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Aminosäuren, Seite 1
Aminosäuren
Einführung
Aminosäuren (AS) spielen in allen Zellen eine herausragende Rolle als Strukturbestandteile
von komplexen Molekülen, Ausgangsstoffe von Synthesen und zum Teil als Energiequellen.
Die Eigenschaften der Aminosäuren und ihr Stoffwechsel sind deshalb von besonderem medizinischem Interesse. Vererbte und erworbene Störungen im Stoffwechsel von Aminosäuren
sind Ursachen von zahlreichen Krankheiten. Als Bausteine von Proteinen sind AS an der
Katalyse und fast dem gesamten Stoffwechsel beteiligt. Im vorliegenden Versuch werden die
Grundlagen der Struktur und Funktion von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen deutlich
gemacht.
Stichworte zur Vorbereitung
Struktur von Aminosäuren und Proteinen, Peptidbindung, proteinogene Aminosäuren
(Wiederholungsstoff). Stoffwechsel nicht-essentieller Aminosäuren. Mechanismus und
Bedeutung von Amidierungs-, Decarboxylierungs- und Transaminierungsreaktionen (einschl.
diagnostisch relevanter Applikationen). Reduktive Aminierung und oxidative Deaminierung.
Glucogene und ketogene Aminosäuren. Funktionen und Abbau von essentiellen und bedingt
essentiellen Aminosäuren. Abbaufamilien. S-Adenosylmethionin und C1-Stoffwechsel.
Phosphoadenosinphosphosulfat. Vitamine im Stoffwechsel von Aminosäuren und Folgen von
Vitaminmangel. Bildung und Abbau von Signalstoffen und Hormonen aus Aminosäuren.
Intrazellulärer Proteinabbau. Lysosomen, Proteasomen.
Versuch 1
Identifizierung von Aminosäuren durch DC und Farbreaktionen
Jede Gruppe erhält eine Lösung (AS-Lösung X), in der sich eine der folgenden Aminosäuren
befindet: Alanin, Arginin, Cystein, Histidin, Prolin, Tryptophan und Tyrosin.
a) Dünnschichtchromatographie
Zur Identifizierung der Aminosäuren wird ein Dünnschichtchromatogramm (DC) des
Gemischs angefertigt (siehe Methodische Einführung). Als stationäre Phase dient eine mit
Kieselgel beschichtete Glasplatte und als Laufmittel ein Gemisch von n-Butanol, Essigsäure
und Wasser im Verhältnis 4:1:1.
5 µl der AS-Lösung werden etwa 1 cm von unteren Rand entfernt auf eine DC-Platte (5 x 10 cm) aufgetragen. In
weitere Spuren werden zum Vergleich Proben der bereitgestellten Lösungen einzelner Aminosäuren
aufgetragen. Nach Trocknen der Flecken wird die Platte vorsichtig in einen Chromatographietrog eingestellt, der
0.5 cm hoch mit Laufmittel gefüllt ist (Abzug !). Nach Schließen des Troges wird chromatographiert, bis die
Laufmittelfront fast den oberen Rand der Platte erreicht hat. Die Platte wird entnommen und im Abzug auf
Filterpapier getrocknet (Dieser Arbeitsgang läßt sich mit einem Heißlufttrockner beschleunigen). Dann wird die
Platte aus etwa 30 cm Entfernung kurz mit Ninhydrin-Reagenz besprüht (die Schicht darf nicht durchfeuchtet
sein) und zum Sichtbarmachen der Flecken kurz auf einer Heizplatte auf etwa 100 °C erhitzt. Alle Aminosäuren
färben sich blau bis violett außer Prolin, das mit dem Reagenz eine Gelbfärbung ergibt.
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Zur Identifizierung von AS in der Dünnschichtchromatographie kann man Rf - Werte
heranziehen. Dies ist die Angabe ihrer Wanderungsstrecke relativ zur Wanderungsstrecke des
Lösungsmittels. Solche Rf -Werte sind in der Tabelle aufgeführt; es handelt sich dabei allerdings nur um Anhaltspunkte, da Rf -Werte je nach Versuchsbedingungen erheblich
schwanken können.
Aminosäure
Alanin
Arginin
Cystein
Histidin
Prolin
Tryptophan
Tyrosin
X
Ala Arg
Rf - Wert
0.27
0.08
0.30
0.06
0.19
0.56
0.47
X
Cys His
X Pro Trp Tyr
b) Identifizierung durch Farbreaktionen
Die Seitenketten einiger Aminosäuren lassen sich mit bestimmten Reagenzien zu Farbstoffen
umsetzen und so qualitativ nachweisen.
Cole-Hopkins-Test im Reagenzglas durchführen. Konz. Schwefelsäure vorsichtig (!!!) mit
Pasteurpipette aus Glas - nicht mit Eppendorf-Pipetten - dosieren! Alle andern Reaktionen
können mit Eppendorfcaps und –pipetten ausgeführt werden.
1. Sakaguchi-Reaktion (spezifisch für Arginin)
Reagenz A) 50 mg 1-Naphthol + 5 g Harnstoff in 100 ml 95 % EtOH
Reagenz B) 0.7 mL Brom + 5 g NaOH in 100 mL H2O
Geben Sie zu 100 µL der AS-Lösung dasselbe Volumen von Reagenz A und dann nach Umschütteln 2
Volumina B. Bei Anwesenheit von Arginin entsteht eine Rotfärbung.
2. Pauly-Reaktion auf Tyrosin und Histidin
Die aromatischen Seitenketten von Tyrosin und Histidin reagieren mit Diazoniumsalzen , z.B.
diazotierter Sulfanilsäure, zu rot gefärbten Azofarbstoffen.
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Reagenz A) 0.5 % Sulfanilsäure in 2% HCl
Reagenz B) 0.5 % Natriumnitrit (NaNO2)
Etwa 100 µL A mit 100 µl B mischen (Diazotierung). Nach 1 min werden 400 µL AS-Lösung gegeben. Nach
Umschütteln macht man durch tropfenweise Zugabe von 10 % Na2 CO3 alkalisch. Bei Anwesenheit von
Tyrosin oder Histidin färbt sich die Lösung intensiv rot, sonst hellgelb.
3) Nachweis von Cystein durch DTNB
Die freie SH-Gruppe des Cysteins reagiert mit dem Disulfid DTNB unter Freisetzung von
orange gefärbtem TNB
Eine 100 µL-Probe der AS-Lösung wird mit dem doppelten Volumen 10 mM DTNB in 100 mM Tris/HCl
Puffer, pH 8.0 gemischt. In Gegenwart von Cystein entsteht eine Orangefärbung.
4. Cole-Hopkins-Reaktion zum Nachweis von Tryptophan
A) 1 g Glyoxylsäure in 100 mL H2O
B) H2SO4 konz. (Vorsicht !)
Zu 100 µL der AS-Lösung in einem großen Reagenzglas gibt man zunächst 1 mL A. In diese Lösung läßt man
langsam 1 mL konzentrierte Schwefelsäure (B) einfließen (Vorsicht ! Reagenzglas-öffnung vom Körper abwenden !). In Gegenwart von Tryptophan entsteht nach Umschütteln ein braunvioletter Farbstoff.
Die Farbreaktionen lassen sich während des DC-Laufs durchführen. Vermerken Sie im Protokoll den Verlauf der einzelnen Versuche und geben Sie an, welche Aminosäuren in Ihrer
Probe enthalten sind.
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Versuch 2
Aspartataminotransferasereaktion und Bestimmung von
Pyridoxalphosphat im Blutplasma
Einleitung
Aminotransferasen (Transaminasen) sind Vitamin B6 - abhängige Enzyme, die am
Abbau der meisten Aminosäuren und an der Biosynthese nicht essentieller
Aminosäuren beteiligt sind. Aspartat-Aminotransferase (AAT, GOT), die eine Rolle
beim Transfer von Redoxäquivalenten aus dem Cytosol in die Mitochondrien spielt,
kommt in einer relativ hohen Aktivität in Herz- und Skelettmuskulatur sowie dem
Leberparenchym vor. Erhöhung ihrer Aktivität in Serumproben deutet auf eine
Schädigung eines der grossen Organe.
Die Bedeutung der Coenzyme für die Aminotransferase Aktivität lässt sich durch
einen Vergleich der enzymatischen Aktivität in der Abwesenheit (Apoenzym) und
Anwesenheit (Holoenzym) des Coenzyms demonstrieren. Unter besonderen
Bedingungen kann man das Coenzym vom Holoenzym abtrennen, um das
Apoenzym zu gewinnen. Durch Rekonstitution und Bestimmung der Aktitivität des
Apoenzyms mit Pyridoxalphosphat (PALP) kann die Konzentration des Coenzyms
(der aktiven Form des Vitamin B6) bestimmt werden. Durch den Nachweis der
enzymatischen Aktivität kommt es zu einer Signalverstärkung, so dass die
Nachweisgrenze im fmol- bis pmol- Bereich liegt.
In einer mit Malatdehydrogenase als Indikatorenzym gekoppelten Bestimmung wird
PALP wie folgt quantitativ nachgewiesen. Eine Serum-Extraktprobe mit und ohne
Zusatz einer bekannten Vitamin B6 Menge wird mit Apo-AAT inkubiert. Der PALP Menge entsprechend wird ein Teil des Apo- zum Holoenzym umgesetzt. In dem
gekoppelten "Assay" wird zwischen der Geschwindigkeit der Oxidation von NADH
und der Konzentration des Holoenzyms und damit der PALPs eine proportionale
Abhängigkeit beobachtet. Durch die Holo-AAT, jedoch nicht durch die Apo-AAT wird
in Anwesenheit von α-Ketoglutarat das Aspartat zu Oxalacetat umgesetzt, das mit
Hilfe von dem Indikatorenzym (Malatdehydrogenase im Überschuss) zur Oxidation
von NADH genutzt wird. Die NADH-Extinktion bei 340 oder 366 nm wird je nach der
Konzentration des gebildeten Holoenzyms schneller oder langsamer sinken.
α Ketoglutarat
Aspartat
AAT(PALP)
→
Glutamat
+
Oxalacetat
Indikatorreaktion:
Oxalacetat
MDH ↓ NADH + H+
Malat + NAD+
Diese beiden Reaktionen sind zwar reversibel, doch zu Beginn der Reaktion wird,
ausgehend von α-Ketoglutarat und Aspartat, das Oxalacetat und durch dessen
Reduktion bei gleichzeitiger Oxidation von NADH Malat gebildet. In Anwesenheit
einer hohen Malatdehydrogenaseaktivität wird die Geschwindigkeit der Oxidation von
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NADH von der Aktivität der AAT bestimmt. Da nur das Holoenzym aktiv ist, korreliert
diese Geschwindigkeit mit der PALP-Menge in der Probe. Der interne Standard, mit
dem die PALP-Konzentration in dem Blutplasma bzw. dem Ansatz um 4 µM bzw.
0,32 nM erhöht wird, ist ein Maß der Konzentration von PALP im Blutplasma.
(Berechnen Sie die Menge des dem internen Standard entstprechenden Coenzyms
im Reaktionsansatz in der Küvette 3 in mol !)
Benötigte Lösungen
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
0,1 M Na-EDTA, pH 7,0
16 µM Pyridoxalphosphat (PALP)
9 M Perchlorsäure
1 M KOH
Puffer: 0,05 M EDTA, 0,5 M Tris - HCl, pH 6,2
Apo - Aspartataminotransferase, 100 units/mL
Indikatorenzymgemisch: 30 mM Asparaginsäure, 0,15 mM oder 0,3 mM
NADH (für Messungen bei 340 bzw. 366 nm) in 10 mM EDTA, 100 mM Tris HCl Puffer, pH 7,4 frisch versetzt mit Malatdehydrogenase (1 unit / mL)
250 mM α-Ketoglurat in 10 mM EDTA, 100 mM Tris - HCl, pH 7,8
Durchführung
a) Probenvorbereitung. Jeweils zwei Kursteilnehmer/innen bilden ein Team. In einem
Reationsgefäß mit 5 µL EDTA (Lösung 1) werden 120-150 µl Kapillarblut gesammelt.
Nach dem Mischen wird die Probe 2 Min. bei 14000 g zentrifugiert. Der klare
Überstand wird in ein neues Gefäß überführt. Weiter wird nach dem Pipettierschema
in der nachstehenden Tabelle gearbeitet. Gefäße 1 und 2 erhalten 25 bzw. 5 µl H20.
Gefäß 3 erhält 5 µl PALP Standard (2). Gefäße 2 und 3 erhalten je 20 µl Blutplasma.
Die Proben werden mit 5 µL Perchlorsäure (3) gemischt und 5 min auf Eis gelagert.
Weiterhin werden Proben mit 80 µL Wasser verdünnt. Nach einer Zentrifugation (2
min 14000 g) werden von den Überständen jeweils 100 µL in neue Gefäße
abgenommen. Die Überstände werden mit 50 µL Kalilauge (4) gemischt und das
gefällte KClO4 wird abzentrifugiert (2 min, 14000 g).
b) Probenanalyse
In drei nummerierte Halbmikroküvetten werden je 100 µL Pufferlösung (5) mit je 40
µL Probenüberstand pipettiert. Es werden je 10 µl Apo-AAT (6) hinzugefügt. Nach
dem Mischen werden die Lösungen 90 Min. bei 37°C inkubiert. Nach der Bindung
des PALP an das Apoenzym werden je 400 µl Indikatorenenzymgemisch (7)
zugesetzt. Die Reaktion wird mit 50 µL α-Ketoglutarat - Lösung (8) gestartet. Sofort
nach dem Mischen mit dem Ansatz und danach 12 mal in Abständen von 30 sec wird
die Extinktion bei 340 (360) nm gemessen. Nach graphischer Auswertung der
Anfangsgeschwindigkeit wird entsprechend der Anleitung in der Tabelle zunächst die
durch den internen Standard verursachte Erhöhung der Reaktions-geschwindigkeit
und danach die PALP-Konzentration in der Blutprobe errechnet.
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Pipettierschema/Durchführung (Angaben in µl)
Ansatz im Reaktionsgefäß Nr. LW
H2O
16 µM PALP
2
3
Inkubation auf Eis
H2O
Zentrifugieren (14000 g)
Neue Gefäße
4
5
0
-
-
5
-
20
20
5
5
5
5 Min.
5 Min.
5 Min.
80
80
80
2 Min.
2 Min.
2 Min.
1'
Nr.
Proteinfreier Überstand
1 M KOH
2 int. Standard 3
25
Plasma
9 M Perchlorsäure
1 Probe
2'
3'
100
100
100
50
50
50
Inkubation auf Eis
2 Min.
2 Min.
2 Min.
Zentrifugieren (14000 g)
2 Min.
2 Min.
2 Min.
Küvette
Puffer
5
Überstand
Apo AAT
1
Nr.
6
Inkubation 37°C
2
3
100
100
100
40
40
40
10
10
10
90 Min.
90 Min.
90 Min.
Enzym-Gemisch
7
400
400
400
Startlösung
8
50
50
50
Mischen
Extinktion nach 30 sec
"
60 sec
"
90 sec
"
120sec
"
150 sec
"
180 sec
"
210 sec
"
240 sec
"
270 sec
"
300 sec
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Auswertung
Lineare Geschw. v (∆E/min)
Differenz ∆v (Ansatz 2 - Ansatz 1)
-
∆v Standard (Ansatz 3 - Ansatz 2)
-
PALP-Konzentration 1 (µM)
-
PALP-Konzentration 2 (µM)
4
0,032
Substratumsatz durch PALPZusatz3 (µM/min)
Wechselzahl4 (min-1)
1
2
3
4
Die PALP-Konzentration (im Ansatz 2) in der Blutplasmaprobe bzw. (im Ansatz 3) die auf
20 µL bezogene Konzentraton des PALP-Standards [16 µM x (5:20) = 4 µM]
Die PALP-Konzentration des Standards in 600 µL Reaktionsansatz 3 entspricht 32 nM. [16
µM : (Verdünnungsfaktor F im Extrakt x Verdünnungsfaktor im Reaktionsgemisch) = 16 µM
: (33 x 15) = 32 nM]
Berechnung nach dem Lambert - Beer`schen Gesetz. (Eine 1 mM NADH - Lösung in einer
1 cm Küvette ergibt bei 340 nm oder 366 nm den Extinktionswert von 6,2 bzw. 3,2.)
Bei der Bestimmung der Coenzym-Konzentration anhand der Holoenzymaktivität entspricht
die Wechselzahl dem Verstärkungsfaktor des Nachweises. In unserem Ansatz stellt die
Wechselzahl die Zahl der in einer Minute oxidierten NADH-Moleküle dar, bezogen auf ein
Molekül PALP bzw. des Holoenzyms. (Die hier zu berechnende Wechselzahl wird auf
Grund einer unter den gewählten Versuchsbedingungen unvollständigen Umsetzung des
Coenzyms zum Holoenzym etwas unterschätzt.) Im SI System wird das Äquivalent der
Wechselzahl in sec-1 berechnet.
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Grafische Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeit (∆E/min)
Extinktion
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
30
60
90 120 150 180 210 240 270 300 330
Zeit (sec)
Das Protokoll:
Die Mess- und die Indikatorreaktion:
Prinzip der Messung:
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Gemessene PALP-Konzentration im Blutplasma:
Menge des dem internen Standard entstprechenden Coenzyms im Reaktionsansatz
in der Küvette 3 in mol:
Wechselzahl der Aspartataminotransferase:
FRAGEN
a) Wiederholungsthemen
1. Welche sind die proteinogenen Aminosäuren und in welche Strukturklassen kann man
diese einteilen ?
2. Welche Aminosäuren sind basisch, welche sauer, hydrophob, tragen Hydroxylgruppen,
enthalten ein Schwefelatom, tragen nicht-ionisierbare oder aromatische Seitenketten ?
3. Von welcher Aminosäure gibt es keine Enantiomere, von welchen mehr als zwei ?
b) Stoffwechselfragen
4. Warum muß die Nahrung Proteine enthalten ? Wie hoch ist der tägliche Bedarf ?
5. Wovon hängt die ernährungsphysiologische Qualität eines Proteins ab ?
6. Kennen Sie die essentiellen Aminosäuren ?
7. Wie werden die Aminosäuren Glutamin und Glutamat synthetisiert und abgebaut ?
8. Wie und zu welchen Produkten werden Aminosäuren decarboxyliert ?
9. Wie werden überschüssige Aminosäuren verwertet ?
10. Welche Aminosäuren werden aus den Intermediaten der Glykolyse, welche aus denen des
Citratzyklus synthetisiert ?
11. Wie werden Aminosäuren bei Hunger mobilisiert ? Welche Hormone fördern den Abbau
von Aminosäuren und Proteinen ?
12. Welche Abbaufamilien von Aminosäuren kennen Sie ?
13. Durch welche Systeme werden Proteine in der Zelle abgebaut, was sind die Produkte?
14. Welche Aminosäuren und welche Vitamine sind am C1-Stoffwechsel beteiligt ?
15. Welche Amino- und Ketosäuren sind Substrate der Aspartat- bzw-.
Alaninaminotransferase ?
16. Welche Pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme ausser Aminotransferasen sind Ihnen
bekannt ?
17. Welches Stoffwechselprodukt tritt bei B6-Mangel in erhöhter Konzentration im Urin auf ?
18. Welches Stoffwechselprodukt tritt bei Tetrahydrofolsäure-Mangel in erhöhter
Konzentration in Urin auf ?
19. Welche Aminosäuren werden zur Synthese von Adeninnukleotiden benötigt ?
20. Welche Aminosäuren werden für die Synthese von Phosphatidyl- und Sphingolipiden
benötigt?