von Domäne B1 in Richtung A1. Der gleiche Vorgang wiederholt sich
vielfach, sodass die DNA entwunden wird. Die Punkte auf dem roten Strang,
die zwei Orte auf dem Strang markieren, bewegen sich, wenn die Doppelhelix
entwunden wird.
Das Sequenzmotiv P-Schleife-NTPase-Falte kommt auch in vielen anderen
Proteinen vor, die eine starke Konformationsänderung nach der Bindung von
einem Nucleotid durchmachen. Beispiele sind G-Proteine, NMP-Kinasen und
Myosin.
Konservierte
Aminosäuren in Helikasen
Beim Vergleich der Aminosäuresequenzen mehrerer Hundert
Helikasen fand man mehrere
Abschnitte mit stark konservierter
Sequenz (farbig dargestellt). Auf die
Struktur von PcrA übertragen, liegen
diese konservierten Bereiche an der
Grenzfläche zwischen den Domänen
A1 und B1 sowie an der Oberfläche,
die das ATP bindet. (Zeichnung nach
3PJR.pdb.)
Dies unterstützt die Annahme, dass
alle Helikasen ganz ähnliche
Konformationsänderungen
durchmachen.
Struktur der gleitenden DNA-Klammer
DNA-Polymerasen sind
hochprozessiv: Die β2Dimeruntereinheit der
DNA-Polymerase III
bildet einen Ring, der
den DNA-Doppelstrang
umfasst. Man beachte
den zentralen Hohlraum,
durch den die DNA
gleitet. Durch die
Umklammerung der
DNA in diesem Ring
kann die Polymerase die
DNA entlangwandern,
ohne von ihrem Substrat
abzufallen.
Die Replikationsgabel
Bei E. coli werden etwa 2.000
Basen pro Sekunde eingebaut!
Schematische Darstellung der
Anordnung der Polymerase III
und der assoziierten Enzyme
und Proteine, wie sie bei DNA
vorkommen, die repliziert wird.
Die Helikase trennt die beiden
Stränge der ursprünglichen Doppelhelix, sodass
die DNA-Polymerasen jeden Strang als Matrize
für die DNA-Synthese verwenden können.
Abkürzung: SSB, einzelstrangbindendes Protein.
Das Holoenzym der DNAPolymerase III
Jedes Holoenzym besteht aus zwei Kopien des
Core-Enzyms der Polymerase, das die
Untereinheiten α, ε und θ sowie zwei Kopien
der β-Untereinheit umfasst und mit der
zentralen Struktur verknüpft ist. Diese enthält
den clamp loader-Komplex und die hexamere
Helikase DnaB.
Posaunenmodell
Die Replikation des Leit- und des
Folgestranges erfolgt koordiniert,
indem die Matrize des Folgestranges
eine Schleife bildet. Dadurch entsteht
eine Struktur, die sich so ähnlich wie
der Außenzug einer Posaune bewegt
und sich mit der Vorwärtsbewegung der
Replikationsgabel verlängert. Wenn die
Polymerase des Folgestranges einen
Abschnitt erreicht, der bereits repliziert
ist, wird die gleitende Klammer
freigesetzt und eine neue Schleife
gebildet.
Die DNA-Polymerase I entfernt
den Primer und füllt die Lücken
zwischen den neu gebildeten
Okazaki-Fragmenten auf.
Bei E. coli beginnt die DNA-Replikation an einer einzigen
Stelle, dem Replikationsursprung
OriC ist 245 Basenpaare lang und enthält eine Tandemanordnung von
drei nahezu identischen Oligonucleotiden mit je 13 Nucleotiden (grün)
sowie fünf Bindungsstellen (gelb) für das DnaAProtein. DnaA gehört zu
der Familie der P-Schleifen-NTPasen. Der daraus gebildete Komplex
zerfällt nach der Hydrolyse von ATP.
Zusammenbau von DnaA
Monomere von DnaA binden
an ihre Bindungs-stellen (gelb)
in der oriC-Region und bilden
zusammen eine komplexe
Struktur, möglicherweise ein
ringförmiges Hexamer, wie es
hier dargestellt ist. Diese
Struktur markiert den
Replikationsursprung und
unterstützt die Trennung der
DNA-Stränge in den ATreichen Abschnitten (grün).
Auch DnaA hat das
Sequenzmotiv P-SchleifeNTPase-Falte: Nach der
Hydrolyse von ATP ändert sich
seine Konformation stark und
das DnaA Hexamer zerfällt.
Einige Arten von DNA-Polymerasen
Bezeichnung
Funktion
Prokaryotische Polymerasen
DNA-Polymerase I
entfernt den Primer und füllt die Lücken im Folgestrang
DNA-Polymerase II
DNA-Reparatur
(fehleranfällige Polymerase)
DNA-Polymerase III
Hauptenzym der DNA-Synthese
Eukaryotische Polymerasen
DNA-Polymerase a
Initiatorpolymerase
Primaseuntereinheit
synthetisiert den RNA-Primer
DNA-Polymerasehängt etwa 20 Nucleotide an den Primer
untereinheit
DNA-Polymerase b
DNA-Reparatur
(fehleranfällige Polymerase)
DNA-Polymerase d
Hauptenzym der DNA-Synthese
Bei Eukaryonten beginnt die DNA-Synthese an mehreren Stellen („Replikons“).
Analog zu E. coli bilden sich zunächst Replikationsursprungskomplexe aus sechs
verschiedenen Proteinen, die alle zu DnaA homolog sind.
Anschließend wird eine Helikase mobilisiert.
Für das kopieren eines eukaryotischen Replikons werden zwei verschiedene DNAPolymerasen benötigt.
Der eukaryotische
Zellzyklus
Bei Eukaryoten müssen DNAReplikation und Zellteilung
genau koordiniert werden. Die
Mitose (M) findet immer erst
nach der DNA-Synthese (S)
statt. Die beiden Vorgänge sind
durch die zwei Phasen G1 und
G2 (G für gap = Lücke) getrennt.
Bei Eukaryonten beginnt die
DNA-Synthese an mehreren
Stellen („Replikons“).
Telomere sind besondere Strukturen an den Enden linearer
Chromosomen
Die DNA an den Telomeren enthält mehrere Hundert
Tandemwiederholungen aus einer Sequenz aus sechs Nucleotiden.
Aus dem Ende des Telomers ragt ein einzelsträngiger Abschnitt des Greichen Stranges. Nach einem Modell für den Telomermechanismus
wandert dieser Strang in den Doppelstrang ein, sodass sich eine große
doppelsträngige Schleife bildet.
Bildung der Telomere
Der Synthesemechanismus für den
G-reichen Strang der Telomer-DNA.
Die RNA-Matrize der Telomerase ist
blau dargestellt, die an den Greichen Strang des Primers
angefügten Nucleotide sind rot.
(Nach Blackburn EH (1991) Nature
350: 569–573.)
Der Proteinbestandteil der
Telomerase ist mit den Reversen
Transkriptasen verwandt.
Telomerasen bringen ihre eigene
Matrize mit.
Bei der DNA-Replikation kann es zu Fehlern kommen:
Vermehrung von Triplettwiederholungen
Sequenzen mit Tandemwiederholungen von Triplettsequenzen können länger
werden und weitere Tripletts aufnehmen, wenn einige Wiederholungseinheiten
bei der Replikation eine Schleife bilden. Die mit dem roten Strang als Matrize
gebildete Doppelhelix enthält dann zusätzliche Sequenzen, die der
ausgestülpten Region entsprechen. Solche Fehler treten bei der Krankheit
Chorea Huntington auf.
Basen können durch oxidierende, alkylierende Agenzien
und durch Licht beschädigt werden
Wenn Guanin zu 8-Oxoguanin oxidiert wird, kann die so beschädigte
Base über einen Randbereich des Moleküls, der sonst nicht an der
Ausformung von Basenpaaren beteiligt ist, mit Adenin ein Basenpaar
bilden.
Desaminierung von Adenin kann zu Mutationen führen
Die Base Adenin kann zu Hypoxanthin desaminiert werden.
Hypoxanthin bildet Basenpaare mit Cytosin ähnlich wie Guanin, sodass
die Desaminierungsreaktion zu einer Mutation führen kann.
Manche mutagene Verbindungen
entstehen erst durch Leberenzyme
Aflatoxin, ein Produkt einzelliger
Pilze, die auf Erdnüssen gedeihen,
wird durch Cytochrom P450 aktiviert.
In dieser hoch-reaktiven Form
verändert sie das Guanin und
andere Basen in der DNA, sodass
es zu Mutationen kommt.
Manche Mutationen entstehen durch (UV-) Licht
Durch ultraviolettes Licht entstehen Querverbindungen zwischen
benachbarten Pyrimidinen in einem Strang der DNA. Wenn diese
Thymindimere nicht repariert werden entstehen Mutationen in der
Erbsubstanz.
Eine Verbindung, die Quervernetzungen erzeugt
Die Verbindung Psoralen und seine Derivate können durch zwei
reaktive Stellen, die mit Nucleotidbasen reagieren, Quervernetzungen
zwischen DNA-Strängen erzeugen.
DNA-Schäden können auf verschieden Weise erkannt und
repariert werden: (1) Korrekturlesen
Wenn eine falsche Base eingebaut wird, verlangsamt sich die DNA-Synthese
aufgrund der Schwierigkeit, ein Nicht-Watson-Crick-Basenpaar durch die
Polymerase zu fädeln. Gelegentlich verlässt die wachsende Polynucleotidkette
das Polymerasezentrum der DNA-Polymerase und wandert zum Exonucleasezentrum. Dort werden ein oder mehrere Nucleotide aus der neu synthetisierten
Kette herausgeschnitten und möglicherweise falsche Basen entfernt.
(2) Die Mismatch-Reparatur
kommt in allen Zellen vor
Die Reparatur von Fehlpaarungen in
der DNA von E. coli beginnt mit dem
Wechselspiel der Proteine MutS,
MutL und MutH. MutS erkennt eine
GT-Fehlpaarung und MutH spaltet in
der Nähe der Fehlpaarung das
Rückgrat. Ein Teil des DNAStranges, der das fehlerhafte Thymin
enthält, wird von der Exonuclease I
ausgeschnitten und von der DNAPolymerase III neu synthetisiert.
(Nach Service RF (1994) Science
263: 1559–1560.)
(3) Die DNA-Photolyase nutzt
Lichtquanten um Pyrimidindimere in
die ursprünglichen Basen zu spalten.
(4) Basenexcisionsrearatur
Dargestellt ist der Komplex aus
dem DNA-Reparaturenzym AlkA
und dem Analogon eines DNAMoleküls, dem eine Purinbase
fehlt (eine apurinische Stelle).
Der Zucker im DNA-Rückgrat
der apurinischen Stelle
„springt“ zum Ausschneiden
aus der DNA-Doppelhelix in
das aktive Zentrum des
Enzyms.
(4) Excisionsreparatur
Die Reparatur eines DNAAbschnitts mit einem Thymindimer
durch die aufeinander folgende
Tätigkeit
(i) einer spezifischen Excinuclease,
(ii) einer DNA-Polymerase und
(iii) einer DNA-Ligase.
Das Thymindimer ist blau
dargestellt, der neue DNA-Abschnitt
ist rot. (Nach Hanawalt PC (1982)
Endeavour 31: 83.)
Warum gibt es Thymin statt
Uracil in der DNA?
Durch spontane Desaminierung von
Cytosin entstehen häufig Uracilreste in
der DNA. Diese – und nicht die ThyminStellen – werden von dem Enzym
Uracil-DNA-Glycosylase erkannt und
ausgeschnitten. Danach wird der
Bereich ohne Pyrimidin („AP“) durch
eine Endonuclease geschnitten und die
Fehlstelle durch Cytosin ersetzt.
Die Methylstelle von Thymin ist die
Markierung, die es von desaminiertem
Cytosin unterscheidet!
Viele Krebsarten entstehen durch
fehlerhafte DNA-Reparatur
Krebszellen sind häufig durch DNAschädigende Moleküle angreifbar:
(1) Sie teilen sich häufig
(2) Sie haben häufig Defekte in DNAReparatursystemen
Cyclophosphamid und Cisplatin schädigen
die DNA schnell wachsender Zellen mehr als
die DNA normaler Zellen. Deswegen kann
manchmal der Krebsteufel mit diesen
Belzebuben ausgetrieben werden.
Es gibt aber auch genetisch bedingte
Schwächen in den Reparatursystemen, z.B.
bei Xeroderma pigmentosum. Dabei sind
Komponenten des Nucleotidexcisionsreparatursystems mutiert. Viele betroffene
entwickeln bösartige Hauttumoren unter
Einfluss von Sonnenlicht.
Der Ames-Test
A) Eine Petrischale mit etwa 109 Bakterien, die kein Histidin synthetisieren
können. B) Zugabe eines Stückes Filterpapier mit einem Mutagen, das zu einer
großen Zahl von Revertanten führt, die Histidin synthetisieren können. Diese
Revertanten werden nach zwei Tagen als Ring von Kolonien um das
Filterpapierstück sichtbar. Die wenigen sichtbaren Kolonien in Schale A sind
spontane Revertanten. (Ames BN et al (1975) Mutat Res 31: 347–364.)
Die DNA-Rekombination spielt bei der Replikation, Reparatur
und anderen Reaktionen der DNA eine wichtige Rolle
Zwei DNA-Moleküle können rekombinieren und neue Moleküle mit Abschnitten
beider Ausgangsmoleküle bilden. Dies ist wichtig für:
(1) Unterbrochene Replikation
(2) Reparatur von Doppelstrangbrüchen
(3) Meiose
(4) Herstellung der Antikörpervielfalt
(5) Für Viren, die so ihr genetisches Material in die Wirtszelle einbauen
(6) Für die Gentechnik, um z.B. „Knockout-Mäuse“ herzustellen.
Stranginvasion
Dieser Vorgang, an dem Proteine wie RecA beteiligt sind, kann eine
Rekombination initiieren.
Eine Stranginvasion kann viele Prozesse in Gang setzen,
beispielsweise die Reparatur von Doppelstrangbrüchen, wobei der
Rekombinationspartner ein intaktes DNA-Molekül ist mit einer
überlappenden Sequenz.
Mechanismus der Rekombination
Zu Beginn lagern sich zwei DNA-Moleküle zu einer Rekombinationssynapse zusammen.
In jeder Doppelhelix wird ein Strang von der Rekombinase geschnitten, und die dabei
freiwerdenden 3'- Enden werden jeweils mit einem Tyrosinrest (Y) des Enzyms verknüpft. Die neuen Phosphodiesterbindungen bilden sich, wenn ein 5'-Ende des anderen
gespaltenen Stranges dieses Tyrosin-DNA-Addukt angreift. Nach der Isomerisierung
wiederholen sich diese Schritte, sodass die rekombinierten Produkte entstehen.
Rekombinasen und
Topoisomerase I
Der direkte Vergleich von CreRekombinase (blau) und Topoisomerase I (orange) zeigt, dass
beide Enzyme eine gemeinsame
Kernstruktur besitzen. Die Tyrosinreste, die an der DNA-Spaltung
mitwirken, sind für beide Enzyme
als rote Kugeln eingezeichnet.
(Zeichnung nach 2CRX.pdb und
1A31.pdb.)