SLIDES winterthur010606NoClips

Sandro Rusconi (9.3.52)
Winterthur 01.06.2006
28. W'thurer Fortbildunkgskurs
1972 -75
Primarschullehrer (Locarno, Switzerland)
1975 -79
Diploma in Molekularbiologie UNI Zuerich
1979 - 82
PhD curriculum UNI Zuerich, molecular biology
1982 - 84
Oberassistent UNI Zuerich
1984 - 86
Postdoc UCSF, K Yamamoto, (San Francisco)
1987 - 93
Group leader, UNI Zuerich, PD
1994 - oggi
Ordentliche professor Biochemie UNI Fribourg
1996 - 02
Direktor Swiss National Research Program 37
'Somatic Gene Therapy'
2002 - 03
Sabbatical, Tufts Med. School Boston and
Univ. Milano, Pharmacology Department
2002 - 05
Präsident Union of Swiss Societies for
Experimental Biology (USGEB)
2002 - 06
Euregenethy Network (EU-harmonsiation of
biosafety and ethical aspects in gene therapy)
2005 -...
Direktor Divisione Cultura e Studi Universitari
Cantone Ticino
UNIFR
Rusconi
2006
Sportdoping
mittels
Gentransfer:
relistisch oder nur
virtuell?
UNIFR
Rusconi
Aspekte die behandelt werden
2006
Ziele und methoden der Therapie mittels Gentransfer
('Gentherapie') Gene, Prinzipien, Vektoren, Methoden
Wo stehen wir mit Gentherapie?
Erfolge und Misserfolge einer 15-jährigen Geschichte
Quintessenz
Wieso ist Gentransfer attraktiv für den Doping?
Erwartungen insbezug auf Leistung und Tarnung
Lesen sie vor
allem
Welche konkrete Möglichkeiten gäbe es fuer Gendoping? im diesen orange
Box
Praktische Perspektiven, Hürde, Detektionsmöglichkeiten,
Nebeneffekte, Risiko-Nutzen Bilanz
Schlussfolgerungen
Gendoping ist noch im sehr unreifem Zustand, trotzdem bewegt
sich jemand in dieser Richtung
Abschnitt 1: Konzepte
UNIFR
Rusconi
2006
Gewebe, Zellen, Genen
Genfunktion, Genmanipulation
Was ist eigentlich einen Gen?
Was man sich vorstellt und was realisierbar ist
mit Dentransfer
1013
1 Organismus ->
Zellen (10'000'000'000'000!!!),
in spezialisierten Gewebe und Organe
2 mm
2m
UNIFR
Rusconi
2006
0.2mm
0.02mm
Ergo
0.001mm


DNA
RNA
Protein
in 1 cm3 -> 1'000'000'000 Zellen
um Gentransfer zu erzielen muss man
neue DNA Molekuele in den Zellkerne
dieser Zellen einschleusen
UNIFR
Rusconi
Das Motto: 'ein Gen = eine Funktion'
ist definitiv veraltet
DNA
RNA(s)
2006
Protein(s)
Transcription / translation
Gene expression
GENE
2-5 FUNCTIONS
Ergo:
die Nebeneffekte eines Gentransfers koennten viel
weiter gehen als man sich von den bekannten
Funktionen sich vorstellen darf
Aber, was ist eigentlich ein Gen?: ein Segment von
Erbinformation die durch eine Nanomachine interpretiert
wird
DNA
GENE
RNA
UNIFR
Rusconi
2006
Protein
Um die
Rolle zu leisten,
muss einen DNA Segment
Transcription
/ translation
FUNCTION




folgende Signale beinhalten
RNA Transkription (qualitativ und quantitativ)
RNA Maturatuion
RNA Translation (Uebersetzung in eiweisse)
RNA Abbau
RNA
Dilemma: wie kann man alles in einem verkuerzten
DNA Stück einpacken?
DNA
spacer
regulatory
coding
spacer
Was man sich vorstellt und was ist eigentlich machbar im
Bereich humaner Gentransfer?
UNIFR
Rusconi
2006
gesellschaftliches Mythos der Gentechnik
Ergo
Genmanipulationen werden die Schaffung von
gezielt
das gilt auch für Gendoping.
konstruierte transgene Monster-Armeen erlauben
Fuer die Nächste 30-50 Jahren müssen wir
keine transgene Athleten erwarten.
Aber somatisch veränderte Sportler sind wo
Realität
im Bereich des Machbares.
Die Schaffung transgene Menschen (mit erbbaren,
artifiziellen Genveränderungen) steht noch weit
Man 'begnügt' sich mit somatischem Gentransfer (nicht
permanent und nicht erbbar)
Abschnitt 2: Somatische Gentherapie (SGT)
UNIFR
Rusconi
2006
Definition und Anwendungen
Unterschiede zur konventionellen Therapie
Wieso 'somatisch'?
Anatomische Gentransfer-Wege
Somatische Gentherapie (SGT):
Definitionen und Anwendungen
efinition von SGT:
'Gene als Medikamente anwenden':
Behandlung von Krankheiten
mittels Gentransfer
NFP37 somatic gene therapy
www.unifr.ch/nfp37
UNIFR
Rusconi
2006
Chronische Behandlung
Akute Behandlung
Erbkrankheiten
Erworbene Krankheiten
Loss-of-function
Gain-of-function
Vorbeugende Behandlung
Pharmakologische Betrachtungen des DNA Transfers
UNIFR
Rusconi
2006
Konventionelle Medikamente
Protein MedikamenteDNA als Medikament







Mw 50- 500 Daltons
Synthetically prepared
Rapid diffusion/action
Oral delivery possible
Cellular delivery:
- act at cell surface
- permeate cell membrane
- imported through channels
Can be delivered as
soluble molecules
Ångstrom/nm size
rapidly reversible treatment







Mw 20 ’000- 100 ’000 Da
Biologically prepared
Slower diffusion/action
Oral delivery not possible
Cellular delivery:
- act extracellularly
Mw N x 1’000’000 Da
 Biologically prepared
 Slow diffusion
 Oral delivery inconceivable
 Cellular delivery:
- no membrane translocation
- no nuclear translocation
- no biological import
Can be delivered as
 Must be delivered as
soluble molecules
complex carrier particles
nm size
50-200 nm size
rapidly reversible treatment slowly or not reversible

Therapie mittels DNA



braucht spezielle formulierung des Materials (Vektoren)
ist viel komplizierter als konventionelle verabreichung
ist viel weniger reversibel als konventionelle pharmakologische Therapie
Wieso 'somatisch ' ?
UNIFR
UNIFR
Rusconi
Rusconi
2006
2003


Ergo:
Keimzellen: die Zellen die für somatische
die Vermehrung Gentherapie
des Organismus berürht
notwendigdie
sind
Keimzellen NICHT
 Die Veränderung ist nicht erbbar
Solmatische Zellen: alle andere Zellen des Körpers
Die drei anatomische Hauptwege fuer den Gentransfer:
UNIFR
Rusconi
2006
Ex-vivo
In-vivo
lokale Verabreichung
Ergo

In-vivo
systemische Verab.
die ex-vivo und die lokale in-vivo
Routen sind heute bevorzugt
V
Beispiele:
- Knochenmark
- LeberZellen
- HautZellen
Beispiele:
- Gehirn
- Muskeln
- Auge
- Gelenke
- Tumoren
Beispiele:
- Intravenös
- intra-arteriell
- intra-peritoneal
Abschnitt 3: Vektoren für Gentransfer
UNIFR
Rusconi
2006
Die zwei Klassen: viral und nicht-viral
Beispiele der Unterschiede
Mini-liste der gängigen Vektoren
Limitierungen der gängigen Vektoren
Zwei Klassen von SGT Vektoren: Viral bzw Nicht-Viral
UNIFR
Rusconi
2006
non viral gene transfer
(transfection)
A
Wieso sind Viren bessere Vektoren?


viral gene transfer
(Infection)
direct nuclear shuttling!
viel effizienter!
nicht virakle systeme haben folgende Hürde
noch nicht überschritten:
-B
Stabilität im Blut
- Spezifisches Andocken
- Vermeidung des intrazellulären Abbau
Nuclear envelope barrier!
- Transfer im Zellkern
- Integration ins Wirtsgenom
- Anti-apoptotische Funktionen
- Tarnung gegenüber dem Immunsystem
- ...
Praktisches Beispiel: Transfer eines Reporter-Gens mit
Transfektion (= nicht viral) oder Infektion (= Viral)
UNIFR
Rusconi
2006
Transfection
Zellen inkubiert mit
1'000'000 r-DNA/cell
während 12 Stunden
Infection
Zellen inkubiert mit
3 r-virus/cell
während 30 min
Ergo
 Gentransfer mit viralen vektoren ist millionenfach effizienter als
nicht viraler Gentransfer
Mini-liste der gängigen Vektoren für Gentransfer
UNIFR
Rusconi
2006
r-Adenovirus
Naked DNA
r- Adeno-associated V.
Liposomes & Co.
r- Retrovirus
Oligonucleotides
r- Lentivirus
RNAi
Ergo
 aber erinnern wir daran: "nobody is perfect..."
Limitierungen der gängigen SGT Vektoren
r-Adenovirus
- no persistence
- limited packaging
- toxizität immunogenizität
r-AAV
- no integration in host g.
- very limited packaging
- autoimmunität?
r-Retrovirus (incl. HIV)
- limited packaging
- zufälliger Insertion
- unstable genome
In generale
- Immunantwort
- limitierte Verpackungsraum
- Stillegung der Expression
- Ineffizienz der Produktion
Solutions:
- synthetic viruses
(“Virosomes”)
UNIFR
Rusconi
2006
Biolistic bombardment
or local direct injection
- limited area
Electroporation
- limited organ access
Liposomes, gene correction & Co.
- rather inefficient transfer
In generale
- ineffizienter transfer
- Seltene integration ins Wirtsgenom
Ergo
Solutions: synthetische Partikeln
 in die Zukunft werden
- improved liposomes
viele Virale Funktionen
integrieren
with viral properties
(“Virosomes”)
Abschnitt 4: der langsame Fortschritt der Gentherapie
UNIFR
Rusconi
2006
Klinische Versuche der letzten 15 Jahren
Erfolge und Meilensteine
Dokumentierte Nebeneffekte
UNIFR
15 jahre Gentherapie in der Klinik
Rusconi
2006
trials

100
Trotz intensiver Forschung hat
weniger als 2% der SGT Versuche
Phase III erreicht
40
20
Januar 2006:
1030 cumulative protocols
1500
5300 treated /enrolled patients
cancer
80
60
patients
Ergo
Ausnahmen (China!)
Jan. 1. 2004:Gendicine, by Sibiono
Inc. 2004, in Cina. 2600 behandelte
hered.
patienten in 2004, >50'000 in 2005?
Nov. 1. 2005:H101, by Shanghai
Sunway biotech, in Cina. Unbekannte
Angaben.
1990 1992
1994
1996
66% phase I
19% phase I-II
13% phase II
0.8% phase II-III
1.7% phase III
II
1000
I-II
I
500
vasc.
20% overall still pending
Infect.
or not yet Initiated !
www.wiley.com/genetherapy
1998
2000
Einige Meilensteine (auch wenn meistens nur in Phase I)
UNIFR
Rusconi
2006
1990, 1993, 2000, // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese 90/93/ C Bordignon 2000/2004
Anderson, 1990
Isner, 1998
Fischer,
Kirn, 2000
1997, 2000, Critical limb ischemia
2000, 2002
J Isner, I Baumgartner,
1998
25 Leben
2001
Manuel Grez
klar gerettet dank Gentherapie
2002
Sibiono
Hans Peter
Hossle
2000, Hemophilia
2003
Shenzen
Reinhard
Seger
M Kay, K High
~200 Leben
Intravascular adenoviral
2004/2005agents
Qualitätsverbessert
2000, 2002,
X-SCID
in cancer patients:
A Fischer, 2000/2002, Thrasher 2003
Lessons
from clinical
very
encouraging
data trials
from
~nnn Leben gerettet oder verbessert
(review)
just
initiated
clinical trial,
in China mit Gendicine oder H101 ?
dropped
2004?
2001, 2003 ONYX oncolytic Viruses
prospected
>10inpatients
licensed China 2005?
D Kirn (Cancer Gene Ther 9, p 979-86)
(approved China 2004)
Bordignon, 2000Gendicine
(ESGT, Stockholm)
-> ! Hum
Gene
Ther 16, 1016 ff.
2002,
science
296,
2410
ff)
2004, Chronic Granulomatous Disease
M Grez Frankfurt; R Seger Zürich
2004/2005 Gendicine (adeno-p53 vector)
L Peng, Sibiono Inc, Shenzen, China
H101 (approved in China, 2005)
Die meist befürchtete Nebeneffekte der SGT
UNIFR
Rusconi
2005

Immunantwort zum Vektor

Immunantwort gegenüber dem Frenden Gen

allgemeine Toxizität der viralen Vektoren

Verunreinigungen in den viralen Vektor-Präparate

zufälliger Integratikon ins Wirtsgenoms,
-> erhötes Tumor-Risiko

Verunreingung des Genoms von Keimzellen
Ergo
 Die Illusion der 90er Jahren ist verdunstet
 ZUstand der technologie ist noch unreif
 Indikation beschchränkt sich auf tödliche oder sonst schwere
Krankheiten
UNIFR
Beispiele von Nebeneffekte 1:
Von Pennsylvania bis Paris
Rusconi
2006
NY May 5, 1995, R. Crystal:
adenovirus, cystic fibrosis (lung)
one patient mild pneumonia-like condition
Trial interrupted and many others on hold.
UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson:
adenovirus , OTC deficiency (liver)
one patient (Jesse Gelsinger) died of a severe septic shock.
Many trials were put on hold for several months (years).
Paris, Oct 2, 2002, A Fischer:
retrovirus , x-SCID (bone marrow)
one patient developed a leukemia-like condition.
Trial suspended and some trials in US and Germany on hold until 2003.
Paris, Jan 14, 2003, A Fischer:
retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort
a second patient developed a similar leukemia
30 trials in USA were temporarily suspended
Paris, Jan 24, 2005, A Fischer:
retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort
a third patient developed a similar leukemia
Ergo
SGT kann unter dem heutigen
Technologischen Zustand Schwere
Nebeneffekte verursachen
Beispiele von Nebeneffekte 2:
Autoimmunität gegen EPO in experimentelle Affen
UNIFR
Rusconi
2005
Blood (2004), Vol. 103, No. 9, comment: pp. 3248-3249
Autoimmunity in EPO gene transfer (macaques)
Els Verhoeyen and François-Loïc Cosset
Papers:
- Chenuaud and colleagues (page 3303)
- Gao and colleagues (page 3300)
inadvertent autoimmune response in nonhuman primates resulting from
transfer of a gene encoding a self-antigen.
- homologous EPO cDNA via AAV vectors
- muscle or lung,
- supra-physiologic serum levels of EPO
Ergo

K High, ASGT June meeting 2004
[Abstract1002] Immune Responses to AAV and to

Factor IX in a Phase I Study of AAV-Mediated, Liver-Directed
Gene Transfer for Hemophilia B

Genexpression in den 'Falschen' Geweben
führt zu detektierbaren Unterschiede in der
Protein Faltung/Modifizierung
Die Unterschiede können Autoimmunität
auslösen
Ein wichtiger Signal fuer alle die träumen
sich mit EPO Gentransfer in den Muskeln
zu dopen.
Abschnitt 5: Potential von Gentransfer für
Dopingszwecke
Wieso bleibt es attraktiv?
Auf welchen Niveaus dürfte es anwendbar sein?
Welche Funktionen könnte man modulieren?
Beispiel Tierversuche (Lee Sweeney)
UNIFR
Rusconi
2006
Doping mittels Gentransfer = 'gene doping') : ...wieso
bleibt es so faszinierend trotz den SGT Schwierigkeiten
UNIFR
Rusconi
2006
Gentherapie (Zusammenfassung)
- Behandlung ist nicht erbbar
- Anwendbar für jede Krankheitsklasse
- Einige Vektoren wurden verbessert
- Das prinzip hat in einigen Fällen funktioniert
Dann:
...aber:
was macht Gentransfer so attraktiv für Doping?
- Noch nicht klinisch konsolidiert
- mystisches Glauben in der 'Macht der Gene'
- Heutige Technologie beinhaltet viele
Risiken 'natürlicher' als traditioneller D.
- erscheint
- Pionierzustand
- man stellt es sich als 'permanent' vor
- man stellt es sich 'besser' als konventioneller D.
- man meint es sei 'undetektierbar'
Ergo:
Obiektiv betrachtet, sollte Gentransfer
nur zur Behandlung von schweren
Krankheiten beschränkt bleiben.
Trotzdem interessiert sich den Doping
feld vermehrt fuer Gentransfer-Techniken
Welche Funktionen kommen in Frage
als Gendoping-Ziele?

UNIFR
Rusconi
2006
ex vivo, in hämatopoietische Gewebe:
pro-hematopo. (Epo receptor, oxygen transport...)

in vivo lokal (Beispiel Muskeln):
metabolische Verstärker, Wachstumsfaktoren,
Muskelfasern Modulatoren, Herzmodulatoredn
(glucose/oxygen, MGF, IGF-1, anti-myostatin, Epo)

in vivo lokal (beispiel gelenke und Sehne):Ergo:
Entzündungshemmer, Erholungsfaktoren, Reparaturfaktoren
Doping mittels Gentransfer
(anti-TNF, BMPs, ...)
hat vielfältige
Anwendungsrichtungen

in vivo systemisch:
metabolische verstärker, Hormone, anti-Schmerzfaktoren
(hormone metabolising enzymes, peptide hormones,
proenkephalins, ...)
Die Tierexperimente von Lee Sweeney (2004)
haben viel Staub aufgewirbelt...
UNIFR
Rusconi
2006
Transfer IGF-1 Gen (J. App Physiol 96, 1097 ff (2004))
Das System


IGF-1 -> growth factor for muscles
AAV Vector, intra muscular
Rat model , + or - training
Die Resultate
muscle force and muscle mass increased
beyond levels obtained in training
Ergo
ok, Dr. Sweeney, das gentransfer hat
einige Resultate gebracht, aber...
muscle force

... Hier sind unsere Fragen
- Kann man es auf Menschen
extrapolieren?
- Kg Muskeln zum transformieren?
- Wie kann man genügend Vektor
herstellen? +
training:
+
- Symmetrie der Effekte?
IGF-1:
+ +
- Wie steht es mit Nebeneffekte?
- -
-
Abschnitt 6: Gefahre und Limitierungen vom Gendoping
UNIFR
Rusconi
2006
Welche spezifische Nebeneffekte darf man sich erwarten?
Technische und objektive Limitierungen
Entdeckungsmöglichkeiten
Vergleich mit konventionellem Doping
Erwartete Nebeneffekte vom Gendoping
UNIFR
Rusconi
2006
Mittel- und Kurzfristig



Autoimmunität
Hyperimmunität
Toxischer Shock
Langfristig
Besonders gefährlich: Rücksichtlosigkeit
 Fibrose
 Ungeeignete Technik (niederes GCP Niveau)
 Tumoren

(ungeeigneter Vektor, geringe Kompetenz der Aerzte)
 Unzugänglichkeit zu spätere
 Ungeeignetes Material (niederes GMP Niveau!)
Gentherapie
(pathogen oder pyrogen kontaminiert )

Ungenuegender follow-up
Weitere Limitierungen
vom Gendoping
UNIFR
Rusconi
2006
Gentransfer mit viralen Vektoren
 wieder-verabreiching blockiert
 allgemeine und geno-Toxizität
Gentransfer mit nicht-viralen Vektoren
 allgemein ineffizient
 keine oder geringe Nachhaltung
Ergo:
Risiken und Hürden
scheinen höher als die
Nutzen
Weitere, Strategie-unabhängige Probleme
 Aufwendige und kaum zugängliche Technologie
 Langfristige Erhaltung der Genexpression ist schwierig
 Geringe Rückgängigkeit
 Unsymmetrie der Effekte (bei lokaler Verabreichung)
Entdeckungsmöglichkeiten
vom Gendoping
UNIFR
Rusconi
2006
Entdeckungstechnologien

Antibody detection (viral antigens)

r-nucleic acids detection (PCR)
recombinant protein / post-translational
modification detection (MALDI-TOF , IEF,Ergo
ELISA)
 Fremde Gen-reste darf man nur
kurzfristig nach Gentransfer in
Die Schwierigkeiten
Koerperflüssigkeiten aufspüren
 Anatomically difficult to detect (if locally  Fremde Gensequenzen sind aber
langfristig in Geweben detektierbar
administered)
 Abnormale Produkte (inkorrekt
-> but leaves permanent genetic marking
prozessierte Eiweisse) koennen
 Detection of nucleic acids cannot be easily entstehen und sind detektierbar
 Aenderung einiger Reglemente zur
performed in body fluids (except in early phase)
Detektion und Sanktion?
-> might require specific tissue biopsy

Vorteile und Nachteile vomGD
im Vergleich zum konventionellen Doping
Kategorie
Ergo:
Drug/protein
Gene-based
die Chancen sind theoretisch
ziemlich alle gegen schnell
die Gendoping-Option
Geschwindigkeit
langsam
Aber:
Rückgangigkeit
schnell
Langsam
das obige braucht gesunder Menschenverstand, eine seltene
Eigenschaft im Doping-Feld
Dosierung
einfach
schwierig
(siehe Veterinärprodukte oder klinisch ungetestete Produkte auf
Komplexitätsniveau
hoch
dem Dopingmarkt) tief
verbundene Risiken
je nachdem
hoch
Tarnung
möglich
schwierig
UNIFR
Rusconi
2006
Abschnitt 7: Schlussfolgerungen und Perspektiven
UNIFR
Rusconi
2006
Kurzantworte an komplexe Fragen
Danksagung
Schlussfolgerungen zum Gendoping:
(Plakative Kurzantworte zu FAQ )
UNIFR
Rusconi
2006
Denkt jemanden wirklich daran Gendoping bald anzuwenden?
bestimmt!
Welche Sportart wird vermutlich 'das erste Fall' schaffen?
Pferderennen?
Welches Land wird die erste Gendoped Athleten 'anbieten'?
...China?
Wird Gendoping effizienter als traditioneller Doping sein?
QuickTime™ et un décompresseur
None sont requis pour visualiser
cette image.
Nein
Ist es alles vielleicht nur einen Bluff (Abschreckungsmittel)?
vielleicht auch...
Wird es Opfern der Gendoping Nebeneffekte geben?
Ja, bestimmt
Welches Gen wird als erste gewaehlt für GD?
Epo, dann IGF-1
Wird Gendoping schwierig zum entdecken bleiben ?
Nein
Wieso bleibt GD so attraktiv?
Ignoranz, Ehrgeiz,
Gier
... Danke, und hoffen wir, dass der Sport uns noch über
lange Zeit Emotionen mit viel Fairplay schenken wird
Winterthurer Fortbildung
- Dr. D. und A. Kappeler
- Dr. P.E. Mullis
meine Mitarbeiter an der UNIFR
für evenktuelle Fragen:
[email protected]
info zur SGT und download
dieser Slides Show :
www.unifr.ch/nfp37
UNIFR
Rusconi
2006
UNIFR
Rusconi
2002