Untersuchungen zur Ubiquitinylierung des PTS1
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Aus dem Institut für Physiologische Chemie Abteilung Systembiochemie der Fakultät für Medizin der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. rer. nat. R. Erdmann Untersuchungen zur Ubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p im Rahmen des peroxisomalen Matrixproteinimports in der Hefe Saccharomyces cerevisiae Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Christoph Denter aus Castrop-Rauxel 2009 Dekan: Prof. Dr. med. Gerd Muhr Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ralf Erdmann Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Joachim Rassow Tag der mündlichen Prüfung: 8. Juni 2010 meinen geliebten Eltern Inhaltsverzeichnis 1 1. Einleitung 1.1 Peroxisomen 1 1.2 Peroxisomale Erkrankungen 2 1.3 Modellsysteme und Identifizierung peroxisomaler Proteine 4 1.4 Biogenese von Peroxisomen 5 1.5 Import peroxisomaler Matrixproteine 5 1.6 Signalsequenzen für peroxisomale Matrixproteine und PTS-Rezeptoren 6 1.7 PTS-Rezeptoren Pex5p und Pex7p 6 1.8 Schritte des Proteintransport über die peroxisomale Membran 7 1.9 Das Ubiquitin-Proteasom-System 10 1.10 Bedeutung der Ubiquitinylierung für die peroxisomale Funktion 12 1.11 Zielsetzung der Arbeit 13 2. Materialien und Methoden 14 2.1 Materialien 14 2.1.1 Geräte 14 2.1.2 Feinchemikalien 15 2.1.3 Verbrauchsmaterialien und „Kits“ 17 2.1.4 Mikroorganismen 17 2.1.4.1 Escherichia coli 17 2.1.4.2 Saccharomyces cerevisiae 18 2.1.5 Plasmide 18 2.1.6 Oligonukleotide 19 2.1.7 Enzyme 21 2.1.8 Antiseren 22 2.1.9 Medien 22 2.1.10 Lösungen und Puffer 23 I 2.2 Methoden 24 2.2.1 Kultivierung von Escherichia coli 24 2.2.2 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae 25 2.2.2.1 Wachstum auf Festagarplatten 25 2.2.2.2 Wachstum in Flüssigkulturen 25 2.2.2.3 Oleatwachstumstest 25 2.2.2.4 Anzucht zur fluoreszenzmikroskopischen Analyse 25 2.2.3 Aufschluss von Saccharomyces cerevisiae 26 2.2.3.1 TCA-Aufschluss 26 2.2.3.2 Mechanischer Aufschluss mittels Glasperlen 26 2.2.4 Quantitativ analytische Methoden 26 2.2.4.1 Bestimmung der Zelldichte 26 2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 27 2.2.4.3 Bestimmung der Nukleinsäurenkonzentration 27 2.2.4.4 Bestimmung der molekularen Masse denaturierter Proteine 27 2.2.5 Molekularbiologische Methoden 2.2.5.1 Herstellung und Transformation von Calcium-Chlorid- 27 27 kompetenten Escherichia coli-Zellen 2.2.5.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen 28 2.2.5.3 Fällung von DNA 28 2.2.5.4 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen 28 2.2.5.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR 28 2.2.5.6 Agarose-Gelelektrophorese 28 2.2.5.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 29 2.2.5.8 Ligation von DNA-Fragmenten 29 2.2.5.9 Transformation von Saccharomyces cerevisiae-Zellen 29 2.2.6 Proteinanalytische Methoden 29 2.2.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 29 2.2.6.2 Western-Blotting und Immundetektion 30 2.2.7 Zellbiologische Methoden 2.2.7.1 Direkte immunfluoreszenzmikroskopische Analyse von 30 30 S. cerevisiae-Hefezellen II 2.2.7.2 Membransedimentation eines Proteins in S. cerevisiae- 30 Hefezellen 2.2.7.3 Komplexisolierung membrangebundener Proteinkomplexe 31 mittels IgG-Sepharose Affinitätschromatographie aus S. cerevisiae-Hefezellen 3. Ergebnisse 32 3.1 Ubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p 32 3.2 Pex5p-Verkürzungen 34 3.3 Expressionskontrolle verschiedener Pex5p-Verkürzungen 36 3.4 Überprüfung der Funktionalität der Pex5p-Verkürzungskonstrukte und 37 der Pex1p-TEV-ProtA-Integration 3.5 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der 40 Konstrukte auf den PTS1-Importweg 3.6 Analyse der Membranassoziation der Verkürzungskonstrukte 42 3.7 Analyse von Pex5p enthaltenden Membrankomplexen 44 3.8 Polyubiquitinylierung von Pex5p 47 3.9 Analysen der Punktmutanten 49 3.10 Expressionskontrolle der Punktmutanten 52 3.11 Überprüfung der Funktionalität der Punktmutanten 53 3.12 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der 55 Punktmutation auf den PTS1-Importweg 3.13 Mono- und Poly-Ubiquitinylierung der Punktmutanten 56 3.14 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der 58 Punktmutaion zweier benachbarter Aminosäuren auf den PTS1Importweg 3.15 Polyubiquitinylierung der Doppelpunktmutante 60 III 4. Diskussion 4.1 62 Funktionelle Analyse von N- und C-terminalen Verkürzungen des PTS1- 62 Rezeptors 4.2 Subzelluläre Lokalisation der Pex5p-Fragmente 64 4.3 Interaktion von Pex5p mit verschiedenen anderen Peroxinen 65 4.4 Polyubiquitinylierung von Pex5p 66 4.5 Gerichtete Mutagenese zur Identifizierung der Zielaminosäure der 67 Ubiquitinylierung von Pex5p 4.6 Ubiquitinylierungen der Punktmutanten 68 4.7 Polyubiquitinylierung der Doppelpunktmutante Pex5p [K18/24R] 69 5. Zusammenfassung 71 6. Literaturverzeichnis 73 Danksagung Lebenslauf IV Abkürzungen (w/v) (weight/volume) AAA ATPases associated with diverse cellular activities Abb. Abbildung APS Ammoniumpersulfat BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin) cMRI cerebral magnetic resonance imaging DMSO Dimethylsulfoxid DNA Didesoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethanolsulfonsäure Hs Homo sapiens IgG Immunglobulin G MRT Magnetresonanztomographie O.D. Optische Dichte PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid rpm revolutions per minute (Umdrehung pro Minute) SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) TCA Trichloressigsäure TEMED Tetramethylethylendiamin TEV tobacco etch virus (Tabak Mosaik Virus) Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan UV Ultra-Violett UZ Ultrazentrifuge ü. N. über Nacht V 1. Einleitung „Omnis cellula e cellula“, so beschrieb der Zellularpathologe Rudolf Virchow sein in den 50er Jahren des 19. Jahrhunderts entwickeltes iatromorphologisches Konzept, welches den Ursprung der Krankheiten in den kleinsten morphologischen selbstständigen Einheiten des Organismus, den Zellen, sieht. Heute bilden Physiologie und Biochemie das methodische Repertoire für die molekulare Analyse von Krankheiten. Besonders in der medizinischen Biochemie ist die Kenntnis über den genauen Aufbau der eukaryonten Zelle einschließlich der Funktion und Wechselwirkungen mit anderen Zellen elementar, um funktionelle Veränderungen auf zellulärem Niveau verstehen zu können. Eukaryonte Zellen sind durch eine Plasmamembran, welche aus Proteinen, Lipiden und einem geringen Anteil kovalent gebundener Kohlenhyrate besteht, nach außen hin abgegrenzt. Ein charakteristisches Merkmal gegenüber prokaryonten Zellen ist das Vorhandensein eines komplexen Systems membranumschlossener Reaktionsräume. Zu diesen als Organellen bezeichneten Kompartimenten zählen der Zellkern, das Endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Golgi-Apparat, Vakuolen, Chloroplasten und die Microbodies. Da innerhalb einer Zelle die Organellen jeweils spezifische Funktionen übernehmen, sind diese für die komplexen Stoffwechselleistungen der Zelle essentiell. 1.1 Peroxisomen Peroxisomen sind 0,2 - 1 µm große Organellen, die durch eine einfache Membran vom Zytosol abgegrenzt sind, keine Nukleinsäuren enthalten und ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommen (zur Übersicht (Schrader 2008)). Ihre Entdeckung geht auf Rhodin zurück, welcher diese 1954 bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Nierentubuluszellen fand (Rhodin 1954). Die zunächst von Rhodin als Microbodies bezeichneten Organellen erhielten ihren heutigen Namen Peroxisomen durch De Duve (DeDuve and Baudhuin 1966). Anhand von biochemischen Untersuchungen konnten De Duve und Baudhuin zeigen, dass Peroxisomen das Enzym Katalase besitzen, welches zum Abbau des durch eine Oxidase enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxids und somit zur Detoxifikation fähig sind (DeDuve and Baudhuin 1 1966). Weiterhin enthalten Peroxisomen Enzyme des β-Oxidationsweges. Dieser unterscheidet sich jedoch deutlich von dem der Mitochondrien (Hashimoto 1982) (Kunau, Bühne et al. 1988). Werden in menschlichen Zellen nur langkettige Fettsäuren in Peroxisomen metabolisiert, um nachher durch die Mitochondrien weiter verstoffwechselt zu werden, so sind Pilze und Hefen, wie z.B. die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae auf die peroxisomale β-Oxidation angewiesen, da ausschließlich hier ein Fettsäureabbau stattfinden kann. Weitere Funktionen in Säugerzellen übernehmen die Peroxisomen beim Purin- und Prostaglandinstoffwechsel, der Alkoholoxidation (Schepers, Casteels et al. 1988) (van den Bosch, Schutgens et al. 1992) sowie bei der Biogenese von Cholesterin, Plasmalogen und Gallensäuren (Hajara and Bishop 1982) (Krisans 1992) (Biardi and Krisans 1996). Ebenfalls zu der Familie der Microbodies werden die Glyoxisomen der höheren Pflanzen (Breidenbach and Beevers 1967) und die Glykosomen der Trypanosomen (Opperdoes and Borst 1977) gezählt. 1.2 Peroxisomale Erkrankungen Dass Peroxisomen für den menschlichen Organismus essentiell sind, erkennt man daran, dass ein Funktionsverlust peroxisomaler Proteine beim Menschen zu schwerwiegenden Erkrankungen führt. Bei diesen handelt es sich um autosomalrezessiv und x-chromosomal vererbte Erkrankungen, die in zwei Gruppen eingeteilt werden: 1. peroxisomale Biogenesestörungen (PBDs = peroxisome biogenesis disorders) (Steinberg 2006), 2. peroxisomale Einzelenzymdefekte (Weller, Gould et al. 2003) (Wanders 2006) (Schrader 2008). Bei der Gruppe der peroxisomalen Biogenesestörung werden Peroxisomen gar nicht oder nur unvollständig gebildet. Dies führt zu einem Funktionsverlust und einem stark ausgeprägten Krankheitsbild. Hingegen sind bei Erkrankungen der zweiten Gruppe isolierte Enzymdefekte vorzufinden. Einen Überblick über die Erkrankungen gibt Tabelle 1.1. Ein Beispiel für die Gruppe der peroxisomalen Biogenesestörungen stellt das zerebrohepatorenale Syndrom dar, das nach seinem Erstbeschreiber auch ZellwegerSyndrom genannt wird. Dieser Erkrankung liegt ein Gen-Defekt zu Grunde, welcher zu 2 Markscheidenbildungsstörungen und ZNS-Fehlbildungen führt (Riede 2004). Das klinische Bild ist durch Muskelhypotonie, fehlende Muskeleigenreflexe, renale und hepatische Dysfunktionen, Krampfanfälle, psychomotorische Retardierung sowie Gesichtsanomalien geprägt. Zu diesen gehören eine leicht mongoloide Lidachse, dysplastische Ohrmuscheln, Epikanthus und Hyperthelorismus. Säuglinge weisen häufig einen Turmschädel und weite Fontanellen auf (Weller, Gould et al. 2003). Histologisch findet sich oft das Bild einer Leberzirrhose. Radiologisch erkennt man oft epiphyseale Kalzifizierungen. Außerdem zeigen sich im T1-gewichteten MRT-Bild Zysten im kaudothalamischen Bereich (Barkovich 1997) (van der Knaap 1991). Radiologisch wird das cMRI als ein diagnostisches Instrument genutzt (Weller 2008). Tab. 1.1: Aufstellung von Erkrankungen basierend auf einer peroxisomalen Dysfunktion Gruppe I: Peroxisomenbiogenesedefekte Gruppe II: peroxisomale Einzelenzymdefekte - Zellweger-Syndrom - Atypisches Zellweger-Syndrom - Neonatale Adrenoleukodystrophie - β-Oxidationsdefekte - Infantiler Morbus Refsum - Morbus Refsum - Rhizomelia chondrodysplasia punctata - Hyperoxalurie Typ I - Glutaraidurie Typ III - Andere - x-chromosomale Adrenoleukodystrophie Für die Gruppe der peroxisomalen Enzymdefekte stellt die Adrenoleukodystrophie ein Beispiel dar. Diese X-chromosomal oder autosomal-rezessiv vererbte Krankheit besitzt eine Prävalenz von 1:20.000 bis 1:100 (Riede 2004). Ursache ist die Mutation eines Gens, das für einen ABC-Transporter kodiert. Da dieser am Transport langkettiger Acyl-Coenzym A-Derivate beteiligt ist, führt ein Ausfall zur Anreicherung langkettiger Fettsäuren besonders im Gehirn, welche dort die Myelinisierung stören (Löffler 2003). Außerdem beeinträchtigt ist die Funktion der Nebennierenrinde. Erste Symptome können im Säuglings-, Jugend- oder Erwachsenenalter auftreten. Das zerebrohepatorenale Syndrom und die Adrenoleukodystrophie haben eine Mutation des für den PTS1-Rezeptor kodierenden PEX5-Gens gemeinsam (Dodt, Braverman et al. 1995) (Engelen 2008). Eine weitere Erkrankung, der im Gegensatz zu den oben genannten eine Mutation des für den PTS2-Weg kodierenden PEX7-Gens zu Grunde liegt, ist die rhizomelische Chondrodysplasia punctata Typ 1 (RCDP). Hier stehen skelettale Veränderungen im 3 Vordergrund, woraus ein eingeschränktes Bewegungsausmaß resultiert. Charakteristisch sind gestörte Ossifikationen, besonders der proximalen Extremität, Kalksprenkelungen an Knie, Hüfte, Ellbogen und Schulter sowie ringförmige Risse in den Wirbelkörpern. Faziale Dysmorphien und Hirnsubstanzveränderungen wie Hypooder Demyelinisierung bestimmen ebenfalls das Bild dieser Erkrankung (van der Knaap 1991) (Viola 2002) (Williams 1991). Die Prognose dieser Erkrankungen ist zumeist infaust. Therapeutisch stehen rein symptomatische Maßnahmen im Vordergrund. Versuche mit Plasmapherese oder phytansäurearmer Diät zeigten im Falle der Rhizomelia chondrodysplasia punctata teilweise eine Besserung der Symptomatik. Dennoch überleben Betroffene peroxisomaler Erkrankungen selten das erste Lebensjahr. 1.3 Modellsysteme und Identifizierung peroxisomaler Proteine Anfang der 90er Jahre fand man heraus, dass sich die Hefe Saccharomyces cerevisiae als geeigneter Modellorganismus zur genaueren Erforschung der peroxisomalen Biogenese erwies. Dies liegt zum einen daran, dass die β-Oxidation in diesem einzelligen Organismus ausschließlich in den Peroxisomen stattfindet (Kunau, Bühne et al. 1988) und zum anderen daran, dass die Proliferation der Peroxisomen durch Ölsäure induzierbar ist (Veenhuis, Mateblowski et al. 1987). Ein Wachstumsdefekt auf Ölsäure weist also auf eine Störung der peroxisomalen Funktion hin. Auf Grund dieser Erkenntnisse wurde eine Methode entwickelt, die eine Isolierung von Mutanten mit dysfunktionellen Peroxisomen ermöglichte. Diese als onu-Phänotyp (oleat non utilizer) bezeichneten Mutanten wurden weiter in zwei Gruppen unterteilt. Zum einen differenzierte man eine Gruppe von Mutanten, die einen Defekt in denen für die Peroxisomenbiogenese essentiellen Genen aufwiesen (pex-Mutanten = peroxisome assembly) und zum anderen eine Gruppe mit einem Defekt in der peroxisomalen βOxidation (fox-Mutanten = fatty acid oxidation). Durch diesen methodischen Ansatz konnten zunächst 12 pex- und drei fox-Mutanten identifiziert werden (zur Übersicht (Kunau and Hartig 1992)). Heute sind 32 Proteine, so genannte Peroxine bekannt, die für die Biogenese der Peroxisomen essentiell sind (Schrader 2008). Anhand des computergestützten Abgleichs von Sequenzen der Hefe-Peroxine mit menschlichen 4 EST-Datenbanken (expressed sequence tags) konnten zahlreiche Orthologen gefunden werden, die bestätigen, dass die Mechanismen der Peroxisomenbiogenese von Hefen auch auf höhere Eukaryonten übertragbar zu sein scheint (Dodt and Gould 1996) (Gould and Valle 2000) (Schrader 2008). 1.4 Biogenese von Peroxisomen Erst im Jahre 2005 konnten Richtung weisende Daten zur Klärung der lang andauernden Frage nach dem Ursprung der Peroxisomen beitragen. Höpfner et al. konnten in Studien zeigen, dass Peroxisomen de novo durch Abschnürung vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) entstehen (Hoepfner, Schildknegt et al. 2005) (Motley 2007). Bis zu diesem Zeitpunkt existierten zwei unterschiedliche Vorstellungen der Biogenese. Während DeDuve und Baudhuin schon das Modell der Abknospung der Peroxisomen vom Endoplasmatischen Retikulum vertraten (DeDuve and Baudhuin 1966), beschrieben Lazarow und Fujiki Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts ein anderes Modell. Hiernach sollten Peroxisomen nach Aufnahme von an freien Ribosomen synthetisierten peroxisomalen Proteinen wachsen und sich nach Erreichen einer gewissen Größe teilen (‚growth and division’-Modell) (Lazarow and Fujiki 1985). Die derzeitigen Daten legen nahe, dass in vivo eine Mischung aus beiden Modellen existent ist (Tabak 2006). 1.5 Import peroxisomaler Matrixproteine Da Peroxisomen eine Gruppe von Zellorganellen darstellt, die weder eigene DNA noch Ribosomen enthalten, müssen peroxisomale Proteine im Zellkern kodiert sein. Die peroxisomalen Matrixproteine werden an freien Ribosomen der Zelle synthetisiert (Lazarow and Fujiki 1985) und anschließend posttranslational in die Peroxisomen importiert. Eine Besonderheit der peroxisomalen Importmaschinerie ist die Tatsache, dass sie in der Lage ist, selbst gefaltete und zum Teil oligomerisierte Proteine zu translozieren (Lazarow 2003). Dieser Proteinimport wird mit Hilfe von speziellen 5 Signalsequenzen ermöglicht, die als PTS-Sequenzen (PTS = peroxisomal targeting signal) bezeichnet werden (Leon 2006). 1.6 Signalsequenzen für peroxisomale Matrixproteine und PTS- Rezeptoren Bis heute sind für den Import peroxisomaler Matrixproteine zwei unterschiedliche Signalsequenzen bekannt. Neben einem so genannten PTS1-Signal, welches die meisten Matrixproteine für den Import in die Peroxisomen nutzen, existiert ein PTS2-Signal, welches von deutlich weniger Proteinen genutzt wird. Das PTS1-Signal besteht aus einer am extremen C-Terminus lokalisierten konservierten Abfolge von drei Aminosäuren und liegt bei den meisten peroxisomalen Proteinen vor. Dieses Tripeptid besitzt die Konsensussequenz (S/A/C)-(K/H/R)-(L/M), welche jedoch gering variieren kann (Gould, Keller et al. 1989). Bei der zweiten Signalsequenz, dem PTS2-Signal, liegt ein charakteristisches N-terminales Nonapeptid vor, welches die Konsensussequenz (R/K)-(L/V/I)-XXXXX-(H/Q)-(L/A) aufweist (Swinkels, Gould et al. 1991). Im Gegensatz zum PTS1 ist das PTS2 nur bei einer geringeren Anzahl an Proteinen zu beobachten. So ist in der Bäckerhefe die 3-Ketoacyl-Thiolase das einzige Matrixprotein mit dieser Signalsequenz (Grunau 2009). Darüber hinaus wird noch die Existenz eines dritten Targetingsignals diskutiert, welches als PTS3 oder als non-PTS bezeichnet wird (Schäfer, Kerssen et al. 2004). 1.7 PTS-Rezeptoren Pex5p und Pex7p Die PTS-Signale der Cargo-Proteine werden im Cytosol von löslichen Rezeptoren erkannt und gebunden. Als Rezeptor für PTS1-Proteine wurde Pex5p identifiziert. McCollum entdeckte bei der Analyse einer pex5∆-Mutante, dass diese einen Defekt für den PTS1-Weg aufwies (McCollum, Monosov et al. 1993). Der PTS1-Rezeptor Pex5p besteht aus einer N-terminalen und einer C-terminalen Hälfte. Während die N-Domäne scheinbar unstrukturiert ist, liegen in der C-terminalen Hälfte des Pex5p charakteristischerweise in sechsfacher Wiederholung so genannte TPR-Domänen (TPR 6 = tetratricopeptidrepeat) vor. Über diese Domänen interagiert Pex5p spezifisch mit dem PTS1-Signal (Brocard, Kragler et al. 1994) (Fransen, Brees et al. 1995) (Gatto, Geisbrecht et al. 2000). Der N-terminale Teil des Pex5p weist WxxxF-Motive auf. Diese Bereiche sind im menschlichen Organismus essentiell für die Bindung mit dem peroxisomalen Membranprotein Pex14p und dienen somit der Interaktion mit dem Organell (Schliebs, Saidowsky et al. 1999) (Saidowsky, Dodt et al. 2001). Eine weitere Besonderheit im menschlichen Organismus ist die Beobachtung, dass Pex5p in einer kurzen (Pex5pS) und in einer langen (Pex5pL) Isoform vorliegen kann. Sie unterscheiden sich durch eine Insertion von 37 Aminosäuren, welche durch alternatives Splicing entsteht (Dodt, Braverman et al. 1995). Braverman machte die Beobachtung, dass die lange Isoform vom Pex5p neben der eigentlichen Funktion als PTS1-Rezeptor eine wichtige Funktion bei dem PTS2-Signalweg übernimmt (Braverman, Dodt et al. 1998). Als der eigentliche Rezeptor für den PTS2-Signalweg wurde Pex7p identifiziert. Ebenso wie bei Pex5p ging diese Erkenntnis daraus hervor, dass bei pex7∆-Mutanten Importdefekte von PTS2-Proteinen beobachtet wurden. Dieses Protein gehört zur Familie der WD40-Proteine, bei denen Wiederholungen von 40 Aminosäuren vorliegen (Marzioch, Erdmann et al. 1994). 1.8 Schritte des Proteintransports über die peroxisomale Membran Der Import peroxisomaler Matrixproteine über die Membran des Peroxisoms lässt sich in mehrere Schritte unterteilen. Als erster Schritt steht die Erkennung der Zielproteine durch die Rezeptoren im Cytosol. Hieran folgt der gerichtete Transport des RezeptorCargo-Komplexes zur peroxisomalen Membran, welches auch als ‚targeting’ bezeichnet wird. Auf diesen Schritt folgt das ‚docking’, die Interaktion mit membranständigen Proteinen. Das Cargo wird über die Membran transloziert, und als letzter Schritt erfolgt der Rücktransport des Rezeptors ins Cytosol. Da der Rezeptor diesen Zyklus wiederholt durchlaufen kann, spricht man bei dem letzten Schritt auch vom Rezeptor-‚recycling’. 7 Abb.1.1. Transient pore model (aus (Erdmann and Schliebs 2005)) Nach Bildung eines RezeptorCargo-Komplexes im Cytosol assoziiert dieser über die Dockingproteine mit der peroxisomalen Membran. Nach Freisetzung der Cargoproteine in die Matrix kann die Markierung des Rezeptors mit Monoubiquitin erfolgen, wodurch der Rezeptor nach einem ATP-abhängigen Export erneut dem Cargoimport zur Verfügung steht. Findet eine Polyubiquitinylierung statt, so fungiert dies als Markierung des Rezeptors für die Degradation durch das Proteasom. Das ‚targeting’ der Cargo-Proteine erfolgt, wie oben bereits beschrieben, über die Proteine Pex5p und Pex7p. Diese überwiegend cytosolisch lokalisierten Proteine erkennen spezifisch Cargo-Proteine und führen diese zur peroxisomale Membran. Ist Pex5p, welches PTS1-Signalsequenzen erkennt, ohne weitere Proteine in der Lage, die Cargo-Proteine gerichtet zu transportieren, so kann Pex7p nicht allein agieren, sondern benötigt die Hilfe von Ko-Rezeptoren. In S. cerevisae wurden Pex18p und Pex21p als diese Ko-Rezeptoren identifiziert, welche für den Transport und die Interaktion mit der Membran essentiell sind (Purdue, Yang et al. 1998) (Stein, Schell-Steven et al. 2002). In der Hefe P. pastoris wird diese Funktion von Pex20p und im Menschen von der langen Spliceform des PTS1-Rezeptors Pex5p übernommen (Lazarow 2006). Die als ‚docking’ bezeichnete Anbindung der mit Matrixproteinen beladenen Rezeptoren Pex5p und Pex7p erfolgt über einen Proteinkomplex, dem drei Peroxine zugeordnet werden. Pex13p, Pex14p und Pex17p wurden in der Hefe als diese drei Proteine identifiziert und werden als ‚docking’-Komplex bezeichnet (Erdmann and Blobel 1996) (Elgersma, Kwast et al. 1996) (Albertini, Rehling et al. 1997) (Hettema, Distel et al. 1999) (Agne, Meindl et al. 2003). Sowohl Pex13p als auch Pex14p ist in der Lage mit beiden PTS-Rezeptoren zu interagieren. Pex13p interagiert über eine C- 8 terminale SH3-Sequenz direkt mit Pex14p und Pex5p (Girzalsky, Rehling et al. 1999) (Bottger, Barnett et al. 2000). Der PTS2-Rezeptor Pex7p wird am N-terminalen Bereich gebunden. Auch Pex14p, welches als Strukturmerkmal eine konservierte ‚coiled-coil’Region aufweist, interagiert mit beiden PTS-Rezeptoren Pex5p und Pex7p (Albertini, Rehling et al. 1997) (Girzalsky, Rehling et al. 1999). Wissen über die genaue Funktion von Pex17p existiert zurzeit nicht. Dieses periphere peroxisomale Matrixprotein wurde über seine Bindung an Pex14p identifiziert (Huhse, Rehling et al. 1998). Nachdem die Verbindung mit der Membran eingegangen wurde, muss die Translokation der Proteine über die Membran stattfinden. Gegenstand aktueller Forschung ist die Frage, wie diese Translokation erfolgt. Schliebs und Erdmann postulierten 2005 die „Transient-Pore-Hypothese“ (Abb. 1.1). Dieses Model basiert auf zwei grundlegenden Beobachtungen. Pex5p kann seine Topologie im Rahmen des Importzyklusses ändern und zum Teil als integrales Membranprotein vorliegen (Gouveia, Reguenga et al. 2000). Des Weiteren liegt der Rezeptor sowohl als Monomer als auch als Oligomer vor (Schliebs, Saidowsky et al. 1999) (Moscicka 2007). Die Funktionsweise von Pex5p soll nach dem Modell ähnlich der bakterieller Toxine sein. Diese Toxine liegen als Monomere vor, die sich an der Membran als oligomere Pore formieren (Erdmann and Schliebs 2005). Nach der Translokation erfolgt die Freisetzung des Cargo-Proteins in das Lumen der Peroxisomen. Der Mechanismus dieses Prozesses ist derzeit noch unklar. Es wird spekuliert, dass Pex8p, ein intraperoxisomales peripheres Membranprotein, hieran beteiligt ist. Pex8p besitzt sowohl eine PTS1- als auch PTS2-Sequenz, welche vermutlich für die Zielsteuerung dieses Proteins nötig sind (Zhang, Leon et al. 2006). Zudem gibt es auch Hinweise, dass Pex8p die Auflösung des PTS1-Cargo-RezeptorKomplexes stimuliert (Wang, Visser et al. 2003). Abschließend erfolgt die Rezeptor-Freisetzung aus dem Peroxisom zurück in das Cytosol. Detaillierte in vitro Studien zeigten, dass die Bindung und Translokation von Pex5p ATP-unabhängig erfolgt, jedoch für die Rezeptor Freisetzung ATP essentiell ist (Oliveira, Gouveia et al. 2003). Die Identität der entsprechenden ATPasen konnte in der Hefe S. cerevisiae (Platta, Grunau et al. 2005) und in humanen Fibroblastenzellen aufgeklärt werden (Miyata and Fujiki 2005). Es handelt sich hierbei um die peroxisomalen AAA ATPasen Pex1p und Pex6p, die als Motorproteine für den Pex5pExport dienen. Interessant ist die Beobachtung, dass ca. zwei Drittel der peroxisomalen 9 Erkrankungen auf einen Defekt der Peroxine Pex1p und Pex6p basieren (Weller, Gould et al. 2003). 1.9 Das Ubiquitin-Proteasom-System Das Auftreten nicht benötigter oder beschädigter Proteine im Organismus erfordert ein System zum Erkennen und Abbauen solcher Produkte. Generell existieren in eukaryotischen Zellen zwei Systeme der Proteindegradation. Die Vakuolen, oder im Menschen die Lysosomen, enthalten Proteasen, die diese Funktionen übernehmen. Die zweite Möglichkeit des Abbaus von zelleigenen Proteinen ist das Ubiquitin-ProteasomSystem. Dieses stellte einen selektiven und fein regulierten Prozess dar. Die Markierung der Proteine erfolgt hierbei durch Ubiquitin. Diese so modifizierten Proteine werden dann zum Proteasom transportiert, wo der Abbau durch die dort enthaltenen Proteasen erfolgt (Hicke 2005). In den 80er Jahren des 20. Jahrhunderts erforschten Aaron Ciechanover, Avram Hershko und Irwin Rose die grundlegenden Funktionen des Ubiquitins. 2004 wurde ihnen für diese Arbeit der Nobel-Preis für Chemie verliehen. Abb. 1.2: Die Ubiquitinylierungskaskade (Weissman 2001) Gezeigt ist die ATP-abhängige Aktivierung des Ubiquitins über eine Thioesterbindung am Ubiquitin aktivierenden Enzym (E1). Im nächsten Schritt wird das aktivierte Ubiquitin auf ein Cystein des Ubiquitin konjugierenden Enzyms (E2) übertragen. Eine Protein-spezifische Ubiquitin-Ligase (E3) katalysiert die finale Übertragung des Ubiquitins auf das Zielprotein. Ubiquitin ist ein aus 76 Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit einer Molekülmasse von 8,5 kDa und kommt ubiquitär in allen kernhaltigen Zellen vor. Es ist ein hoch konserviertes Protein mit einer im nativen Zustand meist globulären Konformation. 10 Ubiquitin besitzt am extremen C-Terminus ein Glycin als funktionellen Rest. Dieses Glycin bindet über die ε–NH2-Gruppe kovalent an Lysinreste des Substratproteins. Als weiterer funktioneller Rest tritt das Lysin an Stelle 48 hervor. Über dieses Lysin können mehrere Ubiquitinmoleküle zu einer Polyubiquitinkette verknüpft werden (Ravid 2008) (Pickart 2004). Der Ablauf der Ubiquitinylierung eines Proteins erfolgt in mehreren Schritten. Drei wichtige Enzyme sind an diesem Prozess beteiligt. (1) das Ubiquitin aktivierende Enzym E1, (2) das Ubiquitin konjugierende Enzym E2 und (3) die Ubiquitin-Ligase E3 (Hershko, Ciechanover et al. 2000). In einem ersten Schritt muss zunächst das sich am C-Terminus befindende Glycin des Ubiquitin aktiviert werden. Dieser Vorgang ist ATP-abhängig. Das Enzym, welches diesen Vorgang katalysiert, ist das Enzym E1. In dieser Reaktion wird das Enzym E1 als Thioester gebunden. Das aktivierte Ubiquitin wird nun in einem nächsten Schritt auf eine Thiolgruppe des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms E2 transferiert. In einem letzten Schritt wird nun das aktivierte Ubiquitin auf das Zielprotein übertragen. Diese Funktion übernimmt das Enzym E3, welches das Zielprotein spezifisch erkennt. Die Verknüpfung, eine Isopeptidbindung, erfolgt in der Regel auf die ε–Aminogruppe der Lysinreste des Substrates. Es existieren grundlegend zwei unterschiedliche Formen der Ubiquitinylierung. So ist die Monoubiquitinylierung von einer Polyubiquitinylierung zu unterscheiden. Werden mehrere Ubiquitinmoleküle über das Lysin 48 des Ubiquitin verknüpft, so entstehen Polyubiquitinketten, welche vom Proteasom erkannt werden (Pickart 2004) (Vembar 2008). Das 26S-Proteasom, in dem der Abbau Ubiquitin markierter Proteine stattfindet, ist ein Proteinkomplex mit einer Molekülmasse von 1700 kDa. Es besteht bei Eukaryonten aus drei Untereinheiten, einer 20S- und zwei 19S-Untereinheiten. Dem sich in der Mitte befindenden 20S-Partikel sitzt beidseits jeweils kappenförmig ein 19SPartikel auf. Dabei fungieren die 19S-Partikel als regulatorische Komplexe. Sie erkennen die mit Polyubiquitin markierten Substrate. Das Ubiquitin wird in den 19SPartikel vom abzubauenden Protein abgespalten und in einzelne Moleküle zerlegt. Diese können dann vom Organismus erneut verwendet werden. Des Weiteren entfalten die 19S-Partikel die Proteine, da sie nur im entfalteten Zustand dem 20S-Partikel zugeführt werden können. Der 20S-Partikel dient als katalytischer Teil des Proteasoms, welcher 11 letztendlich die Proteine durch bestimmte β–Proteine an der Innenwand proteolytisch zerlegt (Baumeister 1998) (Finley 1998) (Glickman 2002) (Pickart 2004). Die Monoubiquitinylierung stellt im Gegensatz zur Polyubiquitinylierung einen Prozess dar, der das Substrat nicht dem Proteasom zuführt. Die Markierung mit Monoubiquitin ist eine Modifikation von Proteinen, die als Endozytose-Signal fungiert (Pickart 2004). Sie kann aber auch in Transportprozessen zu anderen zellulären Strukturen involviert sein (Hicke 2005) (Ravid 2008). 1.10 Bedeutung der Ubiquitinylierung für die peroxisomale Funktion In den vergangenen Jahren konnte gezeigt werden, dass sowohl der PTS2-Co-Rezeptor Pex18p bzw. Pex20p als auch das Pex5p sowohl aus der Hefe als auch aus dem Menschen ubiquitinyliert wird (Carvalho 2007) (Williams 2008). Diese Beobachtung stellt die Verbindung zu einigen der peroxisomalen Proteine dar, die die Funktion von Ubiquitin konjugierenden Enzymen oder vermutlich von Ubiquitin-Ligasen besitzen. Das integrale Membranprotein Pex22p interagiert mit dem an der Außenseite der Membran lokalisierten Pex4p, welches der Familie der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme zugeordnet wird (van der Klei, Hilbrands et al. 1998). Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass Pex4p für die Monoubiquitinylierung von Pex5p essentiell ist (Platta 2007). Diese Modifikation ist wiederum Voraussetzung für die Freisetzung des Rezeptors von der peroxisomalen Membran hin ins Cytosol und damit wichtig für das Recycling des Rezeptors. Die Polyubiquitinylierung wird von dem E2-Enzym Ubc4p zusammen mit Ubc5p bewerkstelligt. Diese Modifikation dient der Zuführung des Pex5p zum Proteasom. Kandidatenproteine für die involvierten E3-Enzyme spiegeln die drei peroxisomalen RING-Finger Proteine Pex2p, Pex10p und Pex12p dar. Alle drei besitzen typische Strukturmerkmale von E3-Enzymen und besitzen daher vermutlich eine Ubiquitin-Ligase Funktion (Xie and Varshavsky 1999) (Joazeiro and Weissman 2000) (Platta, Girzalsky et al. 2004). 12 1.11 Zielsetzung der Arbeit Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem ‚targeting’ und der Ubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p aus der Hefe S. cerevisiae. 1. Es sollte untersucht werden, welcher Bereich von Pex5p in der Lage ist, die peroxisomale Membran zu erreichen. 2. Ferner sollten Interaktionen des kleinsten noch peroxisomalen Pex5p-Fragmentes mit Hilfe der Protein A Technik untersucht werden. 3. Da bereits bekannt war, dass die Pex5p-Ubiquitinylierung an der peroxisomalen Membran stattfindet, sollten Pex5p-Fragmente daraufhin untersucht werden, ob sie noch durch Mono- oder Polyubiquitinylierung modifiziert werden können. 4. Abschließend sollten durch gerichtete Mutagenese Lysinreste des Pex5p substituiert werden, um so die Zielaminosäuren des Ubiquitinkaskade zu identifizieren. 13 2. Material und Methoden 2.1 Materialen 2.1.1 Geräte In Rahmen dieser Arbeit wurden die in Tabelle 2.1 aufgeführten Geräte verwendet. Alle nicht angegebenen Geräte entsprachen dem Laborstandard. Tab. 2.1.: Auflistung der verwendeten Geräte Gerät Modell Hersteller Agarose-Geldokumentation Gel Doc 2000 BioRad, München Agarose-Gelsystem --- Ruhr-Universität Bochum Blockthermostat Thermomixer Compact Eppendorf, Hamburg SRX-101 A Medical Film Konica Minolta, Processor Unterföhring Dampfsterilisator Varioclav H+P Labortechnik Drehrad neoLab-Rotator 2-1175 neoLab, Heidelberg EmulsiFlex EmulsiFlex-C5 Avestin, Canada Filmentwickler --- Konica Gelelektrophorese-System Mini-Protean III BioRad, München Mikroliterpipette Research variable 3111 Eppendorf, Hamburg Mikroskop Axiophot Zeiss, Oberkochen pH- Meter PHM220 Radiometer, Kopenhagen Photometer Ultrospec3000pro GE Healthcare, Freiburg Proteintransfer-System Mini Trans-Blot Cell BioRad, München SMART-FPLC-Anlage --- Spannungsquelle Power Pac 300, 3000 BioRad, München Thermoblock T 3 Thermocycler Biometra, Göttingen Videodokumentationsanlage Gel Jet Imager Intras, Göttingen Wasseraufbereitungsanlage Seralpur Pro 90 CN Blotdokumentation Amersham Pharmacia B., Freiburg USF, RansbachBaumbach 14 Tab. 2.1.: (Fortsetzung) Gerät Modell Hersteller Zentrifuge 5810R Rotor: F-45-30-11, Eppendorf, Hamburg F-34-6-38, A-4-81 Zentrifuge 5415R himac CP100α Eppendorf, Hamburg Rotor: P90AT, P40ST Hitachi, Düsseldorf Sorvall Ultra Pro 80 Du Pont Instr., Bad Rotor: TV860, T647,5 Nauheim Sorvall RC-5B Du Pont Instr., Bad Rotor: SLA-3000, SS-34 Nauheim Zentrifugen 2.1.2 Feinchemikalien Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Feinchemikalien sind in Tabelle 2.2 aufgeführt. Nicht genannte Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von in Deutschland vertretenen Firmen bezogen. Tab. 2.2: Auflistung der verwendeten Chemikalien Bezugsquelle Chemikalien Acrylamid/Bisacrylamid (30%, 37,5:1), Applichem, Darmstadt Agar, Ampicillin, DTT, Glukose, Glycin, HEPES, Natriumchlorid, PMSF, Tris BD Biosciences, Heidelberg Agar, Bacto-, Hefeextrakt, Trypton, 15 Tab. 2.2: (Fortsetzung) Bezugsquelle Chemikalien Hefe-Stickstoffbasis YNB (ohne BD Biosciences, Heidelberg Aminosäuren, (NH4)2SO4) Biomol, Hamburg SDS Eurogentec Oligonukleotide Fluka, Buchs (CH) Wasserstoffperoxid (30%ig) Glücksklee, Nestlé, Frankfurt Milchpulver Invitrogen, Groningen (NL) Agar, Select-, Hefeextrakt, SelectPepton, Select- J.T. Baker, Deventer (NL) Natriumfluorid, Saccharose, TCA Merck, Darmstadt APS, EDTA, Ölsäure, Digitonin MP Biomedicals, Eschwege Qiagen, Hilden (BRD) Riedel-de Haën, Seelze Antipain, Aprotinin, Bestatin, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A Ni- NTA Agarose Glycerin, Natriumcarbonat, Natriumthiosulfat Roche Diagnostics, Mannheim PMSF Roth, Karlsruhe Lithiumacetat Serva, Heidelberg Coomassie Brilliant Blau G250 Adenin, Bromphenolblau, Heringssperma Sigma, München DNA, β- Mercaptoethanol, L-Histidin, LLeucin, L-Lysin, Ponceau S, TEMED, Triton X-100, Tween 40, Uracil Tetenal Photowerk GmbH, Norderstedt Röntgenentwickler LX24, -fixierer AL4 Alle weiteren Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von in Deutschland vertretenen Firmen bezogen. 16 2.1.3 Verbrauchsmaterialien und „Kits“ Tab. 2.3: Auflistung der verwendeten Verbrauchsmaterialien und „Kits“ Bezugsquelle Artikel Amersham Biosciences, Freiburg Glutathion Sepharose 4B Diagonal Objektträger, benetzbar Eppendorf, Hamburg DNA-Gelextraktions-Kit, DNA-MinipräpKit GE Healthcare, Freiburg ECL™- Hyperfilm, ECL™- Western blotting detection reagents Interchim, Montlucon cedex Uptima Bradford Reagenz MoBiTec, Göttingen Spin- Column, 1 ml (Mobicols) Omnilab, Münster Glasperlen (∅ 0,5 mm) Sarstedt, Nümbrecht Halbmikroküvetten Schleicher & Schuell, Dassel Nitrocellulosemembran (0,45 µm) Sigma, München Markerproteine für SDS-Elektrophorese Stratagene, Amsterdam (NL) QuikChange® II-Mutagenese PCR Kit Whatman, Maidstone (GB) Whatman 3MM Papier IgG-Sepharose wurde nach Niederhoff (Niederhoff, 2002) präpariert. 2.1.4 Mikroorganismen 2.1.4.1 Escherichia coli Tab. 2.4: Auflistung des verwendeten E. coli-Stamms Stamm Genotyp Quelle F- φ80dlaclacZ ∆M15 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 DH5α hsdR17 (rK- mK -) supE44 relA1 deoR (Hanahan 1983) ∆(lacIZYA-argF)U169 17 2.1.4.2 Saccharomyces cerevisiae Tab. 2.5: Auflistung des verwendeten S.cerevisiae-Stämme Stamm Genotyp Quelle UTL-7A MATa, ura3-52, trp1, leu2-3/ 112 AG Duntze UTL-7A Pex1pTEV-ProtA (Rosenkranz et -%- PEX1::PEX1-TEV-ProtA al., 2006) UTL-7A pex5∆ Pex1p-TEV- (Platta et al., -%- PEX1::PEX1-TEV-ProtA 2005) ProtA UTL-7A pex1∆ -%- pex1::loxP UTL-7A pex4∆ -%- pex4::loxP UTL-7A pex5∆ -%- pex5::loxP (Birschmann et al., 2003) (Platta et al, 2007) (Girzalsky, 1996) UTL-7A pex1∆/pex5∆ (Platta et al., -%- pex1::loxP; pex5::kanMX4 2007) UTL-7A pex4∆/pex5∆ (Platta et al., -%- pex4::loxP; pex5::kanMX4 2007) 2.1.5 Plamide Tab. 2.6: Auflistung der verwendeten Plasmide Bezeichnung Quelle pWK13-PEX5 [1-245] (Klaas, 2005) pWK15-PEX5 [1-313] (Klaas, 2005) pWK16-PEX5 [1-574] (Klaas, 2005) pWK18-PEX5 [17-612] (Klaas, 2005) PTS2-GFP (Girzalsky, 1996) Pex5p [K18R] diese Arbeit Pex5p [K24R] diese Arbeit Pex5p [K31R] diese Arbeit Pex5p [K46R] diese Arbeit 18 Tab. 2.6: (Fortsetzung) Bezeichnung Quelle Pex5p [K81R] diese Arbeit Pex5p [K112R] diese Arbeit Pex5p [K142R] diese Arbeit Pex5p [K194R] diese Arbeit Pex5p [K210R] diese Arbeit Pex5p [K213R] diese Arbeit Pex5p [K227R] diese Arbeit Pex5p [K238R] diese Arbeit Pex5p [K244R] diese Arbeit Pex5p [K266R] diese Arbeit Pex5p [K289R] diese Arbeit Pex5p [K18/24R] (Platta et al., 2007) 2.1.6 Oligonukleotide Zur Genierung der in dieser Arbeit erstellten Punktmutanten wurden die in Tabelle 2.6 aufgeführten Oligonukleotide, die von der Firma Eurogentec (Seraing/Belgien) synthetisiert wurden, verwendet. Tab. 2.7: Auflistung der verwendeten Oligonukleotide. Fett und unterstrichen sind die modifizierten Basentripplets. Name RE 1168 RE 1169 RE 1285 RE 1286 Nukleotidsequenz 5’-GTCAGTGTCGACCATGGACGTAGGAAGTTGC TCA-3’ 5’-GCAGAGATCTTCAAAACGAAAATTCTCCTTTAA ATC-3’ 5’-AAACATACTCAGCAGAACAGATCGCTTCAGTTT AATCAG-3’ 5’-CTGATTAAACTGAAGCGATCTGTTCTGCTGAGT AGTTTT-3’ Orientierung senseAußenprimer antisenseAußenprimer sense antisense 19 Tab. 2.7: (Fortsetzung) RE 1287 RE 1288 RE 1289 RE 1290 RE 1291 RE 1292 RE 1293 RE 1294 RE 1295 RE 1296 RE 1297 RE 1298 RE 1299 RE 1300 RE 1301 RE 1302 5’-TCGCTTCAGTTTAATCAGAGAAATAATGGGCGT CTTAAT-3’ 5’-ATTAAGACGCCCATTATTTCTCTGATTAAACTG AAGCGA-3’ 5’-CCTCTACAGGGTACCAACAGACCAGGTATTAGT GAGGCT-3’ 5’-AGCCTGACTAATACCTGGTCTGGTGGTACCCTG TAGAGG-3’ 5’-GAACCACTGATCGATGATAGAAGAAGAATG GAAATAGGG-3’ 5’-CCCTATTTCCATTCTTCTTCTATCATCGATCAG TGGTTC-3’ 5’-GCAAACCCAACCCAAATTAGAGGAGTGAACG ATATATCT-3’ 5’-AGATATATCGTTCACTCCTCTAATTTGGGTTGG GGTTGC-3’ 5’-GATACAGGAAATTCAGAAAGAGCATGGCAG CGTGGCTCA-3’ 5’-TGAGCCACGCTGCCATGCTCTTTCTGAATTTCC TGTATC-3’ 5’-CAACAGTCTGGTCGTTCTAGAGAAGGAGTCAAT GAGCAA-3’ 5’-TTGCTCATTGACTCCTTCTCTAGAACGACCAGA CTGTTG-3’ 5’-TGGACAGATCAGTTTGAAAGACTGGAAAAA GAAGTCTCA-3’ 5’-TGAGACTTCTTTTTCCAGTCTTTCAAACTGATC TGTCCA-3’ 5’-CAGTTTGAAAAGCTGGAAAGAGAAGTCTCAGAA AACTTG-3’ 5’-CAAGTTTTCTGAGACTTCTCTTTCCAGCTTTTC AAACTG-3’ sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense 20 Tab. 2.7: (Fortsetzung) RE 1303 RE 1304 RE 1305 RE 1306 RE 1307 RE 1308 RE 1309 RE 1310 RE 1311 RE 1312 5’-ATAAATGATGAAATAGAGAGAGAGGAAAAT GTGAGTGAA-3’ 5’-TTCACTCACATTTTCCTCTCTCTCTATTTCATC ATTTAT-3’ 5’-AGTGAAGTAGAACAAAACAGACCAGAAACT GGTGAGAAG-3’ 5’-CTTCTCAACAGTTTCTGGTCTGTTTTGTTCTAC TTCACT-3’ 5’-AAACCAGAAACTGTTGAGAGAGAAGAAGGA GTATATGGA-3’ 5’-TCCATATACTCCTTCTTCTCTCTCAACAGTTTC TGGTTT-3’ 5’-GTGTGGGATAGCATACACAGAGACGCTGAA GAAGTCTTG-3’ 5’-CAAGACTTCTTCAGCGTCTCTGTGTATGCTATC CCACAC-3’ 5’-CTAGGAGAAGACTACTTGAGATATCTCGGCGGT AGAGTA-3’ 5’-TACTCTACCGCCGAGATATCTCAAGTAGTC TTCTCCTAG-3’ sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense 2.1.7 Enzyme Tab. 2.8: Aufführung der verwendeten Enzyme Enzym Bezugsquelle RNaseA Sigma, München TEV-Protease Invitrogen, Groningen (NL) 21 2.1.8 Antiseren Tab. 2.9: Auflistung der verwendeten polyclonalen Antiseren Antikörper/-serum Verdünnung Bezugsquelle 1. Antikörper αScPex1p 1:10.000 (Birschmann et al., 2005) αScPex5p 1:10.000 (Albertini et al., 1997) αScPex6p 1:10.000 (Birschmann et al., 2003) αScPex13p 1:10.000 (Girzalsky et al., 1999) αScPex14p 1:5.000 (Albertini et al., 1997) αScPex15p 1:10.000 (Platta et al., 2005) αScFructose-1,6-Bisphosphatase 1:10.000 (Bigl and Escherich, 1994) αPorin 1:10.000 AG Kunau 2. Antikörper Anti-Kaninchen-IgG Peroxidase- 1:15.000 Sigma-Aldrich (D) Konjugat 2.1.9 Medien Die Anzucht von Bakterien und Hefen erfolgte auf Festagarplatten oder in Submerskulturen. Hierzu wurden nachfolgende Medien verwendet. Bei Verwendung von Festagarplatten wurde dem Medium 2% (w/v) Select-Agar hinzugeführt. Alle Medien wurden für 20 Minuten bei 120°C autoklaviert. LB-Medium NBG-Medium 0,5% (w/v) Hefeextrakt 0,17% (w/v) YNB (Yeast Nitrogen Base) 1% (w/v) Trypton 0,5% (w/v) Ammoniumsulfat 1% (w/v) NaCl 2% (w/v) Glukose ggf. 100µg/ml Ampicillin ggf. 1% Aminosäuren pH = 7,5 pH = 6,0 22 SD-Medium YNBG-Medium 0,1% (w/v) Hefeextrakt SD 0,17% (w/v) YNB 0,3% (w/v) Glukose 0,5% (w/v) Ammoniumsulfat ggf. 1% Aminosäuren YNBO-Medium pH = 6,0 SD 0,1% (v/v) Ölsäure YNBGO-Medium 0,05% (v/v) Tween SD 0,1% (w/v) Glukose Aminosäuren 0,1% (v/v) Ölsäure 2 mg/ml Adenin 0,05% (v/v) Tween 40 2 mg/ml Histidin 3 mg/ml Leucin YPD-Medium 3 mg/ml Lysin 1% (w/v) Hefeextrakt 2 mg/ml Tryptophan 2% (w/v) Glukose 2 mg/ml Uracil 2% (w/v) Pepton 2.1.10 Lösungen und Puffer Carbonat-Blotting-Puffer Proteaseinhibitoren 10 mM NaHCO3 1 µl/ml Antipain (8 µM) 3 mM Na2CO3 1 µl/ml Aprotinin (0,3 µM) 20% (v/v) Methanol 0,16 mg/ml Benzamidin (1 mM) 0,01% SDS 1 µl/ml Bestatin (1 mM) 1 µl/ml Chymostatin (10 mM) Coomassie-Färbelösung 1 µl/ml Leupeptin (5 µM) 0,025% (w/v) Coomassie Brilliant 1 µl/ml Pepstatin (1,5 µM) Blue R250 10 µl/ml PMSF (1 mM) 10% (v/v) Essigsäure 0,21 mg/ml NaF (5 mM) 23 DNA-Probenpuffer (5x) Sammelgelpuffer 50% (w/v) Glycerin 0,5 M Tris/HCl 0,1% (w/v) Bromphenolblau pH = 6,8 Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,4) SDS-Probenpuffer (4x) 1M K2HPO4 250 mM Tris/HCl pH 6,8 1M KH2PO4 8% (w/v) SDS 40% (v/v) Glycerin Lysispuffer 20% (v/v) β-Mercaptoethanol 0,02 M HEPES 0,2% (w/v) Bromphenolblau 0,1 M Kaliumacetat 5 mM Magnesiumacetat Solubilisierungspuffer pH = 7,5 0,02 M HEPES 0,1 M Kaliumacetat PBS-ST 5 mM Magnesiumacetat 17,56 mM Na2HPO4 10% (w/v) Glycerin 2,46 mM NaH2PO4 pH = 7,5 150 mM NaCl 0,02% (w/v) SDS TBE-Puffer 0,1% (w/v) Triton X-100 90 mM Tris/HCl, pH = 8,0 90 mM Borsäure Ponceau S-Lösung 2,5 mM EDTA 2% (w/v) Ponceau S 10% (v/v) Essigsäure Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl pH = 8,8 2.2 Methoden 2.2.1 Kultivierung von Escherichia coli E. coli-Stämme und Transformanten wurden in LB-Medium in Reagenzgläsern oder Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen 1/5 bis 1/10 des Gefäßvolumens) als 24 Submerskulturen auf einem Rundschüttler 14 Stunden bei 37°C angezogen. Gegebenenfalls wurden zur Kultivierung unter selektiven Bedingungen Antibiotika hinzugesetzt. 2.2.2 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae 2.2.2.1 Wachstum auf Festagarplatten Auxotrophien wurden nach Ausstrich von Zellmaterial bzw. nach dessen Transfer durch Replikaplattierung auf Selektivagarplatten (NBG-Festagarplatten) durch 2 bis 3 tägige Inkubation bei 30 °C überprüft. 2.2.2.2 Wachstum in Flüssigkulturen Die Hefezellen wurden in Flüssigkulturen in Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen 1/5 bis 1/10 des Gefäßvolumens) bei 30°C auf Rund- oder Horizontalschüttlern kultiviert. Hierzu wurden die unter 2.1.9 aufgeführten Medien verwendet. Zum Erreichen von optimalen Zellzahlen wurden die Hefezellen in drei 0,3% (w/v) YNBG-Vorkulturen für 10 bis 12 Stunden angezogen. Die YNBGO-Hauptkultur wurde auf eine OD600nm von 0,1 angeimpft und für weitere die 14 bis 16 Stunden kultiviert. Die Zellausbeute betrug 3-4 g Feuchtgewicht pro Liter YNBGO-Medium. Das Kulturvolumen variierte je nach Bedarf. 2.2.2.3 Oleatwachstumstest Nach 24-stündiger Kultivierung der Zellen in YNBG-Medium bei 30°C wurden die Hefen geerntet. Anschließend erfolgte eine Waschung mit sterilem Wasser. Die Zellen wurden auf eine OD600nm von 0,1 eingestellt. In verschiedenen Verdünnungen (relative Zellzahlen 1*107, 1*106, 1*105, 1*104) wurden die Hefezellen auf YNBOFestagarplatten aufgetragen und im Dunkeln bei 30°C kultiviert. Nach 2 bis 8 Tagen wurde die Ölsäureverwertung überprüft. 2.2.2.4 Anzucht zur fluoreszenzmikroskopischen Analyse Zur fluoreszenzmikroskopischen Analyse wurden die Hefezellen auf OleatFestagarplatten ausgestrichen. Die Kultivierung erfolgte im Dunkeln für 48 Stunden bei 25 30°C. Wenige Zellen wurden anschließend zur Analyse auf einen Objektträger gegeben und nach Angaben von Rehling (Rehling et al., 1996) untersucht. 2.2.3 Aufschluss von Saccharomyces cerevisiae 2.2.3.1 TCA-Aufschluss Die Anzucht der Hefezellen erfolgte wie unter 2.2.2.2 beschrieben. Es wurden 30 mg Ölsäure-induzierte Hefezellen in 300 µl A. dest. resuspendiert und mit 15 µl 1 M KPiPuffer pH 7,4 versetzt. Nach Zugabe von 100 µl 50% TCA erfolgte die Fällung der Proteine bei -80 °C für mindestens 30 min. Danach wurden die Proteine sedimentiert (13000 pm, 10 min, Tischzentrifuge) und zweimal mit 500 µl eiskaltem 80%igem Aceton gewaschen und getrocknet. Nach Resuspendierung des Sediments in 80 µl 1% SDS/0,1 M NaOH und 20 µl 5× SDS- Probenpuffer folgte eine Denaturierung der Proteine für 5 min bei 95 °C. 2.2.3.2 Mechanischer Aufschluss mittels Glasperlen Die geernteten und mit sterilem Wasser gewaschenen Hefezellen wurden in dem dreifachen Volumen Lysispuffer mit Protease-Inhibitoren resuspendiert. Anschließend wurde das vierfache Volumen an Glasperlen (ø 0,5 mm) hinzugegeben. Der mechanische Aufschluss erfolgte durch 12maliges Vortexen für 1 Minute auf einem Wirbelmischer. Nach jedem Vortexen wurden die Proben 1 Minute auf Eis gekühlt. Die Glasperlen und nicht aufgeschlossenen Zellen wurden sedimentiert (1500 × g, 10 min, 4 °C, Zentrifuge 5810) und die Überstände jeweils in frische Gefäße überführt. 2.2.4 Quantitativ analytische Methoden 2.2.4.1 Bestimmung der Zelldichte Die Bestimmung der Zelldichte erfolgte in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm, bei dieser Wellenlänge entspricht eine OD von 1 einer Zelldichte von 1-3x107 Zellen pro ml Kultur. 26 2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce) nach Angaben des Herstellers ermittelt. Zur Erstellung der Eichgeraden wurde ein BSAStandard verwendet. 2.2.4.3 Bestimmung der Nukleinsäurenkonzentration Nukleinsäurekonzentrationen wurden mit einem Spektralphotometer bei 260 nm bestimmt, bei dieser Wellenlänge entspricht eine OD von 1 einer Konzentration von etwa 50 µg/ml doppelsträngiger bzw. 33 µg/ml einzelsträngiger DNA. 2.2.4.4 Bestimmung der molekularen Masse denaturierter Proteine Zur Bestimmung der molekularen Masse denaturierter Proteine bei der SDS-PAGE wurden folgende Markerproteine der Firma Sigma (Taufkirchen, BRD) eingesetzt: Tab. 2.10: Auflistung der verwendeten SDS-Markerproteine Markerprotein molekulare Masse in kDa Albumin (Rind) 66 Ovalbumin (Hähnchen) 45 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Kaninchen) 36 Carbonatanhydrase (Rind) 29 Trypsinogen (Rind) 24 Trypsin Inhibitor (Sojabohne) 20 Lactalbumin (Rind) 14,2 2.2.5 Molekularbiologische Methoden 2.2.5.1 Herstellung und Transformation von Calciumchlorid-kompetenten Escherichia coli-Zellen Calciumchlorid-kompetente E. coli DH5α-Zellen wurden nach der Methode von Hanahan erstellt und transformiert (Hanahan, 1983). 27 2.2.5.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen Die Isolierung von Plasmid DNA wurde nach der Methode von Birnboim und Doly durchgeführt (Birnboim and Doly 1979). Teilweise wurde hierbei jedoch ein verkürztes Protokoll angewandt, bei dem auf die Phenol-Chloroform-Extraktion verzichtet wurde. Stattdessen wurde der Plasmid-DNA-haltige Überstand nach alkalischer Lyse der Zellen einmal mit 100 µl Chloroform extrahiert und dann mit 100%-igem Ethanol gefällt. 2.2.5.3 Fällung von DNA Es wurden zu Fällung von DNA 0,1 Volumen 5M Ammoniumacetat 5,2 und 2,5 Volumen Ethanol der Lösung zugesetzt. Bei 13.000 rpm wurde das Präzipitat abzentrifugiert und mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde vakuumgetrocknet, in TE-Puffer gelöst und bei -20°C gelagert. 2.2.5.4 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen Nach Herstellerangaben der Restriktionsendonukleasen wurden die empfohlenen Puffersysteme (New England Biolabs) zur Restriktion von DNA verwendet. Die Restriktionbedingungen richteten sich je nach verwendeter Endonuklease nach den Herstellerangaben. 2.2.5.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR Die Protokolle der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden in Abhängigkeit der Oligonukleotidsequenzen und der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragmentes nach Angaben des „PCR Applications Manual“ (Roche) optimiert. Als Template wurde Plasmid-DNA oder genomische DNA aus S. cerevisiae eingesetzt. Es wurde entweder eine Pwo-DNA-Polymerase (Peqlab) mit 3’-5’-Exonuklease-Aktivität oder eine TaqDNA-Polymerase (Peqlab) nach Herstellerangaben verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden in dem T3-Thermocycler der Firma Biometra durchgeführt. 2.2.5.6 Agarose-Gelelektrophorese Die Plasmid-DNA oder Mutagenese-PCR wurde mit DNA-Probenpuffer versetzt und je nach Fragmentgröße in 0,5 – 1,5%igen horizontalen Agarose-Gelen aufgetrennt. Die Agarose wurde in 1x TBE-Puffer aufgelöst und mit 0,5 µg/ml Ethiumbromid versetzt, 28 um die doppelsträngigen Nukleinsäuren unter UV-Licht sichtbar zu machen. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 Volt für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. 2.2.5.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen Nach der elektrophoretischen Auftrennung und dem Ausschneiden der DNA unter UVLicht wurde die DNA mittels Agarose Gel Extraktions Kit (Eppendorf) nach Herstellerangaben isoliert. Die Elution erfolgte mit 30µl Probenpuffer, anschließend wurden die Eluate bei -20°C gelagert. 2.2.5.8 Ligation von DNA-Fragmenten Die Ligation von Fragment und Vektor erfolgte mit 1U T4-DNA-Ligase und 10x Ligasepuffer über Nacht bei 16°C in einem Volumen von 20 µl. Anschließend wurde ¼ des Ligationsansatzes in CaCl2–kompetente E. coli-Zellen transformiert (2.2.5.1). 2.2.5.9 Transformation von S. cerevisiae-Hefezellen Die Transformation von Hefezellen erfolgte nach von Gietz und Woods mit der Lithium-Acetat-Methode (Gietz and Woods 1994). Die Hefezellen wurden in YPDFlüssigmedium kultiviert und bei einer OD600 von 0,6 sedimentiert, mit A. dest. gewaschen, in LiAc-Lösung aufgenommen und 20 min bei 30 °C inkubiert. Nachdem dem Ansatz Plasmid-DNA sowie Heringssperma-DNA (100 mg/ ml) hinzugefügt wurden, folgte eine 20-minütige Inkubation bei 30 °C. Nach Zugabe von LiAcPEG-Lösung und einer erneuten 20-minütigen Inkubation bei 30 °C erfolgte der 1minütige Hitzeschock bei 42 °C. Nach Zugabe von DMSO und erneuter Inkubation bei 30 °C für 20 min wurden die Zellen sedimentiert (1 min, 5000 rpm), in 100 µl Sorbitol aufgenommen und auf Selektivagarplatten ausplattiert. 2.2.6 Proteinanalytische Methoden 2.2.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen wurden diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gele nach Laemmli (Laemmli 1970) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte in einer Mini-Protean III Zelle (Biorad, 29 München) nach Herstellerangaben. Zur Anfärbung der Proteinbanden wurde Coomassie Brilliant Blue R250 nach Lloyd (Lloyd 1996) verwendet. 2.2.6.2 Western-Blotting und Immunodetektion Der Transfer von Proteinen aus SDS-Polyacrylamidgelen auf Nitrozellulosemembran (∅ = 0,45 µm) nach Laemmli (Laemmli, 1970) erfolgte in einer Mini-Trans-Blot-Zelle. Unter Verwendung von Carbonat-Transferpuffer wurden die Proteine 1 h bei einer konstant angelegten Stromstärke von 300 mA auf die Membran transferiert. Die Proteine wurden auf der Nitrozellulosemembran mit Ponceau S angefärbt. Freie Bindestellen auf der Membran wurden mit 5% Milchpulver in PBS-ST abgeblockt, bevor die Membran mit Verdünnungen verschiedener Antiseren in PBS-ST behandelt wurde (2.1.8). Die Protein-Antikörper-Komplexe wurden auf der Nitrozellulosemembran mit den unter 2.1.8 aufgeführten, mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Zweitantikörpern sowie dem ECL-System nachgewiesen. 2.2.7 Zellbiologische Methoden 2.2.7.1 Direkte fluoreszenzmikroskopische Analyse von S. cerevisiae-Hefezellen Die fluoreszenzmikroskopische Analyse der wie unter 2.2.2.4 angezogenen Hefezellen erfolgte nach den Angaben von Rehling (Rehling et al., 1996). 2.2.7.2 Membransedimentation eines Proteins in S. cerevisiae-Hefezellen Die Lokalisation eines Proteins erfolgte ausgehend von Anzucht der Hefezellen in einer YNBGO-Hauptkultur (2.2.2.2). Die Zellen wurden nach der Ernte mechanisch wie unter (2.2.3.2) beschrieben in Lysispuffer mit Proteaseinhibitoren aufgeschlossen. Bei dem so erhaltenen Heferohextrakt erfolgte ein Angleichen der Proteinkonzentrationen. Durch Zentrifugation (1 Stunde, 100.000xg, 4°C) wurden die Membranen und Proteinaggregate sedimentiert, im Überstand befanden sich lösliche Proteine. Das Sediment wurde in einem dem Überstand äquivalenten Volumen in Lysispuffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert. Von jeder Fraktion wurde ein 300 µl-Aliquot mit 2x SDS-Probenpuffer versetzt, 50 µl wurden für eine immunologische Analyse nach SDSPAGE (2.2.6.1) und Westernblotting (2.2.6.2) eingesetzt. 30 2.2.7.3 Komplexisolierung membrangebundener Proteinkomplexe mittels IgGSepharose Affinitätschromoatographie aus S. cerevisiae-Hefezellen Die Aufreinigung peroxisomaler Membranproteinkomplexe unter Verwendung des TEV-ProteinA-Fusionsanteils erfolgte nach einem Protokoll von Agne et al mit folgenden Änderungen (Agne et al., 2003). Pro Reinigung wurden ca. 3 g Zellen aus einer YNBGO-Hauptkultur wie unter (2.2.3.2) beschrieben in Lysispuffer mit Inhibitoren aufgeschlossen. Aus dem erhaltenen Heferohextrakt (ca. 9 ml) wurden durch Zentrifugation für eine Stunde bei 100.000 × g und 4 °C die Membranen sedimentiert. Zur Proteinbestimmung (2.2.4.2) wurden diese in einem geringen Volumen (4,5 ml) Solubilisierungspuffer mit Inhibitoren resuspendiert und unter Verwendung eines Potter-Elvejham-Homogenisators homogenisiert. Nach der Proteinbestimmung wurde ein Aliquot des Membranhomogenats entsprechend 28,5 mg Protein ad 4,5 ml mit Solubilisierungspuffer mit Proteaseinhibitoren versetzt und mit 4,25 ml 2% (w/v) Digitonin in Solubilisierungspuffer versetzt. Die Proben wurden für eine Stunde auf dem Überkopfschüttler bei 4 °C inkubiert. Es folgte eine weitere Zentrifugation für eine Stunde bei 100.000 × g zur Abtrennung von unlöslichen, nicht solubilisierten Proteinen. Der Überstand wurde mit einem Bettvolumen von 20 µl HsIgG-Sepharose / 28,5 mg Protein (vor Solubilisierung) versetzt und ü. N. auf dem Überkopfschüttler inkubiert (4 °C). Nach Zentrifugation wurde der Überstand bis auf 0,5 ml abgenommen und 5 × mit 1 ml Aufschlusspuffer mit Inhibitorenauswahl gewaschen. Das Säulenmaterial wurde in dem Restvolumen resuspendiert, in zentrifugierbare Plastikminisäulchen überführt und 20 × mit je 250 µl Solubilisierungspuffer (0,1% (w/v) Digitonin, mit Inhibitorenauswahl) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Säulchen verschlossen, und 5 U/g Zellen rekombinante TEV-Protease in einem Gesamtvolumen von 75 µl Solubilisierungspuffer (0,1% (w/v) Digitonin, mit Inhibitorenauswahl) wurden auf das Säulenmaterial gegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 16 °C wurde das gespaltene Protein durch Zentrifugation von der Säule eluiert. Das Säulenmaterial wurde zweimal mit je 37,5 µl Solubilisierungspuffer (0,1% (w/v) Digitonin, mit Inhibitorenauswahl) gewaschen und die drei Eluate vereinigt. Das erhaltene TEV-Eluat wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Das Sediment wurde in dem 1fachen Bettvolumen in SDS-Probenpuffer (1x) aufgenommen und zur immunologischen Analyse nach SDSPAGE (2.2.6.1) und Western-Blotting (2.2.6.2) eingesetzt. 31 3. Ergebnisse 3.1 Ubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p Liegen Proteine innerhalb eines Organismus in fehlgefaltener oder defekter Form vor, so erfordert dies im jeweiligen Organismus ein System, welches diese Proteine erkennt und eleminiert. Ein solches sogenanntes „Quality-control“-System, welches diesen Vorgang katalysiert, ist das Proteasom/Ubiquitin-System. Die Ubiquitinylierung erfolgt dabei über eine fein regulierte und in drei Schritten ablaufende Kaskade. Das durch eine oder mehrere Ubiquitin-Ketten markierte Protein, man spricht auch von polyubiquitinyliertem Protein, wird vom Proteasom erkannt und proteolytisch degradiert. Anders als die Polyubiquitinylierung dient die Anheftung einzelner Ubiquitinreste (Monoubiquitinylierung) nicht der Degradation des Zielproteins, sondern vielmehr der Zielsteuerung von Proteinen zu unterschiedlichen zellulären Bereichen (Pickart, 2001). Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass der PTS1-Rezeptor Pex5p sowohl mono- als auch polyubiquitinyliert wird (Platta et al., 2004) (Kiel et al., 2005) (Kragt et al., 2005). Zur detaillierten Analyse dieser Modifikationen sollte im Rahmen dieser Arbeit zunächst die monoubiquitinylierte Form des Pex5p detektiert werden. Da die Modifikation von Proteinen mit Ubiquitin einen dynamischen Prozess darstellt, der durch Ubiquitinylierung und Deubiquitinylierung reguliert wird, musste die Entfernung des Ubiquitinrestes unterbunden werden. Diese ist durch Zugabe von NEM (N-EthylMalemid) zu den Reaktionen möglich. NEM alkyliert Thiolgruppen, in diesem Fall das Cystein des aktiven Zentrums der deubiquitinylierenden Enzyme innerhalb der Hefezellen und stabilisiert auf diese Weise die monoubiquitinylierte Pex5p-Form (Kragt et al., 2005). Daher ist es nach erfolgter NEM-Behandlung möglich, die MonoubiquitinBande immunologisch nachzuweisen (Kragt et al., 2005). Zu diesem Zweck wurde die Proliferation der Peroxisomen des Wildtyp-Stammes UTL7A durch Wachstum auf Ölsäure als alleinige Kohlenstoffquelle induziert. Nach erfolgter Induktion über 16 Stunden wurden die Zellen sedimentiert und in An- und Abwesenheit von NEM mechanisch aufgeschlossen. Die in der Probe enthaltenen Proteine wurden extrahiert und anschließend mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem 32 Transfer auf Nitrozellulose-Folie erfolgte der immunologische Nachweis unter Verwendung eines spezifischen Pex5p-Antiserums. Wie in Abbildung 3.1 zu erkennen ist, konnte in beiden Proben das Pex5p spezifisch detektiert werden. Wurde NEM der Probe zugesetzt, so konnte im Einklang mit Daten von Kargt (Kragt et al., 2005) eine weitere, höhermolekulare Bande detektiert werden, bei der es sich um die monoubiquitinylierte Pex5p-Form (mono-Ub-Pex5p) handelt. Abb. 3.1: Immunologischer Nachweis von mono-Ub-Pex5p aus Gesamtzelllysaten Ölsäure induzierter Hefezellen Zum Nachweis der Monoubiquitinylierung wurden Hefezellen unter Ölsäure induzierten Bedingungen angezogen. Die Zellen wurden mit und ohne Zugabe von NEM aufgeschlossen. Äquivalenten Mengen der erhaltenen Proben wurden mittels SDS-PAGE in einem 12,5%igen Gel aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf Nitrocellulose erfolgte die immunologische Detektion des Pex5p mittels eines Pex5p-spezifischen Antiserums. Im Gegensatz zu der Monoubiquitinylierung von Pex5p dient die Polyubiquitinylierung des Rezeptors als Markierung zur proteasomalen Degradation (Platta, Girzalsky et al. 2004) (Kiel et al., 2005). Diese Form der Pex5p-Ubiquitinylierung akkumuliert in Gendeletionsstämmen der AAA-Gruppe (PEX1, PEX6, PEX15) sowie der Pex4pGruppe (PEX4, PEX22) und unterliegt nicht der Deubiquitinylierung durch spezifische Ubiquitin-Hydrolasen. Zur Darstellung dieser Pex5p-Modifikation wurden Gesamtzelllysate des Wildtypenstammes UTL-7A und der beiden Mutanten-Stämme pex1∆ und pex4∆ erstellt. Diese wurden unter Ölsäure induzierten Bedingungen angezogen. Die Zellen wurden anschließend aufgeschlossen, die Proteine aufgetrennt und wie oben nach Übertragung auf Nitrozellulose-Folie immunologisch nachgewiesen. In der Abbildung 3.2 ist zu erkennen, dass sowohl im Wildtyp als auch in den Deletionsmutanten Pex5p quantitativ nahezu in gleicher Menge nachweisbar war. In der Deletionsmutante von pex1∆ sind im Einklang mit Platta (Platta et al., 2004) und Kiel 33 (Kiel et al., 2005) eine Di- und Tri-Ubiquitinbande zu erkennen, wohingegen sich bei pex4∆ die Mono- und Di- Ubiquitinbande zeigen. Somit kann festgestellt werden, dass bei Vorliegen defekter Proteine, in diesem Fall zum einen ein pex1∆-Stamm und zum anderen ein pex4∆-Stamm, eine Polyubiquitinylierung von Pex5p stattfindet. Abb. 3.2: Immunologischer Nachweis von poly-Ub-Pex5p Aus Ölsäure induzierten Hefezellen der angegebenen Stämme wurden Gesamtzelllysate gewonnen, welche nach Auftrennung mittels SDS-PAGE auf Nitrocellulose transferiert wurden. Der Nachweis erfolgte mit Pex5p-spezifischen Antiseren. Pex5p zeigt sich in allen Stämmen als deutliche Bande bei ca. 70 kDa. Im Wildtypen ließ sich keine höhermolekulare Pex5p-Bande nachweisen. Hingegen konnten im pex1∆-und pex4∆-Stamm ubiquitinylierte Pex5p-Spezies detektiert werden. 3.2 Pex5p-Verkürzungen Die Modifikation von Proteinen mit Hilfe des Ubiquitins erfolgt in der Regel durch Bildung von Isopeptidbindungen mit Aminosäuren des Zielproteins. Die Beobachtung, dass Pex5p sowohl mono- als auch polyubiquitinyliert wird, warf die Frage auf, an welcher Stelle des PTS1-Rezeptors Pex5p die Interaktion mit dem Ubiquitin lokalisiert ist. Da Ubiquitin Bindungen mit anderen Proteinen in der Regel über Lysine eingeht, wird vermutet, dass auch ein Lysin des Pex5p als Interaktionspartner in Betracht kommt. Aus diesem Grund wurde zunächst ermittelt, an welchen Stellen des Pex5p Lysine vorkommen. Insgesamt konnten innerhalb des PTS1-Rezeptors 36 Lysine identifiziert werden. Durch die Erkenntnis, dass die Ubiquitinylierung an der Membran erfolgt (Platta et al., 2004), wurde zunächst überlegt, welcher Teil des Pex5p ausreicht, um die peroxismale Membran zu erreichen und ob diese Pex5p-Verkürzung noch 34 modifiziert wird. Hierzu sollten im Folgenden verschiedene Konstrukte des Pex5p genauer untersucht werden. Abb. 3.3: Graphische Darstellung verschiedener Pex5p-Konstrukte Ausgehend von dem Gesamtprotein Pex5p [1-612] wurden verschieden Konstrukte untersucht. Charakteristische Bereiche des Proteins sind besonders hervorgehoben. Die Zahlen geben die jeweiligen Aminosäurereste an. Die untersuchten Pex5p-Varianten umfassten neben dem gesamten Protein die NTerminale Hälfte, bei dem die TPR-Domänen fehlen (Pex5p [1-313]), die für die CargoBindung essentiell sind. Hinzu kam eine weitere C-terminale Verkürzung (Pex5p [1245]) der neben der TPR-Domäne zusätzlich der größte Teil des Acyl-CoA-OxidaseBindebereichs fehlt (Brocard et al., 1994) (Fransen et al., 1995). Bei zwei weiteren Konstrukten fehlten lediglich die letzten C-terminalen 38 Aminosäuren (Pex5p [1-574]) oder die ersten N-terminalen 16 Aminosäuren (Pex5p [17-612]), von denen gezeigt wurde, dass sie zumindest für die Pex5p Ablösung von der peroxisomalen Membran eine Rolle spielen (Costa-Rodrigues et al., 2004). In den folgenden Versuchen sollte das Interaktionsverhalten dieser Mutanten mit der peroxisomalen Membran genauer untersucht werden. 35 3.3 Expressionskontrolle verschiedener Pex5p-Verkürzungen Initial war es notwendig zu überprüfen, ob die gewählten Pex5p-Verkürzungen stabil expremiert werden. Dazu wurden der Wildtyp UTL-7A und ausgewählte Transformanten (pex5∆ + Pex5p [1-245], pex5∆ + Pex5p [1-313], pex5∆ + Pex5p [1574], pex5∆ + Pex5p [17-612]) unter Ölsäure induzierten Bedingungen angezogen. Als zusätzliche Kontrolle diente der Wildtype Stamm mit integrierter Pex1p-TEV-ProtA Fusion. Da dieser Stamm im Folgenden Verwendung fand, soll an anderer Stelle genauer darauf eingegangen werden. Nach erfolgter Anzucht, Zellsedimentation und Zellaufschluss wurden die enthaltenen Proteine extrahiert. Diese wurden dann über SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose-Folie transferiert. Hier erfolgte der immunologische Nachweis der Proteine durch spezifische Antiseren. Abb. 3.4: Expressionskontrolle verschiedener Pex5p-Verkürzungen Nach Proliferation der Zellen in Ölsäure wurden Gesamtzelllysate der Stämme erstellt. Anschließend Auftrennung der Proteine über SDS-PAGE und Transfer auf Nitrocellulose. Der immunologische Nachweis erfolgte mittels Pex5p-spezifischer Antiseren. Die Expression der Stämme ist mit Ausnahme des pex5∆ (Negativkontrolle) erkennbar. * entstand vermutlich durch Degradation. 36 Wie aus der Abbildung 3.4 erkennbar ist, wurde das Pex5p in allen Stämmen mit Ausnahme des pex5∆-Pex1p-TEV-ProtA-Stammes, welcher als Negativkontrolle diente, expremiert. Zwischen der Expression des Wildtyp-Stammes und des WildtypStammes mit dem intergrierten TEV-ProtA war keine Unterschied festzustellen. Bei allen Stämmen zeigte sich eine quantitativ nahezu identische Konzentration von Pex5p. Lediglich bei pex5∆ + Pex5p [1-313] zeigt sich eine vermehrte Anreicherung von Protein. Die Bande auf Höhe von 31 kDa bei pex5∆ + Pex5p [17-612] entstand vermutlich durch Degradation. Dennoch ist auch bei diesem Stamm Pex5p klar nachzuweisen. Alle Konstrukte zeigten eine Expression. 3.4. Überprüfung der Funktionalität der Pex5p-Verkürzungs- konstrukte und der Pex1p-TEV-ProtA-Integration Im Folgenden sollte untersucht werden, in wie weit die ausgewählten Pex5pVerkürzungen in der Lage sind, die pex5∆-Mutante funktionell zu komplementieren. Hierzu wurde die für die Verkürzungsproteine codierenden Plasmide in die pex5∆Mutante transformiert. Die erhaltenen Transformanten, der Wildtyp UTL-7A sowie die pex5∆-Mutante wurden nachfolgend hinsichtlich des Wachstums auf Ölsäure als alleinige Kohlenstoffquelle untersucht. Das Wachstum der Hefezellen hängt unter Verwendung von Oleat als Kohlenstoffquelle von einer funktionierenden β-Oxidation ab. Da die β-Oxidation in S. cerevisiaeHefezellen ausschließlich im peroxisomalen Lumen stattfindet, kann ein Wachstumstest in einem Medium mit Ölsäure als alleiniger Kohlenstoffquelle Auskunft über die Funktionalität der Peroxisomen geben (Kunau et al., 1995). Da diese auch von der Funktion des Pex5p abhängt, kann mit diesem Test analysiert werden, ob die Teilfragmente des PTS1-Rezeptors bereits in der Lage sind, diese Funktion des Proteins auszuführen. Die entsprechenden Zellen wurden zunächst in einem 0,3%igen Glukosemedium für eine Dauer von 24 Stunden angezogen. Anschließend wurden zur Analyse 10fache Verdünnungen der jeweiligen Stämme und der Kontrollen, ausgehend von einer 37 Zellzahl von 1*107 Zellen/ml, auf Ölsäureplatten aufgetragen. Diese wurden 5 Tage bei 30°C inkubiert. Wie in Abbildung 3.5 zu sehen ist, konnte der Wildtyp die Ölsäure nutzen, wie aus der Bildung eine Hofes sowie die Erhöhung der Zellzahl zu erkennen ist. Im Gegensatz hierzu war im Einklang mit van der Leij (van der Leij et al., 1993) der pex5∆-Stamm nicht zur Verstoffwechselung von Ölsäure in der Lage, ein typisches Charakteristikum von pex-Mutanten (Distel et al., 1996). Die Expression des plasmidkodierten Pex5p rekonstituierte diesen Defekt, und die entsprechende Transformante zeigte ein dem Wildtyp ähnliches Wachstumsverhalten (Abb 3.5). Sowohl die N- als auch C-terminalen Verkürzungen des PTS1-Rezeptors führten in allen Fällen zu einem Funktionsverlust des Proteins, angezeigt durch das fehlende Wachstum (Abb. 3.5). Dies zeigt, dass alle Bereiche von Pex5p essentiell sind. Es muss aber auch in Betracht gezogen werden, dass die Deletion auch nur einzelner Aminosäuren die strukturelle Integrität von Pex5p beeinträchtigen und so zu einer funktionslosen Struktur des Proteins führen. Abb. 3.5: Überprüfung der Funktionalität der Pex5p-Verkürzungen durch Wachstumstest Die Stämme UTL-7A, pex5∆, pex5∆ + Pex5p, pex5∆ + Pex5p [1-245], pex5∆ + Pex5p [1-313], pex5∆ + Pex5p [1-574], pex5∆ + Pex5p [17-612] wurden ausgehend von einer relativen Zellzahl von 1*107 in einer 10fachen Verdünnungsreihe auf einer Festagarplatte aufgetragen. Nach 5 Tagen bei 30°C waren ein deutliches Wachstum und eine Hofbildung erkennbar. Die Pex5p-Verkürzungen wiesen keine ausreichende Funktionalität auf. 38 Um beide Möglichkeiten zu diskriminieren, sollten in nachfolgenden Versuchen im Rahmen dieser Arbeit Isolierungen von Proteinkomplexen erfolgen. Als Köderprotein wurde das Pex1p gewählt, welches eine direkte Funktion in der Extraktion des Pex5p aus der peroxisomalen Membran besitzt (Miyata and Fujiki, 2005) (Platta et al., 2005). Untersucht werden sollte, inwieweit die verschiedenen Pex5p-Varianten Bestandteil dieses Pex1p-haltigen Komplexes sind. Liegt dieses vor, kann die Zielsteuerung des PTS1-Rezeptors nicht betroffen sein und damit dessen Struktur durch die Deletion einzelner Aminosäuren nicht dramatisch verändert worden sein. Abb. 3.6: Wachstumstest zur Überprüfung der Funktionalität nach Integration des TEV-ProtA an Pex1p Wachstumsverhalten der Stämme UTL-7A, pex5∆, und UTL7A Pex1p-TEV-ProtA auf eine Ölsäure haltigen Festagarplatte nach 5 Tagen bei 30°C. Das Wachstum der Kolonien und die Bildung eines Hofes um die Kolonien herum zeigen eine Verwertung der Ölsäure. Aufgetragen wurde eine 10fache Verdünnungsreihe. Die Integration des TEV-Prot-A hat keinen negativen Einfluss auf das Wachstumsverhalten des Wildtypen. Durch heterologe Rekombination wurde das Pex1p mit einem Protein-A-Tag (ProtA) versehen, das zur Bindung an IgG-Sepharose herangezogen werden kann. Zwischen Protein A und Köderprotein liegt eine TEV-(tabacco etch virus)-Proteaseschnittstelle, welche später die Entfernung des Tags ermöglich und zudem die Isolierung nativer Proteinkomplexe erlaubt. Um zu untersuchen, ob der TEV-ProtA-Anteil Auswirkungen auf die Funktion des Pex1p hat, wurde initial das Wachstum des Integrationsstammes auf Ölsäure als alleinige Kohlenstoffquelle untersucht. Analog zur oben beschriebenen Vorgehensweise wurden das Wachstum des Wildtyps, der pex5∆-Mutante sowie des Wildtyps mit Expression des Pex1p-TEV-ProtA auf Oleat als Kohlenstoffquelle untersucht. Wie in Abbildung 3.6. zu sehen ist, zeigte der Integrationsstamm ein dem 39 Wildtypen vergleichbares Wachstum. Diese zeigt, dass der ProtA-Anteil nicht die Funktion des Pex1p beeinträchtigt. Die mit den Pex5p-Verkürzungskonstrukten transformierten pex5∆Stämme zeigen keine Funktionalität. Der Wildtyp und der Wildtyp mit dem Pex1p-TEV-ProtA zeigten das gleiche Wachstumsverhalten. 3.5 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der Konstrukte auf den PTS1-Importweg Obwohl die Pex5p-Verkürzungen nicht in der Lage sind, die pex5∆-Mutante funktionell hinsichtlich des Wachstums auf Ölsäure zu komplementieren, ist nicht ausgeschlossen, dass eine Restfunktion des Rezeptors ausgeführt wird. Um dieses zu analysieren wurden fluoreszensmikroskopische Untersuchungen der Stämme durchgeführt. Da das Pex5p als cytosolischer Rezeptor für den PTS1-Importweg der Proteine über peroxisomale Membranen essentiell ist, stellte sich die Frage, inwieweit nun solche Defekte bzw. Veränderungen des Pex5p Auswirkungen auf den effizienten Import von Proteinen haben. Zur Analyse der Lokalisation von PTS1-Matrixproteinen wurde das Reporterprotein GFP (green fluorescent protein) aus Aequorea victoria mit einer PTS1Sequenz fusioniert. Dieses artifizielle peroxisomale Matrixprotein wurde bereits in vorangegangenen Arbeiten eingesetzt und stellte sich als hinreichend für die vorliegende Fragestellung heraus. Das kodierende Plasmid wurde in die entsprechenden Stämme transformiert. Selektionspositive Transformanten-Zellen wurden zwei Tage auf Ölsäureagarplatten bei 30°C inkubiert und anschließend fluoreszenzmikroskopisch untersucht. 40 Abb. 3.7: Untersuchung des Einflusses der Pex5p-Verkürzungen auf die Lokalisation des artifiziellen peroxisomalen Matrixproteins GFP-SKL mittels in vivo-Fluoreszenzmikroskopie Die angegebenen Stämme wurden nach erfolgter Anzucht unter Ölsäure induzierten Bedingungen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Ein punktiertes Fluoreszenzmuster zeigt eine peroxisomale Lokalisation des Markerproteins, wo hingegen Zellen mit einem cytosolisches Leuchten ein PTS1Importdefekt aufweisen. (Balken: 5µm) In der Normarski-Aufnahme ist in allen Stämmen eine normale Struktur der Zellen zu erkennen. Betrachtet man das Fluoreszenzmuster der einzelnen Zellen, so lässt sich sowohl in den Wildtyp-Zellen als auch in den Wildtyp-Zellen mit der Expression des Pex1p-TEV-ProtA eine punktierte Verteilung des GFP erkennen. Daraus kann man schließen, dass hier ein effizienter Import des Marker-Proteins über die peroxisomalen Membranen stattgefunden hat. Im Gegensatz dazu ist bei dem Stamm mit der pex5∆Deletion und bei den pex5∆-Stämmen mit Expression der Pex5p-Verkürzungen eine cytosolische Verteilung des GFP zu sehen. Aus dieser cytosolischen Verteilung des 41 GFP-SKL lässt sich schließen, dass ein funktioneller Transport in die Peroxisomen nicht erfolgt ist. Dies bestätigt das Ergebnis der Funktionalitätsuntersuchung, wonach durch einen Defekt am PTS1-Rezeptor Pex5p kein effizienter Proteintransport über die peroxisomalen Membranen stattfinden kann. Die Wildtypzellen zeigen ein punktiertes Muster des GFP mit Lokalisation in den Peroxisomen. Die pex5∆-Stämme mit Pex5p-Verkürzungskonstrukten zeigen keinen effizienten Import des GFP in die Peroxisomen. 3.6 Analyse der Membranassoziation der Verkürzungskonstrukte Da sich in den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigte, dass die Pex5pVerkürzungen nicht in der Lage sind, wie das Wildtypprotein PTS1-Proteine effizient in die Peroxisomen zu transportieren, stellte sich die Frage, inwieweit diese Konstrukte generell zur peroxisomalen Membran gelangen und somit eine Interaktion mit dieser eingehen können. Dies ist auch im Hinblick darauf interessant, da die Ubiquitinylierung von Pex5p an der Membran der Peroxisomen stattfindet. Zur genaueren Untersuchung der Fragestellung wurde eine Membransedimentation durchgeführt. Hierbei wurden lösliche und membranassoziierte Proteine voneinander getrennt. Die Anzucht der Hefezellen des Wildtypen und der modifizierten Pex5p-Konstrukte pex5∆ + Pex5p [1-245], pex5∆ + Pex5p [1-313], pex5∆ + Pex5p [1-574] und pex5∆ + Pex5p [17-612] erfolgte zunächst in 0,3%iger Glukoselösung über 36 Stunden. Anschließend wurden die Zellen in eine Rytka-Hauptkultur überimpft. Hierbei handelt es sich um eine Mischung von Ölsäure- und Glukosemedium. Die Zellen wurden mechanisch aufgeschlossen (2.2.3.2) und das erhaltene Homogenat nach vorheriger Abtrennung von Zelldebris und nicht aufgeschlossener Zellen durch Zentrifugation in einen Überstand mit löslichen und ein Sediment mit membrangebundenen und partikülären Proteinen aufgetrennt. Äquivalente Anteile der erhaltenen Fraktionen wurden anschließend einer immunologischen Untersuchung mittels spezifischer Antiseren unterzogen. 42 Pex13p ist ein integrales Membranprotein, welches über hydrophobe Wechselwirkungen mit der Membran verbunden ist (Erdmann and Blobel, 1996) (Gould et al., 1996) (Elgersma et al., 1996). Der Nachweis von Pex13p sollte nur im Homogenat und in den Membranen möglich sein. Im Einklang mit dieser Aussage konnte tatsächlich nur im Homogenat und im Sediment der einzelnen Stämme Pex13p nachgewiesen werden, welches eine saubere Trennung der Fraktionen widerspiegelt. Als weitere Kontrolle dieses Sachverhalts wurde das ausschließlich cytoplasmatisch lokalisierte Protein Fructose-1,6-Bisphosphatase analysiert. Dieses Protein war immunologisch nur im Homogenat und den Überständen der verschiedenen Konstrukte nachzuweisen, was wiederum ein Nachweis für eine saubere Trennung der Fraktionen darstellt. Abb. 3.8: Versuch zur immunologischen Analyse der Membransedimentation Analyse des Wildtypen und der verschiedenen Pex5p-Modifikationen im Hinblick auf lösliche und membranassoziierte Verteilung. Nach Glasperlenaufschluss und Zentrifugation des Homogenates bei 100.000 x g wurden äquivalente Mengen der erhaltenen Proben mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Der Nachweis von Pex5p, Pex13p und Fruktose-1,6-Bisphohsphatase (F-1,6BP) erfolgte mittels spezifischer Antiseren. Dabei dienten Pex13p und die Fruktose-1,6-Bisphohsphatase als Nachweis einer sauberen Trennung in membranassoziierte bzw. lösliche Proteine. Die Untersuchung der Membranassoziation zeigt, dass beim Wildtyp in allen Fraktionen Pex5p vorzufinden ist, also es sowohl löslich als auch partikulär lokalisiert ist. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung einer dualen Verteilung des Rezeptors, welche im Folgenden zum Modell des zyklisierenden Rezeptors führten (Dodt and Gould, 1996). Alle Pex5p-Verkürzungen konnten sowohl in der Überstandsfraktion als auch im Sediment detektiert werden und zeigten somit eine dem Wildtypprotein ähnliche Verteilung auf (Abb. 3.8). Eine Ausnahme stellt das Pex5p [1-245] dar, welches ausschließlich im löslichen Überstand vorliegt. Diese Beobachtung lässt darauf 43 schließen, dass Pex5p [1-245] nicht mehr eine Interaktion mit der peroxisomalen Membran eingehen kann, wohingegen die anderen Proteine noch dazu in der Lage sind. Aus diesen Untersuchungen kann man nun schließen, dass das Konstrukt Pex5p [1-313] das kleinste Pex5p-Fragment ist, welches in diesen Experimenten noch die Membran erreicht. Das kleinste Konstrukt, welches die Membran noch erreicht, ist Pex5p [1-313]. 3.7 Analyse von Pex5p enthaltenen Membrankomplexen Die bisher durchgeführten Analysen zeigen, dass die Fusion des Pex1p mit dem TEVProtA am C-Terminus keine Auswirkung auf seine Funktion hat. Deshalb war es möglich, den TEV-ProtA-Fusionsanteil zu einer Isolierung von Pex1p zu nutzen. Es konnte gezeigt werden, das Pex5p Bestandteil des Pex1p Komplexes ist (Rosenkranz et al., 2006). Die Sedimentationsanalysen zeigten die teilweise partikuläre Lokalisation der Pex5p Fragmente. Um zu analysieren, ob es sich hierbei um Proteinaggregate handelt oder ob die Fragmente mit der peroxisomalen Membran assoziiert vorliegen, wurde eine Isolierung von Proteinkomplexen mit Pex1p als Köderprotein durchgeführt. Hierzu wurden aus den Wildtypen und den mit den Verkürzungskonstrukten transformierten pex5∆-Pex1p-TEV-ProtA-Stämmen Proteinkomplexe aus den Membranen schonend solubilisiert und über Affinitätschromatographie isoliert (Niederhoff, 2002) (Agne et al., 2003). Zunächst wurden die Zellen wie im Schema dargestellt aufgearbeitet. Zu den mit Digitonin solubilisierten Proteinen wurde IgGSepharose gegeben und über Nacht inkubiert. Das Fusionsprotein mit dem TEV-ProtA bindet dabei über den ProteinA-Anteil an die Sepharose-Matrix mit kovalent gebundenen HsIgG-Molekülen, welche als feste Phase dient. Nicht gebundene Proteine werden anschließend über mehrere Waschschritte entfernt. Mit Hilfe einer TEVProtease gelingt dann die spezifische Elution der Proteinkomplexe. Ein Anteil von 14 Aminosäuren des TEV verbleibt an dem Fusionsprotein (Abb. 3.9). 44 Abb. 3.9: Schematische Darstellung zur Isolierung von Proteinkomplexen unter Verwendung des TEV-ProtA-Fusionsanteils Aus dem Überstand oder dem solubilisierten Membranen erfolgte eine Isolierung der Proteinkomplexe mittels Affinitätschromatographie. Die Trennung erfolgte mit Hilfe des fusionierten TEV-ProtA-Anteils und IgG-gekoppelter Sepharose. Zur Analyse der Affinitätsisolierung wurden äquivalente Mengen der erhaltenen Fraktionen mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und im Western-Blot immunologisch analysiert. Repräsentativ ist in Abb. 3.10 der Verlauf der Isolierung des Pex1p aus dem Stamm UTL-7A-Pex1p-TEV-ProtA dargestellt. Hier zeigte sich ein Vorkommen von Pex1p-TEV-ProtA im Homogenat, im Überstand und im Sediment. Mit Digitonin konnte ein Teil des sedimentierten Fusionsproteins solubilisiert und anschließend mit der Säulenmatrix inkubiert werden. Es zeigte sich, dass das Pex1pTEV-ProtA nahezu vollständig an die IgG-Sepharose gekoppelt werden konnte. So konnten im Durchlauf nur geringe Mengen dieses Proteins detektiert werden. Jedoch konnte nicht das vollständig gespaltene Pex1p von der Säule eluiert werden (Abb. 3.10). 45 Abb. 3.10: Isolation membranassoziierter Proteinkomplexe mittels Affinitätschromatographie unter der Verwendung von TEV-ProtA und HsIgG-Sepharose (A) Schematische Darstellung des Versuchsablaufs. (B) Membrangebundene Komplexisolierung und Analyse der Verteilung von Pex1p-TEV-ProtA. Für die Analyse wurden äquivalente Mengen der Proben mittels SDS-PAGE aufgetrennt, und es folgte ein Transfer auf Nitrocellulose mit Darstellung der Proteine unter Verwendung eines spezifischen Antiserums. In weiteren Analysen sollte nun untersucht werden, welche anderen peroxisomalen Proteine als Interaktionspartner mit Pex1p nachzuweisen sind. Hierzu wurden die TEVEluate aus der Membrankomplexisolierung wiederum mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und in der Western-Blot-Analyse immunologisch untersucht. Die Analyse der TEV-Eluate zeigte, dass im Einklang mit Rosenkranz et al. mit Pex1p das zweite AAA-Protein Pex6p und der Membrananker Pex15p koisoliert werden konnte (Rosenkranz, 2002). Dabei zeigte der Wildtyp mit fusioniertem TEV-Protein allerdings nur eine schwache Bande bei der Reaktion mit Pex15p. Dieses Phänomen ist nicht genauer erklärbar, komme allerdings häufiger vor (Rosenkranz, persönliche Mitteilung). Weiterhin konnten Komponenten die des Dockingkomplexes Pex13p und Pex14p identifiziert werden. In Bezug auf Pex5p zeigte sich, wie zu erwarten war, dass in der Wildtyp-Kontrolle ohne Expression der Pex1p-Fusion keine Bande zu detektieren war. Diese zeigt die Spezifität der durchgeführten Affinitätsisolierung. Im Wildtyp mit fusioniertem TEVProtein konnte hingegen das endogene Pex5p mit Pex1p koisoliert werden. Bei den 46 getesteten Pex5p-Fragmenten ist zu sehen, dass Pex5p [1-313], Pex5p [1-574] und Pex5p [17-612] mit Pex1p koisoliert werden konnten. Einzig Pex5p [1-245] konnte nicht detektiert werden. Dies ist im Einklang mit den vorherigen Ergebnissen, die zeigten, dass dieses Fragment ausschließlich cytosolisch lokalisiert ist, nicht aber zur peroxisomalen Membran gelangt. Abb. 3.11: Proteinzusammensetzung des TEV-Eluats nach Komplexisolierung mit Pex1p-TEVProt-A Immunologischer Nachweis der mit Pex1p-TEV-ProtA koisolierten Proteine. Äquivalente Volumina der einzelnen Eluatfraktionen wurden in einem 12,5%igen SDS-Gel aufgetrennt. Anschließend erfolgten der Transfer auf Nitrocellulose und der Nachweis mittels spezifischer Antiseren. 3.8 Poly-Ubiquitinylierung von Pex5p Nachdem sich gezeigt hatte, dass Pex5p [1-313] das kleinste Verkürzungskonstrukt war, welches noch die Membranen erreicht, stellte sich die Frage, ob es weitere Unterschiede 47 zwischen dem nicht die Membranen erreichenden Pex5p [1-245] und den anderen Verkürzungskonstrukten gibt. Hierzu wurden nun das Konstrukt Pex5p [1-245] und als noch die Membranen erreichendes Konstrukt das Pex5p [1-313] miteinander verglichen. Es wurde untersucht, ob die Pex5p-Fragmente noch durch das Ubiquitin-System erkannt und dem weiteren Weg zugeführt werden. Hierzu wurden die beiden Verkürzungskonstrukte zunächst sowohl in einen pex1∆/pex5∆-Stamm als auch in einen pex4∆/pex5∆-Stamm transformiert. Die Zellen wurden nach Anzucht in 0,3%iger Glukoselösung über 12 Stunden und anschließender Peroxisomenproliferation, welche mit Ölsäure induziert wurde, schonend mit Glasperlen mechanisch aufgeschlossen. Durch Zentrifugation wurden die membranassoziierten Proteine von den löslichen Proteinen getrennt. Es folgte eine immunologische Untersuchung der Membranenfraktion mittels spezifischer Antiseren. Abb. 3.12: Immunologischer Nachweis von mono-Ub-Pex5p, di-Ub-Pex5p und tri-Ub-Pex5p Ölsäure induzierter Hefezellen aus Gesamtzelllysaten Aus Ölsäure induzierten Hefezellen wurden Gesamtzelllysate gewonnen, welche nach Auftrennung mittels SDS-PAGE auf Nitrocellulose transferiert wurden. Der Nachweis erfolgte mit spezifischen Antiseren. (A) Nachweis der Ubiquitinylierung im pex1∆ und pex4∆. (B) Analyse der Ubiquitinylierung bei den Konstrukten Pex5p [1-245] und Pex5p [1-313]. Eine Ubiquitinylierung des Pex5p [1-245] kann nicht erfolgen. Wie bereits zu Anfang dieser Arbeit beschrieben, zeigt die Analyse im Wildtypen keine Ubiquitinylierung. Hingegen lässt sich im pex1∆-Stamm sowohl die di- als auch die triUbiquitinbande und im pex4∆-Stamm die mono- und die di-Ubiquitinbande detektieren. 48 Bei den Verkürzungskonstrukten zeigt sich, dass das Konstrukt Pex5p [1-245] weder im pex1∆/pex5∆-Stamm noch im pex4∆/pex5∆-Stamm ubiquitinyliert wird (Abb. 3.12). Hingegen kann man bei dem Verkürzungskonstrukt Pex5p [1-313] im Zusammenhang mit dem pex1∆/pex5∆-Stamm sowohl die di- und tri-Ubiquitinbanden erkennen und im Zusammenhang mit dem pex4∆/pex5∆-Stamm die mono- und tri-Ubiquitinbanden. Also ist dieses Konstrukt das kleinste, welches noch ubiquitinyliert wird. Dies lässt sich dadurch erklären, dass die Ubiquitinylierung an der Membran stattfindet. Da das Konstrukt Pex5p [1-245], wie in oben durchgeführten Analysen gezeigt, die Membran nicht erreicht und keine Interaktion mit dieser eingehen kann, kann eine Ubiquitinylierung hier nicht erfolgen (Abb. 3.12). Pex5p [1-313] ist das kleinste noch ubiquitinylierte Verkürzungskonstrukt. 3.9 Analysen von Punktmutanten Die Ubiquitinylierung peroxisomaler Proteine erfolgt in der typischen 3-SchrittReaktion mit Aktivierung des Ubiquitin, Konjugation und Ligation. Hierbei übernimmt das peroxisomale Pex4p, welches auch als Ubc10 bekannt ist, die Funktion des Ubiquitin konjugierenden Enzyms. Als Membrananker für das Pex4p dient hier Pex22p (Rosenkranz, 2002). Es ist bekannt, dass Ubiquitin über sein Glycin 76 eine Interaktion mit einem Lysin des Substrates eingeht. Dieses erfolgt kovalent über die ε-NH2-Gruppe (Chau et al., 1989). Da Pex5p [1-313] das kleinste Verkürzungskonstrukt darstellt, welches noch ubiquitinyliert wird, stellte sich die Frage, ob es möglich war ein Lysin zu identifizieren, welches für die Polyubiquitinylierung verantwortlich ist und somit den Abbau des Proteins im Proteasom einleitet. Hierzu wurde zunächst anhand der Gensequenz des Pex5p geschaut, an welchen Stellen die Aminosäure Lysin zu finden ist. Es wurden in den ersten 313 Aminosäuren 15 Lysine identifiziert (Abb. 3.13). 49 Abb. 3.13: Schematische Darstellung von Pex5p [1-313] mit Veranschaulichung der enthaltenen Lysine Anhand der Gensequenz des Pex5p wurden 15 Lysine detektiert, die als Interaktionpartner für das Ubiquitin in Frage kommen. Charakteristische Bereiche des Proteins sind besonders hervorgehoben. Die Zahlen geben die jeweiligen Aminosäuren an. Zur Analyse des Sachverhaltes wurden Punktmutationen von jedem einzelnen Lysin erstellt. Dies erfolgte mittels überlappender Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR = polymerase chain reaction). Hierbei wurde das jeweilige Lysin durch ein Arginin substituiert. Das modifizierte Protein wurde dann wieder in Hefezellen expremiert (Abb. 3.14). Falls ein Lysin für die Polyubiquitinylierung verantwortlich ist, sollte sich dies durch die Mutation zeigen. Zur Kontrolle der einzelnen Schritte bei der Polymerase-Ketten-Reaktion wurden zunächst die bei der PCR-Reaktion entstehenden Teilfragmente (s. Schema der Abb. 3.14 A) mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Abbildung 3.15 A zeigt exemplarisch die Gelelektrophorese für die sechs ersten Punktmutationen. Eine weitere elektrophoretische Auftrennung zeigt die Abbildung 3.15 B. Hier ist exemplarisch von den ersten drei Punktmutanten jeweils der Vektor, das Fragment und der Klon dargestellt. Hierin erkennt man, dass im Klon sowohl der Vektor als auch das DNAFragment nachweisbar ist. Die korrekte Substitution der jeweiligen Basen wurde anschließend durch DNA-Sequenzierungen der erhaltenen Plasmide verifiziert. Zudem konnten hierdurch weitere Mutationen durch die PCR-Reaktion ausgeschlossen werden. 50 Abb. 3.14: Schematische Darstellung der Einführung von Punktmutationen in das Pex5p (modifiziert nach Daubert) Zur Identifizierung der Ziellysine wurden zunächst Punktmutationen des PEX5 mittels überlappender Polymerase-Ketten-Reaktion erstellt. Hierbei wurde das jeweilige Lysin durch ein Arginin ersetzt. Anschließend wurde das modifizierte Protein wieder in Hefezellen transferiert. 51 Abb. 3.15: Exemplarische Darstellung einer Polymerase-Ketten-Reaktion zum Einbringen der Punktmutation in das Pex5p (A) PCR-Analyse der entstehenden Fragmente bei der Ligation des PEX5 zum Einbringen einer Punktmutation. Die Abbildung zeigt exemplarisch die bei den ersten sechs Ligationen entstehenden Teilfragmente des Proteins. (B) Kontrolle des korrekten Einbringens der Punktmutation in das Pex5p. Beispielhaft ist hier für die ersten drei Punktmutanten die Anwesenheit von Vektor und Fragment im Klon nachgewiesen. 3.10 Expressionskontrolle der Punktmutanten Wie auch bei den Verkürzungskonstrukten wurden vergleichbar Punktmutanten immunologisch im Hinblick darauf untersucht, ob sie expremiert werden. Hierbei wurden als Kontrollen wieder der Wildtyp-Stamm UTL-7A, ein pex5∆ und ein pex5∆ + Pex5p verwendet. Nach Ölsäure induzierter Proliferation der Peroxisomen wurden die Proteine nach Zellaufschluss extrahiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine auf Nitrocellulose-Folie transferiert und hier der immunologische Nachweis durch spezifische Antiseren erbracht. Es konnte bei allen Punktmutanten Pex5p mit zum Wildtyp-Pex5p vergleichbarer Konzentration nachgewiesen werden. Die eingefügten Mutationen haben damit keine Auswirkung auf die Expression oder Stabilität der Mutanten-Proteine. Zur Kontrolle, dass von allen Proben äquivalente Mengen über SDS-PAGE aufgetrennt wurden, diente das mitochondriale Porin. Hier zeigten sich keine Differenzen bezüglich der Proteinmengen (Abb. 3.16). 52 Abb 3.16: Expressionskontrolle verschiedener Pex5p-Punktmutanten Ausgehend von in Ölsäure proliferierten Zellen wurden Gesamtzelllysate der einzelnen Mutanten erstellt. Die Auftrennung der Proteine erfolgte über SDS-Page, anschließend Transfer auf Nitrocellulose. Der immunologische Nachweis erfolgte mittels spezifischer Antiseren. Als Äquivalenzkontrolle gleicher Proteinmengen diente Porin. 3.11 Überprüfung der Funktionalität der Punktmutanten Ein Wachstumstest in einem Medium mit Ölsäure als alleiniger Kohlenstoffquelle soll auch hier wieder Auskunft über die Funktionalität der Punktmutanten geben. Bei ausreichender Funktionalität sollten sich zum einen ein Wachstum der Kolonien und zum anderen eine Hofbildung um die Kolonien herum zeigen. Aus einem ausbleibenden oder abgeschwächten Wachstum ließe sich schließen, dass das betroffene Lysin eine essentielle Rolle bei der Ubiquitinylierung des Pex5p einnehme. Nach Anzucht der Zellen in einem 0,3%igen Glukosemedium über 24 Stunden wurden zur Analyse 10fache Verdünnungen der jeweiligen Stämme und der Kontrollen, ausgehend von einer Zellzahl von 1*107 Zellen/ml, auf Ölsäureplatten aufgetragen und anschließend fünf Tage bei 30°C inkubiert. 53 Abb. 3.17: Wachstumstest zur Analyse der Funktionalität der Pex5p-Mutanten Die angegebenen Stämme wurden ausgehend von einer relativen Zellzahl von 1*107 in einer 10fachen Verdünnungsreihe auf einer Festagarplatte aufgetragen. Ein deutliches Wachstum war in allen Mutanten nach 5 Tagen bei 30°C erkennbar. Es zeigte sich zunächst, dass der Wildtyp-Stamm normal auf den Agarplatten wuchs. Wie zu erwarten, konnte man pex5∆-Stamm kein Wachstum beobachten. Nach Transformation von Pex5p in den pex5∆-Stamm ist die Funktionalität wiederhergestellt. 54 Bei allen Stämmen mit einer Punktmutation konnte man ebenfalls ein normales Wachstum erkennen, das sich nicht vom Wachstum des Wildtyps unterschied. Dies zeigte sich auch durch die Hofbildung um die Kolonien herum. Sie sind also in der Lage, Ölsäure zu verstoffwechseln und zeigen somit eine normale Funktionalität. Aus der Überprüfung der Funktionalität lässt sich also keine Aussage darüber treffen, ob ein spezielles Lysin eine Rolle bei der Ubiquitinylierung von Pex5p spielt (Abb. 3.17). Alle Punktmutanten zeigen eine normale Funktionalität. 3.12 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der Punktmutationen auf den PTS1-Importweg Die oben genannten Analysen ergeben, dass alle Punktmutationen eine normale Expression und auch eine normale Funktionalität hinsichtlich des Wachstums auf Ölsäure besitzen. Da ein solches Wachstum jedoch auch möglich ist, wenn die Funktion der Peroxisomen deutlich reduziert ist, sollte in der immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchung noch geklärt werden, inwieweit eine Punktmutation Auswirkungen auf den effizienten Import von Proteinen in die Peroxisomen hat. Zur Analyse der Lokalisation diente erneut das GFP (green fluorescent protein) aus Aequorea victoria. Dies wurde als ein mit einer PTS1-Sequenz fusioniertes GFP in die Stämme transformiert. Nach zwei Tage langer Anzucht in Ölsäure auf Agarplatten bei 30°C wurden die Zellen fluoreszenzmikroskopisch untersucht. In der Normarski-Aufnahme war in allen Stämmen eine normale Struktur der Zellen zu erkennen. In den Wildtyp-Zellen und auch in den Stämmen mit den Punktmutationen ließ sich ein punktiertes Leuchten des GFP erkennen. Somit kann man die Aussage treffen, dass hier ein effizienter Import der Proteine über die peroxisomalen Membranen stattgefunden hat und der Austausch eines Lysins durch eine Arginin keine Auswirkungen auf den peroxisomalen Proteinimport hat. Dieses Ergebnis bekräftigt die Analysen der Funktionalität (Abb. 3.18). 55 Abb. 3.18: In vivo-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Auswirkungen nach Einbringen von Punktmutationen in das Pex5p Nach Anzucht unter Ölsäure induzierten Bedingungen wurden die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In den Mutanten ist eine peroxisomale Lokalisation des PTS1Rezeptors Pex5p erkennbar. (Balken = 5 µm) Die Wildtypzellen zeigen ein punktiertes Muster des GFP mit Lokalisation in den Peroxisomen. Alle Stämme mit Punktmutationen zeigen einen effizienten Import des GFP in die Peroxisomen. 3.13 Mono- und Poly-Ubiquitinylierung der Punktmutanten Die oben beschriebenen Untersuchungen zeigten keinerlei Abweichungen der Expression, der Funktionalität und der Immunfluoreszenzanalysen der Punktmutanten vom Wildtypen. Deswegen sollte eine weitere Analyse zeigen, ob die Punktmutanten 56 noch ubiquitinyliert werden und somit durch das Ubiquitin-Proteasom-System erkannt und abgebaut werden. Abb. 3.19: Untersuchung von Ubiquitinylierungen der Pex5p-Mutanten Ölsäure induzierter Hefezellen aus Gesamtzelllysaten Gesammtzelllysate wurden aus Ölsäure induzierten Hefezellen gewonnen und nach Auftrennung mittels SDS-PAGE auf Nitrocellulose transferiert. Anschließend erfolgte der Nachweis mit spezifischen Antiseren. Porin diente zum Nachweis des Auftragens äquivalenter Probenmengen. Immunologischer Nachweis von (A) mono-Ub-Pex5p, (B) di-Ub-Pex5p und tri-Ub-Pex5p in allen Mutanten. Hierzu wurden die Punktmutanten jeweils in einen pex1∆/pex5∆-Stamm und in einen pex4∆/pex5∆-Stamm transferiert. Die Zellen wurden nach Anzucht in einem 0,3%igen Glukosemedium über 12 Stunden und anschließender Ölsäure induzierter 57 Peroxisomenproliferation mit Glasperlen mechanisch aufgeschlossen. Durch Zentrifugation wurden die partikulären von den löslichen Proteinen getrennt. Anschließend folgte eine immunologische Untersuchung der Membranenfraktion mittels spezifischer Antiseren. Wie in Abbildung 3.19 zu sehen, zeigte die Analyse im Wildtypen (Platta et al., 2004) und in der Negativkontrolle pex5∆ keine Ubiquitinylierung. Hingegen ließen sich im pex1∆/pex5∆-Stamm nach erfolgter Expression des Wildtyp-Pex5p sowohl die di- als auch die tri-Ubiquitinbande und im pex4∆/pex5∆-Stamm die mono- und die diUbiquitinbande bei allen Punktmutanten detektieren. Zur Kontrolle, dass äquivalente Mengen Protein auf das Gel aufgetragen wurden, diente auch hier wieder das Porin. Bei der Analyse der Substitutionsmutanten des Pex5p zeigten sich kaum Unterschiede zum Wildtypen. Zwar konnten quantitative Unterschiede in den Modifikationsbanden beobachtet werden, jedoch sind diese eher auf unterschiedliche Pex5p-Konzentrationen zurückzuführen. Modifikationen des Pex5p konnten für alle Mutantenproteinen dargestellt werden, so dass nicht ein bestimmtes Lysin für die Polyubiquitinylierung in betracht kommt. Entweder sind mehrere Lysine verantwortlich oder der Ausfall eines Restes wird durch das benachbarte Lysin kompensiert. Es ist kein bestimmtes einzelnes Lysin detektierbar, welches für die Polyubiquitinylierung von Pex5p verantwortlich ist. 3.14 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Einfluss der Punktmutation zweier benachbarter Aminosäuren auf den PTS1Importweg Nachdem die oben genannten Analysen gezeigt haben, dass nicht ein bestimmtes Lysin lokalisiert werden kann, an dem die Polyubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p stattfindet, sollte in weiteren Analysen untersucht werden, ob die Punktmutation zweier benachbarter Aminosäuren eine Auswirkung auf die Polyubiquitinylierung des Pex5p zeigt. Zum Ende dieser Arbeit konnte für das Pex5p aus H. polymorpha gezeigt werden, das Lysin 21 eine Rolle für die Modifikation spielt (Kiel et al., 2005). Da die Substitution dieser Aminosäure, es handelt sich im S. cerevisiae Protein um Lys24, 58 jedoch im Rahmen dieser Arbeit keine Auswirkung hatte, wurde wie unter 3.9 beschrieben eine weitere Punktmutation des Lysins 18 mittels überlappender Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR = polymerase chain reaction) eingefügt. Das jeweilige Lysin wurde durch ein Arginin ersetzt. Anschließend wurde das mutierte Protein wieder in Hefezellen transferiert (Abb. 3.14). Zur Analyse der Lokalisation von PTS1-Matrixproteinen wurde das GFP (green fluorescent protein) aus Aequorea victoria genutzt. Hierzu wurde ein mit einer PTS1Sequenz fusioniertes GFP in die Stämme transformiert. Die Zellen wurden nach Anzucht in Ölsäure zwei Tage auf Ölsäureagarplatten bei 30°C inkubiert und anschließend fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abb. 3.20: In vivo-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Auswirkungen nach Einbringen von Punktmutationen der Aminosäuren K18 und K24 in das Pex5p Unter Ölsäure induzierten Bedingungen wurden die Zellen angezüchtet und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In der Doppelmutante ist eine peroxisomale Lokalisation des PTS1Rezeptors Pex5p erkennbar. (Balken = 5µm) Die Zellen zeigten in der Normarski-Aufnahme eine normale Struktur. In den WildtypZellen und auch in dem Stamm mit den Punktmutationen ließ sich ein punktiertes Leuchten des GFP erkennen. Somit findet hier ein effizienter Import der Proteine über die peroxisomalen Membranen statt. Die Mutation zweier benachbarter Lysine mit dem 59 Austausch der Lysine durch Arginin hat keine Auswirkungen auf den peroxisomalen Proteinimport (Abb. 3.20). Auch die Doppelpunktmutation Pex5p [K18/24R] zeigt eine punktförmige und somit peroxisomale Verteilung des GFP. Ein gezielter Import in die Peroxisomen findet somit statt. 3.15 Polyubiquitinylierung der Doppelpunktmutante Die Immunfluoreszenzanalyse der Kombination von zwei Punktmutationen zeigte keinerlei Abweichungen vom Wildtypen. Um zu untersuchen, ob die Doppelpunktmutante dennoch ubiquitinyliert und durch das Ubiquitin-ProteasomSystem erkannt und abgebaut werden kann, erfolgte eine weitere Untersuchung. Wie bei den einzelnen Punktmutationen wurde hier die Doppelpunktmutante jeweils in einen pex1∆/pex5∆-Stamm und in einen pex4∆/pex5∆-Stamm transferiert. Nach Anzucht in einem 0,3%igen Glukosemedium über 12 Stunden und anschließender Ölsäure induzierter Peroxisomenproliferation wurden die Zellen schonend mit Glasperlen aufgeschlossen. Die Trennung der partikulären von den löslichen Proteinen erfolgte durch Zentrifugation. Anschließend wurden die Membranenfraktionen mittels spezifischer Antiseren immunologisch analysiert. Die Abbildung 3.21 zeigt, dass in der Negativkontrolle pex5∆ keine Ubiquitinylierung nachweisbar ist. Im pex1∆/pex5∆-Stamm ist analog zu den oben durchgeführten Untersuchungen sowohl die di- als auch die tri-Ubiquitinbande erkennbar. Ebenfalls zeigt sich eine mono- und eine di-Ubiquitinbande im pex4∆/pex5∆-Stamm. Hingegen ist weder im pex1∆/pex5∆-Stamm noch im pex4∆/pex5∆-Stamm eine Ubiquitinbande in der Doppelpunktmutante Pex5p [K18/24R] detektierbar. 60 Abb. 3.21: Untersuchung der Polybiquitinylierung der Pex5p-Doppelpunktmutante in Ölsäure induzierten Hefezellen aus Gesamtzelllysaten Nach Anzucht in Ölsäure induzierten Hefezellen wurden Gesammtzelllysate gewonnen und nach Auftrennung mittels SDS-PAGE auf Nitrocellulose transferiert. Der Nachweis erfolgte mit spezifischen Antiseren. Im Gegensatz zu dem Wildtypen findet in der Doppelpunktmutante Pex5p [K18/24R] kein immunologischer Nachweis von mono-Ub-Pex5p, di-Ub-Pex5p oder tri-Ub-Pex5p statt. Anhand dieser Analysen kann gezeigt werden, dass tatsächlich die Kombination der Punktmutation der Aminosäure Lysin an Position 18 und 24 essentiell für die Polyubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p ist. Somit erfolgt die Polyubiquitinylierung an den Lysinen 18 und 24. Die Kombination der Mutation der Lysin 18 und 24 des Pex5p zeigt keine Ubiquitinbanden. Somit sind diese Lysine die Zielaminosäuren der Polyubiquitinylierung. 61 4. Diskussion Pathogenetisch liegen bei peroxisomalen Stoffwechselerkrankungen entweder peroxisomale Einzelenzymdefekte oder peroxisomale Biogenesestörungen vor (Weller et al., 2003). Ein entscheidender Aspekt der Biogenese ist der Import von Proteinen in die peroxisomale Matrix. Hierbei handelt es sich um einen Rezeptor vermittelten Transport, der für den überwiegenden Anteil der peroxisomalen Matrixproteine durch den PTS1-Rezeptor Pex5p gewährleistet wird. Pex5p durchläuft einen Zyklus, an dessen Ende die Modifikation mittels Ubiquitin erfolgt (Thoms and Erdmann, 2006) (Platta et al., 2008). Das Ubiquitin dient als Signalsequenz zum Export des Rezeptors von der peroxisomalen Membran zurück in das Cytosol. Zu unterscheiden sind hierbei die Mono- und die Polyubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors. Während die monoubiquitinylierte Form recycled wird und so einem neuen Importzyklus zur Verfügung steht, dient die Polyubiquitinkette dem proteasomalen Abbau des fehlgefalteten oder in defekter Form vorliegenden Rezeptors (Platta et al., 2004) (Brown and Baker, 2008). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Ubiquitinylierung des PTS1-Rezeptors Pex5p in der Bäckerhefe S. cerevisiae untersucht. Ein Schwerpunkt lag in der Analyse von Pex5p-Teilfragmenten hinsichtlich ihrer peroxisomalen Lokalisation und ihrer Assoziation mit membrangebundenen Komponenten der peroxisomalen Translokationsmaschinerie. Des Weiteren wurden Lysine innerhalb des N-Terminus von Pex5p gegen Arginin substituiert. Analysen zum genaueren Verständnis und Suche nach möglichen Interaktionsstellen des Proteins Pex5p mit dem Ubiquitin, bzw. die Aufklärung der biologischen Zusammenhänge dieses Kontrollsystems, sind von Bedeutung im Hinblick auf eine spätere Therapie der peroxisomalen Stoffwechselerkrankungen. 4.1 Funktionelle Analyse von N- und C-terminalen Verkürzungen des PTS1-Rezeptors Vor dem Hintergrund, dass die Ubiquitinylierung der peroxisomalen Proteine an der Membran der Peroxisomen stattfindet (Kiel et al., 2005) (Platta et al., 2004) und somit 62 zunächst ein Erreichen des PTS1-Rezeptors Pex5p essentiell für die Ubiquitinylierung ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, welche Auswirkungen N- oder Cterminale Veränderungen des Pex5p auf diesen Vorgang haben. Das Pex5p besteht grundsätzlich aus der C-terminalen TPR-Domäne und einer N-terminalen Domäne. Während der C-Terminus der Bindung von PTS1-Proteinen dient (Klein et al., 2001), ist im N-Terminus die Bindungsstelle für die non-PTS-Proteine lokalisiert, dessen bislang einziger bekannter Vertreter in S. cerevisiae die Acyl-CoA-Oxidase ist (Klein et al., 2002). Des Weiteren sind im Pex5p-N-Terminus Interaktionsbereiche für die beiden docking-Proteine Pex13p und Pex14p lokalisiert (Azevedo and Schliebs, 2006) (Williams et al., 2005). Die in dieser Arbeit analysierten Konstrukte unterscheiden sich im Vorhandensein oder Fehlen definierter Bereiche des Proteins (Abb. 3.3). Analysen dieser Pex5p-Fragmente zeigen, dass die Konzentration dieser vergleichbar mit der des gesamten Pex5p ist (Abb. 3.4). Eine erhöhte oder erniedrigte Expression der plasmidkodierten Proteine ist daher ebenso unwahrscheinlich wie die dem Pex5p gegenüber veränderte Proteolyse. Trotz der beobachteten Expression der Teilfragmente waren diese nicht in der Lage, die Funktion des Pex5p auszuführen. Sowohl das Wachstum auf Ölsäure (Abb. 3.5) als alleinige Kohlenstoffquelle als auch der Import von Markerproteinen fusioniert mit einer PTS1-Sequenz (Abb. 3.7) konnte in den entsprechenden Transformanten nicht beobachtet werden. Es ist zu diskutieren, aus welchem Grund ein Funktionsverlust der veränderten Proteine erfolgt. Zunächst könnte jede Verkürzung des Proteins, auch nur um einige Aminosäuren, dazu führen, dass eine Entfaltung des Proteins nicht mehr möglich ist und dadurch eine Fehlfunktion resultiert. Eine zweite Möglichkeit wäre, dass durch das Fehlen essentieller Bereiche des Proteins eine Bindung der Interaktionspartner nicht mehr möglich ist. Hier sei besonders das Fehlen der bereits erwähnten N-terminalen Regionen wie der Acyl-CoA-Oxidase- und die Pex13p/Pex14p-Bindungsdomänen oder der C-terminalen TPR-Domänen für die Bindung der PTS1-Cargo-Proteine erwähnt. Während in zwei der gewählten Pex5pFragmente (Pex5p [1-245], Pex5p [1-313]) offensichtlich mindestens eine dieser Interaktionstelle deletiert wurde, liegt bei den Verkürzungen der extremen Termini (Pex5p [1-574], Pex5p [17-612]) lediglich eine Deletion von nur wenigen Aminosäuren vor, wohingegen alle bekannten Bindebereiche weiterhin vorhanden sind. 63 4.2 Subzelluläre Lokalisation der Pex5p-Fragmente Eine mögliche Ursache für den beobachteten Funktionsverlust der Pex5p-Fragente wäre das Fehlen von Interaktionen mit den Proteinen der peroxisomalen Importmaschinerie (Pex13p, Pex14p). In diesem Fall würde das Anbinden des PTS1-Rezeptors unterbunden werden und so ursächlich für den beobachteten Defekt sein. Um diesen Sachverhalt zu klären wurden im Rahmen dieser Arbeit subzelluläre Fraktionierungen durchgeführt. Durch differentielle Zentrifugation wurden Zellhomogenate zum einen in lösliche Überstande und zum anderen in ein partikuläres Sediment getrennt, welches die peroxisomalen Membranen enthält. Die Untersuchungen im Hinblick auf die Assoziation der unterschiedlichen Pex5p-Konstrukte zu der peroxisomalen Membran zeigen, dass bis auf das Konstrukt Pex5p [1-245], welches das kleinste in den Analysen verwendete Protein darstellte und bei dem sowohl der Bindebereich der Acyl-CoAOxidase als auch die für die PTS1-Cargo-Anbindung wichtigen C-terminalen TPRDomänen des Proteins fehlten, alle anderen eine partikulär, vermutlich mit der peroxisomalen Membran assoziiert vorliegen. Diese Ergebnisse warfen zwei Fragen auf. Zum einen können diese Ergebnisse zu der Annahme führen, dass der Bereich oder ein Teilbereich der Aminosäuren 245-313 essentiell für das Erreichen der peroxisomalen Membran ist. Es stellt sich die Frage, ob dieser Bereich des Proteins vielleicht sogar die Interaktion mit dem ,docking’-Komplex, also den Peroxinen Pex13p, Pex14p und Pex17p über das Pex8p eingeht. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt ist jedoch durch Arbeiten von Gouveia et al gegeben (Gouveia et al., 2002) (Gouveia et al., 2003). Diese zeigten, dass die Anbindung des PTS1-Rezeptors Pex5p an die peroxisomale Membran nur möglich ist, wenn das Protein mit Cargo beladen ist (Gouveia et al., 2002). Die Deletion der TPR-Domäne führt zwar zur Unterbindung der Pex5p/PTS1 Interaktion, erlaubt aber immer noch die Anbindung des non-PTS1 Proteins, der Acyl-CoA-Oxidase (Klein et al., 2002) (Schäfer et al., 2004). Im Einklang mit diesen Daten sollte nun Pex5p [1-245] beide Formen von CargoProteinen nicht mehr binden können. Die zunächst zu vermutende Konsequenz, eine fehlende peroxisomale Lokalisation, wurde experimentell im Rahmen dieser Arbeit belegt. Da alle bisher publizierten Daten zur möglichen Cargo-Abhängigkeit der Pex5p Anbindung auf semi in vitro Experimente beruhen, stellen die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Resultate die ersten in vivo Hinweise auf diesen Mechanismus dar. 64 Weiterhin konnte die Untersuchung zeigen, dass das Konstrukt Pex5p [17-612], bei dem die ersten N-terminalen 16 Aminosäuren fehlten, die peroxisomale Membran erreichen konnte. Dieser Bereich scheint also nicht von Bedeutung für die Assoziation an die Membran zu sein. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen von CostaRodrigues. Hier wurde gezeigt, dass der N-Terminus des Pex5p lediglich essentiell für den Export und somit das Recycling des PTS1-Rezeptors ist, ein Fehlen jedoch auch zu einem suffizienten Import führt (Costa-Rodrigues et al., 2004). Interessanterweise konnte auch das Pex5p [1-574] trotz der fehlenden Funktionalität im Membransediment lokalisiert werden. Da weitere Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es sich hierbei nicht um ein unlösliches Proteinaggregat handelt, sondern dieses Protein vielmehr mit seinen Interaktionspartnern assoziiert vorliegt (Abb. 3.11), ist anzunehmen, dass der Defekt in späteren Schritten des Importzyklus zu suchen ist. 4.3 Interaktion von Pex5p-Verkürzungen mit verschiedenen Peroxinen Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit zeigten, dass der überwiegende Anteil der analysierten Pex5p-Fragemente in Sedimentfraktionen lokalisiert ist. Es stellte sich die Frage, inwieweit diese Lokalisation auch mit der Assoziation von Pex5p mit Komponenten der peroxisomalen Importmaschinerie einhergeht, da auch die Möglichkeit besteht, dass es sich bei dem immunologisch nachgewiesenen Pex5p um Proteinaggregate handeln könnte. Um über diesen Sachverhalt genaueren Aufschluss zu bekommen, wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Isolierung von membrangebundenen Proteinkomplexen durchgeführt. Hierbei wurde zur Identifikation von eventuellen Interaktionspartnern des Pex5p die Tatsache genutzt, dass die Fusion des Pex1p mit dem TEV-ProtA keine Auswirkung auf seine Funktion hat (Abb. 3.5) (Rosenkranz et al., 2006). Die Isolierung der membranassoziierten Proteinkomplexe geschah affinitätschromatographisch mit IgG-Sepharose. Diese Methode wurde bereits zahlreich zur Darstellung peroxisomaler Proteinkomplexe genutzt (Agne et al., 2003) (Rosenkranz et al., 2006) (Albertini et al., 2001). Die Analyse der Eluatfraktionen wurde immunologisch durchgeführt. Im Einklang mit Daten von Rosenkranz et al. 65 konnte Pex1p assoziiert mit dem zweiten peroxisomalen AAA Protein Pex6p und Pex15p koisoliert werden (Rosenkranz et al., 2006). Letzteres fungiert als Bindungsprotein von Pex1p und Pex6p mit der Membran und stellt ein integrales Membranprotein dar (Elgersma et al., 1997) (Birschmann et al., 2003) (Birschmann et al., 2005). Assoziiert lag dieser auch als AAA-Komplex bezeichnete peroxisomale Subkomplex (Rosenkranz et al., 2006) mit Komponenten des ,docking’-Komplexes, Pex13p und Pex14p, vor. Da beide Komplexe in der Lage sind mit Pex5p zu interagieren, konnte der PTS1-Rezeptor in den entsprechenden Eluatfraktionen detektiert werden (Abb. 3.11). Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten belegen, dass auch die Pex5pVerkürzungen Pex5p [1-313], Pex5p [1-574] und Pex5p [17-612] nicht nur zumindest partiell partikulär lokalisiert sind, sondern auch eindeutig mit der peroxisomalen Importmaschinerie assoziiert vorliegen (Abb. 3.8). Mit der Ausnahme des Pex5p [1245], welches ausschließlich löslich vorliegt, konnten alle Fragmente funktionell an die peroxisomale ,docking’-Maschinerie anbinden. Aus diesen Daten ist daher auszuschließen, dass die Verkürzung von Pex5p zu keiner deutlich strukturellen Veränderung führte, mit der Konsequenz unlöslicher Proteinaggregate. 4.4 Polyubiquitinylierung von Pex5p Im Rahmen des Rezeptorzyklusses wird der PTS1-Rezeptor in den späten Schritten an der peroxisomalen Membran ubiquitinyliert (Brown and Baker, 2008) (Platta et al., 2008). Die Monoubiquitinylierung dient dem Recycling, wohingegen die Polyubiquitinylierung dem proteasomalen Abbau falsch gefalteter Proteine dient und somit Bestandteil eines „quality control“-Systems ist. Die Ergebnisse der vorhergehenden Versuche zeigten, dass Pex5p [1-313] das kleinste Konstrukt darstellt, welches noch die peroxisomale Membran erreicht. Diese Daten ließen die Frage aufkommen, inwieweit dieses Fragment auch den späten peroxisomalen Schritten der Ubiquitinylierung zugeführt wird. In verschiedenen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass Pex4p, auch bekannt als Ubc10p, ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym darstellt (Platta et al., 2007) (Williams et al., 2007). Das Fehlen von Pex4p oder Pex22p, welches ein integrales Membranprotein 66 und den Interaktionspartner des Pex4p darstellt, führt zu einer verstärkten Polyubiquitinylierung oder der Akkumulation dieser Pex5p-Spezies. Diese Modifikation wird von den beiden Ubiquitin konjugierenden Enzymen Ubc4p und Ubc5p ermöglicht und erfolgt nur an der peroxisomalen Membran nach dem ,docking’ des Rezeptors (Kiel et al., 2005) (Platta et al., 2004). Im Einklang mit diesen Ergebnissen kann man aus den Analysen dieser Arbeit die Erkenntnis gewinnen, dass ein Erreichen der Membran im Hinblick auf eine Ubiquitinylierung von essentieller Bedeutung ist. Die vergleichenden Untersuchungen der beiden Konstrukte Pex5p [1245] und Pex5p [1-313] konnten diese Vermutung eindeutig belegen, da das Nichterreichen der peroxisomalen Membran des Pex5p [1-245] eine fehlende Polyubiquitinylierung zur Folge hatte (Abb. 3.12). Hingegen war eine Detektierung der Polyubiquitinylierung des Pex5p [1-313] eindeutig erkennbar. Dieses stellte das kleinste Konstrukt dar, welches noch in der Lage war, eine Interaktion mit der peroxisomalen Membran einzugehen. Zudem wurde nach erfolgtem ,docking’ Pex5p [1-313] der Ubiquitinylierungsmaschinerie zugeführt. Dies bedeutet, dass Pex5p [1-313] den ,docking’-Komplex sowie Pex8p passiert haben muss, da die Ubiquitinylierung an oder nach dem RING-Finger Komplex erfolgt. Daher müssen alle für diesen Prozess notwendigen Interaktionsstellen in diesem Fragment vorliegen. 4.5 Gerichtete Mutagenese zur Identifizierung der Zielaminosäure der Ubiquitinylierung von Pex5p Nachdem sich in dieser Arbeit gezeigt hatte, dass sich bei dem Konstrukt Pex5p [1-313] noch eine Polyubiquitinylierung detektieren ließ, sollte der Frage nachgegangen werden, ob man nun die spezifische Aminosäure für die Modifikation mit Ubiquitin identifizieren konnte. Vor dem Hintergrund des Wissens, dass Ubiquitin über sein Glycin 76 Interaktionen mit Lysinen des Substrates eingeht, wurde hier ein besonderes Augenmerk auf die Lysine des Pex5p [1-313] gelegt, da dieses Fragment noch ubiquitinyliert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch gerichtete Mutagenese alle 15 Lysine der N-terminalen Hälfte von Pex5p durch die Aminosäure Arginin substituiert (Abb. 3.13-3.15). Die durchgeführten Funktionsanalysen zeigen, dass keines dieser Pex5p-Mutantenproteine hinsichtlich der Funktionalität beeinträchtigt 67 ist (Abb. 3.17-3.18). Strukturelle Veränderungen durch die Aminosäuresubstitution können daher, wenn überhaupt, nur als geringfügig und ohne Bedeutung für die Pex5pFunktion erachtet werden. Vorangegangene Untersuchungen zeigten, dass die Deletion der für die Polyubiquitinylierung verantwortlichen UBC`s UBC4/UBC5 zu einem nur geringen peroxisomalen Importdefekt für PTS1-Proteine führt (Platta et al., 2004). Im Hinblick auf diese Daten war nicht zu erwarten, dass die Substitution zu einem Funktionsverlust des Pex5p führt, selbst wenn die Zielaminosäure für die Ubiquitinylierung identifiziert wurde. 4.6 Ubiquitinylierungen der Punktmutanten Die Analysen der Ubiquitinylierung der verschiedenen Mutanten ließen zu dem Schluss kommen, dass der Austausch eines Lysins durch ein Arginin keine Auswirkungen in Bezug auf die Ubiquitinylierung hat. In allen Mutanten konnten beide Formen der Ubiquitinylierung nachgewiesen werden, so dass diese Schlussfolgerung nahe liegt (Abb. 3.19 A/B). Dies führte zu Überlegungen, welche weiteren Möglichkeiten es geben könnte, da anscheinend nicht nur ein einziges Lysin Ort der Polyubiquitinylierung sein kann. Es bestehen mehrere Möglichkeiten, die in Frage kommen könnten. Zunächst könnte die Möglichkeit bestehen, dass für die Ubiquitinylierung parallel mehrere Lysine erforderlich sind, an denen die Konjugation stattfinden kann. In manchen Fällen übernimmt auch das der Zielaminosäure benachbarte Lysin die Funktion. In beiden Fällen müssten zwei Lysine gleichzeitig substituiert werden, um eine Polyubiquitinylierung zu unterbinden. Eine andere Möglichkeit könnte auch noch bestehen. Zwar konjugiert das Ubiquitin in der Mehrheit der Fälle an die ε–NH2-Gruppe interner Lysin-Reste, aber auch die Modifikation der α–NH2-Gruppe der N-terminalen Aminosäure von Zielproteinen (Ciechanover and Ben-Saadon, 2004) sowie die Konjugation an Serin, Threonin (Wang et al., 2007) und eine Interaktion mit SH-Gruppen von Cystein sind in der Literatur beschrieben (Cadwell and Coscoy, 2005). 68 4.7 Untersuchung der Polyubiquitinylierung der Doppelpunkt- mutante Pex5p [K18/24R] Basierend auf den oben genannten Ergebnissen und Daten anderer Arbeiten, bei denen gezeigt werden konnte, dass sowohl in Hansenula polymorpha für Pex5p (Kiel et al., 2005) als auch in Pichia pastoris für Pex20p (Leon and Subramani, 2007) das jeweils erste konservierte Lysin die Zielaminosäure der Polyubiquitinylierung darstellt, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine ähnliche Versuchsreihe vorgenommen. Da bei verschiedenen anderen Proteinen der Ausfall durch eine Mutation von benachbarten Aminosäuren kompensiert werden kann (Baldi et al., 1996), liegt die Vermutung nahe, dass auch in diesem Fall das benachbarte Lysin eine entscheidende Rolle übernimmt. Hierzu wurde zusätzlich zu der Mutation des Lysins 18 das Lysin 24 durch ein Arginin ausgetauscht. Dabei stellte sich heraus, dass im Gegensatz zu einer Mutation eines einzelnen Lysins, wie sie unter anderem in dieser Arbeit untersucht wurde und bei der eine Polyubiquitinylierung weiterhin nachzuweisen war, bei einer Mutation der ersten beiden N-terminalen Lysine die Polyubiquitinylierung nicht mehr stattfand. Die funktionelle Analyse der Doppelpunktmutante ergab, dass diese noch GFP-PTS1-Cargo importieren kann (Abb. 3.20), was den Rückschluss zulässt, dass die Polyubiquitinylierung unter Wildtyp-Bedingungen nicht essentiell für die peroxisomale Biogenese ist. Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, dass die Polyubiquitinylierung von Pex5p einen ‚qualitiy control’-Mechanismus darstellt. Weitere Untersuchungen dieser und anderer Arbeitsgruppen weisen darauf hin, dass es neben der oben beschriebenen Form der Ubc4p-abhängigen Polyubiquitinylierung an den beiden N-terminalen Lysinen eine weitere, Pex4p-abhängige, Mono- ubiquitinylierung existiert (Kragt et al., 2005) (Platta et al., 2007) (Carvalho et al., 2007). In diesem Fall wurde ein konserviertes Cystein, welches ebenfalls N-terminal lokalisiert ist, als essentiell für diesen Prozess identifiziert (Williams et al., 2007) (Carvalho et al., 2007). Die Pex4p-abhängige Monoubiquitinylierung des Cysteins ist essentiell für den Export von Pex5p und somit auch für die Biogenese als ganzes (Platta et al., 2007) (Williams et al., 2007) (Carvalho et al., 2007) (Grou et al., 2008). Ähnlich wie Pex5p verhält sich nach neuen Daten auch Pex20p, der PTS2-Co-Rezeptor aus P. pastoris (Leon and Subramani, 2007). Pex20p wird poly- und monoubiquitinyliert. Wird durch gerichtete Mutagenese eine dieser beiden Modifikationen unterbunden, so ist der 69 peroxisomale Import von PTS2-Proteinen weiterhin funktionell. Erst die gleichzeitige Unterbindung beider Modifikationen resultiert in einem funktionslosen Co-Rezeptor. In Ergänzung zu den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten und im Einklang zu (Leon and Subramani, 2007) konnte in dieser Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass Pex5p(K18/24R) in einem Wildtyp-Hintergrund normal exportiert wird. Wird aber gleichzeitig das PEX4-Gen deletiert, wird auch der Export des Rezeptors von der peroxisomalen Membran hin zum Cytosol unterbunden (Platta et al., 2007). Die Autoren haben daraus geschlossen, das sowohl das Mono- als auch das Polyubiquitin als Exportsignal des PTS1-Rezeptors fungieren kann. 70 5. Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte eine nähere Charakterisierung des Peroxins Pex5p aus der Hefe S. cerevisiae, das als Cargo-Protein und PTS1-Rezeptor eine essentielle Funktion im Rahmen des Imports und Exports anderer peroxisomaler Proteine besitzt. Weiter erfolgte in diesem Zusammenhang eine Analyse der Interaktion des Pex5p mit dem Ubiquitin, welches ein wichtiges Kontrollsystem der Funktion des PTS1-Rezeptors darstellt. Bei der Analyse verschiedener Pex5p-Verkürzungskonstrukte konnte keine Funktionalität der Proteine nachgewiesen werden. Weder konnte die pex5∆Mutante durch Expression dieser Stämme die Fähigkeit zum Wachstum auf Ölsäure als alleinige Kohlenstoffquelle wiedererlangen, noch konnte in der Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass ein effizienter Import des GFP in die Peroxisomen erfolgte. In der Analyse zur Membransedimentation wurde das Konstrukt Pex5p [1-313] als kleinstes, noch die peroxisomale Membran erreichende Protein identifiziert. Da die Ubiquitinylierung des Pex5p an der peroxisomalen Membran stattfindet, ist eine Interaktion des jeweiligen Proteins mit der Membran essentiell. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pex5p [1-313] das kleinste noch ubiquitinylierte Fragment darstellt. Durch Isolierung von Pex1p-TEV-ProteinA mittels IgG-Sepharose- Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass Pex1p mit den Peroxinen Pex5p, Pex6p, Pex13p, Pex14p, Pex15p in Proteinkomplexen assoziiert vorliegt. Nach Einbringen von Punktmutationen in das Pex5p mit dem Austausch von einzelnen Lysinen gegen Arginin zeigten alle Mutanten eine normale Funktionalität und in der Immunfluoreszenzmikroskopie keine Beeinflussung des PTS1-Importweges. 71 Untersuchungen der Mono- und Polyubiquitinylierung zeigen, dass nicht ein bestimmtes Lysin für die Polyubiquitinylierung verantwortlich ist, bzw. ein bestimmtes Lysin lokalisiert werden kann, an dem eben diese Form der Ubiquitinylierung erfolgt. Die Kombination der Mutation der Lysine 18 und 24 zeigt keine Polyubiquitinylierung. Daher stellen diese Aminosäuren die Ziele der Ubiquitinylierung dar. 72 6. Literaturverzeichnis Agne, B., Meindl, N.M., Niederhoff, K., Einwächter, H., Rehling, P., Sickmann, A., Meyer, H.E., Girzalsky, W., Kunau, W.H. (2003). Pex8p. An intraperoxisomal organizer of the peroxisomal import machinery. Mol. Cell 11 (3), 635-646 Albertini, M., Rehling, P., Erdmann, R., Girzalsky, W., Kiel, J.A., Veenhuis, M., Kunau, W.H. (1997). Pex14p, a peroxisomal membrane protein binding both receptors of the two PTS-dependent import pathways. Cell 89 (1), 83-92 Albertini, M., Girzalsky, W., Veenhuis, M., Kunau, W.H. (2001). Pex12p of Saccharomyces cerevisiae is a component of a multi-protein complex essential for peroxisomal matrix protein import. Eur. J. Cell. Biol. 80 (4), 257-270 Azevedo, J. E. and Schliebs, W. (2006). Pex14p, more than just a docking protein. 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Des Weiteren danke ich ihm und meinen Betreuern Dr. Silke Grunau und Dr. Wolfgang Girzalsky für die wertvollen Hinweise und Anregungen sowie die mir entgegengebrachte Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Ein besonderer Dank gilt meiner Familie, welche mich zu jeder Zeit in hervorragender Weise unterstützt hat. Lebenslauf zur Person Name: Denter Vorname: Christoph Geburtsdatum: 23.06.1982 Geburtsort: Castrop-Rauxel Religion: römisch-katholisch Schulbildung 1988-1992 Grundschule an der Wilhelmstraße Castrop-Rauxel 1992-2001 Ernst-Barlach-Gymnasium Castrop-Rauxel 2001 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife Zivildienst 2001-2002 Zivildienst auf der Intensivstation des St.Rochus-Hospitals Castrop-Rauxel Studium 2002-2008 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 2004 Ärztliche Vorprüfung 2007-2008 Praktisches Jahr im Knappschaftskrankenhaus Recklinghausen 2008 Ärztliche Prüfung 2008 Erlangung der Approbation Beruflicher Werdegang seit 2009 Assistenzarzt in der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Knappschaftskrankenhaus Recklinghausen, Akademisches Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum Chefarzt: Prof. Dr. Hans-Georg Bone
