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INFOTEXT:
Bei Eukaryonten findet man die Erbsubstanz als DNA-Doppelstrang im Zellkern, bei Prokaryonten liegt
sie frei vor.
Die DNA kann auch in einer Ringform vorkommen, dem sogenannten Plasmid, das neben der 'normalen',
d.h. chromosomalen DNA vorkommt. Plasmide findet man in der Regel nur bei Bakterien, das
Darmbakterium E. coli besitzt zum Beispiel ein solches Plasmid. Sie verschaffen dem jeweiligen
Organismus durch bestimmte Gene in der Regel einen selektiven Vorteil, sie sind dann zum Beispiel
resistent gegenüber Antibiotika. Plasmide kommen in seltenen Fällen aber auch in Eukaryonten vor, die
Hefe besitzt ein solches Plasmid (mit einer Größe von ca. 2 Mikrometern).
Wie bestimmt schon den meisten bekannt ist, wird DNA vervielfältigt, man sagt auch sie wird repliziert
Hierfür benötigt man einen Startpunkt. Dieser wird durch eine bestimmte Gensequenz markiert, die man
als 'ori' bezeichnet; das kommt aus dem Englischen und bedeutet 'origin of replication', also
Replikationsursprung.
Bestimmte dieser Plasmide können als Vektoren Fremd-DNA in eine Empfängerzelle transportieren, da
man leicht DNA-Stücke anderer Organismen in sie einsetzen kann. Diese werden dann wiederum als
neuer Bestandteil des Empfängerorganismus repliziert.
Das kann eine wichtige Rolle in der Medizin spielen.
Die meisten von Ihnen haben bestimmt schon einmal von der Zuckerkrankheit Diabetes gehört.
Personen, die an dieser Krankheit leiden, fehlt die ausreichende Menge des Enzyms Insulin. Dieses
Insulin kann man aus anderen Säugetieren gewinnen. Dies ist aber sehr zeitaufwendig. Hier kommt die
Mikrobiologie ins Spiel – Mikroorganismen sind in Kultur zu halten und vermehren sich sehr schnell.
Verwendet wurden dazu früher oft Bakterien, seit einiger Zeit benutzt man dazu aber auch Hefe, da
diese bessere Genprodukte herstellt.
Wenn man sie jetzt also mit dem Gen ausstattet, das die Produktion von menschlichem Insulin induziert,
könnte man das Hormon sehr schnell und einfach herstellen.
Die Frage ist jetzt nur: "WIE BEKOMMT MAN NUR DAS INSULINGEN IN DIE HEFE – UND WIE KOMMT ES
WIEDER HERAUS?
Um diese Fragen zu klären muss man sich erst einmal darüber klar werden, wie ein Plasmid
aufgebaut ist und wie man es verändern kann.
Plasmide müssen nämlich einige charakteristische Bestandteile enthalten, um als Vektoren
eingesetzt zu werden.
Zunächst muss sichergestellt sein, dass sie bei einer Vermehrung der Hefezelle (z.B. bei der
1
Knospung) einer Mutterzelle) automatisch mit verdoppelt (repliziert) werden. Für die
Verdopplung bzw. Synthese der DNA sind bestimmte Enzyme verantwortlich, die Polymerasen.
Polymerasen erkennen bestimmte charakteristische Stellen des DNA-Strangs und replizieren sie.
Diese Stellen nennt man autonom-replizierende Sequenzen (ARS).
Jetzt brauchen wir natürlich noch das Insulingen, aber woher bekommen wir das?
Die einfachste Möglichkeit ist es, sogenannte Insulin - 'messengerRNA'1 aus den Zellen der
Bauchspeicheldrüse zu extrahieren und durch einen Vorgang, den man als reverse Transkription
bezeichnet wieder DNA herzustellen.2
Das Hefegen setzten wir nun in unseren Vektor ein (Transformation). Nicht alle Vektoren
nehmen aber das Hefegen auf, wie wissen wir denn jetzt, welche Plasmide es enthalten und
welche nicht? Hierzu bauen wir in das Plasmid das Gen für die Synthese der Aminosäure Leucin
ein – alle Zellen, die das Hefegen zusammen mit dem Leucin erhalten haben, können jetzt auf
einem Leucin-armen Medium wachsen, alle anderen gehen ein – das Leucin-Gen ist also ein
Marker.
Jetzt haben wir also die ARS und das Hefegen und das Markergen für die Aminosäure Leucin.
Das Hefegen muss aber auch abgelesen werden können, das macht die RNA-Polymerase. Damit
die RNA-Polymerase aber nicht zu viel oder zu wenig abliest, brauchen wir ein Startsignal
(Promotor) und ein Endsignal (Terminator), dabei handelt es sich um bestimmte
Nukleotidsequenzen.
Die Proteinbiosynthese (also auch die Herstellung des Insulins) findet an den Ribosomen statt,
die kennen Sie ja bestimmt noch aus der Zellbiologie. Damit von unserem Insulingen nun ein
Protein gemacht wird (Transkript), brauchen wir auch für die Ribosomen eine
Erkennungsregion, die Ribosomenbindungsstelle (RBS), die hinter dem Promotor sitzt.
So, jetzt kann das Insulin hergestellt werden – aber es ist noch in der Hefezelle?
Um es wieder herauszubekommen könnte man die Hefezellen ja eigentlich künstlich
aufreinigen, das ist aber viel zu aufwendig. Die Wissenschaftler bringen die Hefe stattdessen
dazu, das Insulin selbst wieder abzugeben. Hierfür bauen sie einen Teil eines
Die mRNA ist eine wichtige Zwischenstufe bei der Proteinherstellung, sie transportiert die genetischen
Informationen aus dem Zellkern zu den Ribosomen, dort wird die Nukleotidsequenz in die Aminosäurefolge eines
Proteins übersetzt.
2 Man kann die DNA aber auch künstlich synthetisieren.
1
2
Paarungsfaktorgens ein. Über Paarungsfaktoren haben Sie ja im Modul 'Hefen Allgemein'
schon etwas erfahren, Sie wissen also, dass Hefezellen vor der 'Paarung' einen Signalstoff
aussenden. Es ist also logisch, dass man daran das Insulingen koppelt, so stoßen die Zellen das
Insulin automatisch, allerdings zusammen mit dem Paarungsfaktorteil, aus.
Am Ende muss der synthetisierte Teil des Paarungsfaktors aber wieder entfernt werden. Das
Enzym, das Aminosäuresequenzen schneiden kann, heißt Protease3, sie müssen wir auch
einbauen, wo ist ja jetzt naheliegend, oder?
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Da es im Rahmen des Unterrichts aus organisatorischen und zeitlichen Gründen nicht möglich
ist, einen realen Vektor herzustellen und es zudem auch nicht gestattet ist, Genmanipulationen
in der Schule durchzuführen, wird dieser Versuch als Modellversuch vorgestellt.
Arbeitsvorlage: Siehe nächste Seite!
3
Proteasen findet man auch in Waschmitteln, sie sind dafür verantwortlich, dass die Flecken rausgehen.
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Arbeitsvorlage: Insulinskript
Anleitung:
Schneiden Sie die einzelnen Bestandteile aus und kleben Sie sie anhand der Informationen im
Text auf einem Blatt zusammen!
Plasmid
InsulinGen
RibosomenBindungsstelle
ARSSequenz
Paarungsfaktor
LEUGen
ProteasenErkennungsregion
Promotor
4
Terminator