Harnstoff

Wolfgang Heinemann
Matthias Wuttke
Michael Gehrmann
Mittwoch, 09.01.03
Gruppe 6
Biochemisches Praktikum
Kurstag: Harnbestandteile und
Harnstoffbiosynthese
Einleitung
„Ein göttlicher Saft“, so wird der Harn oft in der Naturheilkunde bezeichnet, vor allem
wenn von der Heilwirkung des „goldenen Saftes“ in der Eigenharnbehandlung
gesprochen wird. Aber nicht nur in der Naturheilkunde, auch in der Schulmedizin
werden seit langem der Harn und seine Bestandteile zu diagnostischen Zwecken
untersucht.
Mit Einführung der Biochemie in die Medizin wurden natürlich auch die
wissenschaftlichen Grundlagen erforscht, so z.B. die Harnstoffbiosynthese, deren
Enzyme und Substrate.
Der Harn wird in der Niere gebildet, wobei aus täglich 180 Liter Primärharn
(Ultrafiltrat) durch Rückresorption in dem proximalen und distalen Tubulus und der
Henle-Schleife ca. 1,5 l Endharn gebildet werden. Mit dem Harn werden
wasserlösliche Endprodukte bzw. Abfallprodukte des Stoffwechsels ausgeschieden,
deren Zusammensetzung und Menge wesentlich von der Nahrungsaufnahme und
der körperlichen Aktivität abhängt. Ebenso ist die Zusammensetzung des Harns
tageszeitabhängig. Die Funktion der Niere wird übergeordnet im wesentlichen von
ADH (Antidiuretisches Hormon) gesteuert.
Die wichtigsten Aufgaben der Niere sind:









Entgiftung und Elimination
Stickstoffausscheidung
Harnkonzentrierung
Regulation des Säure-Basen Haushalts
Regulation des Salz- und Wasserhaushalts
Hormonbildung (Calcitriol, Renin, Erythropoetin)
Calcitriol: Calcium- und Phosphatresorption
Renin (Angiotensin >> Aldosteron, RAAS): Blutdruck
Erythropoetin: Blutzellbildung
Man unterscheidet primär physiologische und pathologische Harnbestandteile.
Physiologische Bestandteile
Substanz
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
ClPO43SO42Harnstoff
Harnsäure
Kreatinin
Freie AS
Glukose
[g]
1,0 – 5,0
1,2 – 4,0
0,1 – 0,4
0,07 – 0,15
2,0 – 7,0
15 – 30
0,2 – 0,8
♀ 1,2
♂ 1,8
0,1 – 0,6
--
[mmol]
50 – 120
30 – 100
5 – 20
3–6
600 – 200
10 – 40
30 – 60
250 – 600
1,2 – 5,0
9 – 18
9 - 18
1–6
--
Pathologische Bestandteile
Treten Substanzen wie






Eiweiße
Zucker
Hämoglobin
Nitrit
Blut
Leukozyten
im Urin auf, so liegt fast immer ein pathologischer Prozess zugrunde.
Proteinurie
Tritt bei Nierenerkrankungen auf, die mit Veränderung der glomerulären Membran
einhergehen (z.B. Glomerulonephritis). Physiologisch tritt die Albuminurie in der
Schwangerschaft auf.
Glucosurie
Tritt nach Überschreiten der glomerulären Filtrationsschwelle von 180 – 200 mg/d
auf, z.B. bei massiver Zuckerzufuhr oder bei Diabetes mellitus. Im Gegensatz dazu
steht der renale Diabetes, dem eine Fehlfunktion der Niere zugrunde liegt (bei
normalem Blutglucosespiegel)
Hämoglobinurie
Tritt nur nach schweren intravasalen Hämolysen auf (hämolytische Anämien,
Transfusionszwischenfälle). Dabei wird die Konzentration von 120 mg/100 ml
überschritten.
Hämaturie
Tritt bei Steinleiden (Nieren-, Blasen-, Uretherstein), Verletzungen oder
Gerinnungsstörungen (Lassa, Marburg, Ebola, Thrombozytopenien) auf. Eine
Makrohämaturie ist bereits mit bloßem Auge an der Rotfärbung des Harns zu
erkennen, eine Mikrohämaturie wird meist mit Urosticks diagnostiziert
(z.B. Servotest ®)
Nitrit
Durch Bakterienurease kann Harnstoff in Ammoniak umgewandelt werden. Im Harn
lässt sich dann Nitrit als endgültiges Oxidationsprodukt des Harnstoffs nachweisen.
Nitrit dient also als Nachweis für einen Befall der ableitenden Harnwege durch
urease-positive Bakterien.
Leukozyturie
Leukozyten finden sich bei sämtlichen Entzündungsprozessen des menschlichen
Körpers in erhöhter Anzahl. Daher ist eine Leukozyturie immer ein Hinweis auf eine
akute Entzündung der ableitenden Harnwege oder aber der Niere (bzw. des
Nierenbeckens bei Pyelonephritis). Hier muss zur differentialdiagnostischen
Abklärung immer die Möglichkeit eines Tumors (ebenso wie bei der Hämaturie)
miteinbezogen werden.
PH-Wert des Harns
Der pH-Wert des Harns schwankt von sauer zu alkalisch. Maßgeblich beteiligt hierbei
ist die Zusammensetzung der Ernährung:



pH-Wert sauer: überwiegend Tierprodukte
pH-Wert leicht sauer: Mischkost
pH-Wert basisch: vegetarische Ernährung
Harnstoffbiosynthese
Die Harnstoffbiosynthese dient vorwiegend der Entgiftung des Ammoniaks (NH3),
das beim Abbau von Aminosäuren und Purinbasen entsteht. Unter Aufwendung von
4 energiereichen Phosphatbindungen (3 ATP + 1 PP) wird Ammoniak in der Leber zu
Harnstoff umgewandelt. Harnstoff eignet sich besser zur Ausscheidung, weil er



nicht toxisch ist
ungeladen ist
leicht durch biologische Membranen diffundieren kann
Harnstoffzyklus
Aus: Kreutzig, Biochemie
Purinabbau
Purinbasen werden in der Regel wiederverwertet. Das hat energetische Gründe: die
Synthese des Puringerüsts ist sehr energieaufwendig, der Abbau hingegen liefert nur
sehr wenig Energie. Trotzdem kann es bei einem Überschuss von Purinbasen zum
Abbau derselben kommen.
Beim Abbau der Purinbasen im menschlichen Organismus bleibt der Purinring
erhalten. Er ist nicht weiter verwertbar und wird in Form des Urats (Harnsäure)
ausgeschieden. Harnsäure wird über die Niere ausgeschieden.
Störungen beim Purinstoffwechsel
Eine Störung äußert sich meist in einer Hyperuricämie (gesteigerter
Harnsäurespiegel im Serum). Ursachen sind:



gesteigerte Produktion von Harnsäure (Enzymdefekte)
mangelnde Ausscheidung durch Nierendefekte
gesteigerte Zufuhr purinreicher Kost
Als Folge können im Gewebe Uratkristalle ausfallen (Tophi), die lokale
Entzündungen hervorrufen können. Da sich diese Tophi v.a. in bradytrophem
Gewebe ablagern (Knorpel, Gelenke, Hornhaut) ist das Großzehengrundgelenk
häufig davon betroffen. Man nennt diese Erkrankung Gicht, hier im speziellen
Podagra.
Abbau der Purinbasen
Aus: Kreutzig, Biochemie
Kreatinphosphat
Kreatinphosphat (CrP) ist eine wichtige Energiereserve im Muskel. Durch Abspaltung
eines Phosphatrestes kann aus ADP ATP gebildet werden.
Kreatin wird in Form von Kreatinin über die Nieren ausgeschieden. Die tägliche
Ausscheidung ist der Muskelmasse proportional (s.o.). Der Vergleich von CrP im
Serum und im Harn über einen bestimmten Zeitraum dient zur Bestimmung der GFR
(glomerulären Filtrationsrate).
Ketonkörper
Bei erhöhtem Fettstoffwechsel und dadurch gesteigerter Acetyl-CoA Konzentration
(Diabetes mellitus, Hunger) werden vermehrt Ketonkörper gebildet und im Harn
ausgeschieden. Sie dienen als Energielieferant für das ZNS und andere Organe bei
Kohlehydratmangel. Ketonkörper sind dann im Serum wie auch im Harn
nachweisbar.
Versuche
1. Harnstoff
In diesem Versuch soll die Harnstoffbiosynthese unter verschiedenen Bedingungen
betrachtet werden. Dazu werden verschiedene Proben hergestellt, bei denen
verschiedene Substratlösungen eingesetzt werden (zu den verschiedenen
Substraten folgen Details und Erklärungen weiter unten) und die gebildete Menge an
Harnstoff nach gleicher Zeit verglichen wird.
Alle Proben enthalten:



Leberextrakt aus Schweineleber (alles nötigen Enzyme für die
Harnstoffbiosynthese)
Inkubationspuffer
0,025 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,8
L-Aspartat
MgSO4
ATP
3-Phosphoglycerat
H2O dest.
Die Proben werden zunächst mit H2O dest. und Inkubationspuffer vorbereitet, danach
werden die Substrate zugefügt:
Probe Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
Substrat(e)
L-Ornithin
Carbamoylphosphat
L-Ornithin, Carbamoylphosphat
L-Ornithin, NH4HCO3
L-Ornithin, NH4HCO3, N-Acetylglutamat
L-Citrullin
L-Arginin
Danach 5 min bei 37°C inkubieren und mit dem ebenfalls vorinkubierten
Leberextrakt mischen. Die Proben 30 min bei 37°C inkubieren.
Zum beenden der Biosynthese durch Denaturierung der Enzyme werden die Proben
anschließen 15 min bei 100°C erhitzt und die denaturierten Proteine abzentrifugiert.
Die Überstände der Proben (2,0 ml) werden anschließend mit 2,5 ml H 2O dest.,
einem Säuregemisch aus Schwefelsäure und Phosphorsäure sowie einem Indikator
für Harnstoff (Harnstoffreagenz) versetzt. Die Säure ist deswegen von Nöten, weil
das Harnstoffreagenz nur im sauren Milieu arbeitet. Es ergibt sich für jede Probe eine
charakteristische Rotfärbung, deren Extinktion bei 570 nm photometrisch gemessen
wird.
Probe Nr.
E570
E570 –Probe 1
mol Harnstoff pro Ansatz
mol Harnstoff pro mg
Protein /h
1
2
3
4
5
6
7
8
0,039
0,024
0,066
0,462
0,026
0,026
0,560
1,113
0
- 0,015
0,027
0,423
- 0,013
- 0,013
0,521
1,074
-0.0012
0.2046
3.2
0.09852
0.09852
3.9
8.14
0.00066
0.1123
1.756
0.0541
0.0541
2.14
4.466
Der Wert der Probe 1 wird von den Proben 2-7 abgezogen, da der Leberextrakt
natürlich außer den Enzymen auch die nötigen Substrate in geringer Menge enthält
und somit Harnstoffbiosynthese in geringem Maße abläuft (Harnstoffbiosynthese
findet schließlich in der Leber statt!!). Es interessiert bei dem Versuch aber die mit
Hilfe der zugegebenen Substrate synthetisierte Harnstoffmenge.
Nach dem Lambert – Beer’schen Gesetz gilt :
E c  d
E
c
d
unter Berücksichtigung der Verdünnung : c 
E V

d v
V = Probevolumen/Gesamtvolumen
v = Volumen der zu bestimmenden Substrats
Mit E 570  1,9 103 l / mol  cm
D = 1 cm
V = 7.2 ml
v = 2.0 ml
c
 E  mol  cm   7, 2ml 
1,9 10 l 1cm
3
2ml
E
3,6mol

3
1,9 10
l
Glas 2 :
0, 015
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  0, 28 106
l
c
Umrechnung in μmol Harnstoff pro Ansatz (folgende Ansätze analog)
Menge
mol
mol
 c  VAnsatz  0, 28  4 103
 0, 0012
Ansatz
l
l
Glas 3 :
0, 027
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  51,15 106
l
c
Menge/Ansatz : 0,2046 μmol
Glas 4:
0, 423
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  801, 4 10 6
l
c
Menge/Ansatz : 3,2 μmol
Glas 5:
0, 013
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  24, 63 106
l
c
Menge/Ansatz : 0,09852 μmol
Glas 6 :
0, 013
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  24, 63 106
l
c
Menge/Ansatz :0,09852 μmol
Glas 7 :
0,521
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  987,16 106
l
c
Menge/Ansatz : 3,9 μmol
Glas 8 :
1, 074
mol
 3, 6
3
1,9 10
l
mol
c  2034,95 106
l
c
Menge/Ansatz : 8,14 μmol
Berechnung des Proteingehalts nach folgender Formel
Pk 
E 546  5,33mg
100l
Hierzu wurde die Proteinbestimmung nach Biuret durchgeführt.
Im Ansatz befinden sich NaCl, Leberextrakt, sowie Blutreagenz.
Die Extinktion der Analyse wurde gemessen: E 546  0, 076
d.h. : cPr otein, Leberextrakt 
0, 076  5,33mg
mg
 0, 00405
100l
l
Jedoch ist nicht die Proteinkonzentration, sondern die Proteinmenge gefragt.
Proteimenge
mg
 c  VAnsatz  4, 05
 0,9ml  3, 645mg
Ansatz
ml
Nun soll die Harnstoffmenge noch auf die vergangene Zeit umgerechnet werden. Da
die Inkubationszeit 30 Minuten betrug, muss die Menge noch mit 2 multipliziert
werden (auf eine Stunde).
Beispielsrechnung
Beispiel Glas 5:
 molHarnstoff
0, 09852 mol  2
 mol
h 
 0, 0541
mgProtein
3, 645mg  h
mg  h
Diskussion der Ergebnisse:
Glas 1
Glas 2
Glas 3
Glas 4
Glas 5
Glas 6
Glas 7
Glas 8
Obwohl keine Substrate hinzugegeben wurden, lief eine
Harnstoffbiosynthese statt. Grund hierfür ist die Tatsache, dass das Extrakt
Substrate enthält und so Harnstoffbiosynthese stattfinden kann.
Dieser Wert sollte ähnlich dem des Glas 1 sein. Vermutlich Pipettierfehler.
L-Ornithin reagiert mit Carbanyl-phosphat zu L-Citrullin. Carbanylphosphat
wurde nicht hinzugegeben >> L-Ornithin hat keine Reaktionspartner.
L-Ornithin fehlt, Carbanylphosphat hat keinen Reaktionspartner.
Harnstoffbiosynthese findet statt, allerdings in der Mitte des Zyklus, daher
kein beschleunigter Ablauf
So gut wie keine Harnstoffbiosynthese, da N-Acetylglutamat fehlt, deshalb
kein NH4HCO3 und daher kein Carbanylphosphat.
Kein Wasser vorhanden >>Arginin kann nicht in Orntihin und Harnstoff
umgewandelt werden.
Harnstoffbiosynthese findet in großem Maß statt. Diese Reaktion ist im
Harnstoffzyklus der Reaktion von Glas 4 nachgeschaltet, draus resultiert ein
höherer Umsatz.
Hier findet am meisten Harnstoffbiosynthese statt, da alle Komponenten
vorhanden sind.
Aufgabe : Prinzip der Atp – Synthese :
Die Zugabe von 1,3 – Phosphoglycerat löst dieses Problem, indem es ein Pi auf ein
ADP überträgt (Ausgangsprodukt ist 3 – Phosphoglycerat => PEP=>Pyruvat).
3. Kreatininbestimmung nach Jaffé
Das im Harn enthaltene Kreatinin bildet mit Pikrinsäure im alkalischen Medium einen
roten Farbkomplex. Photometrisch bestimmt man dessen Extinktion bei 520 nm.
In Reagenzgläser wird pipettiert:
Aqua dest.
Kreatinin (1mg/100ml)
Verdünnter Harn
Pikrat (17,5 mM in 0,8 N NaOH)
E520 / E520 gegen Leerwert
cAnalyse  50*
Leerwert
2 ml
Standard
1 ml
1 ml
Analyse
1 ml
2 ml
2 ml
1 ml
2 ml
0,292 / 0
0,337 / 0,045
0,556 / 0,264
E 520, Analyse
* cStandard
E 520, Standard
mit cStandard = 1mg/100ml
cAnalyse  50 *
0,264 1mg
293mg
*

0,045 100ml 100ml
umgerechnet auf 1,5 l (24h) ergibt sich cAnalyse  293 15
mg
g
 4,395
1,5l
1,5l
Der Wert liegt oberhalb der Norm (Normwerte 1,0 – 3,2g/24h)
Fragen
a) Warum braucht man hier zur Berechnung keinen Extinktionskoeffizienten? Der
Extinktionskoeffizient kürzt sich heraus
b) Welches ist die physiologische Funktion von Kreatinphosphat? Kreatinphosphat ist
ein Reservephosphat im Muskel das der schnellen Regeneration von ATP
dient. Bei Muskelarbeit läuft die Kreatinkinasereaktion ab:
Kreatinphosphat  ADP
Kreatin  ATP
Enzym: cytosolische Kreatininkinase; leicht surer pH_Wert des Cytosols
verschiebt das Gleichgewicht nach rechts! In der Ruhephase arbeitet die
mitochondriale Kreatininkinase. Vorteil gegenüber anderen Wegen der
Energiemobilisierung: Zeiteinsparung !
c) Kreatinin wird wie das Polysaccharid Inulin zur Bestimmung der PlasmaClearance
benutzt. Was versteht man unter diesem Begriff?
Plasma-Clearance: Verhältnis der pro Zeiteinheit ausgeschiedenen
Substanzmenge zur Plasmakonzentration der betreffenden Substanzen. Hier:
Kreatinin-Clearance.
d) Welchen Vorteil hat das Kreatinin gegenüber dem Inulin?
Inulin: exogene Clearance (Zufuhr von außen)
Kreatinin: endogene Clearance (Zufuhr von innen)
4. Pathologische Harnbestandteile
Untersuchung des Urins eines Probanden mit Hilfe von Teststäbchen (Urosticks) auf
pathologische Harnbestandteile.
Ergebnis:
Dichte:
pH-Wert:
Leukozyten:
Nitrit:
Eiweiß:
Glukose:
Ketonkörper:
Urobilinogen:
Bilirubin:
Blut:
1,015
6
o.B.
o.B.
+1 (30/0,3)
o.B.
o.B.
o.B.
o.B.
o.B.
Fragen
a) Wie ist die Entstehung von Ketonkörpern bei Diabetes mellitus und im Hunger zu
erklären?
Hunger, Nahrungskarenz >> keine Stimulation der Insulinsekretion (kein
Anstieg der Blutglukosekonzentration). Bei Diabetes mellitus herrscht
absoluter Insulinmangel. Aus dem Insulinmangel folgt: die Wirkungen des
Insulins fallen weg (z.B. Steigerung der Fettsynthese). Die freien Fettsäuren
im Blut steigen an, eine schnellere ß-Oxidation der Fettsäuren als
Weiterverwertung des entstehenden Acetyl-CoA im Citratzyklus.
Bei der hohen Acetyl-CoA Konzentration gibt es zwei Möglichkeiten:
- der Zitratzyklus ist verlangsamt, da Oxalacetat im Zyklus zu Acetyl-CoA im
Unterschuss vorliegt)
- Ketogenese
Lynenzyklus
Aus: Kreutzig, Biochemie
b) Welche Verbindungen werden zu den Ketonkörpern gerechnet?
Aceton, ß-Hydroxybuttersäure, Acetacetat
c) Können Ketonkörper vom Organismus verwertet werden?
Ja, bei niedrigem Glukoseangebot greifen Herz, Nierenrinde und
Skelettmuskel auf die Energiegewinnung durch Ketonkörper zurück.