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Diagnostik von Pockenviren Bund-Länder-AG „Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen“ Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts 06/01/2004 1 Gliederung • • • • Einleitung klinisches Bild Eingruppierung des Erregers der Pocken Diagnostik und Differentialdiagnostik – Elektronenmikroskopie – Nachweis von Nukleinsäuren – Erregeranzucht • Probenahme und Versand • Diagnostik aus Patientenmaterial und aus Umweltproben • Liste der Laboratorien zur Pockendiagnostik 2 Pocken • Erreger: Variola-Virus • Inkubationszeit 12 bis 14 Tage (7 - 19 Tage) • Hohe Viruskonzentrationen in Vesikeln und Krusten • Übertragung über Tröpfchen, hohe Viruskonzentration in Saliva • Letalitätsrate ca. 30 % (Variola major) bzw. ca. 1 % (Variola minor) 3 Pocken als Biowaffe 1754/67 Briten „schenkten“ Indianern in Nordamerika Pockenvirus-verseuchte Decken > 50% der Mitglieder der betroffenen Stämme starben 4 Pocken - klinisches Bild Tag 3 Tag 5 Tag 7 5 Klassifizierung von Chondropockenviren (Pockenviren der Vertebraten) Orthopoxviren Avipoxviren Capripoxviren Leporipoxvirus Parapoxvirus Suipoxvirus Molluscipoxvirus Yatapoxvirus Variola, Vaccinia, Affenpocken, Kuhpocken, Kamelpocken Geflügelpocken, Kanarienpocken Ziegenpocken, Schafspocken, Lumpy Skin Disease Myxomatose Orf, Pseudokuhpocken Schweinepocken Molluscum contagiosum Tanapocken, Yabapocken 6 Orthopockenviren Virus Variola Vaccinia Affenpocken Kuhpocken Kamelpocken Ectromelia Waschbärpocken Wühlmauspocken Uasin-Gisha-Pocken Taterapocken Infektionen bei Wirtsbereich Mensch eng Büffel, Kuh, Mensch, Schwein, breit Kaninchen, natürlicher Wirt? Menschenaffen, Affen, Mensch breit natürlicher Wirt: Eichhörnchen (?) Karnivoren, Kuh, Mensch, Ratte breit natürlicher Wirt: Gerbils, Nagetiere (?) Kamel eng Mäuse, natürlicher Wirt (Wühlmäuse?) eng Waschbär (racoon) breit? Wühlmäuse (vole) eng Pferd, natürlicher Wirt? mittel Tatera kempi (Gerbilart) eng 7 Übersicht über die Laboruntersuchungen • Elektronenmikroskopie – orientierende Schnelldiagnostik (ca. 30 min.) – Unterscheidung zwischen Herpesviren, Para- und Orthopockenviren • Nachweis von Nukleinsäuren/Sequenzierung – Unterscheidung zwischen verschiedenen Orthopockenviren (innerhalb von 24 h) • Virusanzucht – Nachweis der Vermehrungfähigkeit (Asservierung für weitergehende Untersuchungen) 8 EM-Differenzierung von Pockenviren und Herpesviren Herpesvirus Orthopockenvirus Parapockenvirus Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom 9 EM-Differenzierung Verschiedene Aspekte der Orthopockenviren (OPV) OPV: mit Virushülle OPV: M-Form OPV: M-Form+C-Form Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom 10 Elektronenmikroskopie • Fixierung des Probenmaterials (z.B. mit 4 % Formaldehyd in 0,05 M HEPES-Puffer pH 7,0 oder PBS) • Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % NatriumHypochlorid oder 2 % Peressigsäure) • Negativkontrastierung (stabile, stark adhäsive Trägernetze; als Kontrastmittel parallel Phosphorwolframsäure und Uranylazetat oder Ammoniummolybdat) 11 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand • Probenahme durch den verantwortlichen Arzt (1, 2) • Pockenbläschen mit Schere, Pinzette o.ä. öffnen (1) bzw. Schorf mit Pinzette entnehmen (2) • Vesikelprobe auf Objektträger, direkt oder mit Tuberkulinspritze (1) • Lufttrocknen (1, 2) • Inaktivierung (1, 2) • bruchsicherer Container (1, 2) • Sterile Umverpackung (1, 2) 1 Versand von Vesikelflüssigkeit 2 Versand von Vesikeln / Schorf Quelle Fotos: RKI Quelle: RKI 12 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand - Grid-Methode • EM-Trägernetz mit dunklen „Ober“- Seite für 2-3 sec auf die Bläschenflüssigkeit abdrücken, pro Läsion 2-3 Grids • Lufttrocknen in der Pinzette • Inaktivierung mit 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer • Versand: - beschriftetes Röhrchen - sterile Umverpackung Quelle Fotos: RKI 13 Nachweis von Nukleinsäuren • Inaktivierung des Probenmaterials (z.B. mit Lysispuffer 25-50 % Guanidiniumchlorid) • Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure) • Probenaufbereitung/Isolierung der DNA (Protease, AL-Puffer) • Nachweis von Nukleinsäuren – Consensus PCR (Vertreter der Orthopoxviridae OPV) – Differenzierung des Variola-Virus von anderen OPV (Sequenzierung z. B. crmB-Gen, ATI-Gen, HA-Gen oder validierte Varila-spezifische PCR ) 14 Erregeranzucht • Nur aus nicht-inaktiviertem Probenmaterial • Nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 (BSL4) • Eine Differenzierung erfolgt nach Präparation der Virus-DNA über PCR mit Sequenzierung und phylogenetischer Analyse 15 Gewinnung klinischer Proben Zusammenfassung der Möglichkeiten zur Probenahme: EM: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % FA 2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% FA 3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % FA 4) Direkter Abklatsch (Grid) fixiert mit 4 % Formaldehyd PCR: Aliquot in Reaktionsröhrchen (in einer Glove-Box) Benötigtes Material zur Probenahme: • Schutzausrüstung • Pinzette, Schere, Spritze, Objektträger, Grid (je nach Technik) • Versandröhrchen (z.B. Einfrierröhrchen) • Stoßsichere, auslaufsichere Umverpackung (mit Beipackzettel) Zur Fixierung/Desinfektion : • 4 % Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer (EM) • Lysispuffer AL, Puregene Kit, o. ä. (PCR) • Desinfektionsmittel zur Außendekontamination 16 Gewinnung von Umweltproben (1) • Probenahme durch Einsatzkräfte (z.B. Feuerwehr) • Sicherstellung, dass kein explosiver Stoff / kein chemischer Kampfstoff enthalten ist • Risikoanalyse: – Fall 1: geschlossenes Behältnis – Fall 2: geöffnetes Behältnis (a) Feststoff, (b) Pulver, (c) Flüssigkeit – Fall 3: Freisetzung • • • • • Schutzkleidung anlegen Probenahme Außendesinfektion des Probenahmegefäßes Stoßfeste Umverpackung Beschriftung der Umverpackung (Fundort, Datum, Uhrzeit) 17 Gewinnung von Umweltproben (2) • Schwarzbereich: durch Probe kontaminierter Bereich – Schutzanzug mit positivem Druck – Raum verschließen – Desinfektion der Oberflächen (Entscheidung, ob und wann ) • Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse) – Außendesinfektion des Probenahmegefäßes – weitere Verpackung des Probenmaterials – Desinfektion der Schutzanzüge etc. • Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich – Betreten nur nach Desinfektion der Schutzkleidung – Nur steril verpackte Probe 18 Probentransport • Schnellstmöglicher Probentransport zum Labor (Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen.) • Information des Ansprechpartners im Labor • Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und Anforderungen an die Diagnostik • Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll (inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten) • Persönliche Übergabe durch vorab bestimmten Kurier (Übergabeprotokoll wird momentan erstellt) • Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das Labor an den behandelnden Arzt oder zuständigen Amtsarzt 19 Pockenvirusdiagnostik Umweltprobe Klinische Probe z.B. Rachenabstrich; Blut; Vesikelinhalt; Krusten Probenasservierung Untersuchung im EM PCR Negativkontrastierung (Differentialdiagnose zu VZV) Orthopockenviren Orthopocken- und Variola-spezifische Primer bzw. Sonden positiv beide positiv Klinische Probe: Verdacht Umweltprobe: Verdacht z.B. Pulver, Erdprobe, Wasser, Abklatsch etc. 1. Fixierung für EM 2. Inaktivierung für PCR 3. Asservierung für Anzucht Anzucht in Zellkultur Differenzierung mit PCR Sequenzierung beide positiv Klinische Probe: bestätigt Umweltprobe: begründeter Verdacht Umweltprobe: bestätigt Vorbereitung von drei Probengefäßen: Die Schritte 1–3 werden bei klinischen Proben direkt bei der Abnahme von Patienten und bei „Umweltproben“ in einer Glove Box durchgeführt. Eine Anzucht von Pockenerregern ist nur in BSL-4-Laboratorien möglich. Nach Fixierung bzw. nach Inaktivierung können die Proben unter BSL-1/-2-Bedingungen weiter bearbeitet werden . 20 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (1) Verdacht auf Pockenviruserkrankung: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischer Probe 21 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (2) Bestätigt positiv: Positive Orthopockenvirus-/Variola-PCR aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (validierte PCR, Sequenzierung) oder Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung) (Anzucht von Pockenviren aus klinischem Material und Bestätigung von Variola mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung)) 22 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in “Umwelt”proben Verdacht: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus einer Umweltprobe begründeter Verdacht: PCR positiv für Orthopockenviren bzw. für Variola; Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) Bestätigung: Anzucht von Pockenviren zum Nachweis der Vermehrungsfähigkeit in Zellkultur und Bestätigung von angezüchtetem Variolavirus mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) 23 Vorschlag für Laboratorien zur Pockendiagnostik Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin Prof. Dr. H. Schmitz Dr. Stephan Günther 20359 Hamburg BSL 4 Institut für Virologie der Universität Marburg Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk Dr. Jan ter Meulen / Dr. Stephan Becker 35037 Marburg BSL 4 Robert Koch-Institut BSL 3 Konsiliarlaboratorium für EM-Erregerdiagnostik Dr. Hans R.Gelderblom Retrovirologie, Prof. Dr. Georg Pauli 13353 Berlin Niedersächsisches Landesgesundheitsamt Dr. Matthias Pulz Dr. Masyar Monazahian 30449 Hannover BSL 3 Institut für Medizinische Virologie Prof. Dr. H. W. Doerr Prof. Dr. Holger Rabenau der Johann Wolfgang Goethe-Universität 60596 Frankfurt/Main Sanitätsakademie der Bundeswehr Dr. Hermann Meyer Dr. Finke Institut für Mikrobiologie 80937 München BSL 3 BSL 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Oberschleißheim BSL 3 Dr. Gerbermann 85764 Oberschleißheim Institut für Medizinische Prof. Dr. Hans Wolf Prof. Dr. Wolfgang Jilg Mikrobiologie und Hygiene 93053 Regensburg BSL 3 24 Diagnostische EM-Laboratorien mit überprüfter Expertise* Institution Abteilung LUA Sachsen Standort Dresden IZW-Friedrichsfelde Elektronenmikroskopie BBGes-ILAT Institut für Lebensmittel, Arzneimittel FU Berlin, UKBF Inst. für Infektionsmed., Abt. Virologie BgVV FG 306 Robert-Koch Institut ZBS 4, Bildgebende Verfahren LVL Brandenburg Laborbereich Potsdam LVL Brandenburg Laborbereich BFAV Insel Riems Bernhard-Nocht-Institut Elektronenmikroskopie Universitätsklinikum Kiel Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Virologie Wehrwissenschaftliches Institut für Schutztechnologien, Virologie Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Virologie Uni Bielefeld Zentrum für Ultrastrukturelle Diagnostik Universität Marburg Institut für Virologie Justus-Liebig-Uni Gießen Institut f. Virologie, FB10, VetMed Justus-Liebig-Uni Gießen Inst.f.Hyg. u. Infektionskrankh. d. Tiere Dt. Primatenzentrum GmbH Abt. Tiermedizin u. Primatenhaltung LUA Sachsen-Anhalt Standort Stendal Univ.-klinikum Münster Institut f. Medizinische Mikrobiologie Universität Bonn Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Immunol. Zentrales Institut des Sanitätsdienstes d. Bundeswehr, Elektronenm. LUA, FB Tiermedizin Inst.f. Tierseuchendiagnostik Staatl. Veterinäruntersuchungsamt, Diagnostik/ Virologie Universität Frankfurt/ Main Institut f. Medizinische Virologie Paul-Ehrlich Institut Abteilung 3/3 Uniklinikum Institut für Anatomie und Zellbioologie Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten, Inst. für Immunologie Ludwig-Maximilians-Univ. Institut f. Medizinische Mikrobiologie Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Uni-Klinikum Regensburg Zentrales EM-Labor, Pathologie * Expertise geprüft von der DVV PLZ 1099 10315 10557 12203 12277 13353 14469 15236 17493 20359 24105 29633 30625 33615 35037 35392 35392 37077 39576 48151 53105 56070 56073 59821 60596 63225 66421 72076 80539 85764 93042 Ort Dresden Berlin Berlin Berlin Berlin Berlin Potsdam Frankfurt/O. Greifswald-Insel Riems Hamburg Kiel Munster Hannover Bielefeld Marburg Gießen Gießen Göttingen Stendal Münster Bonn Koblenz Koblenz Arnsberg Frankfurt/M. Langen Homburg / Saar Tübingen München Oberschleißheim Regensburg 25
