DNA diagnostics (simple trait) - Ruhr

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Mukoviszidose
Cystische Fibrose (CF)
- Einführung, Pathogenese
- Klinik
- Genetik, Mutationen
- Wiederholungsrisiko
- Gentherapie
CF
Inzidenz
1/3300 Lebendgeburten
Frequenz
abhängig von Ethnizität
Diagnose
>70% im 1. Lebensjahr
90% bis zum 8. Lebensjahr
Mutation
CFTR-Gen (CF transmembrane
conductance regulator)
Funktion CFTR
H2O Na+ Cl-
1. apikaler Cl-Kanal
2. reguliert
andere
apikale Kanäle
normal
CF-Zelle
bronchialer CFTR et al.
Adenosin
ORCC
P2Y2
Adenosin
KCNJ1
CFTR
Na+K+2Cl-
ENAC
Na/K-ATPase
CFTR – Proteinexpression
Bronchien
Pankreasgang
Schweißdrüsen
Intestinum
Gallenwege
Vas deferens
CF-Symptome
Lunge
52%
Gedeihstörung / Ernährungspr.
43%
Mekonium-Ileus
21%
CBAVD (congenitale bilaterale
♂♂
Aplasie vas deferens, Azoospermie)
[Familienanamnese
17%]
Nasen-Sinus:
CFSymtome
Sinusitis
Polypen
Lunge
Atemwegs-Obstr.
Bronchiektasen
Pneumothorax
Leber
Gallengangsstau
Pankreas
Enzymdefizienz
Diabetes
Intestinum
Mekoniumileus
DIOS
Rektumprolaps
Infertilität
CBAVD
Haut
[Cl]- im Schweiß ↓
CF - Diagnose
Familienanamnese
Schweißtest: [Cl-] 
5% falsch negativ
nasale Potentialdifferenz
Genotypisierung
CF - Diagnose pränatal
Ultraschall: echodichter Darm,
Mekonium-Peritonitis
Genotypisierung
Chorionzottenbiopsie 10.-12. SSW
Amniozentese 13.-16. SSW
Vererbungsmodus CF ?
A
autosomal dominant
B
autosomal rezessiv
C
X-chromosomal
D
mitochondriale Vererbung
E
multifaktoriell
Definition
Allele - verschiedene Variationen eines Gens/
DNA-Sequenz an einem definierten Locus
der homologen Chromosomen
Bevölkerung: bis zu mehrere 100 Allele
ein Individuum: normalerweise 2 Allele
Definition
Compound-Heterozygotie = kombinierte Het.
an einem Genort (Locus) bei einer betroffenen
Person zwei unterschiedlich mutierte Allele
CFTR-Gen, -Protein
5‘
3‘
Exon
Intron
N
C
Glykosylierung
Zellmembran
Cytoplasma
Transmembran
Segmente
NukleotidBindestelle
R Domäne
Cl-
Mutationsklassen CFTR-Gen
Cl- Cl- Cl-
Wt CFTR
Protein
I
II
III
Cl-
Cl-
Cl-
IV
V
VI
Ø Protein Ø Transport Ø Funktion ↓ Funktion
G542X
…
ΔF508
…
G551D
…
R117H
…
↓ Protein ↓ ProteinStabilität
3272-26A>G ΔF508
…
…
Ø
ProteinFaltung
Fehlregulation
Ø
Protein
RNA ↓↓
Leitungsdefekt
Umsatz
↑↑
Protein
↓↓
http://cftr2.org/mutation.php?view=general&mutation_id=23
Mutationen führen zum Verlust der CFTRProteinproduktion. Welche der Aussagen ist
am wenigsten wahrscheinlich ?
A
B
C
D
E
Missense-Mutationen
Nonsense-Mutationen
Frame shift-Mutationen
Deletionen von Basen
Insertionen von Basen
Mutationen M
stumme M
Ø Aminosäure-Austausch
 DNA-Polymorphismus ?
konservative M
Ø Funktionsänderung im Protein
frame shift M
geänderter Leserahmen
nonsense M
vorzeitiger Translationsstop
CF-Inzidenz
Finland
1:15000
Canada
1:900 1:2500
USA Eur. 1:2500
African 1:15000
Latin 1:10000
Native 1:10500
Germany
1:3300
Ireland
1:1400
Portugal
1:6000
Australia
1:2900
New Zealand
1:3200
Detektionsraten von CFTR-M
Anteil F508-M
Population
Belgien
Bulgarien
Kreta
Czech. Republik
Dänemark
Estland
Finnland
D Niedersachsen
D Rheinland-Pfal
GR Pelopones/Attica
GR Thesalia/Macedonien
Ungarn
I Friaul
I Umbrien
Irland Republik
Nordirland
ΔF508
Population
(%)
75
65
46
70
87
64
46
80
52
57
67
44
37
68
73
62
Israel
Libanon
Niederlande
Norwegen
Polen
P Faro/Beja
P Lissabon
Russland
Slovakei
SP Extremadura
SP Baskenland
Schweden
Schweiz
Tunesien
Türkei
Ukraine
ΔF508
(%)
32
35
74
67
66
68
48
62
56
46
71
73
43
18
27
54
CFTR-M
CFTR-M
>2000 M bekannt
100 M bei D-stämmigen Betroffenen
D-Population: 7 M mit Frequenz  1%
> 50% Betroffene in D F508 homozygot
 DNA-Sequenzanalyse
CF M database (2016)
M-Typ
n
missense
795
40
frame shift
Spleiß
nonsense
313
228
167
16
11
8
40
52
15
2
3
1
Sequenzvariation
269
13
Unbekannt
128
6
in frame in/del
große in/del
Promotor
Frequenz %
M-Analysen
compound heterozygot für missense M und 35ΔG
Wildtyp
mutiert
...GAGCCAGATCT...
C→T
...ACACCCCCCAGGATC...
6xC→5xC
homozygot 35ΔG
Wildtyp
mutiert
...ACACCCCCCAGGATC...
6xC→5xC
Genotyp/Phänotyp Korrelation
F508-homozygot  Pankreasinsuffizienz
Ø Genotyp/Phänotyp Korrelation bei
Lungenbeteiligung
CF-Symptomatik: Variabilität durch genetic modifiers
Lungen, Nebenhöhlen
Infektion, Entzündung,
Obstruktion
Schweißdrüsen
↑ [Cl]-Konzentration
im Schweiß
Leber
Zirrhose
Pankreas
exokrine Dysfunktion,
Diabetes, Pankreatitis
Intestinum
Mekonium-Ileus
distale intestinale
Obstruktion
Fortpflanzung
obstruktive Infertilität ♂
Atemwegsobstruktion
TGFB1, MBL2, EHF, APIP,
Chr20q13.2, SLC6A14,
SLC9A3
P. aeruginosa-Infektion
MBL2, DCTN4,
SLC6A14
exokrine Insuffizienz
Diabetes-Risiko, -Beginn
TCF7L2, CDKAL1,
CDKN2A/B, IGF2BP2
SLC26A9
intest. Obstruktionsrisiko
MSRA, SLC6A14,
SLC26A9, SLC9A3
BMI
Chr1036.1, Chr5q14
CFTR-Genotyp
genetic modifiers
Umwelt-, Zufallsfaktoren
DNA-Test
sequenzielles Vorgehen:
erst häufige Mutationen testen (Kit)
dann komplette Sequenzierung (
)
noch teuer
klinisches Bild berücksichtigen !
DNA-Diagnostik
I
Interpretation des DNA-Tests
- Mutation oder Polymorphie?
II Trias: Beratung  DNA-Test  Beratung
- DD
- pränatal (PID)
Gendiagnostik-Gesetz GenDG
I
Arztvorbehalt / prädikt. FA Humangenetik
II
Einwilligung nach suffizienter Aufklärung
III
Ergebnis nur an Ratsuchenden
IV
keine pränatale Untersuchung auf spät
manifestierende Erkrankungen
ad
GendiagnostikGesetz (GenDG)
- Aufklärung
Wiederholungsrisiko
heterozygot
heterozygot
?
Anlageträger
gesund
1/4
Anlageträger
Anlageträger
2/4
krank
1/4
Erkrankungsrisiko:
1/4
Wiederholungsrisiko ?
Die 20-jähr. klinisch unauffällige Schwester zweier
Geschwister mit CF ist schwanger und fragt nach der
Wahrscheinlichkeit, dass das Kind CF-betroffen sein
wird. Die Familienanamnese des Kindsvaters ist leer
hinsichtlich CF.
Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit unter der
Voraussetzung, dass 1 von 10 000 Neugeborenen
von CF betroffen ist.
Wiederholungsrisiko
heterozygot
heterozygot
?
Erkrankungsrisiko:
1/4
Risiko für Anlageträgerschaft: 2/3
Anlageträger
Anlageträger
klinisch
gesund
1/3
Anlageträger
2/3
unauffällig
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
Populationsgleichgewicht:
Verteilung in den Allel-
Gameten
der Eltern
A (p)
a (q)
A (p)
AA
(p2)
Aa
(pq)
a (q)
Aa
(pq)
aa
(q2)
häufigkeiten ändert sich
nicht von einer Generation
zur nächsten
Genort mit 2 Allelen:
p2
q2
+ 2pq + = 1
[AA] [Aa] [aa]
Normalbevölkerung
p2 + 2pq + q2 = 1
[AA] [Aa] [aa]
Homozygoten-Frequenz
seltene Erkrankung
Heterozygoten-Frequenz
1:10 000 (q2)
 q = 1:100
p=1
2pq = 2:100 = 1:50
Wiederholungsrisiko
heterozygot
heterozygot
?
Risiko für Anlage-
Heterozygotenfrequenz
1/50
trägerschaft: 2/3
Erkrankungsrisiko beim Kind:
2/3 x 1/50 x 1/4 = 1/300
(0,33%)
Erkrankungsrisiko:
1/4
Präimplantationsdiagnostik (PID)
Blastomerendiagnostik
„Alternative“: Polkörperdiagnostik
Polkörper (PK)
Eisprung
1. PK
Fertilisation
2. PK
22h nach Spermien-Eindringen
Polkörperchen enthält nur Anteile
des mütterlichen Genoms
Therapie CF
Lunge
physikalisch, antibiotisch,
Transplantation
Pankreas
Substitution, Diät, Vitamine
Leber
symptomatisch
CBAVD
in vitro-Fertilisation
CFTR-Gen
Alter (Jahre)
CFTR-Protein
1. Schwangerschaft
Schweißtest
 NaCl im
Schweiß
Erstbeschreibung
CF
Therapie CF
Potentiator:
Ivacaftor
Corrector:
Lumacaftor
ProduktionsCorrector
Ataluren
ethische Aspekte CF-Genetik
DNA-Test erfordert kompetente
humangenetische Beratung
Screening problematisch
Gen-Therapie: „Prinzip Hoffnung“
CF - Gentherapie
Gentherapie
M.C.: Gentransfer mit
rekombinanter DNA;
Ø Erlaubnis; bestraft
CF:
Adenovirustransfer
1. klinische Studie
1. erfolgreiche Gentherapie: X-SCID
China: Gendicine
head + neck cancer
Adrenoleukodystrophie
Leber‘
Amaurosis
Hämophilie
2014:
Retinitis
pigmentosa
1980 1988 1992 1999 2000 2002 2003 2007 2008 2010 2011 2012 2014 2015
Gentransfer in Tumor +
ADA-SCID Behandlung
JG: OrnitintranscarbAmylase-Defizienz
Adenoviren 
X-SCID Therapie:
Lymphproliferat.

Arthritis-Phase1/2
klin. Gentherapievers.
?
ß-Thalasämie
Wiskott-Aldrich
Syndrom
>2000 klinische Studien in >35 Ländern
 cursed or inching towards credibility?
2012 in EU:
LPLDefizienz
CRISPR hum.
triploide
Embryonen
Gentherapie – wofür ?
Stufenmodell zur Bewertung
gentherapeutischer Eingriffe
I Substitutionstherapie mit gentechnisch erzeugten Proteinen
II Somatische Gentherapie für genetische Erkrankungen
III Somat. Gentherapie für genet. Erkrankungen Ungeborener
IV Keimbahn-Therapie für Erbfehler
V Keimbahn-Therapie zur Krankheitsprävention (Infektionen)
VI Keimbahn-“Therapie” für Risikofaktoren (Sterilität)
VII Keimbahn-“Therapie” für Intelligenz, Aggressivität etc.
Ethische Probleme/Streitfragen Gentherapie
· Biosicherheit (Viren, public health, Datensicherheit…)
· in utero-Gentransfer (größere Unsicherheiten,
Gentransfer in die Keimbahn?)
· Forschung für Keimbahn-Gentransfer regulieren
· Tierexperimente (bei Keimbahn-Gentransfer) regulieren
Erwachsene CF (US)
CF Lebenserwartung:
bessere Behandlung, längeres
Überleben
Erwachsene CF (US)
Erwachsene CF (US)
CF Lebenserwartung:
bessere Behandlung, längeres
Überleben
Erwachsene CF (US)
70
60
50
Diagnose bei
Neugeborenscreening (%)
40
Alter bei Diagnose
(Jahre)
30
Erwachsene ≥18
Jahre (%)
20
mittleres
Todesalter (Jahre)
10
0
1999
2004
2009
2013
2014
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