Zusammenhänge zwischen der Synthese von
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663 SYNTHESE VON RNS UND PROTEIN Zusam m enhänge zwischen der Synthese von Ribonucleinsäure und Protein bei der Vermehrung eines Virus der Influenza-Gruppe (Virus der Klassischen Geflügelpest)* Von C h r is t o p h S c h o l t is s e k und R udolf R ott Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen (Z. Naturforschg. 16 b, 663— 673 [1961] ; eingegangen am 24. J u li 1961) With the aid of isotopic techniques the ribonucleic acid (RNA) and protein metabolism of embryo­ nic chicken cells infected with fowl plague virus was studied. In addition to normal cell-RNA only viral RNA was found in the infected cells. The synthesis starts after 1 hour p.i. and proceeds during the rest of the infectious cycle. By labelling the viral subunits (s-antigen and hemagglutinin) with 14C-leucine it could be demonstrated, that the synthesis of their protein components starts also at about 1 hour post infectionem. p-Fluorophenylalanine (FPA) had no influence on the normal RNA and protein metabolism of the cells. If FPA was given immediately after infection, no virus RNA was synthesized. FPA given 2 hours p.i. did not interfere anymore with the production of viral RNA. This was taken as evidence for the existence of an “early protein” necessary for the induction of virus multiplication, s-antigen grown in the presence of FPA and demonstrable by serological methods was not incorporated into the intact virus particle. The findings suggest, that the synthesis of an “early protein” is necessary prior to viral RNA syn­ thesis, that the RNA and the protein of the s-antigen are made simultaneously at the same site, and that the s-antigen acts as a template for the synthesis of the hemagglutinin-protein. Frühere Untersuchungen über die Vermehrung des Virus der Klassischen Geflügelpest (KP) hatten ergeben, daß die Untereinheiten dieses Virus nach­ einander und an verschiedenen Stellen der Wirtszelle in Erscheinung treten (Zusammenfassung s. S c h ä ­ f e r 1) . Das s-Antigen, der eigentliche Ribonucleinsäure-Träger des Virus, läßt sich ungefähr 3 Stdn. p.i. erstmals im Zellkern feststellen, während das H äm agglutinin, ein Kohlenhydrat-Proteinkomplex, etwa 1 Stde. später nachzuweisen ist und ausschließ­ lich im Cytoplasma gefunden wird2. Von der 4. Stde. p.i. an wird auch in zunehmendem Maße s-Antigen im Cytoplasma gefunden. Bei der Infektion von L-Zellen allerdings, die kein oder nur wenig infek­ tiöses Virus produzieren (abortiver Vermehrungs­ zyklus) , scheint das s-Antigen den Kern nicht zu ver­ lassen, obwohl auch hier H äm agglutinin im Cyto­ plasma nachzuweisen ist 3. A uf Grund dieses Befun­ des kann man annehmen, daß die unmittelbare A n­ wesenheit von s-Antigen im Cytoplasma für die * Folgende Abkürzungen wurden verwendet: g-Antigen = Innenkomponente des Virus = Ribonucleoproteid; s-Anti­ gen = dasselbe Material in freier Form in der Zelle; HA = Hämagglutination; p.i. = post infectionem; FPA = p-Fluorphenylalanin; PA = Phenylalanin; AP = Aminopterin; RNS = Ribonucleinsäure; DNS = Desoxyribonucleinsäure; RNase = Ribonuclease C = Cytidinmonophosphat (CMP) ; U = Uridinmonophosphat (UMP). Fertigstellung des Hämagglutinins nicht erforderlich ist. Einen weiteren Hinweis, daß die Synthesen der beiden Untereinheiten zwei getrennte Vorgänge sind, erbrachten Z im m e r m a n n und S c h ä f e r 4 mit Hilfe von p-Fluorphenylalanin, mit dem sie die Syn­ these von s-Antigen von der des Hämagglutinins abtrennen konnten. Gewisse Phasen des Infektionsprozesses, die nicht oder nur wenig genau mit biologischen Testen ver­ folgt werden können, wurden mit Hilfe der IsotopenTechnik angegangen. So konnte W e c k e r 5 nachweisen, daß die Virus-RNS de novo synthetisiert wird, während die Phosphorlipoide des Virus von der Zelle übernommen werden. Außerdem zeigten W e k k e r und S c h ä f e r 6 mit 32P-markierten Virusteilchen, daß die Zelle einen Mechanismus besitzt, mit dessen Hilfe das g-Antigen bei der Infektion in Freiheit ge­ setzt wird. Bei den hier zu besprechenden Untersuchungen standen folgende Fragen im Vordergrund: 1 2 3 4 5 6 W . S c häfer , in: Virus Growth and Variation (eds. A . I saacs and B. W . L acey ) University Press, Cambridge 1959, pp. 61. P. M. B r e ite n f e ld u . W . S c h ä fe r , Virology 4 , 328 [1957]. R. M. F r a n k lin u . P. M. B r e ite n f e ld , Virology 8, 293 [1959], T h . Zimmermann u . W . S c h ä fe r , Virology 1 1 , 676 [I960]. E. W e ck e r, Z . Naturforschg. 1 2 b, 208 [1957]. E. W e c k e r u . W\ S c h ä fe r , Z . Naturforschg. 1 2 b. 483 [1957], Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM C. SCHOLTISSEK UND R. ROTT 664 1. Welche Vorgänge laufen bei der Induktion der s-Antigen-Synthese ab; d. h., was geschieht in der ersten Stde. nach der Infektion? 2. Wie wird die Hämagglutinin-Synthese durch das genetische Material induziert? Hier war vor allem zu untersuchen, ob eine Überträger-RNS, die nicht identisch mit der Virus-RNS oder der RN S der Zelle ist, diese Rolle übernimmt, oder ob das Hämagglutinin-Protein vielleicht am s-Antigen syntheti­ siert wird und u. U. erst später und an einem ande­ ren Ort seine antigene Spezifität erhält. Für die Behandlung dieser Fragen ist die Unter­ suchung des RNS- und Proteinstoffwechsels der infi­ zierten Zelle unter verschiedenen Bedingungen er­ forderlich. Eine Arbeit über den RNS-StoffWechsel bis zu 3 Stdn. p.i. ist bereits erschienen7. Darin sind auch die wichtigsten bei dieser Arbeit angewen­ deten Methoden beschrieben. Erwähnt sei nur, daß auch bei den hier zu behandelnden Untersuchungen zur Charakterisierung der RN S das OligonucleotidMuster bestimmt wurde. Aus der Verschiebung der einzelnen Oligonucleotid-Verhältnisse bei den infi­ zierten Zellen läßt sich direkt die Menge an VirusRNS im Gemisch mit neusynthetisierter Zell-RNS errechnen. Material und Methoden Im folgenden werden nur die Materialien und Metho­ den beschrieben, welche von den in der vorhergehenden Arbeit 7 benutzten abweichen. 1. p -F 1u o r p h e n y 1a 1a n i n , P h e n y l a l a n i n und A m i n o p t e r i n Die chemisch reinen d -, L-Verbindungen von FPA und PA sowie das AP wurden durch die California Corporation for Biochemical Research, Los Angeles, Californien, bezogen. 2. G e w e b e k u l t u r e n Im allgemeinen wurden Gewebekulturen aus 10 Tage alten Hühnerembryonen mit einer Zellzahl von 0,5 bis 1 • 10" in Petrischalen von 9 cm Durchmesser verwendet 7. 3. R e i n i g u n g des V i r u s Das Virus wurde durch Adsorption-Elution an bzw. von Hühnererythrozyten und anschließendes Zentrifu­ gieren bei pi (1. c. 9) 7,5 gereinigt 8. In Vorversuchen hatte sich ergeben, daß Virusparti­ kel, die aus Gewebekulturmedien gewonnen werden, von den Erythrozyten schlechter eluieren als solche aus 7 C. S c h o l t i s s e k [1961]. u. R .R o tt, Z. Naturforschg. 16 b. 109 HA-Einheiten/ml Stdn. Allan­ tois-Fl. Kulturüberstände Zellen 128 256 128 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 128 16 — Ausgangsfl. Nach Adsorption ohne R D E ohne R D E ohne R D E ohne R D E ohne R D E m it R D E — 0,5 1,5 3 6 19 3 4 8 32 128 32 Tab. 1. Elution von Viruspartikeln aus Allantoisflüssigkeit, Kulturüberständen und homogenisierten Zellen, nach Adsorp­ tion an Hühnererythrocyten. Je 12 ml der Ausgangslösungen wurden mit 3 ml gepackten Erythrocyten 30 Min. in der Kälte gehalten, danach zentrifugiert und die Erythrocyten 3-mal mit NaCl-Phosphatpuffer gewaschen. Elution bei 37 °C in NaCl-Phosphatpuffer. Nach den angegebenen Zeiten wurden die Ansätze zentrifugiert, in den Uberständen der HA-Titer bestimmt und die Rüdestände erneut mit 12 ml inkubiert. Bei einem Zeitwert wurden 5 E/ml RDE zugefügt. Zellhomogenaten (ohne RDE) oder Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnerembryonen (mit RDE) (s. Tab. 1). In den Hauptversuchen wurden daher die Bedingun­ gen zur Elution durch Verwendung einer geringeren Menge an Erythrozyten (1 ml gepackte Erythrozyten pro 4000 HA-Einheiten) und einer höheren RDE-Konzentration (10 Einheiten/ml) günstiger gestaltet. Die Elutions­ zeit betrug 5 Stdn. (37 °C). Die Isolierung der Virus­ partikel aus den Gewebekulturen konnte trotzdem nicht ohne Verlust durchgeführt werden. Aus diesem Grunde können auch immer nur Werte aus einem Versuchsansatz miteinander verglichen werden. 4. V e r s u c h e mi t p-Fluorphenylalanin Bei den Versuchen mit FPA wurden in Anlehnung an die Untersuchungen von Z i m m e r m a n n und S c h ä f e r 4 270 y/m 1 dieser Verbindung entweder unmittelbar nach der Infektion oder 2 Stdn. p.i. zu den Kulturen gegeben. In den 14C-Leucin-Experimenten wurde der Block 5 Stdn. p.i. durch Absaugen des Mediums und Zugabe von frischem Medium mit 600 y/ml PA und 12C-Leucin aufgehoben. Als Gewebekulturen wurden bei den Untersuchungen mit FPA einschichtige Lagen embryonaler Hühnerzel­ len mit einer Zellzahl von 2 —4-10" pro Kultur ver­ wendet (nähere Angaben s. 1. c. 4). 5. G e w i n n u n g d e r r a d i o a k t i v e n Virusspaltprodukte Nach der Infektion bzw. 2 Stdn. p.i. wurde den K ul­ turen 0,3 bis 0,5 mMol 14C-Leucin mit einer spezifischen Aktivität von 6,24 mC/mMol zugesetzt. Der Einbau der 8 W. Z il l ig , W. S chäfer u. S. U llmann , Z. Naturforschg. 10 b, 199 [1955]. 9 P. G ie b l e r , Z. Naturforschg. 13 b. 238 [1958]. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM SYNTHESE VON RNS UND PROTEIN radioaktiven Aminosäure wurde gestoppt durch Absau­ gen des Mediums und Zugabe von neuem Medium mit einem etwa 300-fachen Überschuß an 12C-Leucin. 22 Stdn. p.i. wurden die Viruspartikel aus dem Über­ stand der Kulturen nach Zugabe von nicht-radioaktivem Viruskonzentrat (Endkonzentration 8000 HA-Einheiten/ml) gereinigt und mit Äther gespalten. Nach Zen­ trifugieren des Spaltansatzes bei einem p.i. von 7,5 zur Abtrennung von eventuell noch nicht gespaltenem Virus, wurde das Hämagglutinin durch Adsorption an Ery­ throzyten vom g-Antigen abgetrennt und dann durch Elution von den Erythrozyten gewonnen 10. Als Kontrollen verwendeten wir Kulturen, die eine entsprechende Zeit in 14C-leucin-haltigem Medium ge­ halten und erst nach Auswechseln des Mediums gegen 12C-Leucin-Medium infiziert wurden. Das Virus wurde hier in analoger Weise wie beim Hauptversuch auf­ gearbeitet. 6. B e s t i m m u n g der R a d i o a k t i v i t ä t i n d e n 14C -m a r k i e r t e n P r o t e i n e n Die radioaktiven Proteine wurden aus den Lösungen durch Zugabe von 60-proz. HC104 (Endkonzentration 0,4-rc.) ausgefällt und 2-mal mit 6-proz. Trichloressigsäure gewaschen. Die Niederschläge wurden in geringer Menge konzentrierter Ameisensäure gelöst, auf Alumi­ niumplättchen gegeben und getrocknet. Die Auszählung der Proben erfolgte in einem Methandurchflußzählrohr FH 407 der Firma Frieseke u. Höpfner, ErlangenBruck. 7. B e s t i m m u n g in der der R a d i o a k t i v i t ä t Gesamt-RNS Die Radioaktivität in der Gesamt-RNS wurde immer aus der Summe der Radioaktivität der Oligonucleotide errechnet; es hatte sich nämlich gezeigt, daß bei der Bestimmung der Radioaktivität in der Zell-RNS bis­ weilen erhebliche Fehler durch Adsorption von an­ organischen 32P hervorgerufen werden. Das bei der Verdauung mit RNase anfallende „Core“ wurde nicht berücksichtigt. E r w ä g u n g e n zur A u s w e r t u n g Versuchsergebnisse der Wie schon einleitend erwähnt, erfolgt die Charak­ terisierung und Berechnung der Virus-RNS im Ge­ misch mit zelleigener RNS auf Grund der Verschie­ bung des Oligonucleotid-Musters. Bei den Versu­ chen zur Ermittlung von Virus-RNS in infizierten Zellen zu späten Zeitpunkten p.i. fielen die Oligonucleotid-Verhältnisse der RN S durchweg sehr nied­ rig aus, so daß ein Vergleich mit der RN S aus ge­ reinigtem Virus zunächst nicht möglich war. Erst als 10 11 W. S c h ä fe r u . W. Z i llig , Z. Naturforschg. 9 b, 779 [19541. L. I. H e c h t, P. C. Zamecnik, M. L. Stephenson u . J. F. S cott, J. biol. Chemistry 233, 954 [1958]. 665 wir die C-Werte um einen bestimmten Betrag an­ hoben, der in Tab. 1 als Prozent des ursprünglich gemessenen Wertes angegeben ist, konnten wir fest­ stellen, daß auch in diesen Fällen sich die Oligonucleotid-Muster in Richtung auf das Muster der reinen Virus-RNS verschieben, wie es bereits bei dem 3 Stdn. p.i. aufgearbeiteten Material festgestellt w u rd e7. Der Korrekturbetrag wurde empirisch er­ mittelt. Der Wert für die C-Fraktion wurde so bestimmt, daß sich nach Erhöhung dieser Fraktion aus der Verschiebung der verschiedenen C/Oligonucleotid-Verhältnisse immer der gleiche Gehalt an Virus-RNS ergab. Von der Verwendung einer ande­ ren Nucleotid-Fraktion als Bezugs-Nucleotid wurde Abstand genommen, um die vorliegenden Ergeb­ nisse mit früheren Untersuchungen 7 vergleichen zu können. E in entsprechender Korrekturfaktor mußte auch bei RN S aus normalen Zellen eingeführt wer­ den, wenn diese längere Zeit ( > 5 Stdn.) in M in i­ malmedium gehalten wurden. Die Ursache für das Absinken des C-Wertes mit zunehmender Zeit scheint darin zu liegen, daß der Einbau von :52P gerade in diese Fraktion durch die Infektion oder auch durch längeres Kultivieren der Zellen im M inim alm edium gestört wird. Wurden, wie bei den FPArVersuchen, dichtere Zellschichten verwendet, so war das Absinken der Radioaktivität in der C-Fraktion stark reduziert. Das beobachtete Verhalten kann auf folgende Weise erklärt werden: Bei der Protein-Synthese spielt eine lösliche RNS im Cytoplasma eine wichtige Rolle, die am Ende die Gruppe — C — C — A-Aminosäure enthält11. Diese Endgruppe unterliegt einem wesentlich höheren Stoffwechsel in vivo als die Restmolekel12. Bei RNase-Verdauung tritt die Radioaktivität nach M ar­ kierung dieser Endgruppe in der C-Fraktion a u f 12. Die notwendige Erhöhung der C-Fraktion in der R N S der infizierten Zellen läßt die Vermutung zu. daß gerade dieser Endstoffwechsel durch die Infek­ tion besonders stark betroffen wird. Bei den Zeit­ werten, bei denen der Korrekturfaktor angewendet werden mußte, fanden wir auch eine Schädigung des allgemeinen RNS- und Protein-Stoffwechsels. In Übereinstimmung damit fanden S a l z m a n n und M it­ arbb. 13 bei der Infektion von HeLa-Zellen mit PolioVirus eine Schädigung des RNS- und Protein-Stoff- 12 C. S c h o l t i s s e k , Biochem. Z. 331, 365 [1959]; 332, 458 [I960]. 13 N. P. S a l z m a n , R. Z. L o c k a r t u . E. D. S e b r i n g , Virology 9, 224 [1959]. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM C. SCHOLTISSEK UND R. ROTT 6 66 Wechsels, wobei wieder speziell die C-Fraktion (A b­ bau mit A lkali) besonders stark betroffen war. Der gleiche Effekt wurde erzielt, wenn eine essentielle Aminosäure aus dem Kulturmedium weggelassen wurde. Ergebnisse 1 . R N S -S t o f f w e c h s e 1 d e r i n f i z i e r t e n Zellen Bei den Untersuchungen über den Gesamt-RNSStoffwechsel wurde der Einbau von 32P in die ZellRN S zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit Hilfe eines Puls-Experimentes verfolgt und mit dem Einbau in die RN S nicht-infizierter Zellen verglichen. Abb. 1 gibt die Ergebnisse wieder. Daraus geht her­ vor, daß der radioaktive Einbau in die RN S der infi­ zierten Zellen zunächst bis zur 3. Stde. p.i. ansteigt, später aber auf etwa 50% des Einbaus nicht-infizierter Zellen abfällt. In der vorangegangenen M itteilung 7 wurde be­ reits gezeigt, daß der Anstieg der Radioaktivität in der RN S der infizierten Zellen bis zur 3. Stde. p.i. auf das Auftreten von Virus-RNS zurückzufüh­ ren ist. Der spätere Abfall des Einbaus kann nicht durch vorzeitiges Ablösen von Zellen erklärt werden. Der Zellrasen bleibt bis zum Abschluß des Versuchs ohne Lücken. Außerdem war die Menge des Zell­ materials aus den überstehenden Medien, die sich in der Zentrifuge bei 2000 g abschleudern ließ, zu jeder Zeit p.i. dieselbe und vernachlässigbar gering. 2 —5 Stdn. C/X X - u AC GC (GA) C AAU + AU? GU Erhöhg. d. C-Frak­ tion in % d. ur­ sprünglichen Wertes Abb. 1. Veränderung des RNS-StoffWechsels mit zunehmen­ der Zeit p.i. in Gewebekulturen embryonaler Hühnerzellen, die mit KP-Virus infiziert wurden. Versuchsbedingungen s. Tab. 2. Der Prozentsatz der Radioaktivität in der gesamten Zell-RNS wurde aus der Summe der gemessenen Oligonucleo­ tide errechnet. Die Punkte geben den Prozentsatz der Radio­ aktivität in der RNS der infizierten Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollzellen am Ende der 32P-Aufgabe wie­ der. Die zugehörigen Linien bezeichnen die Verweilzeit des 32P auf den Kulturen. N = Radioaktivität in infizierten Zellen; N0 = Radioaktivität in nicht-infizierten Zellen. Es ist allerdings nicht ausgeschlossen, daß zu späten Zeiten p.i. das eingesetzte 32P durch nicht-radioaktive P-Verbindungen aus Abbauprodukten von Zellkom­ ponenten z. T. verdünnt wird. Unser besonderes Interesse galt der Frage, ob zu der Zeit, zu der das Häm agglutinin erstmals fest­ stellbar ist, eine weitere R N S (Überträger-RNS) 7 —9 Stdn. 5 - 7 Stdn. nicht infiz. infiz. nicht infiz. 1,36 3,06 1,81 2,38 1,27 2,82 1,95 2,49 1,51 3,20 1,54 2,85 1,39 2.80 2,34 2,07 2,71 2,62 2,16 3,74 0 5 20 infiz. nicht infiz. Virus infiz. RNS 1,43 2,69 0,86 1,53 3,17 1.42 3,04 3,44 2,60 2,08 3,75 2,17 2,79 2,24 1,98 3,08 3,49 3.32 1,40 1.66 3,28 40 20 1,68 45 0 Tab. 2. Synthese von virusspezifischer RNS zu späten Zeitpunkten post infectionem. Je Wert wurden 10 Kulturen infiziert bzw. mit normaler Eiflüssigkeit behandelt. Zwischen den oben angegebenen Zeiten wurden 0,12 mC 32P pro Kultur aufgegeben und danach aus den Zellen die RNS aufgearbeitet7. Gewinnung und Bezeichnung der Oligonucleotide s. 1. c. 7. Die Zahlen geben das Verhältnis C/Oligonucleotid wieder. Der empirische Korrekturfaktor für die C-Fraktion ist in der untersten Zahlenreihe angegeben. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM 667 SYNTHESE VON RNS UND PROTEIN auftritt. Sie müßte sich durch Änderung im Oligonucleotid-Muster der neugebildeten und daher 32P-markierten RNS zu erkennen geben. Aus Tab. 2 geht hervor, daß das Oligonucleotid-Muster der RNS aus infizierten Zellen nicht nur — wie in der vorhergehenden Mitteilung gezeigt wurde — bis zur 3. Stde. p.i., sondern auch darüber hinaus immer zwischen dem der normalen Zell-RNS und dem der Yirus-RNS liegt. Es sind also keinerlei Anzeichen dafür vorhanden, daß eine zusätzliche, als Überträger-RNS fungierende Nucleinsäure auftritt. Errechnet man aus den erhaltenen Verschiebun­ gen in den C/U-Verhältnissen den prozentualen Anteil der virusspezifischen RNS im Gemisch mit neugebildeter, zelleigener RNS, so erhält man die in Abb. 2 aufgetragene Kinetik der Virus-RNS-Synthese. Danach besitzt auch die Syntheserate der Virus-RNS 3 Stdn. p.i. ein Maximum. der Hauptteil der radioaktiven RN S in der Kern­ fraktion gehalten werden ( 86 % maximal im Ver­ gleich zu 50% in früheren Versuchen), ein Rest von virusspezifischer RN S fand sich aber immer noch in der Cytoplasma-Fraktion (etwa 10% der Gesamt-RNS aus der Cytoplasma-Fraktion). Weiterhin wurde untersucht, ob für die Vermeh­ rung des KP-Virus eine DNS-Synthese erforderlich ist. Die Versuche wurden ähnlich wie die von S i m o n an­ gegebenen 15 durchgeführt. Aminopterin, welches die Synthese von Thymin und damit die DNS-Synthese ver­ hindert, wurde in Konzentrationen von 10 y bis 1 mg/ml zu bestimmten Zeiten vor bzw. nach der Infektion den Kulturen zugesetzt und die Vermehrung des Virus mit Hilfe der HA-Reaktion verfolgt. Um Thymin bzw. Thy­ midin aus den Kulturen weitgehend zu entfernen, wur­ den diese 7 Stdn. vor der Infektion mit Minimalmedium 7 2-mal gewaschen und dann in diesem Medium weiter­ gezüchtet. Das zur Infektion benützte Virus wurde durch Zentrifugieren gereinigt und in NaCl-Phosphatpuffer P H 7,2 aufgenommen. AP-Aufgabe 7 Stdn. vor Infekt. AP-Menge (y/ml) Virus-Ausbeute HA-Einheiten 300 512 512 10 2 Stdn. vor Infekt. 100 300 800 100 Stdn. p.i. Abb. 2. Anteil der virusspezifischen RNS in Prozent an der gesamten neu gebildeten RNS in infizierten Kulturen embryo­ naler Hühnerzellen in Abhängigkeit von der Zeit. Versuchs­ bedingungen wie Abb. 1. Die Werte wurden aus der Abwei­ chung des C/U-Verhältnisses von nicht-infizierten Kontrollzellen in Richtung auf die reine Virus-RNS errechnet. 0 Stdn. 300 1000 Ko Der Ort der Synthese der Virus-RNS in der Zelle (3 Stdn. p.i.) ließ sich ebenso wie in den vorher­ gehenden Untersuchungen auch jetzt nicht mit Sicherheit ermitteln. Um das Austreten von RN S aus den Zellkernen zu verhindern, wurde während des Homogenisierens der Zellen in SaccharoseLösung Phosphatpuffer bzw. CaCl 2 in verschiedenen Konzentrationen zugegeben 14. Dadurch konnte zwar 14 C. S choltissek u. V. R. P otter , Z. Naturforschg. 15 b, 453 [I960]. 15 E. H. S im on , Virology 13, 105 [1961]. - 512 512 512 512 512 512 512 512 512 512 256 256 512 512 512 512 Tab. 3. Einfluß von Aminopterin auf die Vermehrung des KP-Virus in Gewebekulturzellen. Die Gewebekulturen wur­ den in Minimalmedium gezüchtet und erhielten zu den in der Tab. angegebenen Zeiten bzw. mit der Infektion AP in ver­ schiedenen Konzentrationen. Die Zellen wurden mit einem gereinigten Viruspräparat infiziert und die hämagglutinie­ rende Aktivität 16 Stdn. p.i. in den Ansätzen (Zellen und Kulturmedien) bestimmt. W ie Tab. 3 zeigt, läßt sich die Vermehrung des KP-Virus durch AP nicht beeinflussen. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM C. SCHOLTISSEK UND R. ROTT 6 6 8 2. P r o t e i n s t o f f w e c h s e l in fizie rten Zellen der Das Problem der Beeinflussung des Gesamt-Proteinstoßwechsels durch die Infektion haben wir bei den hier zu beschreibenden Untersuchungen nur ge­ streift und auf eine genaue Analyse der Kinetik ver­ zichtet. Es wurde lediglich festgestellt, daß der 14CLeucin-Einbau bei infizierten Zellen im Vergleich zu nichtinfizierten Kulturen im Verlauf von 24 Stdn. p.i. um etwa 45% gehemmt wird ( 4C-Leucin-Auf­ gabe von 0 — 24 Stdn. p .i.). Genauer studiert wurde der Beginn der Markie­ rung der Virus-Untereinheiten mit 14C-Leucin. 14C-Leucin wurde unmittelbar nach der Infektion auf die Kulturen gegeben und der Einbau des Isotops durch Zufügen von 12C-Leucin in 300-fachem Uberschuß zu verschiedenen Zeiten p.i. gestoppt. Die im 12C-leucinhaltigen Medium ausgereiften Viruspartikel wurden 22 Stdn. p.i. aus den Überständen isoliert, mit Äther zerlegt und in den Untereinheiten die Radioaktivität be­ stimmt. In einem Vorversuch hatten wir festgestellt, daß der Einbau von 14C-Leucin in die Zellproteine ohne merkliche Verzögerung gleich nach Zugabe des Iso­ tops beginnt und daß die oben angegebene Menge an 12C-Leucin ausreicht, um den Einbau des Isotops umgehend abzustoppen (s. Abb. 3). In einem ersten Hauptversuch wurde gefunden, daß bei Zugabe von 14C-Leucin bis 1 Stde. p.i. weder Abb. 4. Einbau von 14C-Leucin in die Untereinheiten des KP-Virus in vivo. Für jeden Wert wurden 10 Kulturen infi­ ziert. Je Kultur wurden 0,3 /^Mol 14C-Leucin zugefügt und die Kulturflüssigkeit nach den angegebenen Zeiten mit einem 12C-Medium ausgetauscht. Die Viruspartikel wurden 20 Stdn. p.i. aus den Kulturüberständen aufgearbeitet. das g-Antigen noch das H äm agglutinin signifikant markiert werden. W ie die Ergebnisse eines weiteren Versuches zeigten (Abb. 4 ), tritt erstmals eine M ar­ kierung des Hämagglutinins sowie des g-Antigens auf, wenn 2 Stdn. p.i. der Einbau der 14C-Aminosäuren abgestoppt wird. Das Verhältnis der Radio­ aktivität im g-Antigen zu der im Hämagglutinin änderte sich nicht mehr wesentlich, wenn während der Virusvermehrung über 20 Stdn. 14C-Leucin an­ geboten wurde. Die Frage war nun, inwieweit die erhaltenen Werte durch mit geschleppte Zell-Proteine beeinflußt werden. Um das zu prüfen, wurden Kontrollexperimente angesetzt, bei denen Zellen vor der Infektion eine entsprechende Zeit in einem 14C-Leucin-Medium gezüchtet und erst danach in Gegenwart von 12C-Leucin infiziert wurden. Verglichen mit Ansätzen, in denen das 14C-Leucin eine analoge Zeit nach der In ­ fektion zugesetzt war, betrug hier die Radioaktivität des s-Antigens 10 — 15%, die des Hämagglutinins un­ gefähr 20 Prozent. Abb. 3. Einbau von 14C-Leucin in die Proteine embryonaler Hühnerzellen und Abstoppen des Einbaus durch Ausverdün­ nen mit 12C-Leucin. Je Wert wurden 4 Kulturen verwendet. Es wurden 0,005 /^Mol 14C-Leucin und 0,24 /^Mol 12C-Leucin je Kultur aufgegeben. 3 Stdn. danach wurde das Isotop mit einem 250-fachen Überschuß an 12C-Leucin verdünnt. 16 Die folgenden Versuchsergebnisse sind teilweise bereits veröffentlicht: C. S choltissek 191, 1023 [1961]. u. R. R ott, Nature [London], 3. R N S - u n d P r o t e i n -S t o f f w e c h s e 1 u n t e r p - F l u o r p h e n y l a l a n i n 16 Nach den bereits zitierten Untersuchungen von und S c h ä f e r 4 läßt sich die Vermeh­ rung des KP-Virus in einzelne Phasen zerlegen, wenn man zum infizierten System FPA zusetzt. W ird FPA direkt nach der Infektion von embryonalen Hühnerzellen mit KP-Virus den Kulturen zugefügt, Z im m e r m a n n Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM SYNTHESE VON RNS UND PROTEIN so lassen sich zu keinem Zeitpunkt p.i. virusspezifi­ sche Untereinheiten durch die üblichen biologischen Verfahren nachweisen. Erfolgt die Zugabe erst 2 Stdn. p.i., so wird s-Antigen gebildet, eine Zunahme der hämagglutinierenden und infektiösen Einheiten aber nicht beobachtet. Zur Ergänzung dieser Experimente wurde zu­ nächst einmal untersucht, wie FP A den allgemeinen RNS- und Protein-Stoffwechsel der verwendeten Zel­ len beeinflußt. Hierzu erhielten 14 nicht-infizierte Kulturen (2 bis 4 -IO7 Zellen/Kultur) 270 7/ml FPA und 2 Stdn. später je 0,14 mC 32P ; einer entsprechenden Zahl von Kontrollkulturen wurde kein FPA zugefügt. 4 Stdn. nach der FPA-Zugabe wurden die Kulturen aufgearbeitet und die Radioaktivität in der Gesamt-RNS bestimmt. In der RNS der FPA-Kulturen wurden 45 747 Im p./M in., in der RNS der Kontrollkulturen 45 073 Im p./M in. gemessen. Demnach wird der RNS-Stoffwechsel normaler Zellen durch FPA nicht beeinflußt. Der Einfluß von FP A auf den Protein-Stoffwechsel wurde mit Hilfe von Einbau-Versuchen mit 14CLeucin in die Zellproteine studiert. Hierzu wurden der Einfachheit halber dieselben infizierten K ultu­ ren verwendet, von denen später das 14C-markierte Virus gewonnen wurde. FPA und 14C-Leucin wur­ den 2 Stdn. p.i., 12C-Leucin und PA 5 Stdn. p.i. ge­ geben. Als Kontrollen dienten entsprechend m ar­ kierte Kulturen, denen kein FPA angeboten wurde. Die Radioaktivität in den Zellproteinen der FPAKulturen lag in einem Experiment 10% über der der Kontrollkulturen, in einem anderen Experiment 10 % unter dieser. Die Versuchsresultate ergaben demnach, daß auch der Proteinstoffwechsel unter unseren Bedingungen durch FP A nicht gehemmt wird. Waren die Zellschichten jedoch in den Kulturen nur halb so dicht wie bei den oben beschriebenen Experimenten, so stellten wir eine Abnahme des 14C-Einbaues unter FPA bis zu 50% fest. Der FPABlock ließ sich hierbei durch P A auch nur unvoll­ kommen aufheben, d. h. die Virusausbeute betrug in den FPA-behandelten Kulturen nur etwa 10% der nicht-behandelten Kulturen. Bei Verwendung dich­ terer Zellschichten wurden in den Kulturen, die von 2 bis 5 Stdn. p.i. dem FPA ausgesetzt waren, durch­ schnittlich aber mindestens 50% der hämagglutinie­ renden Partikel der nicht-behandelten Kulturen ge­ funden (Tab. 4). Um den Einfluß von FPA auf die Synthese der Virus-RNS zu prüfen, wurden Zellen mit einem FPA- 669 Virus-Ausbeute im Medium (HA-Einheiten) Experi­ ment g-Antigen von 1 FPA 0 FPA 2 Vir 10000 2 FPA 0 F PA 2 Vir 208 2315 32 32 64 ö FPA 2 Vir 429 5500 128 256 Imp./Min. 753 750 211 128 128 256 Tab. 4. Einbau von 14C-Leucin in das g-Antigen des KPVirus. Einfluß von FPA auf die Verwendungsmöglichkeit des g-Antigens für die Virus-Synthese. Für jeden Wert wurden 10 Kulturen infiziert. Beim FPA 0-Wert wurden 270 7 /ml FPA sofort nach der Infektion zugeführt, beim FPA 2-Wert erst 2 Stdn. post infectionem. Die Vir-Proben erhielten kein FPA. Die Aufgabe von 0,5 ^Mol 14C-Leucin/Kultur geschah 2 Stdn. post infectionem. 5 Stdn. p.i. wurde das Medium ab­ gesaugt und frisches Medium aufgegeben, das 600 7/ml Phenylalanin und 12C-Leucin in 300-fachem Uberschuß ent­ hielt. Die Virus-Partikel wurden 22 Stdn. p.i. aus den KulturÜberständen geerntet, aufgearbeitet und ihr g-Antigen isoliert. Block unmittelbar nach der Infektion (FPA 0) bzw. 2 Stdn. p.i. (FP A 2) mit solchen verglichen, die kein FP A erhielten. Der Zeitpunkt der 32P-Aufgabe variierte von Experiment zu Experiment. W ie Tab. 5 zeigt, unterscheidet sich die RN S infi­ zierter Zellen, bei denen der FPA-Block unmittelbar nach der Infektion gesetzt wurde, niemals von der nicht-infizierter Zellen. W urde FP A jedoch 2 Stdn. p.i. zugesetzt, so war die Synthese der Virus-RNS nicht mehr behindert. Es konte immer, gleichgültig wann 32P zugegeben wurde, eine klare Verschiebung des Oligonucleotid-Musters in Richtung auf das der Virus-RNS beobachtet werden. Danach wird unter den hier geprüften Bedingungen das serologisch er­ faßbare Protein (s-Antigen) nur dann gebildet, wenn auch Virus-RNS produziert wird. Außerdem zeigen diese Resultate, daß die Virus-RNS-Synthese erst erfolgt, nachdem eine für die Virusvermehrung notwendige FPA-sensitive Phase durchlaufen wurde. W eiterhin war zu klären, ob die virusspezifische RNS, die unter FPA synthetisiert wurde (Block 2 Stdn. p.i.) an das Protein des s-Antigens gebunden wird. Die Versuchsanordnung war dieselbe wie in 1. c .7 beschrieben. Nach Zerschlagen der infizierten Zellen im Bühler-Homogenisator wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugieren entfernt und das im Überstand enthal­ tene s-Antigen m it spezifischem Antiserum ausgefällt. Darauf wurde die R N S in den Zelltrümmern, dem Überstand und im ausgefällten s-Antigen untersucht. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM C. SCHOLTISSEK UND R. ROTT 670 Exper. Zeit der Markierung Stdn. p.i. FPA O u 1 2 2-5 AC GC U 4-6 FPA 2 Virus7 Kein FPA C/X AC GC U Kontr. Vir. Kontr. Vir. Kontr. Vir. RNS 1,24 2,97 1,83 1,22 1,24 3,01 1,83 1,10 0,86 2,62 1,96 1,23 2,96 1,84 1,08 2,99 1,85 2,68 2,04 2,60 2,08 1,44 3,29 1,81 1,44 3,31 1,89 1,43 3,47 1,87 1,28 2,98 1,99 1,48 3,34 1,84 1,28 0.86 1,18 2,90 1,80 1,17 2,92 1,92 2,66 2,60 2,08 1,87 0,86 3 1- 3 AC GC U 1,66 4 4-6 AC GC 3,33 1,82 2,60 2,08 1,70 3,75 1,89 1,51 2,96 1,90 1,50 0,86 2,88 2,60 2,08 1,82 Tab. 5. Wirkung von FPA auf die Synthese virusspezifischer RNS. Je Wert wurden 5 Kulturen (24 Stdn. alt) verwendet. Zu einer Gruppe wurden 270 y/ml FPA sofort nach der Infektion bzw. nach Behandlung mit normaler Allantoisflüssigkeit aufgege­ ben (FPA 0) ; bei der nächsten Gruppe wurde das FPA erst 2 Stdn. p.i. zu den Kulturen zugefügt (FPA 2). Bei der dritten Gruppe wurde das FPA fortgelassen. Zwisdien den angegebenen Zeiten p.i. wurden 0,15 mC 32P pro Kultur zugefügt und danach die RNS aus den gesamten Zellen aufgearbeitet. Weitere Angaben s. Tab. 2. RNS aus den Überständen C/X nicht infiz. infiziert g-Antigen entfernt RNS des ausge­ fällten g-Äntigens RNS aus Virus7 0,86 X = u 1,25 1,33 0,93 AC 2,96 3,00 2,58 2,60 GC 1,68 1,68 2,02 2,08 Tab. 6 . Ausfällen des s-Antigens aus Homogenaten infizierter Zellen. Zu je 10 Kulturen, die wie in Tab. 5 infiziert bzw. mit normaler Eiflüssigkeit behandelt worden waren, wurden 2 Stdn. p.i. 270 y/ml FPA und 0,2 mC 32P/Kultur aufgegeben. 4 Stdn. p.i. wurden die Zellen gewaschen, in NaCl-Phosphat­ puffer pH 7,2 im Bühler-Homogenisator homogenisiert und nach einmaligem Einfrieren und Auftauen zentrifugiert. Zu den Überständen wurde s-Antigen-Konzentrat und Antiserum gegen s-Antigen zugefügt. Weitere Aufarbeitung s. 1. c. 7. Die Menge der an die Zelltrümmer gebundenen Virus-RNS änderte sich mit fortschreitender Zeit. Tab. 7 gibt über die Mengenverhältnisse der VirusRN S in den Zelltrümmern in Abhängigkeit von der Zeit p.i. Aufschluß. Daraus geht hervor, daß die 32P-Aufgabe von . . . bis . . . Stdn. p.i. 0 bis 3 m it FPA ohne FPA 0% 2 bis 4 2 bis 7 5 bis 7 6 bis 8 O O \0\0 O^O'' Aus den Überständen wurde die Virus-RNS je­ weils nahezu quantitativ ausgefällt. Die Ergebnisse eines Versuches, bei dem 32P 2 Stdn. p.i. zugegeben wurde, sind in Tab. 6 zusammengestellt. In Überein­ stimmung mit den Resultaten der vorhergehenden Mitteilung 7 zeigt dieses Ergebnis, daß die nicht an Zelltrümmer gebundene Virus-RNS praktisch nicht in freier Form vorliegt, sondern offensichtlich bei oder unmittelbar nach ihrer Synthese mit dem s-AntigenProtein verbunden wird. Zu späten Zeitpunkten nach der Infektion sind quantitative Aussagen schwierig zu machen, da ein Teil der Virus-RNS an die Zell­ trümmer gebunden wird. 26% 33% 55% 53% Tab. 7. Anteil der virusspezifischen RNS in den Zelltrüm­ mern in Abhängigkeit von der Zeit der Zugabe von 32P. Ver­ suchsbedingungen wie Tab. 6 . FPA-Zugabe 2 Stdn. post infectionem. Bindung des s-Antigens an die Zelltrümmer kein typischer FPA-Effekt ist, sondern auch ohne diese Verbindung mit einer kleinen Verschiebung auftritt. Ob die in den Zelltrümmern enthaltene virusspezifi­ sche R N S ebenfalls an s-Antigen-Protein gebunden ist, ließ sich nicht entscheiden. Betrachtet man dieses Ergebnis, so läßt sich auch erklären, weshalb unter F P A im Komplementbindungstest ein Abknicken der s-Antigen-Kurve fest­ gestellt wird, während die Versuche mit fluoreszie­ renden Antikörpern eine stetige Zunahme des s-Antigens vermuten lassen (vgl. I . e . 4). Für den Komplementbindungstest wurden immer die Uber­ stände der zertrümmerten Zellen verwendet. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM SYNTHESE VON RNS UND PROTEIN Es ist bekannt, daß unter dem Einfluß von einigen Aminosäure-Analogen, z. B. FPA , Enzymproteine gebildet werden, die keine oder nur eine vermin­ derte Enzymaktivität besitzen 17. Aus diesem Grunde wurde untersucht, ob das unter FPA synthetisierte 671 Beim KP-Virus werden die neugebildeten Virus­ partikel über längere Zeit von der Wirtszelle konti­ nuierlich ausgeschieden. Aus diesem Grunde sind sprunghafte Stoffwechselveränderungen bis zur Zer­ störung der Zellen innerhalb der geprüften Zeit kaum zu erwarten. In Übereinstimmung m it dieser Erwartung nim m t der Gesamt-RNS-Stoffwechsel erst nach der 3. Stde. p.i. allmählich ab (s. Abb. 1). Der Anstieg des 32P-Einbaus bis zur 3. Stde. p.i. läßt sich am einfachsten dadurch erklären, daß sich zu diesem Zeitpunkt die Synthese der Virus-RNS auf dem Höhepunkt befindet (vgl. Abb. 2 ). F rü h e r 7 wurde bereits darauf hingewiesen, daß die Bildung der Virus-RNS eine zusätzliche Leistung der Zelle ist. Die in Abb. 2 wiedergegebene Kurve über die Syntheserate der Virus-RNS zeigt eine auffallende Ähnlichkeit mit der Kurve, die von M ü l l e r und M it­ arbb. 18 beim Einbau von 14C-Leucin in das s-Antigen in vitro gewonnen wurde. Die Ähnlichkeit in Lage und Form der Kurven zusammen mit der Tat­ sache, daß die Virus-RNS sofort nach ihrer Synthese weitgehend an das s-Antigen gebunden is t7, unter­ stützt die Anschauung, daß die Synthese der VirusR N S gleichzeitig m it und am gleichen Ort wie die der Protein-Komponente des s-Antigens erfolgt. Die Suche nach einer Überträger-RNS, die die Hämagglutinin-Synthese im Cytoplasma induzieren könnte, blieb, wie Tab. 2 zeigt, auch zu späten Zeit­ punkten p.i. ohne Erfolg. Eine Möglichkeit wäre, daß eine solche R N S nur in sehr geringer Menge gebildet wird; in diesem Fall sollte man aber an­ nehmen, daß sie analog einer in Rattenleber 12,14 und in Bakterien 19,20 gefundenen RNS-Fraktion einen hohen Stoffwechsel besitzt. Eine solche RN S würde stark mit 32P markiert sein und müßte mit der hier verwendeten Methode erfaßt werden. Vielleicht ist eine Überträger-RNS nicht erfor­ derlich, weil die Synthese beider Virus-Proteine (s-Antigen und H äm agglutinin) an der Virus-RNS erfolgt. Darauf deutet die Feststellung hin, daß beide etwa gleichzeitig produziert werden. Das H äm agglutinin läßt sich vermutlich deshalb später als das s-Antigen m it H ilfe biologischer Me­ thoden in der Zelle feststellen, weil es die für die biologischen Aktivitäten maßgebenden Strukturen erst im weiteren Verlauf des Vermehrungsprozesses gewinnt. W omöglich ist für diesen Schritt die A n­ wesenheit des genetischen Materials nicht mehr er­ forderlich. Die Studien über die Beeinflussung der Synthese der Virus-RNS durch FPA geben einen Hinweis auf die Frage, was in der 1 . Stde. p.i. in der Zelle vor sich geht. Da sich die Virus-RNS-Synthese vor der 2 . Stde. p.i. durch F P A hemmen läßt, muß während dieser Zeit ein Protein synthetisiert wer­ den, das für die laufende Reproduktion des geneti­ schen Materials, der Virus-RNS, notwendig ist. Man 17 G. N. 20 F. s-Antigen für die Bildung von Virus-Partikeln ver­ wendet wird. Die Versuche wurden so durchgeführt, daß wir den infizierten Zellen direkt nach der Infektion bzw. 2 Stdn. p.i. FPA anboten. 14C-Leucin wurde in jedem Fall 2 Stdn. p.i. zugegeben. Der Einbau des Isotops und der FPA-Block wurden 5 Stdn. p.i. beendet und die Viruspartikel 22 Stdn. p.i. aus den Kulturmedien iso­ liert. Die Bildung des s-Antigens wurde mit Hilfe der Komplementbindungs-Reaktion kontrolliert. W ie bereits oben erwähnt, war, wenn FP A unm it­ telbar nach der Infektion zugegeben wurde, serolo­ gisch kein s-Antigen nachzuweisen. Erfolgte die Zu­ gabe von F P A dagegen 2 Stdn. p.i. so wurde dieses in der üblichen Menge gebildet. W ie Tab. 4 zeigt, hatte die zeitlich verschiedene Zugabe des FP A dagegen keinen Einfluß auf die Radioaktivität des aus den Virusteilchen isolierten g-Antigens. In beiden Fällen überstieg sie niemals 15% der Radioaktivität des ohne FPA produzierten g-Antigens; dabei wurde berücksichtigt, daß die Virusausbeute in den mit FP A behandelten Zellen immer nur 50% der nicht-behandelten Zellen betrug. Die Befunde lassen den Schluß zu, daß das unter F P A synthetisierte s-Antigen nicht zur Bildung neuer Viruspartikel verwendet wird. Diskussion C ohen u . R. M u n ie r, Biochim. biophysica Acta [Am­ sterdam] 31, 347 [1959]. 18 G. C. M u e l l e r , S. v. Z ah n- U llm ann u . W. S c h ä fe r , J . biol. Chemistry 235, 660 [I960]. 18 S. B r e n n e r , F. Jak o b u . M . M eselson , Nature [London] 190, 576 [1961]. G ro s, H . H i a t t , W . G ilb e r t , C. G . K u r la n d , R . W . Risebrough u . J. D. W a ts o n , Nature [London] 190, 581 [1961]. 21 R . M u n ie r u . G . N. C ohen, Biochim. biophysica Acta [Am­ sterdam] 31, 378 [1959]. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM 672 C. SCHOLTISSEK UND R. ROTT weiß, daß FPA an Stelle von P A in das Protein ein­ gebaut wird 21. Wenn das erwähnte, für die Vermeh­ rung wichtige Protein nun eine falsche Aminosäure enthält, ist es nicht mehr funktionstüchtig. Ein ent­ sprechendes Protein wurde auch bei der Phagenver­ mehrung diskutiert 22-24 und hier als „early pro­ tein“ bezeichnet. Da die RN S des KP-Virus keine abnormalen Basen enthält und demnach alle Enzyme für die RNS-Synthese schon in der nichtinfizierten Zelle vorhanden sind, könnte die Funktion des hier ver­ muteten „early protein“ in der Stabilisierung der genetischen Inform ation des infizierenden Partikels liegen. Man könnte z. B. dabei an die Synthese einer komplementären DNS denken, die zusammen mit dem „early protein“ eine stabile Matrize für die weitere Virus-RNS-Synthese ergibt. Diese Möglich­ keit läßt sich jedoch weitgehend ausschließen, da die Virusvermehrung durch Hemmung der DNSSynthese mit Aminopterin nicht beeinflußt werden kann. Ein Vermehrungsmodell, bei dem eine VirusDoppelstrang-RNS eine Rolle spielt, kann von vorn­ herein fallen gelassen werden, da die Basenverhält­ nisse der K P -R N S 8 und die der ihm verwandten Influenza-Viren2o einen Doppelstrang ausschließen. Schließlich ist in Betracht zu ziehen, daß das „early protein“ eine zur Virus-RNS komplementäre RNS stabilisiert, die als Matrize fortwährend in Funktion ist. Für das Vorhandensein einer solchen stabilen Matrize spricht die Feststellung, daß von 2 Stdn. p.i. ab die s-Antigen-Synthese durch FPA nicht mehr beeinflußt werden kann. Die Matrize übernimmt offenbar eine Funktion, die derjenigen der DNS in normalen Zellen entspricht. Da in der ruhenden Zelle ein analoges Matrizensystem bereits vorhanden ist, wird deren RNS- und Protein-Syn­ these durch FPA auch nicht gehemmt. A n sich ge­ stattet unsere Charakterisierungs-Methode eine der­ artige komplementäre RN S von der Virus-RNS zu unterscheiden. Da man nur eine geringe Menge von ihr erwarten kann und sie am Stoffwechsel nicht teil­ nimmt. ist es nicht verwunderlich, daß sie dem Nach­ weis entgeht. 22 J. T omizawa u. S. S unakaw a , J. gen. Physiol. 39, 553 [1956], 23 G. S. S tent, in: Advances in Virus Research V (eds. K. M. S mith and M. A. L a uffer ) Acad. Press, New York 1958, pp. 95. Bei der Diskussion des „early protein“ war unter­ stellt worden, daß unter FPA ein funktionsuntüchti­ ges Protein synthetisiert wird. In Tab. 4 ist der Nachweis erbracht worden, daß ein in Gegenwart von FPA hergestelltes Virusprotein zwar serologisch noch nachweisbar ist, in das Viruspartikel aber nicht eingebaut wird. Das mit FPA versehene s-Antigen wird offensichtlich als Baustein für die Virussynthese verworfen. Kürzlich beschrieben W e c k e r und S c h o n n e 26 die W irkung von FP A auf die Synthese von infektiöser R N S bei der Vermehrung des Pferdeencephalomyelitis-Virus (W E E ). Sie kamen zu dem Schluß, daß eine Proteinsynthese vor Beginn der Virus-RNSSynthese nicht notwendig sei, da sich die Synthese von infektiöser RNS durch F P A zu jeder Zeit nach der Infektion abbrechen ließ; danach liegt bei die­ sem Virus eventuell ein anderer Vermehrungs­ mechanismus vor. Man muß aber auch m it der Möglichkeit rechnen, daß hier zwar Virus-RNS un­ ter FPA gebildet, durch die von den Autoren ver­ wendeten Methoden aber nicht erfaßt wird. Es könnte z. B. durch ein falsches Protein der Schutz der RN S vor abbauenden Enzymen verlorengehen und die Nucleinsäure dadurch ihre Infektiosität ein­ büßen 27. Eine nur wenig abgebaute RNS würde mit der von uns angewendeten Methode jedoch erfaßt werden. Eine weitere Differenz betrifft den Einbau von 14C-Aminosäuren in das Zellprotein unter FPA . W ährend wir keine Beeinflussung feststellen konn­ ten, fanden W e c k e r und S c h o n n e eine solche in ihrem Experiment; dazu ist zu bemerken, daß un­ sere Konzentration an FPA weniger als halb so hoch war als die von ihnen verwendete. Bei weniger dich­ ten Zellschichten fanden auch wir eine Abnahme der Einbaurate mit der Zeit. Unsere Befunde stehen mit folgendem Bild von der Vermehrung des KP-Virus im Einklang: W ährend der Infektion wird das g-Antigen der Viruspartikel in Freiheit gesetzt6 und an dessen RN S eine komplementäre RN S synthetisiert. Sie wird mit Hilfe eines neugebildeten Proteins („early protein“ ) stabilisiert, das mit den bisher verfüg- 24 L. V. C ra w fo rd , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 28. 208 [1958]. 25 G . L. A d a , B. T. P e r r y , J. gen. Microbiol. 14. 623 [1956]. 26 E. W e c k e r u . E. Schonne, Proc. nat. Acad. Sei. USA 47, 278 [1961]. G ie re r. Z. Naturforschg. 13 b. 485 [1958]. 27 A. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM SÄUREHYDROLYSE VON RIBONUCLEINSÄURE UND DESOXYRIBONUCLEINSÄURE 673 baren, virusspezifischen, biologischen Testen nicht erfaßt werden kann. Spätestens 2 Stdn. p.i. ist die Synthese dieses hypothetischen Matrizen-Komplexes abgeschlossen. Nunmehr beginnt die gleichzeitige Synthese von Virus-RNS und s-Antigen-Protein im Zellkern 4. A n diesem Ribonucleoproteid wird sofort das Protein des Hämagglutinins synthetisiert (vgl. auch Anm. 28), das allerdings erst später im Cyto­ plasma 4 seine für die biologische Aktivität erforder- liehe Struktur erhält. Der Zusammenbau der bei­ den Untereinheiten zum infektiösen Viruspartikel erfolgt in unmittelbarer Nähe der Zellmembran 29. 28 L. 29 G. H o yle , J. of Hyg. 50. 229 [1952]. Herrn Professor Dr. W. S c h ä f e r danken wir für die Unterstützung und Förderung der Arbeit, Fräulein D. K u n e r t , Herrn O. H a r z e r und Herrn W. K r a u s für ihre wertvolle Mithilfe. Die Arbeit wurde mit Mitteln der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durchgeführt. H otz u. W. S chäfer , Z. Naturforsdig. 10 b, 1 [1955]. Säurehydrolyse von Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure Von W . P ollm ann und G. S chram m Aus dem, Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen (Z. Naturforsdig. 16 b, 673— 678 [1961] ; eingegangen am 28. J u li 1961) A method for the potentiometric titration of secondary phosphate groups in nucleic acids is de­ scribed. Ribonucleic acids of yeast and of microsomes contain 5 —6% secondary phosphate groups which cannot be removed by dialysis. The potentiometric method was applied to study several enzy­ matic hydrolyses and the non-enzymatic hydrolysis between pn 2.4 —1.8. The rate of hydrolysis for the purines and for the phosphate groups is approximately proportional to the H®-concentration. The constants of hydrolysis for ribonucleic acid and for deoxyribonucleic acid were determined. In DNA the depurinisation is 650 times faster than in RNA. In den Nucleinsäuren kommen zwei Arten von Bindungen vor, die in saurer Lösung leicht hydroly­ siert werden: 1. die glykosidische Bindung zwischen den Zuckerresten und den Purinen und 2. die Phosphorsäurediester-Bindung zwischen den einzelnen Zuckerresten. Die Stabilität der glykosidischen B in­ dung ist abhängig von den benachbarten Substituen­ ten, die Spaltung erfolgt bei den Purinen bedeutend leichter als bei den Pyrim idinen und ist auch von Purin zu Purin etwas verschieden. Die Gründe hier­ für wurden kürzlich in einer Arbeit von M i c h e e l 1 aufgezeigt. Die Beständigkeit der Glykosid-Bindung ist aber auch von der Art des beteiligten Zuckers abhängig, denn bei der DNS (Desoxyribonuclein­ säure) erfolgt die Purinabspaltung viel leichter als bei der RN S (Ribonucleinsäure), so daß aus der DNS Purinreste quantitativ abgespalten werden kön­ nen, ohne daß hierbei die hochmolekulare Struktur völlig zerstört wird. Diese Hydrolysenprodukte wur­ den von C h a r g a f f als A purinsäuren2 bezeich­ net. Von F r e e s e 3 wurde gezeigt, daß die Entfernung bestimmter Basen aus der DNS zu Mutationen fü h ­ 1 F . M ic h ee l , A. H essing , 2 C h . T am m , M . E. H odes Chem. Ber. 94, 1814 [1961]. u . E. C h argaff , J. biol. Chemistry ren kann, da bei der nachfolgenden Vermehrung diese Fehlstellen durch andere Basen wieder auf­ gefüllt werden. A uf der anderen Seite geht aus U n­ tersuchungen an verschiedenen isolierten Nuclein­ säuren hervor, daß die Hydrolyse der Phosphat­ brücken zu einer Inaktivierung führt. Es ist daher wichtig, genaue Unterlagen dafür zu besitzen, inwie­ weit eine Spaltung der glykosidischen Bindungen zu den Purinen ohne Kettenabbau möglich ist. Die Möglichkeit zur Herstellung von Apurinsäuren hängt von dem Verhältnis der beiden Reaktionskonstanten ab. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Hydrolysen-Geschwindigkeit der Phosphorsäurediester-Gruppen zu den sekundären Phosphaten und die Hydrolysen-Geschwindigkeit der glykosidischen Bindungen zu den Purinen bei verschiedenen N u ­ cleinsäuren quantitativ bestimmt. Zur Messung der ersten Reaktion arbeiteten wir ein potentiometrisches Titrationsverfahren aus. Die Menge der ab­ gespaltenen Purinreste wurde nach bereits bekann­ ten Verfahren durch Chromatographie und anschlie­ ßende Extinktionsmessung bestimmt. 3 E. B autz u. [1961] ; E. E. F r ee se , Proc. nat. Acad. F r ee s e , Brookhaven Sympos. 195, 49 [1952]. Unauthenticated Download Date | 5/11/16 7:16 PM Sei. USA 47, 540 12, 63 [1959].
