High-throughput analysis of invasion strategies - ETH E

DISS. ETH No. 19699
High-throughput analysis of invasion strategies of
Salmonella Typhimurium in non-phagocytic cells
A dissertation submitted to the
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Sabrina Dilling
Dipl. Biologist, Johann Wolfgang Goethe-University of Frankfurt/Main
Born on September 7th, 1981 in Lutherstadt Wittenberg
Citizen of Germany
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt (examiner)
Prof. Dr. Annette Oxenius (co-examiner)
Prof. Dr. Christoph Dehio (co-examiner)
Zurich 2011
Preface
Thesis summary
Salmonella Typhimurium (S. Tm) is an enteroinvasive pathogen that has developed
unique strategies to invade eukaryotic cells. Two type III secretion systems (TTSS) encoded
on Salmonella pathogenicity islands (SPI) 1 and 2 are of key importance for the virulence and
pathogenicity of the pathogen. They act as molecular syringes that deliver bacterial virulence
factors (effector proteins) directly into the host cell cytosol. Inside their target cell, these
effectors act in concert to manipulate host cell functions in order to successfully establish
and maintain the infection.
Previous studies demonstrated that TTSS-1 effector proteins trigger cytoskeletal
rearrangements leading to membrane ruffling, bacterial engulfment and internalization of
the pathogen, a process known as a classical trigger mechanism. Essential effector proteins
required for the uptake are SipA, SopB, SopE and SopE2. These virulence factors stimulate
actin polymerization either via direct actin interaction or indirectly by interfering with Rho
GTPases or other signaling molecules. Some intracellular targets of S. Tm TTSS-1 effectors
have been identified; however, the complexity of the host cell mechanisms leading to
Salmonella Typhimurium internalization is still not completely understood.
In my thesis, I focused on the individual and combined impact of the main effectors
facilitating invasion and investigated the host cell factors which are essential for the uptake
of S. Tm into mammalian epithelial cells.
In order to study host cell targets we first developed an automated 'modified gentamycin
protection assay' that can be easily used to measure the infection rate of S. Tm strains into
HeLa cells in a high-throughput format. The bacteria were engineered to express GFP only
after invasion. HeLa cells and internalized GFP-expressing bacteria were detected via
automated microscopy and the infection efficiency was determined using the image analysis
software CellProfiler. Using this invasion assay, we found that S. Tm effector triple mutants
that either express SipA, SopB, SopE or SopE2 (but not the three other effectors) were
individually able to invade HeLa cells. The intensity of the invasion was dependent on the
specific effector proteins. SopE was most efficient to promote invasion. Moreover, SopB,
SopE and SopE2 triggered pronounced membrane ruffles and thereby facilitated invasion by
other bacteria ('helper function'). In contrast, SipA functioned as a 'selfish' effector protein
facilitating the invasion of the SipA-expressing bacteria but not of other bacteria. These
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Preface
observations suggested that SipA facilitates invasion in a fundamentally different way than
SopB, SopE and SopE2. Both invasion strategies were investigated in this thesis.
Furthermore, we analyzed the host cell proteins that are involved in the SopE-dependent
uptake of Salmonella Typhimurium. For this purpose, we performed a high-throughput
siRNA screen and analyzed 7000 genes from the human druggable genome for their
involvement in SopE-dependent invasion. We identified several novel host genes including
Profilin 1, Cap 1 and the COPI complex as well as known factors like the Arp2/3 complex,
verifying the validity of our approach. Further work by my collaboration partners was able to
assign 72 host genes to particular steps of invasion process including bacterial docking,
effector injection, membrane ruffling, membrane closure and the maturation of the
Salmonella-containing vacuole. Finally, this lead to the detailed analysis of the COPI complex.
This complex was identified in previous RNAi screens suggesting a general role in bacterial
and viral infection. The depletion of components of the COPI complex strongly inhibited S.
Tm invasion. This was attributable at least in part to a novel function of the COPI complex in
maintaining Rho GTPases and lipids in plasma membranes by trafficking cholesterol and
sphingolipids to the host cell membrane.
On the other hand, I used the RNAi screening platform to study SipA-dependent host cell
invasion. We identified a new mode for SipA-dependent invasion, which occurred in the
absence of membrane ruffles. Instead, S. Tm triple effector mutants expressing SipA (but not
SopB, SopE and SopE2) invaded in the presence of thick entangling filopodia or were just
sinking into the cells without any cellular protrusions. RNAi screening revealed the
involvement of Rho GTPases, in particular Cdc42, RhoG and RhoF, but the physiological
functions remain uncertain. We assume that Cdc42 and RhoF are required for either Arp2/3
complex-dependent
or -independent
actin polymerization during
SipA-dependent
internalization. In order to identify further host targets we performed a genome wide RNAi
screen testing 20000 genes for their impact on SipA-dependent invasion. The strongest
invasion inhibitory hits upon depletion were again the Rho GTPases and components of the
Arp2/3 complex. Furthermore, additional host cellular signaling proteins not previously
implicated in Salmonella host cell invasion were identified. Their validation and functional
role is currently under investigation.
In conclusion, this work demonstrates that S. Tm interrogates different strategies to
achieve entry into epithelial cells, a first key step in the development of the disease.
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Preface
Zusammenfassung
Salmonella Typhimurium (S. Tm) ist ein invasiver Darmkrankheitserreger, der einzigartige
Strategien entwickelt hat um eukaryotische Zellen zu invadieren. Zwei Typ-3Sekretionssysteme (TTSS), die auf den Salmonella Pathogenitätsinseln (SPI) 1 und 2 kodiert
sind, besitzen eine zentrale Bedeutung für die Virulenz und Pathogenität des Erregers. Sie
fungieren
als
molekulare
Injektionsspritzen,
welche
bakterielle
Virulenzfaktoren
(Effektorproteine) direkt in das Zytosol der Wirtzellen transferieren. Ein perfektes
Zusammenspiel der Effektorproteine ermöglicht die Manipulation von Wirtszellprozessen,
die dem Bakterium erfolgreich die Aufnahme erleichtern und zur Etablierung der Infektion
beitragen.
Frühere Studien zeigten, dass Effektorproteine des TTSS-1 Veränderungen
des
Aktinzytoskeletts hervorrufen, die zu Membranausstülpungen, bakterieller Phagozytose und
Internalisierung des Erregers führen. Dieser Prozess ist bekannt als klassischer 'Trigger'Mechanismus. Essentielle Effektorproteine für die Invasion sind SipA, SopB, SopE und SopE2.
Diese Virulenzfaktoren stimulieren die Polymerisation von Aktin entweder über die direkte
Interaktion mit Aktin oder indirekt durch die Wechselwirkung mit Rho GTPases oder anderen
Signalmolekülen. Einige intrazelluläre Wirtsfaktoren, auf die TTSS-1-Effektoren von
Salmonellen zielen, sind bereits identifiziert worden. Jedoch ist die Komplexität der
Wirtzellmechanismen, die zur Aufnahme von Salmonellen führen, noch weitgehend
unverstanden.
In meiner Doktorarbeit habe ich mich auf die individuelle und kombinierte Wirkung der
wichtigsten Effektorproteine, die die Invasion ermöglichen, konzentriert und analysierte
Wirtszellfaktoren die benötigt werden für die Aufnahme von Salmonella Typhimurium in
menschliche Epithelzellen.
Um Wirtszellfaktoren zu identifizieren, haben wir zunächst einen automatisierten
Invasionsassay etabliert, der einfach eingesetzt werden kann, um die Infektion von S. Tm
Stämmen in HeLa Zellen mit hohem Durchsatz zu messen. Die Bakterien wurden so
verändert, dass sie ausschliesslich nach der Invasion GFP exprimieren. HeLa Zellen und
invadierte GFP-leuchtende Bakterien wurden mit automatischer Mikroskopie detektriert und
die Invasionseffizienz wurde mittels der Bildanalyse-Software CellProfiler gemessen. Mit
diesem Invasionsassay haben wir festgestellt, dass S. Tm Dreifach-Effektor-Mutanten, die
entweder nur SipA, SopB, SopE oder SopE2 (jedoch nicht die drei anderen) besitzen,
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Preface
selbstständig HeLa Zellen invadieren konnten. Die Intensität der Aufnahme war abhängig
von den spezifischen Effektorproteinen. SopE konnte am effizientesten die Invasion
vermitteln. Ausserdem führten SopB, SopE und SopE2 zur Bildung von ausgeprägten
Membranausstülpungen, die auch anderen Bakterien zur Invasion verholfen haben ('HelferFunktion'). Im Gegensatz dazu agierte SipA 'selbstsüchtig', indem nur die Invasion von SipAexprimierenden Bakterien, nicht aber die der anderen Bakterien, gefördert wurde. Diese
Beobachtungen legten nahe, dass SipA die Invasion in einer grundlegend anderen Weise als
SopB, SopE und SopE2 ermöglicht. Beide Invasionsstrategien wurden in dieser Arbeit
untersucht.
Darüber hinaus analysierten wir Wirtszellproteine, die bei der SopE-abhängigen Invasion
von Salmonella Typhimurium beteiligt sind. Zu diesem Zweck führten wir einen siRNA Screen
durch und testeten 7000 Gene des menschlichen Genoms auf ihre Notwendigkeit für die
SopE-abhängige Invasion. Wir identifizierten sowohl neue Wirtsgene, die Profilin 1, Cap 1
und den COPI-Komplex einschliessen, also auch bekannte Faktoren wie den Arp2/3 Komplex,
die die Funktionalität unseres Invasionsassays bestätigten. Durch weitere Studien meiner
Kooperationspartner konnten 72 Wirtsgene speziellen Invasionsprozessen einschliesslich
bakterieller Bindung, Effektortranslokation, Ausbildung von Membranausstülpungen,
Membranverschluss und die Reifung der Salmonellenphagosomen zugeordnet werden. Dies
führte schliesslich zu einer detaillierten Analyse des COPI-Komplexes. Der COPI-Komplex
wurde schon in früheren RNAi Screens identifiziert wodurch er eine zentrale Rolle sowohl bei
bakteriellen als auch bei viralen Infektionen einzunehmen scheint. Das Ausschalten
verschiedener Komponenten des COPI-Komplexes führte zu einer starken Inhibierung der S.
Tm Aufnahme, die nun durch eine neue Funktion des COPI-Komplexes bei der Positionierung
von Rho GTPasen und Lipiden in die Plasmamembran, durch den Transport von Cholesterol
und Sphingolipiden zur Wirtszellmembran, erklärt werden kann.
Auf der anderen Seite, habe ich die RNAi-Screening Plattform genutzt, um die SipAabhängige Invasion zu analysieren. Wir haben festgestellt, dass die SipA-abhängige Invasion
ohne die Ausbildung von Membranausstülpungen erfolgt. Stattdessen invadierte die S. Tm
Dreifach-Effektor-Mutante, die nur SipA (aber nicht SopB, SopE oder SopE2) exprimiert, in
Gegenwart von verdickten Filopodien erfolgte oder die Bakterien sanken in die Zellen ein
ohne jegliche Beteiligung zellulärer Ausstülpungen. Invasionstudien in Gegenwart von
siRNAs verdeutlichten eine Beteiligung von Rho GTPasen, insbesondere Cdc42, RhoG und
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RhoF, deren physiologische Funktionen bisher ungewiss sind. Wir gehen davon aus, dass
Cdc42 und RhoF sowohl bei der Arp2/3-abhängigen als auch bei der -unabhängigen
Aktinpolymerisation während der SipA-vermittelten Internalisierung erforderlich sind. Um
weitere Wirtsfaktoren zu identifizieren, führten wir einen genomweiten RNAi Screen durch,
wobei wir 20000 Gene auf ihre Auswirkung auf die SipA-abhängige Invasion testeten. Als
stärkste Inhibitoren der Invasion ermittelten wir wieder Rho GTPasen und Komponenten des
Arp2/3 Komplexes. Darüber hinaus wurden zusätzliche Signalproteine der Wirtszellen
identifiziert, die bisher nicht mit der Salmonelleninvasion in Verbindung gebracht wurden.
Deren Validierung und funktionelle Rolle werden derzeit untersucht.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Salmonella Typhimurium unterschiedliche
Strategien entwickelt hat, die den Zugang zu Epithelzellen ermöglichen, einen ersten
wichtigen Schritt bei Entwicklung der Erkrankung.
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