Nukleotid Biosynthese

Nucleotid Biosynthese
Nucleotide kennen wir als Bausteine der DNA. Doch im Grunde erfüllen sie noch zahlreiche
andere Aufgaben:
- Aktivierte Vorstufen von Nukleinsäuren, wichtig für Replikation des Genoms &
Transkription in RNA
- ATP (ein Adeninnucleotid) als universeller Form biologisch verwendbarer Energie
- GTP (ein Guaninnucleotid) als Energiequelle für spezifische biol. Prozesse
- UDP-Glucose (ein Nucleotidderivat) für Biosynthesen, z.B. Glykogen-Synthese
- Wichtig für Signaltransduktion. z.B. cAMP und cGMP als second messenger
- ATP dient zudem als Phosphatdonor bei der Proteinkinase
Nucleotide sind aufgebaut aus je einem Basenring (Purin bzw. Pyrimidin), einem Zucker
(Ribose für RNA, Desoxyribose für DNA) und einer Phosphatgruppe (ohne Phosphatgruppe:
Nucleosid).
Die Ringsysteme der Nucleotide werden an den Aminosäuren (AS) Glycin und Aspartat
aufgebaut. Aspartat dient zudem, zusammen mit Glutamin, als Ammoniakquellen, welche bei
der Biosynthese benötigt werden.
Der Prozess der Nucleotid-Biosynthese ist äusserst wichtig für die Medizin und Pharmazie.
Viele Krebstherapeutika greifen genau diesen Prozess an und verhindern somit die Zellteilung
von aus der Kontrolle geratener Zellen.
Die Nucleotid-Biosynthese kann in zwei Formen unterteilt werden:
- de novo-Synthese
- Recycling (engl: „salvage pathways““)
Bei de novo-Synthesen werden Nucleotidbasen aus einfacheren Verbindungen hergestellt.
Dabei unterscheiden sich noch der Aufbau bei einer Pyrimidinbase und der einer Purinbase:
- Pyrimidinbase wird zuerst aufgebaut und anschliessend an einer Ribose angehängt
- Purinbase wird direkt an einer Ribose Stück für Stück aufgebaut.
Bei der Recycling werden – wie der Name schon sagt – bestehende Basen wiederverwertet
und an eine Riboseeinheit angehängt.
Durch diese beiden Synthesen entstehen aber erst die Ribonucleotiden, welche Bestandteile
der RNA, aber nicht der DNA sind. Die Ribosen werden also danach zuerst zu Desoxyribosen
reduziert, bevor sie für die DNA benötigt werden können.
Nomenklatur
Namen der Basen, Nucleoside und Nucleotide:
Base
Adenin / Adenin
Guanin / Guanin
Uracil / Thymin
Cytosin / Cytosin
RNA / DNA
Ribonucleosid /Desoxyr.
Ribonucleotid / Desoxyribonucleotid
Adenosin / Desoxyadenosin Adenylat (AMP) / Desoxyadenylat (dAMP)
Guanosin / Desoxyguanosin Guanylat (GMP) / Desoxyguanylat (dGMP)
Uridin / Thymidin
Uridylat (UMP) / Thymidylat (TMP)
Cytidin / Desoxycitidin
Cytidylat (CMP) / Desoxycytidylat (dCMP)
Synthese von Pyrimidinbasen
Die Pyrimidinringe werden aus Hydrogencarbonat, Asparaginsäure und Glutamin
synthetisiert, wobei Glutamin als NH3-Lieferant dient.
Aus Hydrogencarbonat und Ammoniak wird Carbamoylphosphat hergestellt
Die Reaktion wird mit dem Enzym Carbamoylphosphat-Synthetase (CPS) katalysiert. Dieses
Enzym hat insgesamt 3 aktive Zentren. Im ersten Zentrum – ATP-„Greif“-Falte genannt
(ATP-grasp fold) – welches sich am N-Terminus befindet, wird Hydrogencarbonat
phosphoryliert zu Carboxyphosphat. Somit wird das Molekül aktiviert (Phosphorylierung ist
die häufigste Methode, um inaktive Stoffe für biol. Vorgänge zu aktivieren). Anschliessend
greift das NH3 am Carboxyphosphat an und bildet Carbaminsäure.
Im zweiten ATP-„Greif“-Falte wird das Carbaminsäure wiederum phosphoryliert zu
Carbamoylphosphat.
Das dritte aktive Zentrum von diesem Enzym hat die Aufgabe, Glutamin durch Hydrolyse in
Ammoniak und Glutamat aufzuspalten. Das Ammoniak wird anschliessend für die
Herstellung von Carbaminsäure benötigt. Diese Domäne enthält einen Cystein- und einen
Histidinrest und ist auch bei der CTP- und GMP-Synthetase zu finden.
Zwischenprodukte erreichen die aktiven Zentren durch einen Kanal
Die drei aktive Zentren sind durch einen Kanal miteinander verbunden. Zwischenprodukte
wandern von einem Zentrum zum anderen, ohne das Enzym zu verlassen. Das Ammoniak,
das beim dritten Zentrum hergestellt wird, wandert zum Carbaminsäure-Zentrum, und weiter
zum Carbamoylphosphat-Zentrum. Das Kanalsystem hat den Vorteil, dass die
Zwischenprodukte auch wirklich für die Reaktion zur Verfügung stehen und nicht „abhauen“,
ausserdem bleiben die labilen Zwischenprodukte vor der Hydrolyse geschützt.
Uridylat-Synthese
Durch eine Reaktion zwischen Carbamoylphosphat und Aspartat entsteht Carbamoylaspartat
(beteiligtes Enzym: Aspartat-Transcarbamoylase), welches zum cyclischen Dihydroorotat
umgewandelt wird. Dieses wird durch NAD+ zu Orotat oxidiert. Orotat reagiert mit 5Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP), eine aktivierte Riboseform, zum Orotidylat, ein
Pyrimidinnucleotid. Die Reaktion wird durch die Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase
katalysiert, welches eine Hydrolyse des Pyrophosphats bewirkt. Das Orotidylat wird zm
Uridylat (UMP) decarboxyliert. (beteiligtes Enzym: Orotidylat-Decarboxylase)
- Carbamoylphosphat + Aspartat  Carbamoylaspartat  Dihydroorotat (cyclisch)  Orotat
- Orotat + PRPP  Orotidylat  Uridylat
Orotidylat-Decarboxylase ist eines der effektivsten Enzyme, die man zur Zeit kennt. Ohne
dieses Enzym würde die Decarboxylierung nämlich 1017 mal langsamer ablaufen (von 1x alle
78 mio. Jahre auf 1x/sek.)!
Cytidin-Synthese
Für die Synthese von CTP muss zuerst UMP in UTP umgewandelt werden. Dies geschieht
durch zwei Enzyme: zum einen die Nucleosidmonophosphat-Kinase und, logisch abgeleitet,
die Nucleosiddiphosphat-Kinase. Für die erste Phosphorylierung wird eine Phosphatgruppe
des ATP benutzt. Das zweite Kinasenenzym ist allerdings viel unspezifischer. Es kann
Phosphatgruppen von beliebige Triphosphate nach Diphosphate transferieren.
XDP + YTP
XTP + YDP
X,Y: beliebiges (Dexoxy-) Ribonucleotid
Nach der UTP-Synthese wird eien Carbonylgruppe durch eine NH2-Gruppe ersetzt. Die
Reaktion verläuft analog der einer Carbamoylphosphat-Synthese. Zuerst wird ein O-Atom
phosphoryliert, danach wird die Phosphatgruppe durch ein Ammoniak ersetzt, welches von
einem Glutamin geliefert wird. Das daraus entstehende CTP kann nun bei der RNA-Synthese
eingesetzt weden.
Synthese von Purinbasen
Während Pyrimidinbasen nur durch de novo-Synthesen hergestellt werden können, können
Purinbasen sowohl de novo synthetisiert als auch durch recycelt werden.
Recycling
Freie Purinbasen können mit PRPP Purinnucleosidmonophosphate bilden. Die Reaktion ist
analog der Orotidylatbildung.
Es gibt zwei Recyclingenzyme, welche Purinbasen wiederverwenden können:
- Adenin-Phosphoribosyltransferase katalysiert die Bildung von Adenylat
- Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) hingegen ist für die
Bildung von Guanylat und Inosinat zuständig (Inosinat = IMP = Inosinmonophosphat,
IMP ist eine Vorstufe von Guanylat und Adenylat)
De novo-Synthesen von Purinringsysteme
Im Gegensatz zur Pyrimidin-Synthese wird der Purinring direkt Schritt für Schritt am
Ribosephosphat aufgebaut.
Das Pyrophosphat des PRPP wird durch eine Aminogruppe ersetzt. Dabei entsteht
5-Phosphoribosyl-1-amin mit -Konfiguration in der Aminogruppe. Enzym: GlutaminPhosphoribosyl-Amidotransferase. Das Enzym besitzt zwei aktive Zentren. Das erste ist
homolog mit dem der Phosphoribosyltransferase, Das zweite erzeugt eine Glutaminhydrolyse,
welche Ammoniak für den weiteren Reaktionsverlauf bereitstellt. Anders als bei der
Carbamoylphosphat-Synthetase katalysiert ein Cysteinrest am N-Terminus die
Glutaminhydrolyse. Das daraus entstandene Ammoniak wird aber auch in diesem Fall durch
ein Kanal zum PRPP transportiert.
Dieses Enzym wird nur bei der Bildung von PRPP und Glutamin aktiviert.
Aufbau des Purinringes
Weitere 9 Schritte sind für die Purinring-Synthese erforderlich. Dabei sind die ersten 6
Schritte analog. In jedem Schritt wird ein Carbonylsauerstoffatom druch Phosphorylierung
und anschliessend durch ein Ammoniak oder eine Aminogruppe substituiert.
1. Glycin wird ans 5-Phosphoribosyl-1-amin gehängt  Glycinamidribonucleotid
2. Ein aktivertes Formiat bindet sich an das Glycinamidribonucleotid 
Formylglycinamidribonucleotid
3. Die innere Amidgruppe wird mit einer Aminogruppe vom Glutamin verbunden 
Amidinrest  Formylglycinamidinribonucleotid
4. Formylglycinamidinribonucleotid wird zyklisiert  5-Ring (5Aminoimidazolribonucleotid), Reaktion ist irreversibel!
5. Die exozyklische Aminogruppe greift ein Hydrogencarbonat an  Umlagerung der
Carboxylatgruppe auf Imidazolring  Carboxyaminoimidazolribonucleotid
6. Ein Aspartat wird ans Carboxyaminoimidazolribonucleotid gehängt 
5-Aminoimidazol-4-(N-succinylcarboxamid-)ribonucleotid
Es werden also laufend Glycin, Formiat, Ammoniak, Hydrogencarbonat und Aspartat mithilfe
einer analogen Reaktionsmechanismus ans Phosphoribosylamin gehängt.
7. Fumatat wird vom 5-Aminoimidazol-4-(N-succinylcarboxamid-)ribonucleotid
abgespalten  5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonucleotid
8. Eine Formylgruppe wird auf die Verbindung übertragen  5-Formaminoimidazol-4carboxamidribonucleotid (vgl. Schritt 2)
9. Durch Abspaltung eines H20-Moleküls zyklisiert das letzte Zwischenprodukt zu
Inosinat (IMP), welches nun für die weitere Synthese zum Adenylat und Guanylat
eingesetzt werden kann
(Graphische Darstellung der Reaktionsschritte: Abb. 25.7 und 25.8 im Stryer)
AMP und GMP entstehen aus IMP
-
IMP  AMP: Ein Carbonylsauerstoffatom wird durch eine Aminogruppe
substituiert. Mechanismus: Addition eines Aspartats und anschliessender Elimination
eines Fumarats (vgl. Schritt 6 & 7 der IMP-Synthese). Unterschied: Als
Energielieferant dient nicht ATP, sondern GTP. Das beteiligte Enzym
(Adenylsuccinat-Synthase) hat keine ATP-„Greif“-Domäne. Übrigens wird dieses
Enzym auch für Schritt 7 der IMP-Synthese eingesetzt
IMP + GTP + Asp  Adenylsuccinat + GDP + Pi
Adenylsuccinat  AMP + Fumarat
-
IMP  GMP: Addition von einem NH2-Rest am IMP. Mechanismus: Oxidation von
IMP mithilfe von NAD+  Xanthylat. Das Sauerstoffatom des Xanthylats wird durch
eine Aminogruppe substituiert  GMP. Für diese Reaktion ist im Gegensatz zur
AMP-Synthese ATP erforderlich.
IMP + NAD+ + H2O  Xanthylat + NADH + H+
Xanthylat + NH3 + ATP  GMP + AMP + PPi
Radikalische Reduktion von Ribonucleotide zu Desoxyribonucleotiden
Prinzip :
Substrat:
Red.mittel:
Enzym:
Die 2’-Hydroxylgruppe der Riboseeinheit wird durch ein H-Atom ersetzt.
Ribonucleosiddi- oder –triphosphate,
NADPH
Ribonucleotid-Reduktase (können z.T. ganz anders aussehen bei verschiedenen
Organismen. Der Reaktionsmechanismus ist jedoch derselbe)
Mechanismus beim E.coli:
Der Riboncleotid-Reduktase der E.coli besteht aus zwei Untereinheiten: R1 und R2.
R1: 1 aktives Zentrum und 2 allosterische Kontrollstellen (3 Cystein- + 1 Glutamatrest)
R2: 2 Ketten mit je ein stabiles Tyrosylradikal
Reaktionsschrittte:
1. 1 Elektron wandert vom Cysteinrest in R1 nach Tyrosylradikal im R2 
Cysteinradikal
2. Cysteinradikal nimmt ein H vom C-3’ der Riboseeinheit  Radikal am Ribose-C-3’
3. Ein OH- am C-2’ wird von einem zweiten Cysteinrest protoniert und abgespalten 
Radikal am Ribose-C-2’
4. Ein Hydridion (1 Proton mit 2 Elektronen) wandert von einem dritten Cysteinrest nach
C-2’ der Riboseeinheit  S-S-Brücke und wieder freies Radikal am C-3’
5. C-3’-Radikal holt H vom ersten Cysteinrest wieder zurück (vgl Schritt 2)  Ende der
Reduktion
6. Disulfidbrücke der R1-Untereinheit wird gespalten, Enzym wird regeneriert
Thymidylat-Synthese
Während alle andere Ribonucleotide durch einfache Reduktion in Desoxyribonucleotide
überführt werden können, sieht das beim Uracil ein bisschen anders aus. Das Analogon vom
Uracil in der DNA ist Thymin, welches eine zusätzliche Methylrest enthält. Dieses Methylrest
erleichtert die Identifizierung und Reparatur von DNA-Schäden (Wenn bei der Replikation
etwas schief läuft, kann das Reparatursystem den Strang mit Methylgruppen als „Original“
erkennen. Vgl. Kapitel 27).
Mechanismus: Desoxyuridylat (dUMP) wird zu Thymidylat (TMP) methyliert. Als
Methyldonor dient das N5-N10-Methylentetrahydrofolat, welches zu Dihydrofolat oxidiert
wird. Das beteiligte Enzym heisst Thymidylat-Synthase.
Reaktion: Ein Thiolat wird ans Thymidylat-Synthase angefügt. Dieser bindet sich
anschliessend ans dUMP  Aktivierung von dUMP  nukleophiler Angriff am Methyldonor
 Abspaltug einer Methylgruppe vom Methylentetrahydrofolat  Abtrennung der EnzymThiolat-Verbindung
(Methylentetrahydrofolat besitzt ein Fünfring mit einer Methylengruppe. Die Enzym-ThiolatVerbindung bewirkt die Öffnung des Fünfrings. Die Methylengruppe wird durch die
Übertragung eines Hydridions in eine Methylgruppe umgewandelt, welches nun vom
aktivierten dUMP angegriffen werden kann)
Damit neues Thymidylat hergestellt werden kann, muss das Tetrahydrofolat wieder
regeneriert werden. NADPH dient hier als Reduktionsmittel, und katalysiert wird diese
Reaktion von der Dihydrofolat-Reduktase. Das daraus entstehende Tetrahydrofolat kann nun
in weiteren Schritten wieder in N5-N10-Methylentetrahydrofolat umgewandelt werden.
Viele Krebshemmende medikamente blockieren die Thymidylat-Synthese
Zellen mit hoher Teilungsrate brauchen viel mehr Thymidylat zur DNA-Synthese und
reagieren deshalb besonders empfindlich auf Blockierung der TMP-Synthese. Bei der Chemotherapie sind Thymidylat-Synthase und Dihydrofolat-Reduktase bevorzugte Angriffspunkte:
Fluoruracil wird in vivo in Fluordesoxyuridylat (F-dUMP) umgewandelt. Dieses dUMPAnalogon hemmt die Thymidylat-Synthase irreversibel, da sich das Dihydrofolat wegen der
hohen Elektronegativität des Fluors nicht vom F-dUMP lösen kann. Die Reaktion wird also
auf der Stufe des F-dUMP-Methylentetrahydrofolat-Thiolat-Enzym-Verbindung blockiert.
Aminopterin und Methotrexat hemmen die Tetrahydrofolatregenerierung. Sie werden bei
schnell wachsende Tumoren eingesetzt wie z.B. akute Leukämie. Der Nachteil dieser
Medikamente ist, dass alle schnellwachsnde Zellen angegriffen werden, also auch gesunde
Knochenmarkstammzellen, Epithelzellen des Intestinaltraktes und Haarfollikel, was zu
Nebenwirkungen wie geschwächtes Immunsystem, Brechreiz und Haarausfall führen.
Trimethoprim bindet sich sehr stark an die Dihydrofolat-Reduktase von Bakterien und
Protozoen, während sie an jene von Säugern 105-mal schwächer binden. Der Grund dafür sind
kleine Konfigurationsunterschiede der Enzyme. Wegen dieser Eigenschaft wird es häufig bei
der Infektionsbehandlung eingesetzt.
Regulierung der Nucleotidbio-Synthese durch Rückkopplungsmechanismen
Die Purinnucleotid-Synthese wird an folgende Stellen durch Rückkopplung kontrolliert:
- Umwandlung von PRPP in Phorphoribosylamin, welches am Anfang der
Purinribonucleotid-Synthese stattfindet. Gehemmt wird der Vorgang durch AMP und
GMP, welche synergistisch (=sich in ihrer Wirkung verstärkend) wirken
- AMP hemmt die Umwandlung von IMP in Adenylsuccinat, welches sein direkter
Vorläufer ist. Analog hemmt GMP die Umwandlung von IMP in Xanthylat
- Wir wissen, dass bei der AMP-Synthese GTP benötigt und bei der GMP-SyntheseATP
eingesetzt wird (vgl. Seite 4). Diese reziproke Substratbeziehung sorgt für ein
Gleichgewicht in der AMP und GMP-Produktion
Die Reduktion von Ribonucleotide zu Desoxyribonucleotide erfolgt über allosterische
Wechselwirkungen. Die R1-Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase von E.coli hat 2
allosterische Zentren (vgl. Seite 5): Eines kontrolliert die Gesamtaktivität des Enzyms, das
andere die Substratspezifität.
-
Überschuss an Desoxyribonucleotiden  dATP  Hemmung der PurinnucleotidSynthesen  Pyrimidinnucleotid-Produktion begünstigt
Überschuss an Pyrimidindesoxynucleotiden  TTP  Hemmung der
Pyrimidinnucleotid-Reduktion + Förderung der GDP-Reduktion  dGTP-Spiegel
steigt  stimuliert Reduktion von ATP zu dATP
NAD+, FAD und Coenzym A werden aus ATP gebildet
NAD+-Synthese:
Nicotinat + PRPP  Nicotinatribonucleotid + PPi
Nicotinatribonucleotid + ATP  Desamide-NAD+ + PPi
Desamide-NAD+ + Glutamin  NAD+ + Glutamat
Das Nicotinat bindet sich ans PRPP, wobei zwei Phosphatgruppen von PRPP abgespalten
werden. Anschliessend wird ein AMP-Rest des ATP auf das daraus entstandene
Nicotinatribonucleotid übertragen. Dieses Desamido-NAD+ enthält eine Carboxylgruppe,
dessen Sauerstoffatom im letzten Schritt durch eine Aminogruppe ersetzt wird. Das
Ammoniak, das dafür benötigt wird, stammt (wie immer) aus Glutamin.
(Nicotinat, auch Niacin oder Vitamin B6, leitet sich von Tryptophan ab. Ein Tryptophan- und
somit Nicotinatmangel kann zu Pellagra führen. Symptome der Pellagra sind: Dermatitis,
Diarrhoe und geistiger Verwirrung)
FAD-Synthese:
Riboflavin + ATP  Riboflavin-5’-phosphat + ADP
Riboflavin-5’-phosphat + ATP  Flavinadenindinucleotid (FAD) + PPi
Eine Phosphatgruppe des ATP wird auf Riboflavin übertragen. Daraus entsteht Riboflavin-5’phosphat (= Flavinmononucleotid FMN). Dieser wird anschliessend mit einer AMP-Einheit
eines zweiten ATP zu FAD verbunden.
Coenzym A-Synthese:
Auch hier wird eine AMP –Einheit aus ATP auf die Phosphatgruppe eines Phosphorylierten
Zwischenprodukts übertragen. Daraus entsteht ein Pyrophosphat, welcher dann zu
Orthophosphat hydrolysiert wird.
Purine werden im Menschen zu Urat abgebaut
Die Nucleotide in unseren Zelle werden laufend erneuert. Sie werden durch Nucleotidasen zu
Nucleosiden abgebaut und weiter durch Nucleosid-Phosphorylasen in freie Basen und
(Desoxy-)Ribose-1-phosphat zerlegt. Ribose-1-phosphat wird durch Ribosephosphat-Mutase
in Ribose-5-phosphat umgewandelt, welches für die PRPP-Synthese genutzt werden kann.
Einige Basen werden recycelt, andere weiter abgebaut und ausgeschieden.
Z.Bsp. wird AMP zu Hypoxanthin abgebaut, welches von Xanthin-Oxidase zu Xanthin und
weiter zu Urat (Salz der Harnsäure) oxidiert wird, Dieses kann nun ausgeschieden werden.
Ein zu hoher Uratkonzentration im Serum führt zu Gicht (Urat kristallisiert im Körper und
schädigt Gelenke und Nieren). Zur Behandlung wird manchmal Allopurinol, ein XanthinOxidase-Inhibitor, eingesetzt.
(Der Serumspiegel des Urats beim Menschen liegt gerade unter der Löslichkeitsgrenze,
während er bei Halbaffen 10x tiefer liegt. Dies erklärt vielleicht die höhere Lebenserwartung
und die geringere Krebshäufigkeit der Menschen im Gegensatz zu anderen Primaten, denn
Urat ist, wie die Ascorbinsäure (Vitamin C), ein hervorragender Antioxidans)
Das Lesch-nyhan-Syndrom (LNS)
Bei Lesch-Nyhan-Syndrom handelt es sich um eine X-Chromosomal rezessiv vererbbare
Genmutation, welche zur Folge hat, dass das Recyclingenzym Hypoxanthin-GuaninPhosphoribosyltransferase praktisch ganz fehlt (vgl. Seite 3). Betroffene haben einen
zwanghaften Hang zur Selbstzerstörung. Sie knabbern unkontrolliert an Finger und Lippen
und würden sie abkauen, wenn man sie nicht daran hinderte. Auch anderen gegenüber
verhalten sie sich manchmal aggressiv. Bei schwereren Formen kommen noch geistige
Behinderung und spastisches Verhalten dazu.
Durch das Fehlen der Hylpoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase ist eine erhöhte PRPPKonzentration, eine höhere Geschwindigkeit der de novo-Purinbiosynthese und eine
Überproduktion von Urat zu kennzeichnen, was schon früh zu Bildung von Nierensteinen und
Symptomen von Gicht führen kann. Der genaue Zusammenhang zwischen dem Fehlen der
Transferase und den neurologischen Symptomen ist bislang unbekannt. Doch zeigt diese
Krankheit, dass der Weg der Recycling für IMP und GMP wahrscheinlich nicht ohne Grund
gewählt wurde.