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Target Identification and Animal Models
Das menschliche Genom könnte nach optimistischen
Schätzungen 5000 bis 10000 neue drug targets
enthalten.
Alle jemals eingesetzten Medikamente zielten auf
etwa 500 targets auf molekularer Ebene ab.
Aktuell kommen auf alle Medikamente am Markt nur
120 targets.
Die 100 meist verkauften Medikamente zielen gar nur
auf 43 Proteine ab.
Gibt es also nur wenige sog. valid targets ?
Gibt es zu wenig Information über sog.
drugable targets ?
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
1
Innovation vs. „me too“
Neue chemische Verbindungen (new molecular entities)
und neuartige targets
COX2 Arthritis celecoxib
PDE5 Erectile dysfunction
sildenafil
BCR-ABL Leukämie imantinib
Die meisten NMEs zielen auf
bereits bekannte targets ab.
Aber: müßen besser als
bestehende Verbindungen sein,
um zugelassen zu werden.
Lit: B.P.Zambrowicz & A.T.Sands Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 38
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
2
Typische Targets im Genom
Anteil am menschlichen Genom und Pharmaka am Markt
Bisher etwa 500 Enzyme als targets benutzt.
Möglicherweise 10.000 potentielle targets im Genom
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
3
Typische Targets
drug targets by biochemical class
Enzymes
47%
GPCRs
30%
Ion Channels
7%
DNA
1%
Intergrins
1%
Miscellaneous
2%
Other Receptors
4%
Transporters
4%
Nuclear
Receptors
4%
Aufteilung der auf dem Markt befindlichen Pharmaka
bezüglich ihrer biochemischen targets
Quelle: Hopkins & Groom, Nat.Rev.Drug.Disc. 1 (2002) 727
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
4
Validierung von targets
Wann ist ein auf genetischer Ebene identifiziertes target
tatsächlich auch brauchbar ?
Exprimierierung
Disease model
defined physiological
and clinical endpoints
Animal model
Es muß geklärt werden ob sich das target als therapeutic
target eignet und so ein valid target ist.
An dieser Stelle setzen dann Proteomics, Metabolomics und
Pharmacogenetics / genomics an.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
5
Informationsfluß in einer
drug discovery pipeline
Bioinformatik
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
6
Auf dem Weg zum target (I)
Für den Fall einer bekannten Krankheit ist die Identifizierung
eines geeigneten targets ein konvergenter Prozeß
Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
7
Auf dem Weg zum target (II)
RNA
target protein
Exprimierung
Modifikationen
DNA
Verwendete Techniken zur Identifizierung von targets
Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
8
Auf dem Weg zum target (III)
Forward genetics: Screening von Verbindungen gegen
Variationen des Phänotyps und Mutationen
Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
9
Auf dem Weg zum target (IV)
orthologues genes
Identified gene
Animal model
Reverse genetics: Veränderung des Genotyps durch
selektive Mutationen
Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
10
Auf dem Weg zum target (V)
Der Bioinformatische Ansatz
zu neuen targets im Idealfall
(Analysten Scenario)
In der Praxis stellt sich vor
allem die Frage:
„Nach welchen Genen muß
man suchen ?“
Lit: A.T. Sands Nature Biotech. 21 (2003) 31
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
11
Nach was muß man also im Genom suchen?
→ Ähnlichkeiten mit bereits verwendeten targets
Die Chance, innovative targets zu finden sollte die Suche
nach den folgenden targets bieten, die bisher unterrepräsentiert sind:
Kinasen und Proteasen
Transmembranproteine (GPCRs, Ionenkänale, Transporter)
DNA, RNA Bindungsstellen
Nukleare Rezeptoren (für Hormone)
(insb. orphan nuclear receptors siehe Vorlesung 10,
bisher nur wenige neue gefunden)
Nach vorsichtigen Schätzungen sollten sich etwa 100-150
neue und „wertvolle“ targets (vaild, drugable) finden lassen.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
12
Target validation
Wann ist ein target für therapeutische Zwecke tauglich, also valid ?
Wenn es in hinreichend kausalem Zusammenhang mit der
Krankheit steht:
a) Als Enzym, GPCR, Ionenkanal, Rezeptor usw.
Überprüfung durch screening mit Leitstrukturen aus
focused libraries
b) Als target auf DNA, RNA, mRNA Ebene selber
Überprüfung durch knockout Mutationen (siehe unten),
single point Mutationen (SNPs, siehe unten),
und gene silencing mittels durch RNA interference (RNAi)
(siehe siRNA)
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
13
siRNA for target validation
Kurze RNA-Stränge von 11 bis 28 Nucleotiden können an
komplementäre mRNA binden und zur deren Degradation durch
RNAsen führen. Diese RNA Interferenz (RNAi) dient in Eukaryoten
zur Abwehr von viraler RNA.
Daraus leitet sich auch deren Bezeichnung als small interfering
RNA (siRNA) ab.
Dieser Effekt kann sowohl zum Stillegen von mRNA genutzt
werden (gene silencing) als auch zum Aufspüren
potentieller targets auf mRNA Ebene.
Der therapeutische Einsatz von siRNAs ist durch deren
Stabilität (Applikationsform) und Selektivität
(unspezifische Bindung) begrenzt.
Lit: M.A. Lindsay Nature Rev. Drug Disc. 2 (2003) 831.
Y.Dorsett & T.Tuschl ibid 3 (2004) 318.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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target characterization
Im gesammten (menschlichen) Genom treten Variationen
auf. Statistisch gesehen
1 Basenpaar pro 1330 Basenpaare
macht etwa 3 ∙106 Unterschiede zwischen zwei nicht
verwandten Individuen.
Auch in den Genabschnitten die tatsächliche oder potentielle
targets kodieren, kommen durchschnittlich mehr als 9
solcher Basenaustauschungen vor.
Daraus folgt:
1. Nicht jede Variation ist ein Defekt oder bedeutet eine
Prädisposition (für eine Krankheit)
2. Die Auswahl potentieller targets wird nicht einfacher
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Pharmacogenetics & Pharmacogenomics
Die kausale Zuordnung eines klinischen Phänotyps (Allel bzw.
Krankheitsbild) zu einer genetischen Ursache wird durch die
Vielzahl der möglichen / vorhandenen Variationen des Genotyps
erschwert.
Als Polymorphismus bezeichnet man Allele die bei mindestens
1% der Population auftreten. D.h. diese Genotypen kommen
regulär vor.
Im Gegensatz dazu bezeichnet man Veränderungen des
Genoms die seltener als 1% auftauchen nur als Mutationen.
→ Sequenzierung der (in Frage kommenden) Genabschnitte
bei möglichst vielen Individuen.
Lit: D.B. Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Single Nucleotide Polymorphism
SNPs sind Unterschiede einer einzelnen Base in der
DNA die innerhalb einer Population auftauchen.
Die Wahrscheinlichkeit durch Sequenzierung SNPs bestimmter
Häufigkeit zu finden läßt sich wie folgt abschätzen:
Anzahl
Individuen
2
5
10
20
40
>1%
SNP Häufigkeit
>2%
>5%
>10%
>20%
4%
10%
18%
33%
55%
8%
18%
33%
55%
80%
59%
89%
99%
>99%
>99%
19%
40%
64%
87%
98%
34%
65%
88%
99%
>99%
Quelle: J.J. McCarthy „Turning SNPs into Useful Markers of Drug
Response“ in Pharmacogenomics, J.Licinio & M.-L.Wong (Eds.),
Wiley-VCH (2002) pp.35-55.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
17
Multiple SNPs
Noch schwieriger ist die kausale Zuordnung einer Reaktion auf
ein Medikament, wenn verschiedene von einander unabhängige
SNPs vorhanden sind. D.h. wenn keine schlüßige Hypothese
vorhanden ist.
Die Zahl der zu sequenzierenden Genabschnitte kann dadurch
undurchführbar groß werden.
Als Beispiele für sog. valid biomarkers hat die US FDA bisher
nur den Polymorphismus von CYP2D6 (Cytochrome P450) und
TPMT (Thiopurine S-methyl-transferase) herausgestellt.
Beide Enzyme sind maßgeblich an der metabolischen
Umsetzung vieler Medikamente beteiligt.
Mehr zum Polymorphismus von CYP2D6 in Vorlesung 10
Lit. P.C.Sham et al. Am.J.Hum.Genet. 66 (2000) 1616.
R.Weinshilboum & L.Wang Nature Rev.Drug Discov. 3 (2004) 739.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
18
Sukzesible Gene
Bisher hat man sukzesible Gene im Zusammenhang mit
folgenden Krankheitsbildern identifiziert:
Herztod
Neurodegenerative Krankheiten (Demenz, Alzheimer,...)
Epilepsie
Schizophrenie
Diabetes
Arthritis
Lungenkrankheiten (Cystische Fibrose)
Übergewicht
Lit. V.D.Schmith et al. Cell.Mol.Life Sci. 60 (2003) 1636.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
19
Gene Candidate Studies
Prinzipielle Vorgehensweise bei potentiellen Gen-Kandidaten
Auswahl des pharmazeutischen target Gens, entweder
bekanntes target (Enzym, Transporter, pathogenes Gen,..)
oder neu identifiziertes Gen aus DNA-Microarrays (auf mRNA
Ebene), Proteomics (auf Proteinenebene), Bioinformatik
Identifizierung von SNPs im ausgewählten Gen durch
SNP-Mapping in größerem Maßstab, Bestimmung der AllelHäufigkeit und ethnischen Verteilung, Analyse der Haplotypen
Genotypisierung von SNPs in klinischen Studien
Identifizierung der Patientenpopulation, Statistische Analyse
Lit. H.Z.Ring & D.L.Kroetz Pharmacogenomics 3 (2002) 47-56.
Besonders empfehlenswerter Review
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Warum Tiermodelle ?
• Zur in vivo Verifikation des
Krankheitsmodelles
• Zum in vivo screening
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Modellorganismen
Bevor man Mäuse und andere Säugetiere zum in vivo screening
verwendet, werden andere Modellorganismen herangezogen die
über entsprechende orthologe Gene verfügen.
Größere Zahl an zum
Menschen orthologer Gene
Zunehmend komplexere
Organismen
Steigender Aufwand und
Kosten bei Experimenten
Literatur :
R. Knippers Molekulare Genetik 8. Auflage
S. 498-503 Modellorganismen, Knockout Technologie
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
22
Was leisten animal models ?
Zur in vivo Überprüfung eines Krankheitsmodelles können
Tiermodelle hilfreich sein.
1. Vergleich des targets in Tier- und menschlichem Genom.
2. Erzeugung von knockout Mutanten / transgenen Tieren
Das Vorhandensein eines adäquaten Tiermodelles ist praktisch
immer die Voraussetzung für die weitere Entwicklung zum
Medikament.
Literatur zu transgenen Mäusen:
R. Knippers Molekulare Genetik 8. Auflage
S. 522 Textbox Plus 18.2
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Warum mus musculus als Tiermodell ? (I)
• Zu 99% aller Mausgene konnten homologe bzw.
orthologe Gene im Menschen identifiziert werden.
Lit: Nature 420 (2002) Ausgabe 6915 vom 5.12.2002
Mouse Genome Sequencing Consortium ibid pp.520-562.
Vergleich gemeinsamer Elemente in Mensch und Maus Chromosomen
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Warum mus musculus als Tiermodell ? (II)
• Damit sind von allen in Frage kommenden Modellorganismen
Mäuse als Säugetiere am nächsten verwandt
• Mäuse haben eine rasche Generationsfolge:
Mäuse sind mit 10 bis 12 Wochen geschlechtsreif. 22 bis
24 Tage nach der Paarung kommen 4 bis 8 Junge zur Welt, und
das 5 bis 6 Mal im Jahr. Eine einzige Maus kann im Jahr gut 40
Junge haben.
• Die verwendeten Zuchtlinien sind genetisch gesehen relativ
homogen (hoher Grad an Inzucht)
• Bisher gelingt die Erzeugung homozygoter transgener Mäuse
leichter als bei Ratten (Rattus norvegicus oder norwegicus)
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
25
KO-mouse models (I)
Bedeutung von knockout Mausmodellen im pharmazeutischen
Bereich:
Medizinische
Kategorie
Umsatz
(2001 in Mio.US$)
Immunologie
Neurologie/Psychatrie
Cardiology
Gastroenterologie
Metabolismus
Onkologie
Hematologie
20 000
19 000
13 000
12 000
11 000
7 000
7 000
Anzahl
targets
8
6
6
2
6
4
2
Anzahl
Medikamente
15
13
13
6
10
8
3
Quelle: A.T.Sands Nature Biotech. 21 (2003) 31
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
26
KO-mouse models (II)
Beispiele für den Einsatz von knockout Mausmodellen
in erfolgreichen Medikamenten:
Targets
Medikament
Maus Phänotyp zeigt:
Protonenpumpe
Lansoprazol
Histamine H1-Rezeptor Famotidine
neutraler Magen pH
Magensäure Sekretion
unterdrückt
ACE
AT1-Rezeptor
Enalapril
Losartan
niedriger Blutdruck
dito
COX2
COX1 und COX2
Celecoxib
Diclofenac
verringerte Entzündungen
weniger Schmerzen
Lit: B.P.Zambrowicz & A.T.Sands Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 38
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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Modellorganismen für Bluthochdruck
Bei Mäusen ist Bluthochdruck praktisch nicht bekannt. Durch
knock-in Mutationen übertrug man die Gene des Renin und
Angiotensin Systems von Ratten auf Mäuse (vgl. Vorlesung 2)
Lit: H.Ohkubo et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 (1990) 5153.
Umgekehrt zeigen knockout Mäuse bei denen das ACE Gen
fehlt, niedrigen Blutdruck.
Lit: J.H.Krege et al. Nature 375 (1995) 146.
Da aber Ratten für funktionelle Studien besser geeignet sind,
wurden auch transgene Ratten erzeugt, die das Ren-2 Gen
erhielten und dadurch starke Symptome des Bluthochdrucks
zeigten die wiederum mittels ACE-Inhibitoren und Angiotensin-II
Antagonisten therapierbar waren.
Lit: J.J.Mullins et al. Nature 344 (1990) 541.
Lit: Li-Na Wei Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 37 (1997) 119.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
28
Modellorganismen für Krebs
In der Krebsforschung spielen zwei Bereiche eine wesentliche
Rolle: Der Mechanismus der Entstehung von Krebs und die
therapeutische Effizienz der verschiedenen Medikamente.
Dabei wurden eine ganze Reihe transgener Mausmodelle
entwickelt, die eine erhöhte Sukzeptibilität für bestimmte
Krebsarten zeigen.
Generell scheinen bei Mäusen aber Tumore sowieso die
häufigste Todesursache zu sein, wenn man andere Faktoren
bei der Haltung ausschließt.
Auf die (ethische) Problematik der Patentierbarkeit transgener
Tiere an sich (ohne Anwendungsbezug) sei an dieser Stelle nur
hingewiesen.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
29
Weitere Tiermodelle
Höhere Säugetiere wie Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Schwein
werden häufig auch zum Test auf metabolische und toxikologische
Eigenschaften von Verbindungen eingesetzt.
Insbesondere der Vergleich von Screening Ergebnissen der
metabolischen Umsetzung von Wirkstoffen mit denen aus in E. coli
exprimierten CYP P450 Enzymen ist interessant, um das
„geeignete“ Tiermodell auszuwählen.
Zukünftig dürfen sich allein schon aus Kostengründen transgene
Mäuse das bevorzugte Tiermodell bleiben.
9. Vorlesung
Modern Methods in Drug Discovery WS04/05
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