Versuchsvorschriften zur Enzymkinetik

Versuchsvorschriften zur Enzymkinetik:
Geräte und Chemikalien:
Geräte:
Blutzucker-Messgerät Accu-Chek® Aviva
Messsonden (Packungen à 50 Stück)
Magnetheizrührer mit Temperaturregelung und Temperaturfühler
Stative mit Klemme und Muffe
pH-Meter
Stoppuhren
Rollrandgläser 25 mL o.ä.
Einmalspritzen PP: 20 mL, 10 mL, 5 mL ohne Spitzen
Stammlösungen:
CAS 57-50-1, M=342.3 g·mol-1
20 g /100 mL H2O (0.584 mol·L-1)
Saccharose (Feiner Zucker)
Trockenhefe-Suspension:
0,5 g/100 mL
(5 Minuten schütteln und im Kühlschrank aufbewahren)
Pufferlösungen nach Sørensen:
Na2HPO4 (CAS 89140-32-9, M = 120,01 g·mol-1) c = 0,067 mol/L bzw. 1/15 mol/L
KH2PO4 (CAS 7778-77-0, M = 136,09 g·mol-1)
pH
4.5*
5.0
5.5
V(KH2PO4) 99.93 99.05 96.1
in mL
V(Na2HPO4) 0.07 0.95 3.9
in mL
*
c = 0,067 mol/L bzw. 1/15 mol/L
6.0
87.9
6.5
68.7
7.0
38.8
7.5
14.8
8.0
3.3
12.1
32.3
61.2
85.2
96.9
) Na2HPO4 tropfenweise zugeben und mit pH-Meter kontrollieren.
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration
Substrat:
Saccharose
Enzym:
Invertase aus Bäckerhefe (Trockenhefe-Suspension)
Puffer:
Standard-Phosphat-Pufferlösung nach Sørensen pH=7,0
Nach jeweils 15 Minuten Reaktionszeit wird bei Raumtemperatur und konstantem pH-Wert
das Produkt Glucose gemessen. Die Messreihe wird im Abstand von 2 Minuten gestartet.
Wegen des Messbereichs des Blutzucker-Messgerätes (10 mg/dL – 600 mg/dL) müssen die
Messproben vorher im Verhältnis 1:19 verdünnt werden (20-fache Verdünnung). Dafür
werden Rollrandgläser mit jeweils 19 mL H2O bereit gestellt.
Lösungen:
Saccharose 20 g/100 mL:
Verdünnungsreihe:
Unverdünnt, 1:1, 1:2, 1:3
Puffer pH=7,0
Trockenhefe-Suspension 0,5 g/100 mL
Materialien:
Blutzucker-Messgerät mit Sensoren
12 Rollrandgläser ca. 25 mL
PP-Einwegspritzen 20 mL, 10 mL und 5 mL
Stoppuhren
Die Experimente werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Experimente sind so konzipiert, dass sie in einer Doppelstunde durchgeführt werden
können. Allerdings müssen die Lösungen bereit gestellt werden.
Versuchsdurchführung:
4 mal 8 mL Pufferlösung werden mit 2 mL Trockenhefe-Suspension vermischt und 30
Minuten stehen gelassen (Inkubation). In der Zwischenzeit wird die Verdünnungsreihe der
Saccharose-Lösungen hergestellt und je 10 mL in Rollrandgläser angefüllt.
Die Messreihe wird im Abstand von 2 Minuten mit 10 mL Saccharose-Lösung gestartet.
Für die Messung werden 4 Rollrandgläser mit 19 mL H2O befüllt. Nach 15 Minuten wird 1
mL Probe mit 19 mL H2O vermischt und die Glucose-Konzentration gemessen.
LINEWEAVER-BURK-Diagramm:
Auftragung von 1/v0 in (mol/L*h)-1 gegen 1/c0(Sac) in L/mol.
Auswertung des LINEWEAVER-BURK-Diagramms:
Aus den Achsenabschnitten werden ermittelt:

vMax aus der 1/v0 – Achse

KM aus der 1/ c0(Sac) - Achse
Die Experimente gelingen auch in ungepufferter Lösung.
Temperatur-Optimum
Bei Temperaturen zwischen 25°C und 70°C wird nach jeweils 15 Minuten Reaktionszeit wird
das Produkt Glucose gemessen.
Die Temperierung erfolgt in geregelten Wasserbädern (Magnetheizrührer mit Thermofühler
und Kristallisierschale).
Wegen des Messbereichs des Blutzucker-Messgerätes (10 mg/dL – 600 mg/dL) müssen die
Messproben vorher im Verhältnis 1:4 verdünnt werden (5-fache Verdünnung). Dafür werden
Rollrandgläser mit jeweils 4 mL H2O bereit gestellt.
Lösungen:
Saccharose 20 g/100 mL:
Puffer pH=6,0
Trockenhefe-Suspension 0,5 g/100 mL
Materialien: Blutzucker-Messgerät mit Sensoren
12 Rollrandgläser ca. 25 mL
PP-Einwegspritzen 10 mL und 5 mL
Magnetheizrührer mit Temperaturfühler und Kristallisierschale
Rührmagnet
Klemmen und Muffen
Versuchsdurchführung:
4 mal 8 mL Pufferlösung werden mit 2 mL Trockenhefe-Suspension vermischt und 15
Minuten temperiert (Inkubation). Im gleichen Wasserbad werden 10 mL Sacharose-Lösung
temperiert.
Die Messung wird durch Mischung der gepufferten Trockenhefe-Suspension mit der
Saccharose-Lösung gestartet. Die Messreihe wird im Abstand von 2 Minuten gestartet.
Für die Messung werden 4 Rollrandgläser mit 4 mL H2O befüllt.
Nach 15 Minuten wird 1 mL Probe mit 4 mL H2O vermischt und die Glucose-Konzentration
gemessen.
Auswertung:
Auftragung von T in °C gegen v in mol/L·min.
pH-Optimum
Bei pH-Werten zwischen 4,5 und 8,0 wird bei Raumtemperatur nach jeweils 15 Minuten
Reaktionszeit wird das Produkt Glucose gemessen.
Lösungen:
Saccharose 20 g/100 mL:
Phosphat-Puffer pH=5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0
Trockenhefe-Suspension 0,5 g/100 mL
Materialien:
Blutzucker-Messgerät mit Sensoren
12 Rollrandgläser ca. 25 mL
PP-Einwegspritzen 10 mL und 5 mL
pH-Meter zur Kontrolle
Versuchsdurchführung:
6 mal 8 mL Pufferlösung werden mit 2 mL Trockenhefe-Suspension vermischt und 15
Minuten stehen gelassen (Inkubation).
Die Messung wird durch Mischung der gepufferten Trockenhefe-Suspension mit 10 mL
Saccharose-Lösung gestartet. Die Messreihe wird im Abstand von 2 Minuten gestartet.
Nach 15 Minuten wird die Glucose-Konzentration gemessen.
Auswertung:
Auftragung des pH-Wertes gegen v in mol/L·min.