Dominik Laumann
Aktive Spezifische Immunisierung (ASI)
als postoperative adjuvante
Tumortherapie
bei Patienten mit Nierenzellkarzinom
(NZK)
Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie,
Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum
Institutsleiter: Prof. Dr. Sören G. Gatermann
Aktive Spezifische Immunisierung (ASI)
als postoperative adjuvante Tumortherapie
bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (NZK)
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Dominik Laumann aus Kenzingen
im Jahr 2000
Dekan:
Prof. Dr. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. F. W. Falkenberg
Koreferent: PD Dr. B. M. J. Sanner
Tag der mündlichen Prüfung: 03.Mai 2001
Meinen Eltern und meiner Frau in Liebe und
Dankbarkeit gewidmet
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
4
TABELLENVERZEICHNIS
5
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
6
1 EINLEITUNG
8
1.1
THEMA UND PROBLEMATIK DER VORLIEGENDEN ARBEIT
8
1.2
DAS NIERENZELLKARZINOM
9
1.2.1
EPIDEMIOLOGIE UND ÄTIOLOGIE
9
1.2.2
PATHOLOGIE UND STADIENEINTEILUNG
9
1.2.3
DIGNITÄT UND PROGNOSE
12
1.2.4
KLINIK UND DIAGNOSTIK
14
1.2.5
THERAPIE
15
1.2.5.1
Chirurgische Therapie
15
1.2.5.2
Chemotherapie
16
1.2.5.3
Hormontherapie
16
1.2.5.4
Immuntherapie des NZK
17
1.3
TUMORIMMUNOLOGIE
17
1.3.1
TUMORANTIGENE
17
1.3.2
IMMUNREAKTION GEGEN TUMOREN
18
1.3.3
AUSWEICHEN DES TUMORS VOR DER IMMUNANTWORT (IMMUNE-ESCAPE)
19
1.3.4
TUMORIMMUNDIAGNOSE
20
1.3.5
TUMORIMMUNOLOGIE DES NZK
20
1.4
1.4.1
TUMORIMMUNTHERAPIEN
MONOKLONALE ANTIKÖRPER
22
22
1.4.1.1
Allgemeines
22
1.4.1.2
Bedeutung von MAK in der Therapie NZK
23
1.4.2
ZYTOKINE
24
1.4.2.1
Allgemeines
24
1.4.2.2
Bedeutung der Zytokine in der Therapie des NZK
26
1.4.3
ADOPTIVE IMMUNTHERAPIEN MIT LAK BZW. TIL
28
1.4.3.1
Allgemeines
28
1.4.3.2
Bedeutung von LAK und TIL in der Therapie des NZK
29
1.4.4
1.4.4.1
AKTIVE SPEZIFISCHE IMMUNTHERAPIEN
Allgemeines
30
30
-21.4.4.2
Tiermodelle für eine Tumorimmunisierung
31
1.4.4.3
Adjuvantien in der Tumortherapie
33
1.4.4.4
NDV als Adjuvans - Struktur und immunologische Funktion
33
1.4.4.5
ASI in der Therapie verschiedener Tumoren
35
1.4.4.6
ASI beim NZK
36
2 METHODEN UND MATERIALIEN
2.1
KLINISCHE STUDIE, VORPHASE
39
39
2.1.1
PLANUNG DES STUDIENKONZEPTES
39
2.1.2
EIN- UND AUSSCHLUßKRITERIEN DER STUDIE
40
2.1.3
PATIENTEN
40
2.1.4
KONTROLLGRUPPE
42
2.2
KLINISCHE STUDIE: DIE AUTOLOGE TUMORVAKZINE
42
2.2.1
NEPHREKTOMIE UND TRANSPORT
42
2.2.2
TUMORAUFARBEITUNG
43
2.2.2.1
Präparation und Dissoziation
43
2.2.2.2
Reinigung des Pellets
43
2.2.2.3
Bestimmung von Zahl und Vitalität der Tumorzellen
43
2.2.2.4
Einfrieren der Zellen in Kryotubes
44
2.2.3
2.3
STERILKONTROLLEN
KLINISCHE STUDIE, IMMUNISIERUNG
44
45
2.3.1
VORBEREITUNG DER VAKZINE ZUR APPLIKATION
45
2.3.2
IMMUNISIERUNGEN
46
2.4
KLINISCHE STUDIE, NACHSORGE
47
2.4.1
ROUTINE-FOLLOW-UP
47
2.4.2
HAUSÄRZTLICHE NACHSORGE
47
2.4.3
DOKUMENTATION
48
2.4.4
STATISTIK
48
2.5
KLINISCHE STUDIE: MATERIAL
49
2.5.1
CHEMIKALIEN
49
2.5.2
VERBRAUCHSMATERIAL
49
2.5.3
GERÄTE
50
2.5.4
GEBRAUCHSLÖSUNGEN
51
2.6
EXPERIMENTE I, ELEKTRONENMIKROSKOPIE
53
2.6.1
HERKUNFT DER PRÄPARATE
53
2.6.2
HERSTELLUNG DER PRÄPARATE FÜR DAS RASTERELEKTRONENMIKROSKOP
53
2.6.3
MATERIAL
54
-32.6.3.1
Chemikalien und Gebrauchslösungen
54
2.6.3.2
Geräte
54
2.7
EXPERIMENTE II, IMMUNFLUORESZENZ
55
2.7.1
HERSTELLEN VON GEFRIERSCHNITTEN
55
2.7.2
HERSTELLEN VON ZELLZENTRIFUGATEN
55
2.7.3
GEWINNUNG VON LYMPHOZYTENSUSPENSIONEN
55
2.7.4
IMMUNFLUORESZENZ
56
2.7.5
MATERIAL
57
2.7.5.1
Chemikalien
57
2.7.5.2
Puffer
57
2.7.5.3
Geräte
58
3 ERGEBNISSE
3.1
KLINISCHE STUDIE: WEITERENTWICKLUNG DER METHODIK
59
59
3.1.1
INTERDISZIPLINÄRE ZUSAMMENARBEIT
59
3.1.2
METHODISCHE VEREINFACHUNG
60
3.1.3
ZELLKULTUREN
61
3.2
3.2.1
KLINISCHE STUDIE:PATIENTENERGEBNISSE
PATIENTEN
62
62
3.2.1.1
ASI-Therapiegruppe
62
3.2.1.2
Kontrollgruppe
64
IMMUNISIERUNGEN
65
3.2.2
3.2.2.1
Durchführung
65
3.2.2.2
Probleme
65
3.2.2.3
Nebenwirkungen
66
3.2.3
PROGNOSEKATEGORIEN
66
3.2.4
AUSWERTUNG BEI DEN PRIMÄR METASTASENFREIEN PATIENTEN
69
3.2.4.1
Rezidive des NZK
69
3.2.4.2
Krankheitsverlauf mit und ohne ASI
70
3.2.4.3
Statistik
71
3.2.4.4
Metastasierungsmuster und Zusatztherapien
73
3.2.4.5
Prognose und Rezidiv
74
3.2.5
AUSWERTUNG BEI DEN PRIMÄR METASTASIERTEN PATIENTEN
75
3.2.5.1
Überlebenszeit mit und ohne ASI
75
3.2.5.2
Statistik
76
3.2.5.3
Krankheitsverlauf unter ASI
77
3.2.5.4
Krankheitsverlauf ohne ASI
79
-43.2.5.5
Zusatztherapien in der ASI-Gruppe
79
3.2.6
DTH ALS PARAMETER
80
3.2.7
EINZELFALLDARSTELLUNGEN
82
3.2.8
ANEKDOTISCHE DARSTELLUNG EINES SONDERFALLS: VERSAGEN DER ASI BEI EINER
PATIENTIN MIT MALIGNEM PARAGANGLIOM
86
3.3
87
EXPERIMENTELLER TEIL. ERGEBNISSE IMMUNFLUORESZENZ
3.3.1
GEFRIERSCHNITTE
87
3.3.2
ZELLZENTRIFUGATE
87
3.4
EXPERIMENTELLER TEIL: ELEKTRONENMIKROSKOPIE
89
3.4.1
PRÄPARATE
89
3.4.2
ERGEBNISSE
90
4 DISKUSSION
4.1
KLINISCHE STUDIE: WEITERENTWICKLUNG DER METHODIK
95
95
4.1.1
ENTNAHME UND TRANSPORT
96
4.1.2
PATHOLOGISCHE DIAGNOSTIK
96
4.1.3
ZELLVEREINZELUNG
97
4.1.4
HERSTELLUNG DER VAKZINE
99
4.1.5
QUALITÄTSSICHERUNG
4.2
KLINISCHE STUDIE: DISKUSSION DER PATIENTENERGEBNISSE
100
102
4.2.1
IMMUNISIERUNG UND ADJUVANTIEN
102
4.2.2
THERAPIEERGEBNISSE PRIMÄR METASTASENFREIER PATIENTEN
104
4.2.3
THERAPIEERGEBNISSE BEI DEN PATIENTEN MIT PRIMÄR METASTASIERTEN TUMOREN
106
4.2.4
STELLENWERT DER IMMUNTHERAPIEN IN DER THERAPIE DES NZK
108
4.2.5
STELLENWERT DER ASI IN DER THERAPIE DES NZK
109
4.3
EXPERIMENTE
112
4.3.1
IMMUNFLUORESZENZ
112
4.3.2
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
112
LITERATURVERZEICHNIS
114
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb.1: NZK-Subtypen, eigene Grafik..................................................................................10
Abb.2: Diagnostik beim NZK ..............................................................................................15
Abb.3: Immunologische Tumorabwehr ...............................................................................18
-5Abb.4: Tumorantigene, eigene Grafik..................................................................................22
Abb.5: Tiermodelle ..............................................................................................................32
Abb.6: Prognosekategorien I................................................................................................67
Abb.7: Prognosekategorien II...............................................................................................68
Abb.8: KFI Metastasenfreie Pat. ..........................................................................................70
Abb.9: Prognose und Rezidiv ..............................................................................................74
Abb.10: Überlebenszeit prim. metastasierte Pat. .................................................................75
Abb.11: Inkubationszeit 10 Minuten I .................................................................................90
Abb.12: Inkubationszeit 10 Minuten II ................................................................................91
Abb.13: Inkubationszeit 10 Minuten III...............................................................................91
Abb.14: Inkubationszeit 30 Minuten I .................................................................................92
Abb.15: Inkubationszeit 30 Minuten II ................................................................................93
Abb.16: Inkubationszeit 30 Minuten III...............................................................................93
TABELLENVERZEICHNIS
Tab.1: TNM-Klassifikation..................................................................................................11
Tab.2: Robson-Klassifikation ..............................................................................................11
Tab.3: V-Stadien ..................................................................................................................12
Tab.4: Klinische Symptome.................................................................................................14
Tab.5: Zytokine ....................................................................................................................24
Tab.6: Ergebnisse von Studien zu Zytokintherapien............................................................27
Tab.7: Erste Studienphase, Patientendaten ..........................................................................41
Tab.8: Nicht-ausgewertete Patienten....................................................................................62
Tab.9: TNM-und G-Stadien ASI-Gruppe ............................................................................63
Tab.10: TNM-und G-Stadien Kontrollgruppe .....................................................................64
Tab.11: Metastasen ASI-Gruppe, n=9..................................................................................68
Tab.12: Metastasen Kontrollgruppe, n=7.............................................................................68
Tab.13: Rezidive ASI-Gruppe..............................................................................................69
Tab.14: Rezidive Kontrollgruppe.........................................................................................69
Tab.15: Statistik; KFI/ASI ...................................................................................................71
Tab.16: Statistik; KFI/Kontrollgruppe .................................................................................72
Tab.17: Statistik; ÜZ/ASI ....................................................................................................76
Tab.18: Statistik; ÜZ/Kontrollgruppe ..................................................................................77
Tab.19: DTH Nicht-metastasierte Pat. .................................................................................81
Tab.20: DTH metastasierte Pat. ...........................................................................................81
Tab.21: Ergebnisse Fluoreszenzmikroskopie.......................................................................89
-6ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A.
A.dest.
ACTH
Ak
APC
ASI
AZ
BHI
CD
CR
DMEM
DMSO
DNase
DTH
EDTA
Fab
Fc
FITC
FITC
Gy
HAU
HBSS
HE
HEPES
HLA
I.E.
IFN
Ig
IL
LAK
LK
m
MAK, MAb
MHC
Arteria
Aqua destillata
Adreno-kortikotropes Hormon
Antikörper
Antigen-präsentierende Zelle
Aktive Spezifische Immunisierung
Allgemeinzustand
Brain-Heart-Infusion
Cluster of Differentiation
Complete Response, komplette Remission
Dulbecco´s modified eagle medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonuclease
Delayed
Type
of
Hypersensitivity;
Immunreaktion vom verzögerten Typ
Ethylendiamin-Tetraessigsäure
Fragment der Antigen-Bindung
konstantes Fragment
Fluoresceinisothiocyanat
Fluoreszeinisothiocyanat
Gray
Hämagglutinierende Einheiten
Hanks balanced salt solutions
Hämatoxilin-Eosin Färbung
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2ethansulfonicacid
Human Leukocyte Antigen
Internationale Einheiten
Interferon
Immunglobulin
Interleukin
Lymphokin-Activated Killer Cells
Lymphknoten
männlich
Monoklonale Antikörper
Haupthistokompatibilitätskomplex
-7min
NDV
NK-Zellen
NZK
OP
OR
PBS
PBS-G.
PE
PR
rIL-2
TATA
TIL
TNF
TNM
TSTA
UICC
V.
w
WHO
Z!HuIg
Minuten
Newcastle Disease Virus
Natürliche Killer-Zellen
Nierenzellkarzinom
Operation
Objective Response
Phosphate-buffered saline
-Gebrauchslösung
Probeexzision
Partial Response
Rekombinantes Interleukin-2
Tumorassoziierte Transplantationsantigene
Tumor-Infiltrating Lymphocytes
Tumor Nekrose Faktor
Tumorklassifikationssystem der WHO/UICC
Tumorspezifische Transplantationsantigene
Unio Internationalis contra Cancrum
Vena
weiblich
World Health Organization
Ziege-anti-humane Immunglobuline
-8-
1 Einleitung
1.1
Thema und Problematik der vorliegenden Arbeit
Thema der folgenden Arbeit ist die Durchführung und Auswertung einer Phase-IIStudie, in der Patienten mit fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen (NZK)
postoperativ mit einer autologen Vakzine aus Newcastle-Disease-Virus (NDV)modifizierten Tumorzellen nachbehandelt wurden.
In Vorstudien mußte zunächst sichergestellt werden, daß mit der verwendeten Methodik reproduzierbare Suspensionen ausreichend vitaler Tumorzellen hergestellt
werden konnten.
Ziel dieser Arbeit war es nachzuweisen, ob diese Therapie den Verlauf der Erkrankung bei den entsprechenden Patienten im Vergleich zu Patienten einer Kontrollgruppe günstig beeinflussen kann.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wird die Wirksamkeit dieses Therapieansatzes im
Vergleich zu anderen aus der Literatur bekannten Behandlungsstrategien erörtert
und versucht, seinen Stellenwert in der Therapie des NZK zu ermitteln.
Darüber hinaus geht es, wie in jeder Phase-II-Studie zu einer neuen
Behandlungsmethode üblich, um die Beobachtung und Dokumentation der
möglichen Nebenwirkungen.
Parallel dazu wurde in einer elektronenmikroskopischen Studie der Frage nachgegangen, ob und wie das NDV in der Inkubationszeit von 30 min die Oberflächen
der Tumorzellen elektronenoptisch nachweisbar verändert.
Mittels Immunfluoreszenz wurde zudem versucht, möglichst spezifische murine
MAK gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte NZK-Antigene (Ag) zu
entdek??ken. Außerdem wurde versucht, eine gegen Tumorantigene gerichtete
Antikörperantwort im Serum betroffener Patienten nachzuweisen und diese mit
dem Krankheitsverlauf zu korrelieren.
-91.2
1.2.1
Das Nierenzellkarzinom
Epidemiologie und Ätiologie
Obwohl seine Inzidenz nach neuesten WHO-Daten in fast allen untersuchten
Staaten deutlich ansteigt, ist das NZK mit einem Anteil von ca. 2% an der
Mortalität aller Malignome nach wie vor ein relativ seltener bösartiger Tumor.
Trotzdem erhält es besonders in Mitteleuropa eine zunehmende Bedeutung mit
Zuwachsraten in der Inzidenz zwischen 10% (Schottland) und 150% (Tschechien,
Italien, [62]). Das NZK kommt vor allem bei der Stadtbevölkerung vor und ist bei
Männern durchschnittlich mehr als doppelt so häufig anzutreffen wie bei Frauen.
Der Tumor ist eine Erkrankung des Erwachsenenalters mit einem Häufigkeitsgipfel
zwischen der 5. und der 7. Lebensdekade.
NZK leiten sich ebenso wie die Nierenadenome von den Zellen der Tubuli und
Sammelrohre ab (s.u.). Sichere ätiologische Faktoren konnten bislang, obwohl im
Tiermodell postuliert, für das humane NZK nicht eruiert werden. Als mögliche
Faktoren werden diskutiert: Tabakgenuß, bzw. das Kadmium im Zigarettenrauch
[2], Kaffeegenuß, genetische (von-Hippel-Lindau´sche Krankheit, polyzystische
Nieren), hormonelle (Geschlechtsprädisposition) und alimentäre (fett-und
fleischreiche Kost) Einflüsse [62].
1.2.2
Pathologie und Stadieneinteilung
Seit Grawitz1 "versprengte Keime der Nebennierenrinde" für das Ausgangsgewebe
der NZK gehalten hat, wurden diese als Grawitz-Tumoren oder Hypernephrome bezeichnet. Seit etwa 10 Jahren wird von der WHO der Begriff "Nierenzellkarzinom"
empfohlen [79], der unmißverständlich die epithelialen Tumoren, die von den
Harnkanälchen ihren Ursprung nehmen, in den Mittelpunkt des Begriffs rückt.
Die mittlerweile weltweit zunehmend anerkannte pathologische Systematik stammt
von Thoenes [151; 152] und wurde 1990 noch einmal erweitert [150]. Sie unterscheidet fünf Subtypen, die sich in der Regel auch ganz bestimmten Zellgruppen als
Ursprungsgewebe zuordnen lassen. Daneben stellt sie noch einen spindelzellig
pleomorphen Typ, der als anaplastische Variante eines der fünf Grundtypen zählt.
1Grawitz,
P. "Die sogenannten Lipome der Niere" 1883
- 10 So findet Thoenes am häufigsten das klarzellige NZK, dessen Grundzelltyp durch
einen hohen Glykogengehalt im HE-Präparat ein "klares" Zytoplasma zeigt. Es
stellt mit einem Anteil von 75% der NZK den Haupt-Subtyp dar, wächst
hauptsächlich solide und leitet sich von den Zellen des proximalen Tubulus ab.
Am zweithäufigsten (11%) findet sich das chromophilzellige NZK, dessen Zellen
weitgehend glykogenfrei sind und das wegen seines meist tubulo-papillären Wachstums früher als "papilläres NZK" bezeichnet wurde. Der Grundzelltyp stammt hierbei ebenfalls aus dem proximalen Tubulus.
Das chromophobzellige NZK (Häufigkeit 2-5%) stammt von den Zellen des Verbindungsstückes, das sehr seltene Duct-Bellini-Karzinom (ca. 1% der NZK) von
den Schaltzellen des Sammelrohres ab (Siehe auch Abb. 1).
Hiervon abzugrenzen ist das Onkozytom der Niere (Häufigkeit ca. 5%), das aus
mitochondrienreichen eosinophilen Zellen (Onkozyten im Sinne Hamperls2) besteht
und eine selbst definierte Tumorentität mit guter Prognose darstellt.
Die restlichen NZK sind dem spindelzellig-pleomorphen Typ, also der
entdifferen-zierten Variante der anderen Typen zuzuordnen.
Glomerulus
Sammelrohr
prox. Tubulus
dist. Tubulus
Verbindungsstück
Henle-Schleife
Typ
Häufigkeit
klarzellig
75%
chromophilzellig
11%
chromophobzellig Onkozytom
5%
5%
Rest: spindelzellig pleomorph (entdifferenziert)
Abb.1: NZK-Subtypen, eigene Grafik
2Hamperl,
H., 1931, Virchows Arch path Anat 282: 724-736
Duct-Bellini
1%
- 11 Die gängige Stadieneinteilung (Staging) wird nach der TNM-Klassifikation der
UICC vorgenommen, wobei T die Ausbreitung des Primärtumors, N den Lymphknotenbefall und M die Fernmetastasierung bezeichnet.
T-Stadien
Tx
T1
T2
T3
T3a
T3b
T4
Primärtumor nicht beurteilbar
Tumor unter 2,5 cm, auf die Niere begrenzt
Tumor über 2,5 cm, auf die Niere begrenzt
Tumor infiltriert größere Venen oder Gerota-Faszie
Tumor infiltriert perirenales Gewebe oder Nebenniere
Tumor mit Ausbreitung in Nierenvenen oder V. cava
Tumor überschreitet die Gerota-Faszie
N-Stadien
Nx
Lymphknotenmetastasen nicht beurteilbar
N0
N1
N2
N3
M-Stadien
Mx
M0
M1
Keine regionären Metastasen
Eine Metastase bis 2 cm Durchmesser
Eine oder mehrere Metastasen von 2 - 5 cm
Metastasen über 5 cm
Fernmetastasen nicht beurteilbar
Keine Fernmetastasen
Fernmetastasen
TAB.1: TNM-KLASSIFIKATION
Den Zusatz "p"erhält das T-Stadium nach histopathologischer Begutachtung.
Das
vor
allem
im
angloamerikanischen
Schrifttum
verbreitete
Klassifikationsschema zum Staging der NZK stammt von Robson et al.
(1968/1973) und stellt die anatomische Ausbreitung in den Vordergrund.
Stadium I
Tumor respektiert die Nierenkapsel
Stadium II
Infiltration des perirenalen Fettes, Begrenzung durch
die Gerota-Faszie
Stadium III
Einbeziehung der regionalen Lymphknoten und/oder
Einbruch in die Venen (V. renalis u./o. V cava)
Stadium IV
Einbruch in benachbarte Organe /Fernmetastasen
TAB.2: ROBSON-KLASSIFIKATION
- 12 -
Die Stadien wurden von Hermanek ergänzt, der den Einbruch des Tumors in eine
Nierenvene für ein entscheidendes prognostisches Kriterium hielt.
V0
Kein Einbruch in eine Nierenvene
V1
Einbruch in die Vena renalis
V2
Einbruch in die Vena cava
TAB.3: V-STADIEN
1.2.3
Dignität und Prognose
Wesentliche Charakteristika des NZK sind seine schlechte Prognose durch frühzeitiges Metastasieren bei langem asymptomatischen Verlauf und die nahezu
fehlenden prognostischen Parameter in nicht-metastasierten Fällen. So treten nach
Nephrektomie in mindestens 50% der nicht-generalisierten Fälle im Laufe des
ersten Jahres nach der OP Metastasen auf [21], in Studien an autoptischem Material
liegt diese Zahl laut Information aus demselben Artikel noch höher.
Zur Abschätzung der Dignität hat sich das früher herangezogene Größenkriterium
allein (Bell´sche Regel: <3cm Adenom, >3cm Karzinom) als nicht zuverlässig
erwiesen.
Auch der Nachweis invasiven und infiltrativen Wachstums (Staging) hat in Bezug
auf nicht organüberschreitende NZK keine wesentliche Bedeutung erlangt, da auch
ganz eindeutige Karzinome häufig durch eine Kapsel begrenzt sind, welche trotz
vorhandener Fernmetastasen häufig lokal nicht überschritten wird.
Da zudem auch das Wachstumsmuster allenfalls als sekundäres Merkmal
herangezogen werden kann, bleiben zytomorphologische, insbesondere nukleäre
Kriterien (Grading), um die Dignität eines NZK einzuschätzen [136; 142; 151].
Das Grading erfolgt durch einen Pathologen mittels visueller Abschätzung des Ausmaßes der Kernatypie:
"
GI
Tumoren, deren Zellen kleine, weitgehend runde Kerne mit
geringen Größenschwankungen und kaum nachweisbaren Nukleolen zeigen und extrem selten Mitosen aufweisen
- 13 "
"
("
G II
Tumoren, die sich in der Differenzierung zwischen G-I und
G-III befinden, also mittelmäßig differenziert sind
G III
Tumoren, deren Zellen entrundete polymorphe Kerne mit
deutlichen großen Nukleolen zeigen und sehr häufig Mitosen aufweisen
G IV
entdifferenzierte Tumoren, nicht von allen Autoren
gebraucht)
Die Prognose des NZK ist im allgemeinen schwierig zu stellen. Unbestritten ist allein, daß sie mit steigendem Grade ernster wird und daß wachsende anatomische
Ausbreitung (Stage) die Prognose ebenfalls tendenziell negativ beeinflußt. Während
im Stadium I nach Robson 66-90% der Patienten 5 Jahre nach der OP noch leben,
sinkt diese Zahl für das Stadium IV auf ca. 10% [32].
Die Granularität der Zellen des NZK weist auf relativen Mitochondrienreichtum hin
und ist entgegen früheren Auffassungen per se kein Kriterium zur Abschätzung der
Dignität, obwohl es tatsächlich so ist, daß das nukleäre Grading bei diesen mitochondrien-reichen Zellvarianten eher höher liegt [80].
Zytogenetische Auffälligkeiten lassen sich zwar in fast jedem Fall eines NZK nachweisen, ob und wie sie jedoch mit der Prognose korrelieren, ist in der Literatur umstritten [59; 71; 149]. Häufigste chromosomale Aberration ist der Verlust eines
Teils des p-Arms von Chromosom 3, so daß verschiedene Autoren hier einen Zusammenhang zu Tumorgenese und Wachstumsprogredienz herstellen (Verlust eines
Suppressorgens oder Antionkogens) [59; 158]. Zum Stadium der Erkrankung besteht aber offensichtlich kein Zusammenhang [71; 149], obwohl es auch Studien
mit anderen Ergebnissen gibt [163].
Dagegen scheint ein Zusammenhang zwischen dem DNA-Gehalt der Zellen, der
Antigenexpression auf ihrer Oberfläche und der Prognose der Tumorerkrankung zu
bestehen, dergestalt, daß aneuploide Zellinien generell zu verminderter Antigenexpression neigen, Fernmetastasen daher aggressiver wachsen als Metastasen diploider Zellinien [91; 103; 106].
Die mit dem MAK Ki-67 nachgewiesenen sog. Wachstumsfraktionen (der Antikörper ist gegen ein nukleär assoziiertes Proliferationsantigen gerichtet) konnten die
erhoffte lineare Korrelation mit der malignen Potenz des Tumors nicht zeigen [60].
Diese Arbeiten rücken vor allem deswegen mehr und mehr in den Vordergrund,
weil die objektive Einschätzung der malignen Potenz eines konkreten NZK in
- 14 nächster Zukunft allergrößte Bedeutung
Differentialtherapien anwenden zu können.
erhalten
wird,
um
rationale
Bei der heutigen Praxis, im Prinzip nur T4-(G3-)Tumoren mit Fernmetastasen in
die ungünstigste Prognosegruppe einzustufen, übersieht man die nahezu 50% der
"kurativ" resezierten NZK-Patienten mit T3/2-(G2-) Tumoren, die innerhalb eines
Jahres nach Nephrektomie Fernmetastasen entwickeln [21] und denen "dann erst"
eine schlechtere Prognose zugeteilt wird.
Diese Fälle, die bis dato noch mit keinem sicheren prognostischen Kriterium von
der anderen Hälfte der Tumorpatienten (die ja mitunter tatsächlich lebenslang tumorfrei bleiben) unterschieden werden können, stellen die eigentliche diagnostische
und therapeutische Herausforderung dar.
1.2.4
Klinik und Diagnostik
Das NZK ist meist symptomarm, 50% der Tumoren rufen Fremdsymptome in anderen Organsystemen hervor [2]. Die klassische Symptomentrias Hämaturie, Flankenschmerz und palpabler Tumor findet sich nur in 11% der Fälle;
Symptom
Häufigkeit
Schmerzen
Hämaturie
Tastbare Resistenz
Gewichtsabnahme
Bluthochdruck
Fieber
Klassische Trias
48%
40%-60%
25%-40%
37%
22%
19%
11%
Varikozele
Keine
1%
5%
TAB.4: KLINISCHE SYMPTOME [6; 20]
Die häufigsten Laborbefunde sind neben der Hämaturie die Erhöhung der Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BSG), eine Anämie und eine Hyperkalzämie; als
Tumormarker sind erhöhte Plasma-Renin-Spiegel, sowie ein Ansteigen des Erythropoetins zu werten. Gelegentlich werden sowohl bei den metastasierten, als auch bei
- 15 den nicht-metastasierten Fällen, paraneoplastische Syndrome beobachtet (StaufferSyndrom, eine Leberdysfunktion, ektope Hormonproduktion, hyperreninämische
Hypertonie).
In der Diagnostik hat die Abdomensonographie als sicheres nicht-invasives Verfahren in den letzten Jahren die zentrale Bedeutung bekommen, und zwar sowohl als
Instrument zur Diagnosestellung bei Verdacht auf NZK, als auch als Screeningmethode in Routineuntersuchungen. Schon jetzt nimmt dadurch die Anzahl der
frühzeitig entdeckten Tumoren erfreulicherweise zu.
Sonographie/Urographie
pathologischer Befund
Zyste
solider Tumor
fragliche Dignität
Computertomographie
fraglich
Angiomyolipom
Milzbuckel, etc.
maligne
Angiographie
Magnetresonanztomographie
Abb.2: Diagnostik beim NZK [32]
1.2.5
1.2.5.1
Therapie
Chirurgische Therapie
Bei lokalisiertem Krankheitsgeschehen ist die radikale Entfernung der tumortragenden Niere samt perirenalem Fettgewebe, den regionalen Lymphknoten und der Nebenniere bei frühzeitiger Ligatur der A. renalis die Methode der Wahl [6; 20]. Im
Falle des Nachweises von Tumorthromben in den Venen werden diese durch Cavotomie oder mittels Kathetern entfernt.
Auch solitäre Fernmetastasen, besonders im Falle günstigerer Prognoseparameter
des Primärtumors, wie mittlerer Grad oder diploider Chromosomensatz, stellen eine
Indikation zu radikaler chirurgischer Therapie dar [2; 66].
- 16 Generalisierte Ausbreitung des Krankheitsgeschehens -als solche muß man neben
Fernmetastasen auch Lymphknotenmetastasen und Fremdorganbefall (Stadium T4)
ansehen [39]- stellt eine Kontraindikation zur chirurgischen Therapie dar, da weder
eine Lebenszeitverlängerung, noch eine Verbesserung der Lebensqualität zu erreichen ist [2; 6]. Als symptomatisch-palliative Maßnahme bei sehr großen
Tumoren kann eine Operation dennoch notwendig werden [20]. In großen, stark
vaskularisierten Tumoren kann eine präoperative Katheterembolisation vorgenommen werden.
1.2.5.2
Chemotherapie
Zur systemischen Therapie des metastasierten NZK existiert bisher keine etablierte
Form der Chemotherapie. Einzig für Vinblastin (auch Vindesin) ist ein gewisser Effekt (ca. 15% Ansprechrate3[45]) beschrieben, den man unter Inkaufnahme teils erheblicher Nebenwirkungen durch Kombinationen mit Ifosfamid und !-Interferon
noch etwas steigern kann [164]. Für 5-FU ist außerdem ein wirkungsverstärkender
Effekt auf eine Interferon/Interleukin-Therapie experimentell gesichert [85]. Genaue Zahlen sind bei den letztgenannten Autoren nicht zu erhalten.
Das NZK in fortgeschrittenen Stadien gilt also als ausgesprochen resistent gegenüber Chemotherapien, was u.a. an dem Auftreten eines Multi-Resistenz-Gens und
der Expression entsprechender maskierender Proteine liegen könnte [6].
1.2.5.3
Hormontherapie
Nachdem in den 70-er Jahren die Steroidabhängigkeit des Nierengewebes und das
Vorhandensein von Steroidrezeptoren auch an NZK-Zellen nachgewiesen wurde,
unternahm man viele Studien mit Gabe von Hormonpräparaten als therapeutischem
Ansatz. Nachdem Bloom 1973 in einem Übersichtsartikel von einer Ansprechrate
von bis zu 15% geschrieben hatte (und dabei Studien mit völlig verschiedenen Designs in die Statistik miteinfließen ließ [9]), konnte deKernion 1978 in einer breiten
retrospektiven Studie bei 110 Patienten in keinem Fall ein objektives Ansprechen
auf eine Hormontherapie nachweisen [20].
3Ansprechrate:
Regredienz oder Stagnation der Gesamttumorzellmasse (soweit mit bildgebenden Verfahren
erfassbar) unter der entsprechenden Therapie
- 17 1.2.5.4
Immuntherapie des NZK
Das NZK, besonders das metastasierende, zeigt sich also als besonders therapierefraktär, so daß schon früh andere therapeutische Prinzipien als die klassischen oben
beschriebenen in den Mittelpunkt des Forschungsinteresses rückten. Aufgrund der
Beobachtung, daß es im Mittel bei 1% der Patienten zu spontanen Remissionen der
Metastasen nach Nephrektomie kommen kann [3; 50; 133], wurde schon frühzeitig
eine Kontrolle des Tumorwachstums durch das patienteneigene Immunsystem
vermutet und nach therapeutischen Ansätzen auf diesem Gebiet gesucht, s.u..
1.3
1.3.1
Tumorimmunologie
Tumorantigene
Schon Paul Ehrlich vermutete die Existenz von Tumorantigenen. Den Beweis dafür
führte Gorer 1937/38, er nannte die entdeckten Oberflächenantigene "tumorspezifische Transplantationsantigene (TSTA)" [28].
Mit Hilfe von Experimenten an Mäuse-Inzuchtstämmen wurde gezeigt, daß die
Tiere durch Immunisierung mit Tumormaterial gegen das Anwachsen eines
nachfolgenden Transplantats des gleichen Tumors geschützt sind [31].
Die TSTA sind "echte" Tumorantigene, die nur auf neoplastischen Zellen
erscheinen. Daneben konnte man noch die "tumorassoziierten (Transplantations-)
antigene" (TATA) nachweisen, die auf nicht-neoplastischen Zellen nur unter
bestimmten Bedingungen der Immuntoleranz exprimiert werden (fetale Antigene
etc.). Diese TATA werden auch Differenzierungsantigene genannt, da vermutet
wurde, daß frühe Entwicklungsantigene durch den Verlust bestimmter
Supressorgene auf den malignen Zellen wieder erscheinen, ja, gerade eine der
möglichen Grundlagen der malignen Transformation darstellen [118].
Die Tumorantigene sind oft spezifisch für den Einzeltumor (z.B. bei chemisch induzierten, wie den durch Methylcholanthren hervorgerufenen Tumoren), teilweise
aber auch gruppenspezifisch für bestimmte Tumorarten (v.a. virusinduzierte
Tumoren). Spontantumoren dagegen scheinen zwar TSTA und/oder TATA zu exprimieren, können damit aber offenbar keine oder nur sehr geringe Immunreaktionen hervorrufen. Am Rande sei bereits hier erwähnt, daß deswegen gerade die
- 18 Zellen
von
Spontantumoren
oft
Ziel
experimentell-therapeutischer
"Xenogenisierung", z.B. mittels Viren, geworden sind [105].
Gegen all diese antigenen Determinanten kann man naturgemäß auch eine humorale
Immunantwort nachweisen.
1.3.2
Immunreaktion gegen Tumoren
Die von Burnet [13] entwickelte Hypothese der "Immune Surveillance" besagt, daß
entartete Zellen ("aberrant cells") vom Immunsystem des Wirtes erkannt und
eliminiert werden. Demzufolge sollte die Entstehung eines Tumors im wesentlichen
durch eine primäre oder sekundäre Insuffizienz des Immunsystems mitverursacht
sein.
Obwohl diese Hypothese nicht experimentell bestätigt werden konnte - die nicht erhöhte Tumorinzidenz bei "Nacktmäusen" gegenüber normalen Mäusen spricht z.B.
dagegen [56] - wurde in den letzten zwanzig Jahren intensiv versucht, das Wechselspiel zwischen Tumor und Immunsystem zu erfassen, vorhandene Effektormechanismen gegen maligne entartete Zellen aufzuspüren sowie, wenn möglich,
immuntherapeutische Ansätze daraus zu entwickeln.
Das folgende Schema zeigt stark vereinfacht die Immunabwehr, wie sie im Prinzip
auch für Tumorzellen als Antigene angewandt werden kann:
! "
#
Abb.3: Immunologische Tumorabwehr
Die grundsätzliche Unterteilung der spezifischen Immunabwehr in humorale und
zelluläre Abwehrmechanismen gilt auch für die Immunreaktion gegen Tumorzellen.
- 19 Auch hier unterliegt das Zusammenspiel von T-Helfer-Zellen, T-Effektorzellen und
Makrophagen letztlich der Kontrolle durch die Gene des "Major histocompatibility
complex", die gekoppelt mit den jeweiligen Zielantigenen "selbst" und "nichtselbst" definieren und so die Immunantwort modulieren.
Endergebnis der Reaktionen des Immunsystems auf fremde Antigene ist die Ausbildung von Effektorzellen und spezifischen Antikörpern. Der Befund, daß bei
Mäusen eine Immunität gegen TSTA durch Übertragung von Lymphknoten- oder
Milzzellen, nicht aber durch Serum zu übertragen war, legte nahe, daß diese
Immunreaktion vorwiegend zellulär vermittelt ist. Effektorzellen sind die
Zytotoxischen T-Lymphozyten, die Immunreaktion ist dem verzögerten Typ (DTH)
zuzuordnen [55]. Auch bei Menschen mit Tumoren konnte mit autologen
Tumorzellen eine DTH-Reaktion hervorgerufen werden, die in einigen Fällen sogar
umgekehrt proportional zur Prognose war, d.h. je heftiger die
Überempfindlichkeitsreaktion (systemisch und lokal) nach 36-72 Std. war, desto
besser wurde der Tumor vom Immunsystem des Individuums bekämpft [89].
Es gibt allerdings Hinweise darauf, daß auch die Makrophagen und die Natürlichen
Killer-(NK-) Zellen an der Tumorabwehr beteiligt sind, entweder unspezifisch oder
im Rahmen der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (engl. ADCC) mittels spezifischer Antikörper und der mit Hilfe von Lymphokinen aktivierten T-Lymphozyten [56]. Die humoralen Effektormechanismen können -wie bei anderen
Fremdzellen- die Tumorzellen durch Komplement antikörpervermittelt lysieren,
durch Opsonisierung die Phagozytose vereinfachen oder durch Antikörper den Verlust der Zelladhäsion erreichen [118].
1.3.3
Ausweichen des Tumors vor der Immunantwort (Immune-escape)
Oft unterlaufen die Zellen eines Tumors die Immunabwehr, so daß es trotz nachzuweisender Immunogenität bestimmter Zellen zu weiterem Tumorwachstum kommt.
Durch Antigenmodulation wechselt die Antigenität ständig, der durch Antikörper
gegen Tumorantigene erzeugte Selektionsdruck führt sukzessive zur Ausbildung
immer weniger immunogener Zellklone, so daß eine spezifische Immunantwort nur
sehr insuffizient greift. Zudem wird vermutet, daß Tumorzellen die Suppressorzellreaktion stimulieren können und damit die spezifische Immunabwehr weiter schwächen [56].
- 20 Der Verlust vor allem der MHC-Klasse-I-Antigene ist signifikant mit gesteigertem
Tumorwachstum und erhöhter Metastasierungsfähigkeit vergesellschaftet [131].
Tumoren können Antigene von der Zellmembran in ihre Mikroumgebung sezernieren ("Antigen shedding" [141]), diese können durch Blockade der Effektorzellen
oder nach Bindung an Antikörper die Zytolyse der Tumorzellen verhindern.
Des weiteren besagt die Theorie des "Wegschleichens" ("Sneaking through"), daß
sehr kleine Tumorzellmengen das Immunsystem einfach quantitativ unterlaufen
können: die Antigenmenge reicht dann für die Entwicklung einer effektiven
Immunantwort nicht aus [105; 131]. Ist die Antigenmenge zu groß, führt der
gegenteilige Effekt ("overriding") ebenfalls zu einer mangelhaften Kontrolle durch
das Immunsystem.
1.3.4
Tumorimmundiagnose
Die Immundiagnose von Krebserkrankungen kann auf zwei grundsätzliche Ansätze
zurückgeführt werden. Der eine beschäftigt sich mit der Auffindung von Tumormarkern im Serum der Patienten zur Verlaufskontrolle der Erkrankung, während
der andere sich mit dem Status der Wirt-Antitumor-Immunreaktion selbst
beschäftigt.
Die Bestimmung von Tumormarkern im Serum ist längst klinischer Alltag, die Detektion tumorspezifischer Antigene (z.B. im Serum oder im Knochenmark der Tumorpatienten) heute noch nicht möglich.
Die Feststellung des Status der Immunreaktion, d.h. der Nachweis des Ausmaßes
einer Immunantwort gegen bestimmte Antigene steht noch auf der Stufe des
Tiermodells; in der vorliegenden Studie wurde u.a. versucht, eine Antikörperreaktion gegen Tumorzellen mittels Immunfluoreszenz nachzuweisen und, wenn
möglich, im Krankheitsverlauf zu quantifizieren.
1.3.5
Tumorimmunologie des NZK
Oosterwijk et al. beschrieben 1986 die Entdeckung eines G250 genannten MAK,
der ein NZK-Membranantigen erkennt, welches sich in normalem Nierengewebe
nicht findet [90]. 1989 beschreiben v. Dijk et al. die Induktion einer T-Zellvermittelten Zytotoxizität durch bi-spezifische MAK, die sowohl dieses NZKassoziierte Antigen G250, als auch das CD3-Antigen der T-Lymphozyten erkennen
- 21 [159]. In jüngster Zeit befasst sich eine Anzahl von Studien mit dem diagnostischen
und therapeutischen Einsatz von MAK gegen das NZK-assoziierte Antigen G250
[23; 67; 70; 137; 139], s.u. Es ist noch nicht klar, in welchem Maße weitere TSTA
und TATA bei Zellen des NZK vorhanden sind. Allerdings lassen viele klinische
Beobachtungen die Generierung Immunantwort gegen die Tumorzellen vermuten,
so die hohe Rate von Spätrezidiven auch nach Nephrektomie und das oft ungewöhnliche Metastasierungsmuster. Nicht zuletzt diesbezüglich auffällig sind die mit
einer Inzidenz von ca. 1% relativ häufigen Spontanremissionen, besonders auch von
Metastasen nach Entfernung des Primärtumors [3; 50].
Zudem untermauern viele Studien diese Vermutungen experimentell, so fand Kjaer
bei Patienten mit NZK im Gegensatz zu einer Kontrollgruppe in 58% der Fälle eine
zelluläre Immunreaktion gegen autologes Tumorgewebe und sogar eine signifikante
Korrelation zwischen der Stärke der Immunreaktion und der Abwesenheit von
Metastasen [54].
Dies wird auch von anderen Untersuchern bestätigt, Nakano fand mit Hilfe der
Mixed lymphocyte culture (MLC) eine Lymphozytenreagibilität gegen autologes
Tumormaterial bei NZK-Patienten, die umso schwächer ausfiel, je
entdifferenzierter der Tumor war [84].
Auch eine deutlich erhöhte Anzahl tumorspezifischer T-Helferzellen und TEffektorzellen konnte bei NZK-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen
nachgewiesen werden [14].
Die Befunde und Versuche zeigen die Bedeutung immunologischer Faktoren für die
Entwicklung und den Verlauf des NZK und belegen die potentielle Fähigkeit des
Organismus, eine Immunabwehr gegen die Tumorzellen auszubilden. Auch das
Hauptproblem der Immuntherapien zeigt sich hier deutlich: je weiter ein Tumor
fortgeschritten ist, je entdifferenzierter er ist und je weiter auch eine Metastasierung
fortgeschritten ist, desto weniger immunogen ist der Tumor tendenziell dann noch
und desto geringer sind dann die Chancen, mit einer spezifischen Stimulation des
körpereigenen Immunsystems die Progredienz zu beeinflussen.
- 22 1.4
Tumorimmuntherapien
Die wichtigsten derzeit erprobten Immuntherapien gegen malignes Tumorwachstum
können etwa wie folgt unterteilt werden:
1. Passive Ansätze, bei denen Antikörper (z.B. MAK gegen TSTA/TATA)
verwendet werden
2. Immunmodulatorische (restaurative) Ansätze, bei denen versucht wird,
postulierte Defizienzen auszugleichen und das Immunsystem mittels
Lymphokinen zu beeinflussen (z.B. Interleukin II, Interferone etc.)
3. Adoptive Ansätze, bei denen die Immunkapazität durch den Transfer aktivierter Lymphozyten erweitert werden soll (LAK, TIL)
4. Aktive Ansätze, bei denen das Immunsystem des Tumorträgers
spezifisch
oder
unspezifisch
stimuliert
wird,
um
eine
Tumorabstoßungsreaktion zu induzieren (ASI)
1.4.1
1.4.1.1
Monoklonale Antikörper
Allgemeines
Die Idee, die qualitativen und quantitativen Unterschiede der Antigenexpression
zwischen normalen und neoplastischen Zellen immuntherapeutisch auszunutzen, ist
nicht neu und wurde bereits von Paul Ehrlich erwähnt. Mit der Entwicklung der
Hybridomtechnik durch Köhler und Milstein 1975 konnte eine Vielzahl meist muriner MAK in größeren Mengen hergestellt werden, die prinzipiell auch gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sein können. Letztere sind Antigene, die auf Tumorzellen in höherer Anzahl exprimiert sind als auf normalen Zellen [30].
Onkofetale Antigene
CEA, CA 125 u.a.
Differenzierungsantigene
Onkogenprodukte
C-RAS, u.a.
260 F9, T 65 u.a.
Tumorspezifische Antigene
Abb.4: Tumorantigene, eigene Grafik
Wachstumsfaktorrezeptoren
Transferrin-, EGF-Rezeptor, u.a.
- 23 -
Die Onkofetalen (Carcinoembryonalen) Antigene sind normalerweise nach der Embryonalentwicklung nicht mehr nachweisbar, werden aber bei einigen Tumoren erneut exprimiert und sogar in die Körperflüssigkeiten abgegeben. MAK gegen diese
Antigene werden v.a. in der Verlaufskontrolle bestimmter Tumoren verwandt.
Die Wachstumsfaktorrezeptoren, zu denen auch der IL-2-Rezeptor gehört, zeigen
vor allem besser die Prognose individueller Tumoren, ihre Blockade kann aber auch
das Wachstum der betreffenden Zelle hemmen [58].
Die Differenzierungsantigene und die onkofetalen Produkte sind besonders Ziel von
MAK mit therapeutischer Zielsetzung geworden. Unkonjugierte MAK können hier
komplementvermittelt oder via ADCC zytotoxisch wirken, mit zytotoxischen,
radioaktiven oder biologisch aktiven Substanzen konjugierte MAK könnten die
jeweiligen Wirkprinzipien direkt zu den Tumorzellen transportieren [30].
Probleme in der therapeutischen Anwendung von MAK beim Menschen sind v.a. in
der murinen Herkunft der MAK begründet. Da Fremdproteine, also auch murine
MAK, vom menschlichen Immunsystem sofort als "fremd" erkannt werden [134],
wird eine körpereigene Antikörperreaktion hervorgerufen, die die Halbwertszeit der
MAK im Körper extrem verkürzt [78].
Außerdem beobachtet man oft eine allergische Typ-III-Reaktion durch Immunkomplexreaktion zwischen Antigen (hier der murine MAK) und dem dagegen gerichteten humanen Antikörper (HAMA), die sich u.a. in Atembeschwerden, Tachykardie,
Durchfall, etc. äußern kann und nicht selten zum Abbruch der Behandlung zwingt.
Besser verträglich wären diesbezüglich der Einsatz humaner MAK oder gentechnologisch erzeugter chimärer "humanisierter" muriner MAK [7].
1.4.1.2
Bedeutung von MAK in der Therapie NZK
Wie auch in der Therapie anderer Tumoren sind die eingesetzten MAK gegen Antigene/Epitope gerichtet, die auf Tumorzellen nur häufiger (möglichst um einige Zehnerpotenzen) vorkommen als auf Normalzellen [7]. Einige dieser MAK wurden in
experimentellen Studien am NZK erprobt, so von Singh et al., der die in-vitro Inhibition des NZK-Tumorzellwachstums durch den Methotrexat-konjugierten MAK
DAL K29 beschrieb [135]. Gegen einen Wachstumsfaktorrezeptor war Kochevars
MAK 5F4 gerichtet, er war in der Lage, in vitro die Proliferation von Zellen einer
NZK-Zellinie zu hemmen [58]. Von Chiou et al. wurde der MAK A6H nach viel-
- 24 versprechenden Versuchen im Nacktmausmodell auch bei Patienten mit NZK angewandt [18; 19].
Es verdichten sich die Hinweise, daß mit dem Antigen G250 ein NZK-assoziiertes
Antigen charakterisiert werden konnte [90], verschiedene Autoren berichten über
Studien zum Einsatz chimärer bi-spezifischer antiG250/antiCD3 MAK. Diese
können die Bindung von T-Lymphozyten an G250-Antigen exprimierende NZKTargetzellen und darüber die Lyse der Tumorzellen ermöglichen. Therapiestudien
wurden in-vivo allerdings durch die Immunreaktion gegen die injizierten murinen
MAK
erschwert
(HAMA-response)
[70;
159].
Diagnostische
Anwendungsmöglichkeiten zeichnen sich durch die radioaktive Markierung der
G250-MAK mit Jod 131 und nachfolgender Immunszintigraphie [67; 138], sowie
durch die Entwicklung immunhistochemischer Nachweismethoden an [139; 140].
1.4.2
1.4.2.1
Zytokine
Allgemeines
Für die Tumorbehandlung relevante Zytokine
Lymphokine
Leukozyten-Interferon (!-IFN)
Fibroblasten-Interferon (#-IFN)
Immun-Interferon ($-IFN)
Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-!)
Interleukine, v.a. der T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2
Wachstumsfaktoren (GF), z.B.
Epidermal growth factor
Platelet-derived growth factor
Insulin-like growth factor
Kolonie stimulierende Faktoren (CSF)
Granulozyten-Makrophagen CSF (GM-CSF)
Multi-CSF (Interleukin 3)
Granulozyten-CSF (G-CSF)
TAB.5: ZYTOKINE [132]
- 25 Die beiden für die Tumortherapie momentan bedeutendsten Substanzen sind das Interleukin 2 und das Interferon-!. Sie sollen im Folgenden näher beschrieben
werden.
Interleukin 2 wurde 1976 von Morgan als T-Zell-Wachstumsfaktor entdeckt und ist
ein von T-Helferzellen sezerniertes 15 kD Glycoprotein, das nicht-antigenspezifisch
die Proliferation und Entwicklung von spezifisch geprägten Vorläuferzellen in
Effektor-T-Zellen stimuliert [88].
Eine Steigerung der Zytotoxizität von T-Zellen, aber auch von NK-Zellen gegen
Tumorzellen wurde nach Gabe von IL-2 zunächst bei Mäusen [36], dann auch beim
Menschen beschrieben [69].
Atzpodien et al. beschreiben sogar einen signifikanten Anstieg der NK-Zell-Zahlen
gerade bei solchen Patienten, die auf eine IL-2/IFN-Kombination mit einer Ansprechrate (= Objective Response, OR) reagiert haben [5].
IL-2 ist bei verschiedenen Tumoren als Monotherapie und in Kombinationen mit
Interferon und/oder Zytostatika eingesetzt worden[157], zudem wird es zur in-vitroStimulierung von LAK (s.u.) verwendet.
Die Toxizität einer IL-2-Therapie ist allerdings erheblich, beobachtet werden
Fieber, Schüttelfrost, Erytheme, Alterationen des Zentralnervensystems und
Leberfunktionsstörungen. Die schwerste Nebenwirkung unter IL-2-Therapie ist ein
Syndrom der kapillären Leckage, das sich innerhalb von Stunden entwickeln kann
und zu Wasseransammlungen im Gewebe, sowie zu intravasaler Hypovolämie führt
[132].
IL-2 wird deswegen heute bevorzugt in Kombinationstherapien oder, so auch in der
vorliegenden Studie , im Rahmen aktiver Verfahren sehr niedrig dosiert angewandt.
Viele biologische Therapieverfahren, so auch die Lymphokintherapien, haben nach
Schirrmacher ein Niedrigdosenoptimum und müssen nicht, wie z.B. die Chemotherapeutika, in Dosen gerade unterhalb der Toxizitätsgrenze angewandt werden [118].
Interferon-!, der zweite nicht-antigenspezifische Mediator, dessen tumortherapeutische Wirkung seit längerem präklinisch und klinisch untersucht wird (Übersicht bei
[52]), zeigt als klassischer "Biological Response Modifier" ganz verschiedene
Wirkmechanismen.
So kann man neben einem direkten inhibitorischen Effekt auf das Zellwachstum allgemein eine Reihe immunmodulatorischer Wirkungen nachweisen, so z.B. eine
Verstärkung der Zytotoxizität von T-Lymphozyten und NK-Zellen und eine Erhöhung der Antikörperantwort.
- 26 Außerdem können Interferone Tumorzellen dazu bringen, mehr MHC-Klasse-IMoleküle und auch Tumorantigene auf der Oberfläche zu exprimieren und sie so
angreifbarer für eine Immunreaktion machen [29].
Seit in den letzten zehn Jahren die Entwicklung der rekombinanten DNATechniken die Produktion großer Mengen hochgereinigter Zytokine erlaubt, wurden
diese experimentell, dann aber auch im Rahmen zahlreicher Phase-I und -II-Studien
in der Therapie vieler Tumoren eingesetzt.
1.4.2.2
Bedeutung der Zytokine in der Therapie des NZK
Die ersten Studien mit einem Lymphokin als Monotherapeutikum beim NZK stammen von Quesada, der mit niedrig dosiertem Interferon-! eine OR von ca. 26% erzielte [143].
Dies konnte in späteren Studien nicht ganz bestätigt werden, die Ansprechraten (OR
= Komplette Remission, CR, + Partielle Remission, PR) pendelten sich selbst bei
Einschluß der minimalen Reaktionen nur bei etwa 16-20% ein [111], Übersicht bei
[37].
In neueren Studien wird diese Zahl sogar auf ca. 10 % herabkorrigiert. Im Mittel
dauern die Remissionsphasen etwa 10 Monate die für die Patienten erzielbare Lebensverlängerung ist minimal [77].
An Nebenwirkungen von IFN-Monotherapien sind neben Fieber, Abgeschlagenheit
und Müdigkeit vor allem Hypotension und Leberschäden beschrieben worden, die
zuweilen zum Abbruch der Therapie zwingen, aber in den allermeisten Fällen
reversibel sind [99].
Monotherapien mit IL-2 werden aufgrund der hohen Toxizität trotz gewisser positiver Ergebnisse [12] weitgehend nicht mehr durchgeführt [132].
Schon Quesada aber auch viele andere haben früh versucht, Interferon-! mit Zytostatika (meist Vinblastin, einem Agens mit beschriebener anti-NZK-Wirkung) zu
kombinieren. Obwohl es hierzu Studien mit beobachteten synergistischen Effekten
gibt [17], überwiegen bei weitem diejenigen Studien, die vor allem auf längere
Sicht hier keinen therapeutischen Vorteil feststellen konnten [24; 143].
- 27 Dagegen scheinen Kombinationen von !-IFN mit IL-2 die Toxizität gegenüber Monotherapien mit den beiden Präparaten nicht nur senken zu können, sondern auch
die Wirkung synergistisch verbessern zu können [165]. Deswegen bilden diese
Kombinationen zunehmend die Grundlage für zahlreiche Phase-II-Studien [20].
Atzpodien et al. berichteten 1993 sogar von einer Remissionsrate von 48% (17/35)
bei Anwendung einer Kombinationstherapie aus IL-2, !-IFN und 5-Fluoruracil [4],
eine kontrollierte Bestätigung bleibt hier abzuwarten.
Agens, Dosis
Pat.-zahl
CR
PR
%OR
!-IFN, 10x106 U/m²
!-IFN, 30x106 U/m²
26
20
0
0
7
1
16,6
5,0
!-IFN, 36x106, Vin, 0,1 mg/kg, alle 3 Wo.
!-IFN, 18x106, Vin, 0,1 mg/kg, alle 3 Wo.
18
18
0
0
6
2
33,3
11,1
IL-2, 5T. je 105 U/kg, dann LAK/IL-2/8-Std.
IL-2, 5T. je 105 U/kg, dann LAK/IL-2/8-Std.
36
35
4
2
8
3
33,3
14,2
IL-2, 3x106 U/m², 5Tage/Wo., für 5 Wo.
IL-2, 105 U/kg alle 8 Std. + tägl. Bolus
10
16
1
0
2
0
33,3
0
TAB.6: ERGEBNISSE VON STUDIEN ZU ZYTOKINTHERAPIEN [37]
Abk.: U:
Einheiten (Units)
kg, bzw. m²: kg Körpergewicht, bzw. m² Körperoberfläche
Vin:
Vinblastin
Die Tabelle soll zitathaft verdeutlichen, daß zu jeder ermutigenden Zytokin-Studie
jedweder Kombination mindestens eine ernüchternde zu finden ist und daß aufgrund der geringen Patientenzahlen bisher keinesfalls allgemeingültige Aussagen zu
machen sind.
Wie bei den meisten Immuntherapien zu beobachten, existieren besonders bei den
Lymphokintherapien bestimmte prognostische Parameter, die für hohe Ansprechraten besonders prädestinieren: Patienten mit hohem Karnowsky-Index (>80%), solche, die solitäre Lungenmetastasen aufweisen, aber interessanterweise auch Patienten, die im Jahr vor der Immuntherapie nephrektomiert wurden, schneiden im Therapieergebnis signifikant besser ab [77; 111].
Muss bringt die damit verbundenen Probleme auf den Punkt: die idealen Immuntherapie-Patienten sind eigentlich die mit normalem Karnowsky-Index und begrenzten
- 28 kleinen Metastasen, die also auch ohne Therapie noch lange weitgehend asymptomatisch weiterleben würden. Gerade diesen aber schlägt man dann bevorzugt eine
langwierige stark beeinträchtigende Therapie zur zweifelhaften Verbesserung der
Langzeitprognose vor [82].
1.4.3
1.4.3.1
Adoptive Immuntherapien mit LAK bzw. TIL
Allgemeines
1985 berichteten erstmals Rosenberg et al. von Ergebnissen einer neuen adoptiven
Immuntherapie bei fortgeschrittener Tumorerkrankung mit Lymphokin-aktivierten
Killer-Zellen (LAK), die zusammen mit IL-2 gegeben wurden.
LAK sind lymphatische Zellen (wahrscheinlich eine Subpopulation der Natürlichen
Killer-Zellen, NK), die nach in-vitro-Kultivierung über mehrere Tage in
Anwesenheit von IL-2 die Fähigkeit erwerben, Tumorzellen abzutöten
Die Lymphozyten wurden durch Leukapherese des Patientenblutes und eine anschließende Ficoll-Gradientenzentrifugation gewonnen und zusammen mit recht
hohen Dosen von bis zu 3*106U/m² Körperoberfläche IL-2 täglich reinfundiert.
Zunächst wurden bei 25 Patienten Remissionsraten von fast 50% (10 PR bei einer
CR) beschrieben [108]. Bis 1988 konnten dann 139 Tumorpatienten, davon 54 mit
NZK, behandelt werden. Die nach den Anfangserfolgen hohen Erwartungen
konnten auch hier wieder nicht ganz erfüllt werden. Denn trotz einer OR von etwa
33% waren die Remissionen von so kurzer Dauer, daß der Einsatz eines so
aufwendigen und auch belastenden Verfahrens in Frage gestellt werden mußte
[110].
Wegen der sehr kurzen Halbwertzeit des rekombinanten humanen IL-2, die in vivo
ca. 5 min beträgt, ist eine kontinuierliche i.v.-Dauerinfusion hoher Dosen
notwendig, um den aktivierten tumoriziden Status der adoptiv transferierten Zellen
aufrechtzuerhalten. Die Dosen und damit auch die toxischen Nebenwirkungen
reichen an die einer IL-2-Monotherapie heran.
Eine vielversprechendere Anwendung von adoptivem Zelltransfer mit IL-2 scheint
dagegen die Kombination mit Tumor-infitrierenden Lymphozyten (TIL) zu sein,
eine Lymphzytenpopulation, die nach längerdauernder Kultivierung von
enzymatisch präparierten Tumorzellsuspensionen mit IL-2 gewonnen wird. Dabei
- 29 werden die Tumorzellen nach kurzer Zeit von den stimulierten proliferierenden TLymphozyten lysiert und man erhält eine Lymphozytensuspension, von der man
eine gleiche zytotoxische Wirkung auch in vivo erwartet. Topalian beschrieb 1988
erstmals ihre therapeutische Anwendung bei humanen Tumoren [154].
Immunologische Grundlage dieser Präparationstechnik ist die Beobachtung, daß die
meisten Tumoren mehr oder weniger stark von lymphoiden Zellen infiltriert sind,
die, im Gegensatz zur Zusammensetzung des peripheren Blutes, eine eindeutige
Prädominanz für aktivierte CD8+ T-Lymphozyten aufweisen. Es konnten auf ihnen
zahlreiche Marker der T-Zell-Aktivierung, wie das MHC II-Molekül HLA-DR, der
Transferrin-Rezeptor oder das CD25-Antigen (IL-2-Rezeptor) nachgewiesen werden [153], so daß der Schluß nahe lag, hier eine durch Tumorantigene sensibilisierte
Lymphozytensubpopulation zu vermuten.
Während es sich also bei den LAK hauptsächlich um aktivierte NK-Zellen handelt,
sind TIL wahrscheinlich spezifisch aktivierte zytotoxische T-Lymphozyten, die größere Spezifität gegenüber dem Target aufweisen und die in der Lage sind, im
Körper zu rezirkulieren und verbliebene Tumorzellen zu finden und zu lysieren[20].
Schirrmacher et al. haben dies 1991 auch im Tiermodell (ESb-Lymphom bei Mäusen) nachweisen können, indem sie MHC-syngene anti-ESb-T-Zellen transferierten
und damit Mikrometastasen spezifisch eliminieren konnten [126].
1.4.3.2
Bedeutung von LAK und TIL in der Therapie des NZK
Unter den ersten Patienten mit Teilremissionen in der Pilotstudie von Topalian befand sich auch ein NZK-Patient, bei dem durch die Behandlung die Masse eines
Lymphknotenmetastasenpaketes eindeutig reduziert werden konnte. Daraufhin
konnten einige Phase I/II-Studien begonnen werden, die von tendenziell um 20%
Remissionsraten -bei allerdings sehr kleinen Patientenkollektiven- berichten [37].
Allerdings gibt es mittlerweile auch Autoren, die die Spezifität von TIL nach in-vitro-Versuchen gerade bei NZK-Zellen bezweifeln [46]. Belldegrun und de Kernion
haben 1992 eine Pilotstudie begonnen, die die Antitumor-Aktivität einer Kombination von TIL, in vivo mit Interferon vorbereitet, einer kontinuierlichen IL-2-Infusion und subkutan injiziertem IFN-! beim NZK untersuchen soll [20].
- 30 Rosenberg hat sich in neueren Studien mehr auf die Therapie des Melanoms konzentriert [51]. Auch die experimentelle Möglichkeit einer Therapie mit genmanipulierten, z.B. mit dem Interleukin-2-Gen transfizierten TIL, steckt noch in der vorklinischen Erprobungsphase [107; 110].
1.4.4
1.4.4.1
Aktive spezifische Immuntherapien
Allgemeines
Schutzimpfungen sind eine der größten Errungenschaften der Medizin im Kampf
gegen gefährliche Infektionskrankheiten; die Krankheitserreger, gegen die immunisiert wurde, werden bei einer Infektion sofort vom Immunsystem erkannt und
bekämpft. Die Immunogenität von Tumorzellen dagegen ist im allgemeinen so
schwach ausgeprägt, daß eine mögliche Immunantwort das Tumorwachstum nicht
stoppen kann.
Diesem Dilemma versucht man durch geeignete Manipulationen entgegenzuwirken.
Durch Infektion der Tumorzellen mit bestimmten Viren oder durch Zugabe bestimmter immunologischer Adjuvantien soll erreicht werden, daß die Immunogenität der Tumorzellen erhöht wird [117].
Voraussetzungen für die Entwicklung von Tumorvakzinen, die im praktisch klinischen Alltag anwendbar sind:
"
"
"
"
Die Vakzine sollte sicher sein, also nicht ihrerseits Risiken z.B. der
Infektion bergen und nur geringe Nebenwirkungen hervorrufen
Die Vakzine sollte so viele tumorassoziierte Antigene wie möglich
enthalten, wenn nötig zusammen mit immunstimulierenden Adjuvantien
Vakzinen mit einem breiten Antigenspektrum sind erforderlich, um dem
Problem der antigenen Heterogenität und der Selektion von Immune-escapeVarianten zu begegnen
Zeit und Arbeitsaufwand zur Vakzineherstellung sollte die klinische
Überprüfung in größeren Patientenkollektiven erlauben
- 31 1.4.4.2
Tiermodelle für eine Tumorimmunisierung
Schon früh wurde versucht, geeignete Tiermodelle für die Erprobung einer Tumorimmunisierung zu entwickeln. Die beiden wichtigsten sind in Abb.5 dargestellt, es
handelt sich um das L10-Leberkarzinom des Meerschweinchens, beschrieben von
Hanna et al. [33; 35] und das ESb-Lymphom der Maus, das von Schirrmacher et al.
verwendet wurde [124].
Aus der Literatur und aus den Modellversuchen ließen sich folgende Postulate für
eine aktive spezifische Immunisierung mit autologen Tumorzellen herleiten:
Die Immunogenität eines Antigens korreliert offenbar mit dessen Größe [49] und
wird durch die Art des Adjuvans entscheidend mitbestimmt [48]. Deswegen wurden
für Immunisierungsversuche meist komplette autologe Tumorzellen verwendet,
wobei sich lebende Zellen wiederum stärker immunogen zeigten als abgetötete Zellen [97]. Wegen der Gefahr des Anwachsens müssen sie allerdings unbedingt inaktiviert sein [33].
Suspensionen aus Zellmembranfragmenten waren nicht in der Lage, eine
äquivalente Wirkung zu erzielen, gemessen an der DTH und der Anzahl und dem
Aktivierungsgrad [169] von zytotoxischen T-Lymphozyten in der Bauchhöhle der
gesundeten Tiere. Im Schwamm-Matrix-Modell Schirrmachers wurden diese als
Effektorzellen der antineoplastischen Immunantwort nachgewiesen [168].
In den unterschiedlichen Tumorsystemen scheint ein Adjuvans, bestehend aus etwa
107Tumorzellen und den adjuvanten Agentien, intradermal appliziert, die beste
Wirkung zu erzielen [119].
- 32 -
Tier-Tumor-Modell
Maus
Meerschweinchen
mit L-10-Leberkarzinom; metastasiert
mit ESb-Lymphom; metastasiert hämatogen
lymphogen bevorzugt in die Lunge
bevorzugt in Leber, Knochen und Lunge
Tumorzellen zur Impfstoff-Herstellung
Gewinnung
aus Tumor durch enzym.Vereinzelung
der Zellen oder Aszites-Zellen
Aszites-Zellen oder
kultivierte Tumorzellen
Lagerung
in flüssigem Stickstoff (-196°C)
in flüssigem Stickstoff (-196°C)
Inaktivierung
Strahlendosis von 200 Gray
Strahlendosis von 100 - 200 Gray
Verstärkung der Immunogenität
Zumischen von Bakterien:
Infektion mit Viren:
10-100 mio. BCG auf 10 Mio.
10-100 Mio. NDV auf 10 Mio.
Tumorzellen pro Einzeldosis
Tumorzellen pro Einzeldosis
Impfung
am Primärtumor operierte
Tiere mit Metastasen
keine Impfung
5% Überlebende
Impfung 2-3 mal
in die Haut
45% Überlebende
Abb.5: Tiermodelle [33; 35; 124]
Impfung 2-3 mal
in die Bauchhöhle
50-80% Überlebende
keine Impfung
0-20% Überlebende
- 33 1.4.4.3
Adjuvantien in der Tumortherapie
Adjuvantien (lat.: adiuvare = helfen) sind Substanzen, die eine spezifische Immunantwort auf ein Antigen unspezifisch verstärken, wenn sie mit diesem zusammen
dem Organismus zugeführt werden. Für die maximale Wirkung sollte das Adjuvans
mit dem Antigen zusammen intradermal oder intramuskulär appliziert werden.
Seit den zwanziger Jahren hat man immer wieder Rückbildungen von Tumoren im
Zusammenhang mit Virusinfektionen (wie z.B. Masern oder Mumps) beobachtet.
Man untersuchte verschiedene Virusarten auf ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit. Cassel
ging davon aus, daß Viren diese über einen onkolytischen Mechanismus
bewerkstelligen [15]. Die moderne Immunologie konnte jedoch nachweisen, daß es
sich um eine immunologische Tumorbekämpfung handelt, in der die Viren als
Adjuvantien anzusehen sind.
Neben dem unten näher beschriebenen NDV wurden hierbei noch eine Reihe
anderer Substanzen eingesetzt, wie z.B. Bakterienextrakte (Corynebakterium
parvum, Bacillus Calmette-Guérin u.a.), Levamisol, Hefeextrakte (Candida
albicans) und Mineralsalze wie Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDA).
Klassische immunologische Adjuvantien, wie z.B. das Freund´sche Adjuvans, sind
für die intradermale Vakzinationstherapie dagegen meist zu toxisch für den
Patienten.
1.4.4.4
NDV als Adjuvans - Struktur und immunologische Funktion
Das NDV gehört zur Gruppe der Myxoviridae und ist ein RNA-Virus, das mit einer
Doppellipidschicht umgeben ist [109]. Es trägt auf seiner Oberfläche spikeförmig
aus der Membran hervorragende Moleküle, vor allem das Adhäsionsmolekül Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und ein Fusionsprotein. Ersteres agglutiniert z.B.
Hühnererythrozyten, was einen gut quantifizierbaren Vorgang darstellt. Als Maß für
die Virusmenge wurde daher die "Hämagglutinierende Einheit" (engl. HAU) eingeführt.
Das intakte Viruspartikel ist nahezu sphärisch und weist einen Durchmesser von ca.
100 nm auf. Bei der elektronenoptischen Beobachtung sind aber auch
Ausziehungen bis zu 500 nm Länge aufgefallen, die vermutlich durch die
Präparation zustande kommen [4]u.a.. Der Vorgang der Adhäsion, Fusion und
Penetration der Viren nimmt nur wenige Minuten in Anspruch [76], so daß davon
- 34 auszugehen ist, daß nach 30 min langer Inkubation (wie z.B. in der hier berichteten
Studie) die Viruscapside mit der Zelloberfläche verschmolzen sind und die RNA
sich bereits in DNA umgewandelt repliziert. Der in unserer Studie verwendete
NDV-Stamm "Ulster" hat zudem noch die Eigenschaft, daß nach Erstinfektion
keine kompletten Viruspartikel mehr gebildet werden können.
Das Virus hat ein breites Wirtsspektrum unter Vögeln, ist aber beim Menschen in
aller Regel apathogen und ruft nur sehr ausnahmsweise bei besonders exponierten
Personen Konjunktivitis und eine Störung des Allgemeinbefindens hervor [113].
Der Stamm "Ulster" ist selbst diesbezüglich unbedenklich, dauerhafte Schäden sind
noch nie beschrieben worden. Cassel beschrieb das NDV bereits 1965 als
antineoplastisches Agens [15].
Beverley berichtete von Tiermodellstudien, in denen er nach Immunisierung mit einer Vakzine aus Tumorzellen und NDV in Mäusen Immunität gegen die vitalen Tumorzellen nachweisen konnte [8]. Cassell legte vor allem Studien über die Anwendung der Viren in der Therapie des malignen Melanoms vor[16].
Schirrmacher veröffentlichte mehrfach Ergebnisse von Studien zum Substrat dieser
antineoplastischen Eigenschaften des NDV. Er fand neben der "Xenogenisierung"
der Tumorzellen durch Expression von NDV-Antigenen [120] eine deutliche Erhöhung der tumorspezifischen T-Zell-Antwort, ohne daß eine spezifische anti-virale
Immunantwort nachgewiesen werden konnte [114; 161].
Zudem erhöht eine NDV-Infektion offenbar die Produktion des Tumor-Nekrosefaktor-! (TNF-!) sowohl bei menschlichen Blutmonozyten, als auch bei Milzzellen
von Ratten und erhöht die Sensibilität der Tumorzellen gegenüber den zytolytischen
Effekten dieses Zytokins[68]. Außer der Bildung von TNF induziert es auch die
Produktion von IFN, ACTH, Stress-Proteinen u.a. [127]. Die Anwesenheit von
virusinfizierten Zellen regt zudem die Produktion von Interleukinen und Interferonen an, ein durchaus nützlicher Nebeneffekt.
In einer umfangreichen "Charakterisierung einer NDV-modifizierten Tumor-ZellVakzine" demonstrierte Liebrich die molekularbiologischen und labortechnischen
Eigenschaften einer Vakzine mit dem Stamm "Ulster" des NDV: Adsorption und
Penetration in Zellmembranen von Zielzellen wies er durch elektronenmikroskopische Beobachtungen nach. Mit entsprechenden MAK zeigte er, daß auf den dissoziierten Tumorzellen die MHC-Moleküle in gleicher Weise wie auf Gefrierschnitten
- 35 des Tumors exprimiert sind. Bei bestrahlten Tumorzellen zeigte er deren
Unfähigkeit zur Proliferation. Bei gleichwohl einem guten Drittel der Zellen war
die metabolische Aktivität erhalten [65].
1.4.4.5
ASI in der Therapie verschiedener Tumoren
Seitdem Anfang der siebziger Jahre Tallberg u. Tykkä beim NZK und Cassel beim
malignen Melanom die ASI erstmals als adjuvante Therapie am Menschen erprobt
hatten, wurden Studien mit unterschiedlichen Ansätzen bei verschiedenen Tumoren
durchgeführt.
In bezug auf das maligne Melanom konnte Cassel nach mehrjährigen (allerdings
nicht prospektiv randomisierten) Studien eine signifikant verringerte
Progressionsgeschwindigkeit des Tumorleidens in der ASI-Therapiegruppe
gegenüber einer Kontrollgruppe nachweisen.
Er setzte hierbei ein NDV-Onkolysat von Lymphadenektomiepräparaten als
Vakzine ein, das er durch Inkubation der Tumorzellen mit Viruspartikeln eines
lytischen NDV-Stammes gewinnen konnte [16; 81].
Davon ausgehend haben Hersey et al. Patienten mit einem Vaccinia-Melanom-ZellLysat mit ähnlich ermutigenden Erfolgen behandelt [40; 41], was auch mehrere
Autoren bestätigen konnten [145]; u.a., so daß man bezüglich des Melanoms
sicherlich noch ausgedehntere Studien erwarten kann.
Auch zum Colorektalen Karzinom haben v.a. die Arbeitsgruppen von Hanna und
Schirrmacher die ASI in zahlreichen Studien erprobt, teilweise mit ebenfalls recht
ermutigenden Ergebnissen [10; 44; 64; 128]. Die einzige Studie mit größeren Patientenzahlen von Wunderlich et al. konnte allerdings keinen Vorteil der Patienten
der ASI-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe feststellen [167].
Zu Vakzinierungen in der Zusatztherapie verschiedener anderer humaner
Karzinome liegen meist Phase-I-Studien vor, so u.a. zum Scheidenkarzinom [26],
dem Bronchialkarzinom [43], dem Magenkarzinom [144] und dem
Ovarialkarzinom [1], ohne daß der ASI eine eindeutige prognoseverbessernde
Wirksamkeit bei diesen Tumoren zugesprochen werden konnte.
- 36 1.4.4.6
ASI beim NZK
Tallberg und Tykkä hatten schon seit 1971, angeregt durch Berichte bei anderen
Tumoren, damit begonnen, die NZK-Patienten in fortgeschritteneren Stadien nach
Nephrektomie mit einer aktiven Immunisierung nachzubehandeln. Sie stellten aus
den Zellen des Primärtumors Homogenisate her und versetzten sie mit Tuberkulin-,
bzw. Candida-albicans-Antigenen. Die Patienten wurden monatlich bis zu 2 Jahre
lang mittels intrakutaner Injektionen behandelt. Hauptkriterium für die Aufnahme
in die Studie war der fortgeschrittene Status des Tumorleidens (Patienten nach "eindeutig palliativer Nephrektomie"). Als Kontrollgruppe diente retrospektiv eine nicht
mit ASI behandelte Patientengruppe mit möglichst ähnlichen Tumordaten.
Sowohl erste Zwischenergebnisse [155; 156], als auch die von 1984 an regelmäßig
erscheinenden "Long-term-follow-up´s" [146; 147] wiesen eine signifikante
Verbesserung der Prognose des Tumorleidens in der mit ASI nachbehandelten
Gruppe nach.
So berichteten sie von einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 25% gegenüber ca. 5%
in der Kontrollgruppe. Die gesamte durchschnittliche Überlebenszeit lag mit ca. 45
Monaten mehr als doppelt so hoch wie in der Vergleichsgruppe (ca. 20 Monate).
Aufgrund dieser recht guten Ergebnisse folgte eine ganze Reihe ähnlicher Studien,
Neidhart setzte BCG als Adjuvans ein [86], andere Studien verwendeten Dimethydioctadecylammoniumbromid (DDA) [98] oder Candida albicans [57; 100] in
jeweils ähnlichen Studiendesigns als adjuvante Substanzen. Die Ergebnisse wurden
jeweils als vorsichtig ermutigend eingestuft.
McCune et al. führten erstmals prospektiv randomisierte Studien zur ASI mit bestrahlten Tumorzellen und Corynebakterium parvum als Adjuvans bei Patienten mit
metastasierten NZK durch. Diese wurden versus Hormontherapie durchgeführt und
konnten eine signifikante Lebensverlängerung in der ASI-Gruppe bei gleichwohl
geringer Ansprechrate nachweisen. So lebten nach 24 Monaten noch 18 von 56
Patienten der ASI-Gruppe (2/20 Pat. der Hormongruppe), während die
Ansprechrate nur 6/56 (1/20) betrug [73-75].
Mitte der achtziger Jahre kamen einige ernüchternde Studien zur Veröffentlichung,
so z.B. die Arbeit von Fowler, der bei 23 mit ASI nach der Tallberg´schen Methode
nachbehandelten NZK-Patienten nur von 2 "minimalen Respondern" berichtet [25],
und die von Rauschmeier, der die berichteten Lebenszeitverlängerungen in seiner
Studie nicht bestätigt sah [100].
- 37 Kurth et al. berichteten 1987 bei 33 Patienten, die mit einer autologen Tumorvakzine mit Corynebakterium parvum als Adjuvans behandelt wurden, von einer objektiven Ansprechrate von 24%, ohne statistisch signifikante Unterschiede bei der
mittleren Überlebenszeit zu beobachten.
Festzuhalten bleibt jedoch, daß die Studien mit großen Patientenzahlen [112; 148]
eher positive Ergebnisse im Sinne der Wirksamkeit der ASI beim NZK liefern. Da
gleichzeitig Mitte der achtziger Jahre die immunologisch-theoretischen Grundlagen
der ASI anhand von Tierversuchen untersucht und ihre Wirksamkeit theoretisch bewiesen werden konnte [33; 124], s.o., war besonders in bezug auf das NZK die
Grundlage für zahlreiche weitere Phase-II-Studien geschaffen.
So erzielten z.B. Schärfe et al. besonders gute Ergebnisse in der Behandlung von
NZK-Patienten mit Leber- und Lungenmetastasierung, während Patienten mit Knochen- oder ZNS-Metastasen kaum reagierten [112], eine Beobachtung, die sich mit
den Ergebnissen anderer Immuntherapien deckt, s.o..
McCune wies 1990 mit einer Corynebakterium-parvum-Vakzine nach, daß
Patienten mit positiver Hautreaktion (DTH) nach intrakutaner Injektion der Vakzine
den deutlich besseren Krankheitsverlauf zeigen, verglichen mit Patienten mit
kleiner oder ohne DTH. Er schließt daraus, daß mit Hautreaktionstests auf autologe
Tumorzellen diejenigen Patienten selektiert werden könnten, die besonders gut auf
eine ASI ansprechen.
In neuester Zeit sind es vor allem die Arbeitsgruppen von Pomer (Heidelberg) und
Atzpodien (Hannover), die die Studien mit der ASI am NZK vorantreiben. Erstmals
nehmen beide Gruppen auch nicht-metastasierte Fälle ins Studiendesign mit auf,
beide arbeiten mit NDV-modifizierten Tumorzellen und unterstützen die intrakutanen Applikationen mit IL-2, bzw. IFN-a.
Pomer beobachtete 7 OR bei 23 Patienten, zusätzlich 7 "stable diseases" [95],
Atzpodien behandelte 72 Patienten ohne nachweisbare Metastasen und kam zu dem
Ergebnis, daß die ASI das krankheitsfreie Überleben bei NZK-Patienten eindeutig
günstig beeinflußt.
Die Aufnahme nicht-metastasierter Fälle begründet sich außer in der praktisch-urologischen Erfahrung vor allem in den Arbeiten Hannas [33; 34] und Schirrmachers
[38; 123; 160], die feststellen, daß eine Immuntherapie grundsätzlich umso
erfolgversprechender ist, je kleiner die zu bewältigende zurückbleibende Tumorzellast im Körper ist. Für das NZK folgern sie daraus:
- 38 1. Die Nephrektomie ist nicht nur zur Gewinnung von Tumorzellen, sondern auch zur Verkleinerung der Tumorlast unerläßlich.
2. Die vielfach nachgewiesene Mikrometastasierung gebietet es, besonders
Patienten mit lokal begrenzten, aber vermutetem mikrometastasierten
NZK als Zielgruppe der ASI zu definieren.
3. Die chirurgische Therapie von Makrometastasen, besonders solitärer in
Leber und Lunge und die anschließende ASI mit Tumormaterial aus den
resezierten Metastasen erscheint als rationale Intervention.
Alle Autoren, die sich mit der ASI allgemein und speziell mit der des NZK beschäftigt haben, stimmen in einem grundlegenden Ergebnis überein: Die ASI ist, abgesehen von leichten Hautrötungen und vorübergehender leichter Temperaturerhöhung,
praktisch nebenwirkungsfrei und ist zudem dem Patienten als Verstärkung eines
körpereigenen Therapieverfahrens leicht vermittelbar. Die im Vergleich zu anderen
Therapien (z.B. IL-2, IFN) niedrigen Behandlungskosten sind ein weiteres Argument dafür, daß bei einem Nachweis ähnlicher Wirksamkeit in größeren Studien die
ASI sicherlich als Routinealternative in der postoperativen Behandlung des NZK
anzusehen ist.
- 39 -
2 Methoden und Materialien
2.1
2.1.1
Klinische Studie, Vorphase
Planung des Studienkonzeptes
Schon seit einigen Jahren wurden in der AG von Professor Falkenberg der
Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie an der Ruhruniversität
Bochum Studien zur aktiven spezifischen Immunisierung von Patientinnen und
Patienten mit fortgeschrittenem NZK durchgeführt. So wurde 1984 in
Zusammenarbeit mit der Urologischen Universitätsklinik Bochum im
Marienhospital Herne (Direktor: Professor Dr. Senge) eine Phase-II-Studie zur
Tumorimmunisierung begonnen [32].
Trotz eher ernüchternder Ergebnisse dieser ersten Versuche wurde 1989 auch wegen der sich häufenden ermutigenden Berichte in der internationalen Fachliteratur
eine neue Studie mit stark modifizierter Methodik begonnen. Grundlage dieser Methodik war zunächst das von Schirrmacher et al. nach umfangreichen Tiermodellstudien [116; 121; 124] vorgeschlagene und von PD. Dr. Pomer et al. [95; 96] für
Humanstudien modifizierte Protokoll der Tumoraufarbeitung zu Vakzinierungszwecken [120]. Die Grundpfeiler dieser Methode sind die unmittelbare Aufarbeitung autologer Tumorzellen (meist Operationspräparat), die Inkubation mit dem seit
langem als antineoplastischen Agens [15] beschriebenen hier als Adjuvans verwendeten NDV und die streng intrakutane Applikation des zuvor mittels Bestrahlung
inaktivierten Impfstoffs.
Beteiligt sind neben der Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie an der Ruhruniversität Bochum und der Urologischen Klinik des
Marienhospitals in Herne seit 1991 auch die Urologische Universitätsklinik
Münster. Ferner haben die Radiologische Abteilung des Marienhospitals
(verantwortlich für die Bestrahlung der Zellen) und das Institut für Hygiene und
Mikrobiologie der Ruhruniversität Bochum (Durchführung der Sterilkontrollen der
hergestellten Vakzine) bei der Durchführung mitgearbeitet.
Zusammen mit der Ethikkommission der Ruhruniversität Bochum wurde die Immunisierung von zunächst 40 Patientinnen und Patienten mit NZK geplant.
- 40 2.1.2
Ein- und Ausschlußkriterien der Studie
Als Einschlußkriterien bezüglich der Patientendaten wurden definiert:
% histologisch gesichertes NZK
% Stadium pT2 ab 4 cm Durchmesser, alle pT3 und pT4, alle N- und MStadien
Als Ausschlußkriterien wurden festgelegt:
% Tumorstadium pT1 oder pT2 kleiner 4 cm Durchmesser
% Karnowski-Index kleiner 604
% Keimnachweis in den Sterilkontrollen der jeweiligen Vakzine
% Maligner Zweittumor
% Schwangerschaft
% Alter unter 18 Jahren
% Fehlende Bereitschaft des Patienten zur Zusammenarbeit
% Hormon-, Zytostatika- oder Radiotherapie in den letzten 6 Monaten
(ausgenommen hormonelle Kontrazeptiva)
% Fehlende schriftliche Einwilligung
Den Abbruch der Therapie wurde gefordert bei:
% Schweren lokalen Nebenwirkungen der Injektionen wie Allergien oder
Ulzerationen
% Systemischen Nebenwirkungen stärkerer Art (obgleich solche bisher nie
beobachtet wurden)
% Rückzug der Einwilligung durch den Patienten
% Eindeutig belegter Tumorprogression unter der Therapie
2.1.3
Patienten
Zwischen Februar 1990 und Dezember 1994 konnten 39 Patienten, die mit fortgeschrittenen NZK in den Kliniken von Herne oder Münster aufgenommen wurden
und auch sonst alle Einschlußkriterien für die Teilnahme an der Studie erfüllten, für
die Studie rekrutiert werden. Sobald die Tumoraufarbeitung erfolgreich war, d.h.
die für eine Immunisierungstherapie erforderlichen Zellmengen ohne bakterielle
Verunreinigungen gewonnen werden konnten, wurden die Patientinnen und
Patienten umfassend über das Konzept der Studie und auch über deren
experimentellen Charakter, sowie über möglicherweise zu erwartende
4Klinisch-onkologischer
Index, der Tumorpatienten von 100% (ohne Symptome) bis 0% (Patient ist tot)
einteilt; Unter 60% benötigt der Patient ständig Unterstützung und medizinische Versorgung.
- 41 Nebenwirkungen aufgeklärt. Eine schriftliche Einwilligung zur Durchführung einer
aktiven spezifischen Immuntherapie war anschließend abzugeben5
Die Tabelle zeigt relevante präoperative Daten der behandelten Patienten:
Patient Geschlecht Alter
W.R.
w
65
E.F.
w
53
R.L.
m
33
H.H.
w
65
A.F.
w
61
C.H.
m
54
H.M.
w
65
H.K.
w
57
W.H.
m
57
A.H.
w
63
G.F.
m
72
F.S.
m
46
U.M.
m
52
M.B.
w
59
W.S.
m
77
H.S.
m
51
M.M.
m
62
W.M.
m
55
K.O.
m
62
K.S.
m
65
K.W.
m
65
H.D.
w
55
K.L.
m
55
K.S.
m
55
M.D.
w
61
A.G.
w
37
W.S.
m
60
B.H.
m
62
H.F.
m
50
M.M.
w
62
B.H.
m
57
W.C.
m
73
G.E.
w
68
B.B.
w
56
H.S.
w
72
V.S.
w
66
E.W.
w
63
E.B.
m
67
F-W. V.
m
51
OP-Dat.
TNMG-Status
Fa-Nr.
05.02.1990 pT2, N0, M0 (M1), G2
1
22.02.1990
pT3, N0, M0, G3
2
13.03.1990
pT3, N0, M0, G3
3
27.03.1990
pT2, Nx, M0, G2
4
21.05.1990
pT2, Nx, M0, G2
5
03.07.1990
pT4, N2, M1, G3
6
27.07.1990
pT3, N0, M1, G2-3
7
19.10.1990
pT3, Nx, Mx, G2
8
27.11.1990
pT2, Nx, Mx, G1
9
08.02.1991
pT2, Nx, Mx, G1
10
26.04.1991
pT3b, N1, Mx, G2
11
29.08.1991
pT3, Nx, Mx, G2
12
18.10.1991
pT4, N2, M1, G3
13
11.11.1991
pTx, Nx, Mx, G1
14
18.11.1991
pT3, Nx, Mx, G1
15
10.12.1991
pT2, Nx, M1, G2
16
23.12.1992
pT3, N2, M1, G1
17
10.01.1992
pT3, Nx, Mx, G2
18
13.01.1992
pT3, Nx, M1, G2
19
27.01.1992
pT3a, Nx, Mx, G2
20
30.01.1992
pT4, Nx, M1, G3
21
10.02.1992
pT3, N+, M+, G2
22
18.02.1992
pT3, N0, Mx, G2
23
09.03.1992
pT2, Nx, Mx, G2
24
10.04.1992
pT3, N0, Mx, G3
25
24.04.1992
Paragangliom
26
17.06.1992
pT3, Nx, Mx, G2
27
22.06.1992
pT3, Nx, M1, G2
28
24.06.1992
pT3b, Nx, M1, G3
29
29.07.1992
pT2, Nx, Mx, G2
30
02.09.1992
pT3, Nx. Mx, G231
08.10.1992
pT3, Nx, Mx, G1
32
17.05.1993
pT3, Nx, M0, G2
33
24.08.1993
pT3a, Nx, Mx, G2
38
23.09.1993
pT3a, Nx, M0, G2
43
05.10.1993
pT2, N0, M0, G2
44
04.11.1993
pT2, N0, M0, G1
45
08.11.1993
pT3b, N0, M0, G2
47
07.12.1993
pT3a, N0, M0, G2
50
TAB.7: ERSTE STUDIENPHASE, PATIENTENDATEN
5Als
Formular vorgelegt, in dem die Grundsätze der Therapie noch einmal verständlich dargelegt wurden
- 42 2.1.4
Kontrollgruppe
Es wurde aus dem Patientengut der Urologischen Klinik des Marienhospital in
Herne nach der "matched-pairs-Technik" retrospektiv eine Kontrollgruppe zusammengestellt. Es handelte sich dabei um Patienten, die im Zeitraum zwischen 1990
und 1992 nephrektomiert wurden und bei denen histologisch ein NZK gesichert
werden konnte.
In keinem der Fälle wurde Tumormaterial postoperativ für eine mögliche ASI aufgearbeitet, andere adjuvante postoperative Therapien werden später erwähnt und
entsprechend bewertet.
Es wurde versucht, zu jedem einzelnen unserer Patienten möglichst einen "Symptomzwilling" zu finden, der vor allem in den Merkmalen Alter, Geschlecht, Tumorstadium, -größe und -grading, sowie im OP-Datum möglichst weitgehend mit den
entsprechenden ASI-Patienten übereinstimmen mußte.
2.2
2.2.1
Klinische Studie: Die autologe Tumorvakzine
Nephrektomie und Transport
Zu Anfang der Studie wurde im Anschluß an die wie üblich durchgeführte
Nephrektomie das komplette Operationspräparat noch im Operationssaal unter
sterilen Bedingungen vom Fett freipräpariert. Unter Aufsicht des Operateurs wurde
dann der Tumor aufgesucht, er wurde samt Restniere durch Längsinzision genau in
der Mitte geteilt. Der eine Teil wurde dem zuständigen Pathologen zur
Begutachtung vorgelegt, der zweite Teil wurde zur Vakzineherstellung
aufgearbeitet. Das Resektionspräparat wurde zum Transport grob zerteilt und in ein
steriles, antibiotikahaltiges Transportmedium überführt (s.u.) und auf Eis in einem
Isolierbehälter ins Labor der AG von Professor Falkenberg in die Ruhruniversität
Bochum gebracht, wo die unverzügliche Weiterverarbeitung in einer sterilen
Werkbank erfolgte.
- 43 2.2.2
2.2.2.1
Tumoraufarbeitung
Präparation und Dissoziation
Zunächst wurden die Tumorteile freipräpariert, zerkleinert und in Medium gewaschen. Für spätere Experimente (s. Experimente, Immunfluoreszenz) mußten
sodann je zwei Tumorstückchen aus Tumormitte und Tumorrand mit Tissuetek
fixiert, in durch flüssigen Stickstoff gekühltem Isopentan schockgefroren und bei
-80°C gelagert werden. Die restlichen Tumorstücke wurden dann mit einem
passenden sterilen Stößel vorsichtig durch ein feines steriles Drahtnetz gequetscht
und zur weiteren Dissoziation in eine 37°C warme Enzymlösung aufgenommen.
Diese enthielt Kollagenase, Hyaluronidase und DNase (s. Dissoziationsmedium),
die Suspension wurde unter ständigem Schütteln etwa 30 min. lang im Wasserbad
inkubiert. Dies dient dem Herauslösen der Tumorzellen aus dem bindegewebigen
Verband und verhindert ein Verklumpen durch DNA zugrundegegangener Zellen.
2.2.2.2
Reinigung des Pellets
Um verunreinigende Anteile wie Binde- und Fettgewebspartikel zu entfernen erfolgte nach der Dissoziation eine Filtration durch sterile 50-mesh-Drahtnetze, die
zur besseren Fettabsorption mit Glaswolle gefüllt waren. Sodann wurde die Suspension 10 min lang bei 4°C und 400g in der Heraeus-Kryofuge zentrifugiert. Nach
dem Abdekantieren wurde das Zellsediment (Pellet) mit einem Puffer
aufgenommen und mit Medium 199 gewaschen. Durch ammoniumhaltige
Lysepuffer wurden während der Einwirkdauer von 1-2 min osmotisch relativ
selektiv Erythrozyten lysiert, während andere Zellen intakt bleiben. Nach erneuter
Zentrifugation konnte die Resuspension in Lysepuffer je nach Aussehen der
Suspension noch mehrfach wiederholt werden. Beim folgenden Zentrifugieren
bleiben die Erythrozytenreste dann weitgehend in der Lösung zurück und wurden
beim Abdekantieren entfernt.
2.2.2.3
Bestimmung von Zahl und Vitalität der Tumorzellen
Die Zellzahl wird mit Hilfe der Neugebauer-Zählkammer bestimmt, nach der Zählung wurden die Portionen durch entsprechendes Verdünnen auf die u.g. Zellzahlen
eingestellt.
Durch Einsatz des Farbstoffes Trypanblau kann eine Unterscheidung zwischen vitalen und abgestorbenen Zellen erfolgen, da er nur die Zellmembranen toter Zellen
- 44 passieren kann und die betreffenden Zellen blau färbt. Die wie oben ermittelte Anzahl toter Zellen wird von der Gesamtzellzahl abgezogen (ein Anteil lebender
Zellen von mindestens 70% wurde vereinbart).
2.2.2.4
Einfrieren der Zellen in Kryotubes
Lebende Zellen können beim Einfrieren durch die Bildung intrazellulärer
Eiskristalle teils irreparabel geschädigt werden. Um dies zu verhindern wird den
fertigen Vakzinierungsportionen ein Einfriermedium zugesetzt, welches das
"Gefrierschutzmittel" DMSO enthält. Letzteres ist bei Raumtemperatur allerdings
zytotoxisch, sodaß die Zellsuspension nach Zusatz des Einfriermediums möglichst
rasch abgekühlt werden muß.
Das nach der Zellzählung und erneuter Zentrifugation erhaltene Zellpellet wird so
in Kryotubes abgefüllt, daß sich in den für die Immunisierung vorgesehenen Proben
mindestens 1,5 x 107 Zellen pro Milliliter (Z/ml) befinden und in den
Kontrollproben
mindestens
1,5 x 106 Z/ml.
Einfriermedium
wird
im
Volumenverhältnis 1:1 zugesetzt, dann werden die Kryotubes umgehend mit
Zellstoff umwickelt und in einem Styroporbehälter bei -80°C gelagert. Nach dem
Einfrieren am nächsten Tag wird die Zellprobe in flüssigen Stickstoff überführt und
hier bei -196°C bis zur Anwendung gelagert.
2.2.3
Sterilkontrollen
Zur Gewährleistung der Keimfreiheit wurden im Anschluß an die
Tumoraufarbeitung unmittelbar vor dem Einfrieren Sterilkontrollen der
Einzelzellsuspensionen durchgeführt. Gleichermaßen wurden die Transportmedien
kontrolliert. Dazu wurden einige Tropfen jeder Lösung auf Nährböden
ausgestrichen oder in Bouillons eingebracht und jeweils aerob und anaerob 7 Tage
lang bebrütet.
Es wurden verwandt (Standardkontrolle im Institut für Mikrobiologie, Prof. Opferkuch):
Aerob, Nährböden: Blutagar
Mc Conkey
Sabouraud
Aerob, Bouillons:
Soja
Sabouraud
Anaerob, Nährb.:
BHI
- 45 Anaerob, Bouillon:
BHI
Die beimpften BHI-Platten und -Bouillons wurden in einen Anaerobiertopf gestellt,
in dem mittels einer mit 35 ml Wasser getränkten Anaerocultplatte nach Verschluß
ein mikroanaerobes Millieu erzeugt wurde. Die Bebrütung, bei Keimbefall auch die
weitere Differenzierung, erfolgte dann im Untersuchungsamt Bochum, welches die
Kontrollen auch schriftlich befundete.
2.3
2.3.1
Klinische Studie, Immunisierung
Vorbereitung der Vakzine zur Applikation
Beim Auftauvorgang sind die Zellen genauso durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle gefährdet wie bei Einfrieren. Daher wurden die Einfrierröhrchen zum schonenden Auftauen in einem 37°C-warmen Wasserbad geschwenkt, bis die
Suspension gerade antaute. Sodann wurde sie in 50 ml DNase-haltiges Medium
(s.u.) aufgenommen und unter leichtem Schütteln 20 min lang im Wasserbad
gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4°C und 400 x g und
Vitalbestimmung wurde der Ansatz noch einmal mit Medium 199 gewaschen.
Das nach erneuter Zentrifugation erhaltene Zellsediment mit den 1,5 x 107 Zellen
wurde mit 32 HAU NDV, suspendiert in 1 ml Medium 199, resuspendiert und 60
min lang bei 37°C im Wasserbad inkubiert.
Das NDV, Stamm Ulster, wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Schirrmacher, Heidelberg, zur Verfügung gestellt. Es hat sich in umfangreichen Studien
dieser Gruppe als gutes Adjuvans bei der aktiven spezifischen Immunisierung erwiesen.
Danach wurden die Zellen wieder gewaschen und zentrifugiert. Das Sediment
wurde in 0,5 ml Medium 199 aufgenommen und in ein steriles BorosilikatGlasröhrchen (Kimble, 5x50 mm) gefüllt Desweiteren wurden als
Immunisierungskontrollen (s.u.) folgende Proben ebenfalls in sterile KimbleRöhrchen abgefüllt:
% ca.1,5 x 106 Tumorzellen, aufgenommen in 0,5 ml Medium 199
% 32 HAU NDV, aufgenommen in 0,5 ml NaCl
% 32 HAU NDV, aufgenommen in 0,4 ml NaCl
% 0,5 ml NaCl
- 46 Außerdem wurden noch 3 Portionen mit je 75 000 Cetus-Einheiten6 rIL-2 bereitgestellt (s. Kap. Immunisierungen).
Die fünf o.g. Immunisierungsproben wurden verpackt und in einem Isolierbehälter
auf Eis so umgehend wie möglich zur jeweiligen strahlentherapeutischen Einrichtung transportiert. Hier mußten folgende Voraussetzungen gegeben sein:
% Linearbeschleuniger zur Bestrahlung mit einer Gesamtdosis von mindestens 100 Gray
% Offizielle Genehmigung auch Zellen zu bestrahlen
Die Bestrahlung dauerte etwa 20 Minuten, wobei die 5x50mm großen Borosilikatröhrchen mit den Proben in ein spezielles Phantom eingespannt wurden. Bei einer
Gesamtdosis von 100 Gray werden die vitalen Tumorzellen durch Induktion von
DNA-Strangbrüchen sicher irreversibel geschädigt und teilungsunfähig gemacht.
2.3.2
Immunisierungen
Die eigentliche Vakzine mit den NDV-modifizierten Tumorzellen wurde mit der ersten Portion rIL-2 versetzt, dieses sollte als Chemotaxis- und Wachstumsfaktor für
Lymphozyten die lokale und systemische Immunreaktion verstärken. Die weiteren
rIL-2-Portionen wurden dem Ansatz mit 0,4 ml NaCl/NDV beigegeben bzw. ohne
Zusatz als rIL-2-Kontrolle verwandt. Die Kontrollen dienten zur Differenzierung
des Effektes der einzelnen Komponenten der Vakzine auf die DTH-Reaktion.
Dann erfolgte die eigentliche Immunisierung des Patienten, ein Arzt der Klinik
applizierte die Lösungen streng intrakutan nach vorgeschriebenem und schriftlich
dokumentiertem Schema:
% Die erste Immunisierung wurde jeweils am rechten Oberschenkel des
Patienten bei ausreichendem Abstand (3-4cm) der Injektionen vorgenommmen
% Die zweite Immunisierung wurde am rechten Arm, die dritte am linken
Arm vorgenommen
% Die Injektionsstellen mußten zur sicheren späteren Identifikation mit einem geeigneten Stift markiert und sorgfältig in einem Immunisierungsprotokoll dokumentiert werden
6Cetus-Einheiten
sind die vom europäischen Haupthersteller von rIl-2, der Firma Euro-Cetus, benutzten
Meßeinheiten und entsprechen je 6 I.E., sodaß 75 000 Cetus-Einh. 450 000 I.E. entsprechen.
- 47 %
Zur Überprüfung der allgemeinen Reagibilität der verzögerten Immunreaktion wurde bei jeder Immunisierung an einem Unterarm eine Abrufreaktion mit dem Multitest Merieux durchgeführt
Die Applikationsorte wurden 72 Stunden und 7 Tage nach der Immunisierung kontrolliert, die DTH in mm gemessen und im Immunisierungsprotokoll dokumentiert.
So wurde bei allen drei Immunisierungsterminen, die ca. 4, 8 und 24 Wochen nach
der Operation anberaumt wurden, verfahren. Wegen des zeitlichen Aufwandes für
den Patienten sollte nach Möglichkeit versucht werden, den 3. Immunisierungstermin mit dem 1. stationären Nachsorgeaufenthalt zu koppeln.
2.4
2.4.1
Klinische Studie, Nachsorge
Routine-Follow-up
Die Patienten wurden zunächst routinemäßig, wie in der Tumornachsorge beim
NZK nach Nephrektomie allgemein üblich, ca. 3 und 6 Monate nach OP, sowie
dann in etwa halbjährigen Abständen zu stationären Nachsorgeaufenthalten in die
behandelnde urologische Klinik einbestellt. Hier wurden in aller Regel neben dem
allgemeinen klinischen Status die üblichen Laborparameter erhoben, sowie ein
Abdomensonogramm, Thoraxröntgenaufnahmen in zwei Ebenen, eine
Computertomographie des Abdomens, eine Skelettszintigraphie und ein
Ausscheidungsurogramm angefertigt. Beim geringsten Verdacht auf eine zerebrale
Beteiligung (Hirnmetastasierung) wurde außerdem eine Computertomographie des
Schädels durchgeführt.
2.4.2
Hausärztliche Nachsorge
Regelmäßig wurden die betreuenden Hausärzte bzw. niedergelassenen Urologen
kontaktiert, um
1. Die außerhalb der Klinik erhobenen, gleichwohl die NZK-Nachsorge betreffenden Befunde erfassen zu können
2. Im Todesfall die erforderlichen Daten erheben und dokumentieren zu
können
3. Mit dem viel näher mit dem Patienten befaßten persönlichen Arzt auch
Fragen der allgemeinen Befindlichkeit und der Persönlichkeit des Patienten, sowie die den psychoonkologischen Bereich berührenden Pro-
- 48 bleme (Stellenwert der ASI-Therapie für den Patienten, Haltung gegenüber einer neuen Therapieform) zu diskutieren
2.4.3
Dokumentation
Zur Dokumentation und späteren genaueren immunologisch-experimentellen Auswertung der Studienergebnisse wurde von jedem Patienten:
%
Eine eigene ASI-Akte mit allen Befunden und Protokollen angelegt
% Tumorstückchen wie beschrieben entnommen und bei -80°C gelagert
% Vor der Operation und bei jedem Immunisierungstermin Venenblut entnommen und das gewonnene Serum bei -20°C gelagert
% Gegebenenfalls nicht zur Vakzinierung verwendete Tumorzellen nicht
verworfen, sondern in flüssigem Stickstoff gelagert.
2.4.4
Statistik
Die Statistik wurde mit dem Programm SPSS Version 8.0, der Firma SPSS Inc.;
233 Street, Wacker Drive, 11th floor, Chicago, IL 60606-6307, USA, 1998
angefertigt.
Für den Vergleich von den Überlebenszeiten wurde die Überlebensanalyse nach
Kaplan-Meier verwendet, die gleichzeitig die gleichzeitig die Betrachtung der
Daten auf statistische Signifikanzen zuläßt.
Als statistischer Test wurde der log rank Test verwendet, da dieser alle Zeitpunkte
in diesem Test gleich gewichtet und er in der Überlebensanalyse als einer der üblichen Teststandards gelten kann.
Als Alternativen stehen auch noch der Tarone-Ware Test (Ein Test zum Vergleich
der Gleichheit von Überlebensverteilungen. Die Zeitpunkte werden mit der Quadratwurzel der Anzahl der zu jedem Zeitpunkt gefährdeten Fälle gewichtet) oder
dem Breslow-Test (ein Test, der die Gleichheit der Überlebensverteilungen
vergleicht. Die Zeitpunkte werden mit der Anzahl der gefährdeten Fälle zu jedem
Zeitpunkt gewichtet), zur Verfügung, diesbezüglich wurden ebenfalls die
Signifikanzen errechnet.
- 49 2.5
2.5.1
Klinische Studie: Material
Chemikalien
EDTA
DMSO
DNase
Glucose 10%
HBSS
Humanserumalbumin 20%
Hyaluronidase
Isopentan
KHCO3
Kollagenase IV
Medium 199
Nanopur-Wasser
NaCl 0,9%
NH4Cl
Penicillin
rIL-2 "Proleukin"
Streptomycin
Tissuetek
Trypanblau
2.5.2
(Riedel-de-Haen)
(Merck)
(Sigma)
(Fresenius)
(Gibco)
(Blutspendedienst DRK)
(Sigma)
(Merck)
(Riedel-de-Haen)
(Sigma)
(Gibco)
(Uni Bochum)
(Fresenius)
(Riedel-de-Haen)
(Sigma)
(Eurocetus)
(Sigma)
(Miles Inc.)
(Sigma)
Verbrauchsmaterial
Aluminiumfolie
Anaerocult-Platten
BHI-Nährboden u. -Bouillon
Blut-Nährboden
Drahtnetz, 50 mesh
Einfrierröhrchen "Kryotubes", 2 ml
Einmalhandschuhe, steril
Einmalskalpelle
Einmelhandschuhe, unsteril
Glasröhrchen aus Borosilikat
"Kimble-Tubes" 5 x 50 mm
(Melitta)
(Merck)
(Oxoid)
(Oxoid)
(Dürener Metalltuch)
(Greiner)
(Beiersdorf, Hartmann)
(Braun)
(Hartmann)
(Kimble)
- 50 McConkey-Nährboden
Multitest Merieux
Petrischalen, eckig
Petrischalen, rund
Sabouraud-Nährboden u. -Bouillon
Soya-Bouillon
Sterilfilter
Zentrifugenröhrchen, 12 ml
Zentrifugenröhrchen, 50 ml
2.5.3
(Merck)
(Merieux)
(Greiner)
(Greiner)
(Oxoid)
(Oxoid)
(Schleicher und Schuell)
(Greiner)
(Greiner)
Geräte
Anaerobiertöpfe
Arbeitsplatz, Laminar Air Flow
Bechergläser
Brutschränke
Gefrierschrank, -20°C
Gefrierschrank, -85°C
Instrumentenkasten
Telecobaltgerät Co 60
Messer, zweischneidig
Mikroskop
Pasteur-Pipetten
Pinzetten
Pipetten, graduiert
Scheren
Stickstoffbehälter
Transportflaschen
Waage
Wasserbad
Zählkammer Neugebauer
Zentrifuge "Kryofuge"
(Merck, Oxoid)
(Biohazard, Gelaire Flow Laboratories)
(Schott)
(Heraeus, Forma Scientific)
(Liebherr)
(Forma Scientific)
(Martin)
(Siemens)
(Martin)
(Olympus)
(Assistent)
(Martin)
(Schott)
(Martin)
(Messer Griesheim)
(Gibco, Seromed)
(Mettler AE 100)
(MGW Lauda)
(Superior)
(Heraeus)
- 51 2.5.4
Gebrauchslösungen
Medium 199
Pulver zum Ansatz von 1l Medium
Entionisiertes Wasser (Nanopur)
350 mg NaHCO3
5958 mg HEPES (= 25 mmol)
Das Medium 199-Pulver wird samt NaHCO3 und Hepes im Nanopur-Wasser gelöst,
sodaß 1000 ml Lösung vorliegen. In dieser wird dann ein pH-Wert von 7,2 eingestellt, das fertige Medium wird sterilfiltriert (Poren 0,2µm) und im Kühlschrank gelagert.
Enzymlösungen
Die Mg-Konzentration in den Enzymlösungen wird auf 4,2 mM eingestellt, da Desoxiribonuklease gerade bei dieser Mg-Konzentration optimal katalytisch aktiv ist.
Dissoziationsmedium
70 ml Medium 199
30,2 mg Kollagenase IV bei 460 U/ml und
27,13 mg bei 512 U/ml lt. Hersteller
34,8 mg Hyaluronidase bei 720 U/ml und
39,5 mg bei 635 U/ml lt. Hersteller
14,8 mg DNase I
6 mg Mg-Ionen pro 35 ml fertiger Gebrauchslösung (3g MgCl2 in 500 ml Nanopur-Wasser aufnehmen, sterilfiltrieren und im Kühlschrank lagern).
Die in pulverisierter Form vorliegenden Enzyme werden in 10 ml Medium 199 aufgenommen, sterilfiltriert und zu einer Lösung aus 60 ml Medium 199 und 2 ml
MgCl2 gegeben. Die hergestellte Gebrauchslösung wird auf zwei Tubes verteilt und
kann bis zum Gebrauch, höchstens aber für ca. 12 Stunden, im Gefrierschrank (20°C) aufbewahrt werden.
Auftaumedium
70 ml Medium 199
14,8 mg DNase
12 mg Mg-Ionen
Das Medium wird wie oben beschrieben bereitet, steril in zwei Portionen zu je
35 ml abgefüllt und bei -20°C gelagert (höchstens ca. 12h).
- 52 Lysepuffer
8,29 g NH4Cl
37 mg DiNaEDTA
1 g KHCO3
Die Ingredienzien werden mit Nanopur-Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und, nach
Einstellung des pH-Werten auf 7,3, sterilfiltriert. Lagerung im Kühlschrank.
Einfriermedium
81 ml Medium 199
4 ml Humanalbumin
15 ml DMSO
Albumin und DMSO werden wegen der Ausfällungsgefahr einzeln mit etwas Medium 199 aufgenommen und sterilfiltriert. Beides wird vorsichtig dem restlichen
Medium 199 zugegeben, die gebrauchsfertige Lösung muß lichtgeschützt im Gefrierschrank bei -20°C gelagert werden.
Transportmedium
Penicillin, 10 000 U/ml
Streptomycin, 10 000 U/ml
gewünschte Menge Medium 199, pro Transport 500 ml
Aufnahme von Penicillin und Streptomycin in der gewünschten Menge
Medium 199, Sterilfiltration, Lagerung im Kühlschrank.
Virussuspension
Die Viren werden unter sterilen Bedingungen als Portionen zu je 32 HAU (was
etwa 107 Viruspartikeln entspricht) in je 0,1 ml NaCl bzw. Medium 199 aufgenommen, in Kryotubes gefüllt und im Gefrierschrank bei -85°C gelagert. Nach dem
Auftauen werden sie wie oben angegeben je nach Erfordernis mit Medium 199 oder
mit NaCl weiterverdünnt.
Interleukin-2-Lösung
1 mg rIL-2-Lyophilisat (= 18 Mio. I.E.)
10 ml Glukose 20%
2 ml Humanserumalbumin 20%
8 ml Nanopur-Wasser
Das Lyophilisat wird in Glukose aufgenommen und vorsichtig mit Albumin und
Nanopur-Wasser gemischt, um ein Aufschäumen zu verhindern. Die rIL-2-Lösung
- 53 wird in 40 Portionen (also 450 000 I.E. entsprechend 75 000 Cetus-Einheiten pro
Portion) zu je 0,5 ml aufgeteilt und im Gefrierschrank bei -85°C gelagert.
2.6
2.6.1
Experimente I, Elektronenmikroskopie
Herkunft der Präparate
Bevor an ausgewählten Tumorzellsuspensionen (es wurden nur die Patientenvakzinen verwandt, die aus verschiedenen Gründen nicht zur Immunisierung verwendet
werden konnten) elektronenmikroskopisch die Wirkung der NDV-Inkubation und Modifikation beobachtet und dokumentiert werden konnte, wurden diese selbstverständlich "ganz normal", d.h. wie oben beschrieben bereitgestellt. Am Untersuchungstag wurde die betreffende Suspension aufgetaut, die Zellen mit DNase inkubiert und gewaschen. Nach der 10-minütigen Zentrifugation bei 400 x g wurde etwa
die Hälfte der Zellen mit 0,5 ml der NDV-Suspension (entspricht 16 HAU) 10, bzw.
30 min lang im Wasserbad inkubiert, die andere Hälfte wurde ohne Virus auch im
Wasserbad inkubiert. Im Anschluß daran erfolgte die sofortige Fixierung beider Ansätze in 3%igem Glutaraldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2 für mindestens 24h.
2.6.2
Herstellung der Präparate für das Rasterelektronenmikroskop
Für die Betrachtung der Präparate mit einem Rasterelektronenmikroskop müssen
die Präparate zum einen Elektronenbeschuß aushalten, weswegen sie zur besserern
Oberflächenleitfähigkeit mit einer Goldschicht belegt werden, und sie müssen zum
anderen hochvakuumbeständig sein. Man trocknet die Präparate um Trocknungsartefakte zu vermeiden am "kritischen Punkt", d.h. bei denjenigen Druck- und
Temperaturverhältnissen, an denen die Phasengrenze zwischen flüssigem und
festem Zustand verschwindet und die Oberflächenspannungen gleich Null sind.
Durch vorsichtige Druck- und Temperaturabsenkung kann man nun eine Trocknung
ohne Zellschädigung erreichen.
Durchführung:
1. Filtration der Zellsuspensionen durch COSTAR Nuclepore-Filter,
Porengröße 5µm
2. Die im Filter zurückgehaltenen Zellen werden mit dem ausgestanzten
Filterstück in Glutaraldehyd aufgenommen
3. Die mit Glutaraldehyd fixierten Präparate werden 24h lang gewässert
- 54 4. Dann werden die Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (Methanol 30%, 50%, 70%, 90% und 100% für jeweils 3h)
4. Das Methanol wird schrittweise durch Fréon 11 ersetzt (Fréon 11 30%,
50%, 70%, 90% und 100% für jeweils 3h)
5. Trocknung am "kritischen Punkt" mit Hilfe einer temperaturgeregelten
Überdruckkammer.
6. Mit Hilfe eines Auflichtmikroskops werden geeignete Abschnitte des
Präparats ausgewählt und auf Stiftprobentellern fixiert
7. Anschließend werden die Präparate in einer Vakuumkammer bei einem
Unterdruck von 0,2 - 0,55 Torr und einer Stromstärke von 25 mA mit
einer monomolekularen Goldschicht belegt.
2.6.3
2.6.3.1
Material
Chemikalien und Gebrauchslösungen
Fixationsmittel
17 ml Glutaraldehyd 3% und
100 ml Phosphatpuffer
Phosphatpuffer
6,8 g KH2PO4 auf 500 ml A dest., zum Gebrauch hiervon 20 ml
17,99 g Na2HPO4 auf 500 ml A dest., zum Gebrauch hiervon 80 ml
pH-Einstellung auf 7,4
Fréon 11, Glutaraldehyd 3%, KH2PO4, Methanol, und Na2HPO4, wurden im pathologischen Institut gestellt und sind dort in höchstmöglicher Reinheit von den üblichen Herstellern bezogen worden.
2.6.3.2
Geräte
Druckkammer "critical point dryer"
Nuclepore-Filter
Rasterelektronenmikroskop
Vakuumkammer
E3000 (Polaron)
(COSTAR)
ISI SS 40.5-1 (Leitz)
Sputter Coater 500 (Emscope)
- 55 Experimente II, Immunfluoreszenz
2.6.4
Herstellen von Gefrierschnitten
Zunächst wurden Gefrierschnitte von denjenigen Tumorstückchen angefertigt, die
zur Dokumentation an den Operationspräparaten entnommen und eingefroren worden waren. Es wurden Semidünnschnitte von 7 µm Dicke im Kryotom bei -15°C
hergestellt und diese sofort auf mit Ethanol gereinigte Objektträger überführt. Nach
ca. 24-stündiger Lufttrocknung konnten die Präparate weiterverarbeitet werden,
wobei zur Identifizierung der Strukturen zunächst eine Färbung mit Methylenblau
und eine lichtmikroskopische Durchmusterung erfolgte. Die Aufbewahrung erfolgte
im Kühlschrank.
2.6.5
Herstellen von Zellzentrifugaten
Die Gefrierschnitte erwiesen sich als für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung
zu heterogen und zu verunreinigt. Als dann verschiedene in der AG von Professor Falkenberg hergestellte MAK auf ihre mögliche NZK-Spezifität getestet werden sollten,
wurden hierzu auch Zellzentrifugate der entsprechenden Tumorzellsuspensionen verwandt. Hierzu wurden durch Verdünnung gewonnene Chargen von ca. 10 000 Zellen
auf 200 µl Flüssigkeit in die Vorrichtung geladen, ein selbstgefertigtes gelochtes Filterpapier auf die gereinigten Objektträger gebracht und 5 Minuten lang bei 600 U/min
zentrifugiert. Nach 24-stündiger Lufttrocknung konnten die Präparate bis zur Weiterverwendung bei -80°C aufbewahrt werden.
2.6.6
Gewinnung von Lymphozytensuspensionen
Beim Nachweis von Tumorzellen mit MAK muß man sie vor allem gegen die in aller
Regel sowohl in den Suspensionen als auch in Gewebeschnitten vorhandenen Lymphozyten abgrenzen können. Deswegen wurden als Kontrollen u.a. aus menschlichem
Venenblut gewonnene Lymphozytensuspensionen eingesetzt.
Durchführung:
1. Je 5 ml Vollblut werden vorsichtig auf 5 ml Separationsmedium (Ficoll)
geschichtet und 20 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert
2. Von der oberen Plasmaschicht so viel wie möglich absaugen und
verwerfen. Mit einer neuen Pasteurpipette die Lymphozyten abnehmen
- 56 3. Die Lymphozytenfraktionen in Reagenzgläser geben, 5 ml PBS-G. zugeben und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugieren
4. Nach Dekomplementierung (30 min im Wasserbad bei 56°C) kann die
Suspension als Zellzentrifugat bereitet werden.
2.6.7
Immunfluoreszenz
Es sollten in den Seren der Patienten Antikörper gegen tumorspezifische Antigene
nachgewiesen und deren Titer im Laufe der Immunisierungsbehandlung verfolgt
werden. Da die Nachweissysteme gegen menschliche Ig gerichtet waren und sich in
den Präparaten antigen-unabhängig [22] gebundene menschliche Ig bereits
befinden, mußten diese zunächst aus dem Nachweis genommen, also "abgedeckt"
werden. Um dies zu erreichen, wurden nach der Methode von Nielsen et al. [87] die
Gefrierschnittpräparate in einem ersten Schritt mit monomeren Fragmenten (Fab)
eines Anti-humanen Anti-Immunglobulin-Antikörpers (Im vorliegenden Fall von
der Ziege) inkubiert, um die endogenen unspezifischen Immunglobuline in den
Schnitten zu blockieren und damit die unspezifische Floureszenz
("Hintergrundrauschen") nach Möglichkeit zu unterdrücken. Dann erfolgte die
Fluoreszenzmarkierung, wobei als Positivkontrollen ANA-positive menschliche
Seren, also Seren, die mit ihrem nachgewiesenen Anteil anti-nukleärer Antikörper
die Zellkerne spezifisch anfärben mußten und als Negativkontrolle PBS-Proben
beutzt wurden.
Durchführung:
1. Markierung der Präparate auf den Objektträgern (Diamantstift)
2. Abdecken der unspezifischen gewebsständigen Ak mit Fab-Fragmenten
eines anti-humanen Ig; es wurden jeweils 50 µl einer für jedes Präparat
individuell zu bestimmenden Verdünnung des Ig mit PBS-G. aufgetragen und 30 min lang bei 37°C inkubiert
3. Waschen in Waschpuffer 3 x 1 min lang, dann Überschichtung mit 50 µl
Aliquots der verschiedenen Verdünnungen der Patientenseren und der
Kontrollsubstanzen; erneute Inkubation von 30 min Dauer
4. Waschen, dann Überschichtung mit 50 µl verschiedener Verdünnungen
eines FITC-markierten ZaHuIg ; erneute Inkubation von 30 min Dauer
5. Erneutes Waschen in Waschpuffer für 3 x 1 min, dann Eindecken der
Präparate mit Eindeckpuffer, Deckgläschen und Eukitt
- 57 Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ist ein Derivat des Fluoreszeins, das sich in alkalischem Millieu leicht kovalent an Proteine bindet. Antikörper werden dadurch zu
Detektoren; ohne ihre immunologische Funktion zu verlieren. Das Absorptionsmaximum liegt bei 490-495 nm, es emittiert ein charakteristisches grünes Licht einer
Wellenlänge von 517 nm.
2.6.8
2.6.8.1
Material
Chemikalien
Eukitt
Glycerin
KH2PO4
Na2HPO4
Rinderserumalbumin, rein
Fab-Z!HuIg
Z!HuIg, FITC-markiert
2.6.8.2
(Langenbrinck)
(Roth)
(Riedel de Haen)
(Merck)
(Serva)
(Ag Falkenberg)
(Nordic)
Puffer
PBS, 20-fach konzentrierte Stammlösung
180 g NaCl
5,34 g KH2PO4, wasserfrei
28,66 g Na2HPO4 x 2 H2O
in 1000 ml A. bidest.
PBS-G durch 1:20-Verdünnung, pH-Einstellung auf 7,2
Waschpuffer
PBS-G und 0,1% Rinderserumalbumin
Eindeckpuffer
PBS-G und 10% Glycerin
- 58 2.6.8.3
Geräte
Mikroskop "Bh 2" mit
Fluoreszenz-Auflichtilluminator
Fotokamera C-35 AD
Kryotom "2700 Frigocut"
Objektträger, Deckgläser
Zellzentrifuge "Zytospin"
(Olympus)
(Olympus)
(Reichert-Jung)
(Langenbrinck)
(Shandon)
- 59 -
3 Ergebnisse
3.1
3.1.1
Klinische Studie: Weiterentwicklung der Methodik
Interdisziplinäre Zusammenarbeit
Die Tumoraufarbeitung nach der bisher in der AG angewendeten Methodik war von
methodischen Problemen begleitet, die sukzessive gelöst werden mußten. Ein
Hauptproblem bestand darin, daß an der Aufarbeitung jeweils mindestens fünf verschiedene unabhängige Stellen (Immunologie, Mikrobiologie, Pathologie,
Radiologie und Urologie) beteiligt sind, die zeitlich und konzeptionell
zusammenarbeiten mußten, sodaß eine enge interdisziplinäre Zusammenarbeit
notwendig war. An erster Stelle ist hier die Zusammenarbeit mit dem Institut für
Mikrobiologie, Prof. Opferkuch, zu nennen.
Die zweite sicherlich bedeutendere Zusammenarbeit ergab sich mit dem Institut für
Pathologie, Professor Morgenroth, zuständig für die pathologische Begutachtung
der Präparate aus dem Marienhospital Herne. Professor Morgenroth und seine Mitarbeiter erklärten sich auf unsere Initiative hin bereit, die Tumoren gemeinsam mit
uns anzunehmen und zu verwerten.
Dies sah in der Praxis so aus, daß ein entsprechend instruierter Assistent aus dem
pathologischen Institut an unserer Werkbank unter sterilen Bedingungen die makroskopische Begutachtung vornahm und die für die histologische Untersuchung notwendigen Proben unter sterilen Kautelen entnahm. Der gesamte Resttumor konnte
danach von uns nach der oben beschriebenen Methode weiter aufgearbeitet werden.
In neuester Zeit ergab sich eine dritte wichtige Zusammenarbeit mit dem
strahlentherapeutischen Institut der Universität Essen, das über ein Gerät zur
Bestrahlung von Blutproben verfügt und das die entsprechenden Arbeiten
ermöglichte.
- 60 3.1.2
Methodische Vereinfachung
Die von Pomer [96] übernommene und von Hinkel [42] weiterentwickelte und
beschriebene Methodik der Aufarbeitung mußte unter folgenden Gesichtspunkten
erneut weiter modifiziert werden:
"
"
"
Die Aufarbeitung der einzelnen Tumoren dauerte sehr lange, sodaß bei ständig zunehmendem Tumoraufkommen eine schnellere Abwicklung des
technischen Ablaufs wünschenswert erschien
Die mechanische Zerkleinerung zerstörte sehr viele Zellen, was zu starken
Schwankungen in der Ausbeute an Zellen aus dem Tumormaterial führte
Es mußten im Anschluß an die mechanische Zerkleinerung immer große
Mengen von Zellfragmenten in der Suspension in Kauf genommen werden,
deren Antigenität völlig unberechenbar erschien.
So entwickelte sich folgende modifizierte Arbeitsmethode, die den technischen Problemen Rechnung trug und die Erfordernisse einer interdisziplinären Zusammenarbeit miteinbezog:
"
"
"
"
"
"
"
Entnahme und Transport des Gewebes wie oben beschrieben
Begutachtung des Tumors durch einen in die sterile Arbeitsweise in der Gewebekultur eingewiesenen Pathologen unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Air-Flow-Werkbank, sorgfältige "Sterilitätsassistenz" durch Mitarbeiter unserer AG, Gewebeentnahme, ggf. Schnellschnittdiagnose
Präparation, Zerkleinerung und Waschen des Gewebes wie beschrieben,
ebenso wie die Probenentnahme zur Dokumentation
Schonende enzymatische Dissoziation über Nacht bei 37°C unter vorsichtigem Rühren
Filtration der Suspension, Zentrifugation und weitere Zellpräparation wie
beschrieben
Anlegen einer Zellkultur mit ca. 10 000 Tumorzellen pro Gewebekulturflasche
Einfrieren, Lagerung, Auftauen der Zellen und Bereitung der späteren Vakzinierungsproben wie oben beschrieben
- 61 3.1.3
Zellkulturen
Von der 32. Aufarbeitung an nahmen wir regelmäßig einen kleinen Teil der gewonnenen Tumorzellen (etwa je 10 000 Zellen in einer Gewebekulturflasche) in
Zellkultur. Zu dieser Maßnahme führten uns sowohl technische als auch
theoretisch-immunologische Überlegungen. Es gelang nicht, aus jeder
Tumoraufarbeitung eine ausreichende Anzahl an Zellen zu gewinnen, insbesondere
dann, wenn das in der Regel viel kleinere Volumen einer Metastase aufzuarbeiten
war.
In einigen Fällen waren aus nicht immer zu eruierenden Gründen über 90% der
Zellen abgestorben. Da lebende Zellen immunogener sind als abgestorbene [97]
wären hierbei die Erfolgsmöglichkeiten einer folgenden Immunisierung
beeinträchtigt worden. In beiden Fällen erhofften wir uns durch geeignete
Zellkulturen eine Reserve, sodaß die betreffenden Patienten trotzdem
erfolgversprechend immunsiert werden könnten.
Theoretisch unterstützte uns die Überlegung, daß es ja gerade die Zellfraktion ist,
die wir in der Kultur expandieren, die zur Proliferation und damit auch potentiell
zur Metastasenbildung befähigt ist. Das heißt, daß wir unter Umständen in der
Zellkultur ein viel spezifischeres Antigengemisch herstellen können. Manche
Autoren führten die ASI-Behandlungen bis zu zwei Jahre lang monatlich durch, ein
Option, die sich mit in Zellkultur expandierten Zellen ebenfalls eröffnete.
Die Zellen wurden hierzu in 25-ml-Kulturflaschen (Falkon) überführt und mit
RPMI-Medium mit 15% FCS (Fetal calf serum) expandiert. Anfangs wurden
Streptomycin, Getamicin und Penicillin zugesetzt. Die adhärent wachsenden Zellen
wurden alle zwei Tage mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in neue
Kulturflaschen umgesetzt. Die Inkubation fand im Brutschrank bei 37°C in einem
mit 5% CO2 versetzten Raumluftgemisch statt.
- 62 3.2
Klinische Studie:Patientenergebnisse
3.2.1
3.2.1.1
Patienten
ASI-Therapiegruppe
Zwischen Februar 1990 und Dezember 1993 konnte das Tumormaterial von 39
NZK-Patienten der Urologischen Kliniken Herne (20 Patienten) und Münster (19
Patienten) aufgearbeitet werden. Von diesen Patienten konnten 30 in die Studie aufgenommen werden (77%), Tabelle 1 zeigt die Gründe für das Herausfallen der übrigen Patienten
Gründe gegen die Auswertung
Anzahl
Reduzierter AZ, Progredienz bis zum Tode, bevor die Immunisie- 4 (+1) Pat.
rungen erfolgen konnten (bzw.Abbruch)
Unbrauchbares Vakzine-Material
2Pat.
Histologisch
kein
NZK
(malignes
Paragangliom), 1Pat.
Immunisierungen trotzdem erfolgt, Bericht siehe unten
Widerruf der Einwilligung durch den Patienten
1Pat.
TAB.8: NICHT-AUSGEWERTETE PATIENTEN
Zwei dieser Patienten sind gleichwohl immunisiert worden, ein Pat. (FA17 M.M.)
hätte laut Studienprotokoll wegen schlechten Allgemeinzustandes und Tumorprogredienz eigentlich nicht vakziniert werden dürfen, sodaß er aus der Auswertung
genommen werden mußte, der Fall einer weiteren Pat. (Paragangliom) wird noch
dargestellt. Von den 30 übrigen Patienten waren 9 primär metastasiert (30%), sie
wurden weitgehend als separate Gruppe ausgewertet und den entsprechenden
Patienten der Kontrollgruppe gegenübergestellt.
Das durchschnittliche Alter der Patienten betrug 59,2 Jahre, wir behandelten 14
Frauen und 16 Männer, das entspricht einem Verhältnis von 1:1,14, was angesichts
der Tatsache, daß sowieso zunehmend Frauen vom NZK betroffen sind und sich das
alte 1:2-Verhältnis in ein 1:1,5-Verhältnis umwandelt [62], eine vertretbare statistische Abweichung darstellt.
- 63 Bezüglich der präoperativen Stadien wurden die Patienten in zwei Auswertungseinheiten eingeteilt, die der Pat. mit fortgeschrittenen, d.h. primär metastasierten oder
in Nachbarorgane eingebrochenen (T4) NZK, und die der nach OP klinisch tumorfreien, d.h. primär metastasenfreien Pat.. Wegen der eindeutigen prognostischen
Unterschiede werden die in den beiden Gruppen erhaltenen Ergebnisse gesondert
interpretiert.
Die Verteilung der präoperativen Prognosekriterien zeigen die folgenden Tabellen:
Metastasenfreie Patienten, T2/3, N0(x), M0(x)
21 Patienten (70%)
T-Stadien
N-/M-Stadien
Anzahl
Prozent
T2
T3a
T3b
N0(x)/M0(x)
N0(x)/M0(x)
N0(x)/M0(x)
8
8
5
27%
27%
17%
Grade: G1 1Pat., G2 18 Pat., G3 2 Pat.
Primär metastasierte Patienten,
Alle T, N+ u./o. M+ 9 Patienten (30%)
T-Stadien
N-/M-Stadien
Anzahl
Prozent
T2
T3
T4
N+/M+
N+/M+
alle N/M
1
6
2
3%
20%
7%
Grade: G2 5 Pat., G3 4Pat.
TAB.9: TNM-UND G-STADIEN ASI-GRUPPE
Es sind alle 30 Patienten immunisiert worden (100%), darunter 23 dreimal oder
öfter (76,6%), die anderen zweimal (5 Pat., 16,6%) oder einmal (2 Pat., 6,6%). Bei
den 7 nicht komplett durchimmunisierten Patienten lag der Grund dafür in 4 Fällen
(13,33%) bei einer quantitativ insuffizienten Vakzine, bei 3 Patienten mußte die
Therapie gemäß den Abbruchkriterien wegen Tumorprogredienz abgebrochen
werden. Ein Beobachtungszeitraum von mindestens 15 Monaten, meist aber von
über 2 Jahren, und bis zu 61 Monaten nach OP, in denen regelmäßige Follow-upUntersuchungen und hausärztliche Einschätzungen stattfanden, konnte den
Auswertungen zugrundegelegt werden.
- 64 3.2.1.2
Kontrollgruppe
Mit Hilfe der Matched-Pairs-Technik (Korrelation von Alter, Geschlecht, TNMStadium und OP-Datum) wurde aus dem Patientengut des Marienhospital Herne
eine Kontrollgruppe von 30 Patienten aus den Jahren 1990-1992 zusammengestellt.
Das Durchschnittsalter dieser Gruppe lag bei 62,6 Jahren, die Verteilung von
Frauen zu Männern bei 1:1,73. Es fanden sich im angegebenen Zeitraum nur 7
primär metastasierte Patienten, die nephrektomiert worden waren, ein weiterer
Grund dafür, die Patienten mit metastasierten Fällen von den anderen zu trennen
und gesondert zu vergleichen und zu bewerten.
Metastasenfreie Patienten, T2/3, N0(x), M0(x)
23 Patienten (77%)
T-Stadien
N-/M-Stadien
Anzahl
Prozent
T2
T3a
T3b
N0(x)/M0(x)
N0(x)/M0(x)
N0(x)/M0(x)
10
5
8
30%
17%
27%
Grade: G1 5 Pat., G2 16 Pat., G3 2 Pat.
Primär metastasierte Patienten,
Alle T, N+ u./o. M+ 7 Patienten (23%)
T-Stadien
N-/M-Stadien
Anzahl
Prozent
T2
T3
T4
N+/M+
N+/M+
alle N/M
3
4
0
10%
13%
0%
Grade: G2 5 Pat., G3 2 Pat.
TAB.10: TNM-UND G-STADIEN KONTROLLGRUPPE
Auch diese Patienten sind regelmäßig zur Nachuntersuchung gebeten worden, zusammen mit den Informationen der Hausärzte konnte ein Beobachtungszeitraum
zwischen 32 und 60 Monate nach OP den Auswertungen zugrundegelegt werden.
- 65 3.2.2
3.2.2.1
Immunisierungen
Durchführung
Sofern die Patienten nicht hospitalisiert waren, wurden sie mit festem Termin in die
Ambulanz bestellt. Der eigens dafür konzipierte Aufklärungs- und Einwilligungsbogen mußte analog der Aufklärung über einen medizinischen Eingriff jedweder
Art noch einmal durchgesprochen und vom Patienten unterschrieben werden. Dann
wurde die Vakzine gemäß dem anzulegenden Protokoll (hierzu standen ebenfalls in
der AG entworfene Formulare zur Verfügung) streng intrakutan appliziert, was
durch die entstehende intradermale Quaddel recht gut zu kontrollieren ist. Nach 3
und nach 7 Tagen wurden die Injektionsstellen begutachtet und die getasteten
Durchmesser der Induration an den Einstichstellen dokumentiert.
3.2.2.2
Probleme
Die bei der Durchführung der Studie aufgetretenen auftretenden Probleme hängen
vor allem mit der Verschiedenheit der Menschen zusammen, mit denen die Studie
durchgeführt wurde.
Patienten: Für jede Immunisierung mußten drei Temine wahrgenommen werden:
Die Immunisierung selbst, der Ablesetermin nach zwei Tagen und der zweite Ablesetermin nach einer Woche. Dies ist schon für Patienten, die in der Nähe der Klinik
wohnen, mit Schwierigkeiten verbunden und führt häufig zu Unregelmäßigkeiten,
gerade bei den Ableseterminen.
Der in die Studie eingebundene Arzt, der die Immunisierungen durchführt, ist selbst
im Klinikalltag eingebunden. Dies kann bei nicht exakter Planung letztlich zu nicht
studiengemäßen Immunisierungen oder -häufiger- zu Vernachlässigungen in der
Dokumentation führen, was die wissenschaftliche Auswertung der
Studienergebnisse ungemein erschwert. Außerdem muß man feststellen, daß die
erhobenen Befunde und dokumentierten Hautreaktionen umso weniger
reproduzierbar und objektivierbar waren, je mehr verschiedene Personen an den
Immunisierungen beteiligt waren.
- 66 3.2.2.3
Nebenwirkungen
Wie auch in der Literatur immer wieder betont wird, treten bei der ASI keine
ernsten Nebenwirkungen auf. Auch in unserer Studiengruppe konnten allenfalls
leichte lokale Erscheinungen an den Einstichstelle eindeutig auf die Vakzinierung
zurückgeführt werden. So beobachteten wir hier in einigen Fällen Hautrötungen,
Juckreiz und eine leichte Druckschmerzhaftgkeit der betreffenden Stellen.
Zu Ulzerationen der Haut ist es bei den Patienten, die in der vorliegenden Studie
mit ASI behandelt wurden, nie gekommen. Alle Symptome haben sich spätestens
innerhalb von 14 Tagen vollständig zurückgebildet, kein Patient berichtete von
einer ernsthaften Beeinträchtigung zu irgendeinem Behandlungszeitpunkt.
Die noch seltener beobachteten systemischen Nebenwirkungen wie eine leichte
Temperaturerhöhung, Abgeschlagenheit, Müdigkeit, Kopfschmerzen und eine allgemeine Antriebslosigkeit konnten in keinem der Fälle eindeutig mit der Vakzinierung in Verbindung gebracht werden (bei zeitlicher Koinzidenz zu grippeartigen Erkrankungen) und waren zudem ebenfalls nur sehr leicht beeinträchtigend und in
kurzer Zeit vollständig reversibel.
3.2.3
Prognosekategorien
Die beiden Patientengruppen wurden unter Berücksichtigung von anatomischer
Ausbreitung (T-Stadium), histologischem Differenzierungsgrad (G-Stadium) und
Einbruch ins venöse System („a“ mit oder „b“ ohne Veneneinbruch) noch weiter in
Prognosekategorien aufgeteilt.
Hierbei wurden bei den nicht-metastasierten Patienten 5 Kategorien gebildet, wobei
die T-Stadien 2 und 3a wegen ähnlicher Prognosedaten zusammengefaßt wurden;
außerdem wurde aus praktischen Erwägungen das T-Stadium 3b in nur zwei Kategorien unterteilt, ausgehend von der Tatsache, daß ein theoretisch mögliches Stadium T3b/G1 bei den Patienten dieser Studie nie beobachtet wurde.
- 67 Das untenstehende Diagramm veranschaulicht die Verteilung der Patienten auf die
einzelnen Prognosekategorien
70%
ASI, n=21
14
60%
Kontr., n=23
50%
40%
9
30%
7
20%
5
5
10%
1
1
1
1
0%
T2/3a, G1
T2/3a, G2
T2/3a, G3
T3b, G1/2
T3b, G3
Abb.6: Prognosekategorien I
In der Kontrollgruppe sind gegenüber der ASI-Gruppe also die ungünstigen Prognoseparameter etwas häufiger anzutreffen, die sehr günstigen allerdings auch, sodaß
sich insgesamt ein recht ausgeglichenes Bild ergibt.
Die primär metastasierten Patienten werden, Vorschlägen in der neueren Literatur
entsprechend [20], anhand des Metastasierungsmusters in eine günstigere (Metastasen in regionalen Lymphknoten u./o. homolateraler Nebenniere u./o. Lunge) Kategorie A und eine ungünstigere (Metastasen in entfernten Lymphknoten u./o. anderen Organen) Prognosekategorie B eingeteilt.
Folgende Metastasenorte kamen in den beiden Gruppen vor:
Kategorie Patient
Metastasen
Besonderheiten
A
G.F.
hiläre u. aortale LK
noduläre Strukturen im Rö-Tx
A
H.M.
Lunge
reduzierter AZ
A
M.D.
hiläre/aortale LK, Lunge
Aufarbeit. Metastasenmaterial
B
C.H.
LK, kontralat. Niere
2. Rezidiv-OP, Enukleation
B
U.M.
LK, Milz, Pankreas, etc.
T4, palliative Rezidiv-OP
B
K.O.
Beide Nieren, Nebenniere
- 68 B
H.S.
Leber,
(multipel)
Knochen
B
H.D.
Knochen, Lunge, LK
B
B.H.
Knochen (multipel)
Später Metastasenexstirpation
TAB.11: METASTASEN ASI-GRUPPE, N=9
Kategorie Patient
Metastasen
Besonderheiten
A
W.W..
hiläre u. aortale LK
A
A.W.
homolat. Nebenniere
A
G.P.
LK, homolat. Nebenniere
B
B.A.
Lunge, Scapula
B
H.B.
Lunge, Rippe
B
A.S.
Humerus
B
M.G.
Nebennieren, Rippe
Enukleation
Zusätzliches Tumorleiden
TAB.12: METASTASEN KONTROLLGRUPPE, N=7
Die Zuordnung zu den Kategorien ist im Vergleich der beiden Gruppen im
folgenden Diagramm dargestellt.
Auf die Besonderheiten einzelner Fälle wird an anderer Stelle noch eingegangen.
70%
60%
6
50%
4
40%
30%
ASI, n=9
3
Kontr., n=7
3
20%
10%
0%
Kat. A
Abb.7: Prognosekategorien II
Kat. B
- 69 Hierbei ergibt sich eine deutlich ungünstigere Ausgangsposition für die ASIGruppe, auf die später noch ausführlich eingegangen wird.
3.2.4
3.2.4.1
Auswertung bei den primär metastasenfreien Patienten
Rezidive des NZK
In der ASI-Gruppe registrierten wir 4 Patienten(19%) mit Rezidiven nach 6, 18, 18
und 28 Monaten, drei dieser Patienten verstarben bereits während des Beobachtungszeitraums. In der Kontrollgruppe traten 8 Rezidive (35%) (nach 4, 4, 7, 13, 16,
19, 24 und 24 Monaten) auf. 6 dieser Patienten mit Rezidiven verstarben im
entsprechenden Zeitraum.
Über die relevanten Daten (einschließlich krankheitsfreiem Intervall und
Überlebenszeit) bezüglich der Rezidive informieren die nachfolgenden Tabellen:
Patient
präop. T/G
Metastasierungsorte
KFI/ÜZ
R.L.
pT3a, G2
Lokalrezidiv
18 Mo./61+Mo.
R.S.
pT3a, G2
Lunge
18 Mo./28 Mo.
F.S.
pT3b, G2
lokal, Leber, Lunge, Hirn
6 Mo./10 Mo.
K.-H. L.
pT3b, G2
Leber Lunge, Hirn
28 Mo./30 Mo.
TAB.13: REZIDIVE ASI-GRUPPE
Patient
präop. T/G
Metastasierungsorte
KFI/ÜZ
H.E.
pT2, G1
Hirn
16 Mo./29Mo.
A.M.
pT2, G2
Leber
19 Mo./40+ Mo.
K.-H.B.
pT2, G3
Lunge, Hirn
24 Mo./36 Mo.
K.P.
pT3a, G2
Hirn
16Mo./18 Mo.
H.W.
pT3b, G2
Hirn, Pleura
13 Mo./17 Mo.
J.S.
pT3b, G2
Hirn, Lunge, Knochen
24 Mo./37 Mo.
M.G.
pT3b, G2
Leber, Lunge, Cava
4 Mo./47+Mo.
I.S.
pT3b, G3
Lokal, Lunge
7 Mo./15 Mo.
TAB.14: REZIDIVE KONTROLLGRUPPE
- 70 In beiden Gruppen waren in sämtlichen Todesfällen die Folgen der Tumorprogredienz (meist kardiorespiratorisches Versagen infolge erhöhten Hirndrucks, einmal
Tumorkachexie, Dyspnoe und Sekundärinfektionen) ausschlaggebend für die Todesursache.
3.2.4.2
Krankheitsverlauf mit und ohne ASI
Das folgende Diagramm zeigt die Kaplan-Meier-Kurven für das krankheitsfreie
Intervall bei den primär metastasenfreien Patienten.
100
90
80
70
%
60
50
40
ASI, n=21
30
Kontr., n=23
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Monate KFI
Abb.8: KFI metastasenfreie Pat.
Man sieht also recht deutlich die Schere, die sich zwischen den Gruppen auftut und
die sich seit der letzten Untersuchung von A. Hinkel [42] jetzt noch etwas deutlicher
herausgebildet hat. So leben nach der jetzt durchschnittlich über 3-jährigen Beobachtungszeit noch 81% der Patienten der ASI-Gruppe krankheitsfrei gegenüber
nur 65% der Patienten der Kontrollgruppe.
Bezüglich der Überlebenszeiten der Patienten mit Rezidiv ergeben sich nach
unseren Beobachtungen trotz des tendenziell späteren Rezidivierungszeitpunkts
keine bedeutsamen Unterschiede. So lebt von den 4 Rezidivpatienten bis dato noch
einer (25%), die durchschnittliche Überlebenszeit der übrigen Patienten betrug 23
Monate (10 Mo. -30 Mo.). Von den 8 Rezidivpatienten der Kontrollgruppe leben
- 71 noch zwei (25%), die durchschnittlich Überlebenszeit lag bei 25 Monaten. Hier
schlägt vor allem der Fall F.S. zu Buche , der später noch näher erläutert wird.
3.2.4.3
Statistik
Krankheitsfreiheit bei den Nicht-Metastasierten Fällen
ASI-Gruppe
KFI
Kumul. KFI
Standardabweich.
Ereignisse
6,00 Monate
0,9524
0,0465
1. Rezidiv
18,00 Monate
2. Rezidiv
18,00 Monate
0,8571
0,0764
3. Rezidiv
28,00 Monate
0,8095
0,0857
4. Rezidiv
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
50,00 Monate
4 Rez.
TAB.15: STATISTIK; KFI/ASI
Anzahl der Fälle: 21
Überlebende: 17 (80,95%)
Anzahl der Ereignisse: 4
- 72 Mittelwert des krankheitsfreien Intervalls (bis 50 begrenzt): 43,81 Monate (bei
Standardabweichung 2,88; 95% Konfidenzintervall zwischen 38,16 und 49,46).
Kontrollgruppe
Überlebenszeit
Kumul. Überleben
Standardabweich.
Ereignisse
4,00 Monate
0,9583
0,0408
1. Rezidiv
7,00 Monate
0,9167
0,0564
2. Rezidiv
13,00 Monate
0,8750
0,0675
3. Rezidiv
16,00 Monate
4. Rezidiv
16,00 Monate
0,7917
0,0829
5. Rezidiv
19,00 Monate
0,7500
0,0884
6. Rezidiv
24,00 Monate
24,00 Monate
7. Rezidiv
0,6667
0,0962
8.Rezidiv
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
50,00 Monate
8 Rez.
TAB.16: STATISTIK; KFI/KONTROLLGRUPPE
Anzahl der Fälle: 24
Überlebende: 16 (66,67%)
Anzahl der Ereignisse: 8
- 73 Mittelwert des krankheitsfreien Intervalls (bis 50 begrenzt): 38,46 Monate (bei
Standardabweichung 3,43; 95% Konfidenzintervall zwischen 31,74 und 45,17).
Die Signifikanz der Abweichungen unter den beiden Gruppen wurde nach dem Log
Rank Test berechnet und beträgt p=0,2684.
Die Unterschiede sind aufgrund der kleinen Fallzahlen statistisch nicht
signifikant.
3.2.4.4
Metastasierungsmuster und Zusatztherapien
In der Beurteilung des Metastasierungsmusters geht es vor allem darum zu untersuchen, inwieweit sich Unterschiede bezüglich der Entwicklung prognostisch eher
günstiger Metastasierungsmuster (Lokalrezidiv, Lungenmetastasen), bzw. eher ungünstiger Muster (Hirn- und Knochenmetastasen) ergeben haben.
In der ASI-Gruppe finden sich 2/4 (50%) Lokalrezidive, 3/4 (75%) Lungenmetastasierungen und 2/4 (50%) Hirnmetastasen. Alle Patienten hatten initial zunächst entweder ein Lokal- oder ein Lungenrezidiv, Knochenmetastasen sind nicht
aufgetreten.
In der Kontrollgruppe kam es zu der Entwicklung von 1/8 (12,5%) Lokalrezidiv,
4/8 (50%) Lungenmetastasen, 5/8 (62,5%) Hirnmetastasen und 1/8 (12,5%)
Knochenmetastase. 4/8 (50%) der Patienten hatten initial direkt Hirnmetastasen
(3/4), bzw. Lebermetastasen (1/4), ohne ein Lokalrezidiv oder Lungenmetastasen zu
entwickeln.
Es kann anhand dieser Daten festgestellt werden, daß die Patienten der ASI-Gruppe
grundsätzlich trotz Rezidivs zu leicht günstigeren Metastasierungsmustern neigen,
die dann zusätzlich therapeutische Interventionsmöglichkeiten erlauben. Das Lokalrezidiv kann noch einmal chirurgisch revidiert und entfernt werden, ebenso wie
solitäre Lungenmetastasen. Multiple Lungenmetastasierung läßt dann immer noch
die Option der adjuvanten Immuntherapie mit Il-2, IFN-a offen, die hier
erfahrungsgemäß ihre besten Ergebnisse aufweist. Die Patienten der Kontrollgruppe
weisen vor allem etwas häufiger und schneller Hirnmetastasen auf, bei denen nach
der derzeitigen Lehrmeinung außer Palliativmaßnahmen keine rationale
therapeutische Intervention mehr sinnvoll ist.
Zu adjuvanten Therapiemaßnahmen kam es in der ASI-Gruppe in zwei Fällen, Pat.
R.L. erhielt zunächst eine Vinblastin-Therapie (5 Stöße 10/91-1/92), dann entschloß
man sich zur erneuten chirurgischen Intervention bei gleichzeitiger Whipple-OP.
Der Patient ist 6/95 bei langsamer Progredienz des Krankheitsgeschehens bei guter
- 74 Gesundheit. Pat. R.S. erhielt nach Resektion von Lungenmetastasen in 10/93, bei
der nicht alle Metastasen entfernt werden konnten, eine Il-2/IFN-a/EndoxanTherapie, die bei zwischenzeitlichem stable disease die Progredienz noch ca. 6
Monate hinauszögern konnte.
In der Kontrollgruppe wird bei Pat. I.S. eine IFN/Vinblastin-Therapie bei Lokalrezidiv und Lungenfiliae eingesetzt, sie verstarb 8 Monate nach Beginn der
Progredienz. Pat. M.G. erhält seit der Diagnose einer pulmonalen Metastasierung
5/92 alle 14 Tage Stöße einer Vinblastin-Therapie, verträgt sie gut und erfreut sich
bei stabilem Krankheitsgeschehen 6/95 guter Gesundheit.
3.2.4.5
Prognose und Rezidiv
Trotz der teils sehr kleinen Patientenzahlen wird hier versucht, eine Korrelation
zwischen der Zuordnung zu den Prognosekategorien (s.o.) und der
Rezidivhäufigkeit aufzuzeigen.
Die folgende Diagramm veranschaulicht die Beziehungen. Die absoluten Patientenzahlen und Relationen beschreibt die darunterstehende Erläuterung.
100%
90%
80%
70%
60%
ASI
50%
Kontr.
40%
30%
20%
10%
0%
T2/3a, G1
T2/3a, G2
T2/3a, G3
T3b, G1/2
Abb.9: Prognose und Rezidiv
In der Kategorie T2/3a, G1 hat ein Patient (1/5) der Kontrollgruppe ein Rezidiv erlitten und keiner der ASI-Patienten. Sowohl 2 Patienten der ASI-, als auch der
- 75 Kontrollgruppe waren in der Kategorie T2/3a, G2 betroffen, was in der Kontrollgruppe aber prozentual stärker ins Gewicht fällt. In die Kategorie T2/3a, G3 konnte
aus beiden Parteien je ein Patient eingeordnet werden, nur in der Kontrollgruppe
war er von einem Rezidiv betroffen. In der Kategorie T3b, G1/2 waren aus der ASIGruppe 2 (2/5) Patienten von einem Rezidiv betroffen, während dies in der Kontrollgruppe bei 4 (4/7) Patienten der Fall war. Der einzige Patient aus der Kontrollgruppe mit T3b, G3 hat ein Rezidiv entwickelt, ist aber hierbei mit keinem Pat. der
ASI-Gruppe vergleichbar und deshalb in der Grafik nicht aufgeführt.
Trotz der geringen Fallzahlen ist die Tendenz deutlich erkennbar: in jeder einzelnen
Prognosekategorie ist der Anteil der Patienten mit Rezidiv bei den immunisierten
Patienten niedriger als bei den nicht-immunisierten Patienten.
3.2.5
Auswertung bei den primär metastasierten Patienten
3.2.5.1
Überlebenszeit mit und ohne ASI
%
In dem folgenden Diagramm sind die Kaplan-Meier-Überlebenskurven der
beiden Gruppen der primär metastasierten Patienten dargestellt:
120
100
80
60
40
ASI, n=9
Kontr., n=7
20
0
0
10
20
30
40
50
60
ÜZ in Monaten
Abb.10: Überlebenszeit prim. metastasierte Pat.
Von den drei überlebenden Patienten kann in einem Fall (G.F.) bei 48 Mo. Remission von einer definitiven Heilung ausgegangen werden, zwei Patienten (H.D. und
M.D.) befinden sich derzeit ohne Anzeichen einer Progredienz nachgewiesener Metastasen im stable disease, eine davon (M.D.) allerdings bei zwischenzeitlichem
Progreß des Krankheitsgeschehens unter der ASI. Todesursachen in der ASIGruppe waren in vier Fällen die Folgen der Tumorprogredienz (In je zwei Fällen
- 76 Hirndruck bei Hirnmetastasen und Tumorkachexie bei multipler Metastasierung),
ein Patient (B.H.) verstarb bei langsam progredientem Tumorgeschehen an seinem
zweiten Herzinfarkt auf dem Boden einer bekannten koronaren Herzerkrankung. In
der Kontrollgruppe ergibt sich ein ähnliches Bild: alle Patienten bis auf einen
verstarben an den Folgen ihres fortgeschrittenen Tumorleidens, ein Patient (W.W.)
verstarb bei gleichwohl progredientem Tumorleiden an einem Herzinfarkt.
3.2.5.2
Statistik
Überlebensanalyse bei den metastasierten Fällen.
ASI-Gruppe
Überlebenszeit
Kumul. Überleben
Standardabweich.
Ereignisse
12,00 Monate
0,8889
0,1048
1. Pat. verstorb.
13,00 Monate
0,7778
0,1386
2. Pat. verstorb.
16,00 Monate
0,6667
0,1571
3. Pat. verstorb.
25,00 Monate
0,5556
0,1656
4. Pat. verstorb.
30,00 Monate
0,4444
0,1656
5. Pat. verstorb.
33,00 Monate
0,3333
0,1571
6. Pat. verstorb.
60,00 Monate
6 Pat. verstorb.
60,00 Monate
6 Pat. verstorb.
60,00 Monate
6 Pat. verstorb.
TAB.17: STATISTIK; ÜZ/ASI
Anzahl der Fälle: 9
Überlebende: 3 (33,33%)
Anzahl der Ereignisse: 6
Mittelwert Überlebenszeit (bis 60 begrenzt): 34,33 Monate (bei Standardabweichung 6,45; 95% Konfidenzintervall zwischen 21,68 und 46,98).
Kontrollgruppe
Überlebenszeit
Kumul. Überleben
Standardabweich.
Ereignisse
2,00 Monate
0,8571
0,1323
1. Pat. verstorb.
8,00 Monate
0,7143
0,1707
2. Pat. verstorb.
20,00 Monate
3. Pat. verstorb.
- 77 20,00 Monate
0,4286
0,1870
4. Pat. verstorb.
22,00 Monate
0,2857
0,1707
5. Pat. verstorb.
33,00 Monate
0,1429
0,1323
6. Pat. verstorb.
44,00 Monate
0,0
0,0
7. Pat. verstorb.
TAB.18: STATISTIK; ÜZ/KONTROLLGRUPPE
Anzahl der Fälle: 7
Überlebende: 0
Anzahl der Ereignisse: 7
Mittelwert Überlebenszeit (bis 60 begrenzt): 21,29 Monate (bei Standardabweichung 5,36; 95% Konfidenzintervall zwischen 4,60 und 35,40).
Die Signifikanz der Abweichungen unter den beiden Gruppen wurde nach dem Log
Rank Test berechnet und beträgt p=0,1675.
Die Unterschiede sind statistisch nicht signifikant.
3.2.5.3
Krankheitsverlauf unter ASI
Um den Krankheitsverlauf unter irgendeiner postoperativen Therapie eines metastasierenden Tumorleidens beurteilen, sowie quantifizieren und damit vergleichen zu
können, ist es notwendig, geeignete Parameter herauszuarbeiten und zu
dokumentieren. Diesbezüglich hat sich neben der vor allem aus Patientensicht
entscheidenden Überlebenszeit (ÜZ) in der medizinischen Forschung vor allem die
schon beschriebene "objektive Ansprechrate (OR)" einer Therapie beim
Tumorleiden des Patienten als Parameter bewährt. Diese setzt sich zusammen aus
dem Anteil der Patienten mit kompletter Remission (CR), der Patienten mit
partieller Remission (PR) und der Patienten mit stabilem Krankheitsgeschehen (SD)
bei zuvor diagnostiziertem Progreß. Ferner spielt die Dauer der erzielten
Remissionen eine ebenso große Rolle.
Die Dauer der Remissionen bezieht sich in dieser Studie auf die Zeit zwischen der
Operation, nach der das Resektat zu einer Vakzine aufgearbeitet wurde, und dem
letzten dokumentierten Follow-up-Datum, an dem ein unveränderter Krankheitsstand, d.h. keine Progredienz befundet wurde. Bei durchschnittlich halbjährlichen
Abständen in den Nachuntersuchungen ist die tatsächliche Remissionsdauer damit
in der Regel etwas länger als bewertet. Wurde schon in der ersten postoperativen
- 78 Nachsorgeuntersuchung ein Progreß nicht ausgeschlossen, mußte von einem fortschreitenden Krankheitsgeschehen von Beginn (Zeitpunkt der OP) an ausgegangen
werden.
Danach wurde eine (11%) komplette Remission (Pat. G.F.) bei einem Patienten mit
lymphogen metastasiertem NZK im Stadium T3b erzielt. Bei diesem Patienten (OPDatum 26.4.1991) wurden computertomographisch im Bauchraum mehrere
Lymphknotenmetastasen beschrieben, die operativ nicht entfernt werden konnten.
In den Staging-Untersuchungen hatten diese sich vollständig zurückgebildet und
konnten bis Mai 1995 nicht mehr nachgewiesen werden. Auch im Aufnahmebefund
gefundene "fragliche feinnoduläre Strukturen" im Röntgenbild des Thorax wurden
später nicht mehr beschrieben. Die Remissionsdauer beträgt bis 5/95 48 Monate.
Des weiteren wurden drei (33%) partielle Remissionen von 12, 12 und 13 Monaten
Dauer beobachtet, eine Patientin davon befindet sich trotz zwischenzeitlicher Progression nach IL-2/IFN-Therapie im Stadium des stable disease.
Es handelt sich hierbei im ersten Fall (Pat. K.O., OP 13.1.1992) um zwischenzeitliche Remissionen von R1-(nicht tumorfrei) resezierter kontralateraler Metastase
samt Nebennierenmetastase.
Beim zweiten Patienten (Pat. B.H., OP Niere 22.6.1992, OP Knochenmetastase
13.7.1992) konnte histologisch eine Remission in entfernten Lymphknotenmetastasen (supraclaviculär) nachgewiesen werden.
Die dritte Patientin (Pat H.D., OP 10.2.1992) litt zum OP-Zeitpunkt schon unter einem weit fortgeschrittenen Krankheitsgeschehen mit Knochen-, Lungen- und
Lymphknotenmetastasen. So wird bei ihr radiologischerseits der Nachweis einer 4
cm großen osteolytischen Metastase im proximalen linken Radius erbracht, zudem
werden Metastasen in der Lunge und in den Lymphknoten des Leberhilus diagnostiziert. Der Verdacht auf weitere Knochenmetastasen in Scapula und Trochanter major links wurde darüberhinaus geäußert. Nach ASI und der späteren Resektion einer
Radiusmetastase waren zwölf Monate post-OP nur noch die Lungenherde bei hier
fraglicher Progredienz (zuvor Röntgenbild, dann Computertomographie des Thorax
zur Diagnose) nachzuweisen (siehe Einzelfälle und Diskussion).
Zwei Patienten (22%) befanden sich einige Zeit in einem stabilen Zustand ohne
nachweisbare Progredienz der Metastasen.
Eine Patientin (Pat. M.D., OP Niere 10.4.1992, OP Lungenmetastasen 10.8.1992)
zeigte zwar nach 5 Mo. offensichtlich neu aufgetretene Lungenmetastasen. Nach
Abschluß der ASI konnte jedoch keine sichere Progredienz beobachtet werden. Bis
- 79 dato (6/95) ist das Krankheitsbild ohne weitere Therapie (eine Immuntherapie
wurde nicht toleriert und daher sofort wieder abgebrochen) als stabil zu bezeichnen
(36 Mo.).
Der zweite Patient (Pat.C.H., OP 3.7.1990) wurde bereits am zweiten (kontralateralen) Rezidiv operiert, der verbliebene Tumorrest (Tumorstadium T4, R1-Resektion) bleibt nach ASI 12 Monate ohne Progredienz (eine mögliche Remission ist
wegen fehlender, z.B. kenspintomographischer Verlaufskontrolle nicht sicher zu
belegen, siehe Einzelfälle).
Bei drei Patienten (33%) war das Krankheitsgeschehen postoperativ von vorneherein auch unter der ASI progredient, zwei davon hatten allerdings auch extrem
schlechte präoperative Prognoseparameter (einmal Metastasen-OP ein Jahr nach
Tumornephrektomie bei nachgewiesenem riesigen T4-Lokalrezidiv und zum
zweiten reduzierter Allgemeinzustand bei massiver Tumorfolgesymptomatik, wie
Fieber, Gewichtsverlust, etc.).
3.2.5.4
Krankheitsverlauf ohne ASI
Es ist in der Onkologie allgemein bekannt, daß die chirurgische Entfernung eines
Primärtumors auch ohne adjuvante Therapie präoperativ nachgewiesene Metastasen
in ihrem Wachstum hemmen kann. In Einzelfällen ist es sogar schon zu Spontanremissionen gekommen. In unserem Kontrollkollektiv ist es in einem Fall (14%)
während des Beobachtungszeitraums von 44 Monaten zu keiner weiteren
Progredienz des Grundleidens (präop. multiple Lymphknotenmetastasen)
gekommen. Der zum Zeitpunkt der OP bereits 83-jährige Patient verstarb an den
Folgen eines Herzinfarktes.
Bei allen anderen Patienten war das Krankheitsgeschehen mehr oder weniger rasch
progredient, drei davon erhielten adjuvante Zusatztherapien (Radiatio und/oder
Chemotherapie).
3.2.5.5
Zusatztherapien in der ASI-Gruppe
Vier Patienten erhielten nach Abschluß der ASI bei nachfolgender Progredienz des
Tumorgeschehens adjuvante Radio- und/oder Chemotherapien. Eine Patientin (Pat.
H.D.) erhielt nach einer zwischenzeitlichen fraglichen Progredienz von
Lungenmetastasen eine Kombination von Il-2/IFN subkutan und befindet sich damit
- 80 nach 2 Intensivzyklen und 12-monatiger Erhaltungstherapie seit 8 Monaten ganz
ohne Therapie weiterhin in Vollremission.
Die Zusatztherapien bei den übrigen Patienten bleiben ohne meßbaren Remissionserfolg: ein Patient (Pat. B.H.) erhielt eine Radiatio nach Lymphknotenresektion,
zwei weitere Patienten (Pat. C.H. u. H.M.) wurden zunächst mit Vinblastin/IFN,
später dann mit Vinblastin/Clinovir behandelt.
3.2.6
DTH als Parameter
Die Auswertung der DTH könnte bezüglich ihres Wertes sowohl als prognostischer
Parameter, als auch als differentialtherapeutischer Parameter erfolgen. Vorausgeschickt sei, daß in dieser Studie die Auswertung der lokalen
Immunisierungsreaktion leider sehr unter der mangelnden Dokumentation durch die
immunisierenden Ärzte leidet. So konnten bei 30 immunisierten Patienten gerade
einmal 7 (23,3%!) komplette und 13 weitere inkomplette Immunisierungsprotokolle
ausgewertet werden (von denen allerdings wiederum 4 praktisch unbrauchbar
waren, da nur einer von mehreren Terminen protokolliert vorliegt).
Die Ergebnisse zeigen die folgenden Tabellen. Erläuternd sei gesagt, daß nicht alle
tatsächlich durchgeführten, sondern nur die ordnungsgemäß dokumentierten Immunisierungen aufgeführt sind.
In der ersten Tabelle ist die Auswertungseinheit der nicht-metastasierten Patienten
dargestellt, die mittleren Spalten zeigen die DTH auf die Tumorzellproben, jeweils
in Millimetern des Durchmessers der tastbaren Induration angegeben in chronologischer Reihenfolge.
Wie anhand der untenstehenden Tabelle belegt werden kann, konnte keine
Korrelation zwischen dem Krankheitsverlauf nach Immunisierung und der
Hautreaktion vom verzögerten Typ auf die Injektionen festgestellt werden. Weder
zeigt sich bei den Patienten mit schlechtem Krankheitsverlauf ein im Vergleich zu
den anderen niedrigeres Reaktionsniveau, noch kann offenbar aus der sukzessiven
Verringerung der Reaktion auf eine ungünstigere Prognose geschlossen werden, da
man diese auch mit wenigen Ausnahmen bei Patienten mit sehr gutem Verlauf
beobachtet.
- 81 Name
107Z/ml
106Z/ml
Verlauf
F.S.
10 - 7,5
4-3
schnell (6Mo) progredient
M.B.
9-5
1-1
krankheitsfrei
W.M.
25 - 10 - 7
0 - 0 - 4,5
krankheitsfrei
K.-H. L.
25 - 10 - 10
0 (4) - 0 - 0
nach 28 Mo. progredient
K.S.
10 - 5
3-0
krankheitsfrei
M.M.
42 - 17
11 - 0
krankheitsfrei
W.C.
4--
0--
krankheitsfrei
B.B.
10 - 4
4-2
krankheitsfrei
H.S.
8 - 10 - 8
5-8-4
krankheitsfrei
V.S.
9-7
2-2
krankheitsfrei
E.W.
12 - 8
9-5
krankheitsfrei
E.B.
5--
0--
krankheitsfrei
F.-W V.
8 - 12 - 15
0-2-2
krankheitsfrei
TAB.19: DTH NICHT-METASTASIERTE PAT.
Diese Beurteilung ist allerdings vorbehaltlich, da erstens nicht alle Immunisierungsprotokolle exakt geführt wurden und da zweitens verschiedene Ärzte diese Untersuchung übernommen haben, was die Interpretierbarkeit erschwert.
Zum Zweiten sehen wir die Auswertungseinheit der primär metastasierten Patienten
Name
107Z/ml
106Z/ml
Verlauf
F.G.
3-4-5
0-2-4
krankheitsfrei seit 48 Mo.
U.M.
11 - 10 - 10
1-1-0
Von Beginn progredient
H.S.
11 - 5
0-1
Progredienz nach ca. 4 Mo.
K.O.
10 - 6 - 2
0 (4) - 0 - 0
Progredienz nach ca. 12 Mo.
H.D.
11 - -
2,5 - -
Ohne Therapie in Remission
M.D.
5--
1--
Derzeit keine Progredienz
TAB.20: DTH METASTASIERTE PAT.
Hier kann zwar ein Anstieg der DTH bei den einzigen auswertbaren Patienten in
Remission und ein Abfall der DTH bei den Patienten mit progredientem
Krankheitsbild konstatiert werden, doch muß dieses Ergebnis aus den o.g. Grüden
ebenso vorsichtig bewertet werden.
- 82 3.2.7
Einzelfalldarstellungen
Von den 9 Patienten mit primär metastasiertem NZK werden im folgenden die 6
günstigeren Verläufe in chronologischer Reihenfolge in Form von Falldarstellungen
beschrieben.
Die Zeitangaben beziehen sich auf das OP-Datum.
Die 3 übrigen Patienten überlebten die OP 12, 13 und 25 Monate, bei zwei von ihnen wurde die Immunisierungstherapie wegen Tumorprogreß gemäß Protokoll abgebrochen.
Bei einem der Patienten (U.M., m, 52 Jahre) handelte es sich bei dem aufgearbeiteten Präparat um exstipierte Halslymphknotenmetastasen bei Zustand nach Nephrektomie ein Jahr zuvor (T3b, N2, M1, G1) und nachgewiesenem Lokalrezidiv
(T4, N2, M1, G3).
Die zweite Patientin (H.M., w, 65 Jahre) wurde im Tumorstadium pT3a, N0, M1,
G2-3 in reduziertem Allgemeinzustand bei Tumorkachexie nephrektomiert. Sie erhielt nach Abbruch der Immunisierungen wegen Metastasenprogredienz eine
kombinierte Vinblastin/IFN-Therapie.
Der dritte Patient (H.S., m, 51 Jahre) im Tumorstadium pT2, Nx, M1, G2, hepatische und ossäre Metastasierung, erhielt nach dem Abbruch der ASI
(szintigraphische Zunahme der Knochenherde) eine Il-2/IFN-Therapie.
Fall 1, (C.H., m, 54 Jahre, Tumorstadium T4, N2, M1, G3)
1/86 Tumornephrektomie links
7/89 Teilresektion der rechten Niere wegen kontralateraler Metastase
7/90 Tumorenukleation rechts wegen zweier im Durchmesser je 5 cm großen Rezidivmetastasen
AZ gut, kompensierte Niereninsuffizienz, starke BSG-Beschleunigung
Histologie: Resektionsränder nicht tumorfrei, Infiltration der Thoraxwand
8/90 ASI aus dem Material der Enukleation, 3 Immunisierungen
11/90 Staging ohne Hinweise auf Rezidiv oder Metastasen
3/91 Staging ohne Hinweise auf Rezidiv oder Metastasen
8/91 Etwa 3 cm großes Rezidiv (nicht ganz eindeutig), IFN-VinblastinTherapie
12/91 Unverändert inhomogene, für einen Rezidivtumor sprechende Struktur der rechten Restniere bei sonst stabilem Krankheitsgeschehen
6/92 Lokalrezidiv in unveränderter Größe, kein Tumorprogreß
- 83 2/93 Lokalrezidiv 11 x 11 cm groß, hepatische Filialisierung, Pat. in
gutem AZ, bei leichter Leukozytose und komp. Niereninsuffizienz
25.4.1993
Schnelle Progrdienz des Lokalrezidivs und der Metastasierung, finale Tumorkachexie, Exitus
Fall 2, (G.F., m, 72 Jahre, Tumorstadium T3b, N1, Mx, G2)
4/90 Makrohämaturien, Diagnose eines lymphogen metastasierten NZK
(paracavale/paraaortale LK-Metastasen infradiaphragmal), Durchführung einer arteriellen Tumorembolisation
4/91 Erneute Makrohämaturien, Rezidiv von etwa 13 cm Größe, weiterhin
LK-Metastasen, Lungenmetastasen nicht auszuschließen
Durchführung einer Tumornephrektomie rechts, laut histologischem Befund
mit Tumorthrombus in der V. cava, Resektionsränder waren tumorfrei, LKMetastasen waren nicht entfernt worden
6/91 ASI aus dem aufgearbeiteten Tumormaterial, 3 Immunisierungen
1/92 Kontrollstaging ohne Hinweis auf ein Rezidiv oder Metastasen,
insbesondere kein Nachweis vergrößerter LK im Abdominalbereich
7/92, 2/93, 8/93, 4/94und 2/95
Jeweils Kontrollstaginguntersuchungen
(Abdomen-und Thorax-CT. Knochenszintigraphien) ohne Nachweis eines
Rezidives oder einer Fernmetastasierung, klinische Beschwerdefreiheit, seit
2/93 Verdacht auf ein Prostatakarzinom
6/95 Fernmündlich Zustand unverändert gut
Fall 3 (K.O., m, 62 Jahre, Tumorstadium T3a, Nx, M1, G2)
1/92 Tumornephrektomie, Tumor mit 10 cm Durchmesser, Metastasen in
derselben Niere und in der gleichseitigen Nebenniere (bei OP entfernt)
sowie in der kontralateralen Niere und Nebenniere (bei OP nicht entfernt,
histologisch mittels PE gesichert)
2/92 ASI aus Tumor- und Metastasenmaterial, 3 Immunisierungen
8/92, 2/93
Stabiles
Krankheitsgeschehen,
Remission
der
Nebennierenrindenmetastase rechts, keine Veränderungen im Bereich der
rechten Niere
3/93 Gang- und Standunsicherheiten führen zur Diagnose einer Kleinhirnmetastase rechts bei unverändertem lokalen Status
- 84 8.5.1993
Wegen des ungünstigen Sitzes der Metastase rasche Entwicklung eines Hydrozephalus mit Hirndrucksymptomatik - nur noch symptomatische Therapie, Exitus
Fall 4 (H.D., w, 55 Jahre, Tumorstadium T3b, N+, M+, G2)
2/92 Abklärung einer schmerzhaften tumorösen Vorwölbung im Bereich
des linken Ellenbogens, Diagnose eines metastasierenden NZK (10 cm
Durchmesser, mit Cavazapfen), Tumornephrektomie rechts
Metastasenverdacht neben linkem Radius in Scapula, Trochanter major
links, Lunge und Leberhilus-LK
3/92 Postoperativ Lungenembolie, später Resektion der ossären Metastase
im linken Radius
3/92 ASI aus Tumormaterial (eine Immunisierung)
9/92 Unauffälliges Kontrollstaging mit unverändertem Lungenbefund
(Metastasenverdächtige Rundherde im Rö-Thorax) und ohne Nachweis anderer Metastasen oder eines Rezidivs
4/93 Kontrollstaging mit Nachweis von 4-8 meist unter 1 cm großen Lungenrundherden im CT des Thorax, ansonsten kein Hinweis auf Metastasen
oder Rezidiv
5/93 Der Befund wird als Progreß aufgefaßt, Einleitung einer IFN-Inhalationstherapie, bei fehlender klinischer Toleranz Umsetzen auuf eine kombinierte subkutane IFN/Il-2-Injektionstherapie
7/93 Rückbildung der pulmonalen Metastasen bereits nach dem ersten
Therapiezyklus
9/93 Kontrollstaging (einschließlich Thorax-CT) ohne Hinweis auf
Rezidiv oder Metastasen, komplette Remission nach zwei Zyklen IFN/Il-2
4/94, 10/94, 2/95
Kontrollstagings unter IFN/Il-2-Erhaltungstherapie
(bis 9/94) und nach Absetzen derselben ergenben weiterhin keinen Hinweis
auf ein Rezidiv oder Metastasen
5/95 Fernmündlich klinisch guter Zustand
Fall 5 (M.D., w, 61 Jahre, Tumorstadium T3b, N1, Mx, G3)
4/92 Zufallsdiagnose eines linksseitigen Nierentumors, sonographisch und
computertomographischer Nachweis von paraaortalen LK-Metastasen, Tumornephrektomie links
- 85 Das zur Immunisierung aufgearbeitete Tumormaterial muß wegen positiver
Sterilproben (Kontamination von Transportmedium und Vakzine) verworfen
werden
8/92 Lungenoberlappenresektion links wegen solitärer Metastase (histologisch passend zum NZK)
9/92 ASI aus dem Metastasenmaterial, 3 Immunisierungen
1/93 Wahrscheinlich (jetzt CT gegenüber 9/92 Rö-Thorax) neu aufgetretene bis 2 cm große pulmonale Rundherde
3/93 Abschluß der Immunisierung
5/93 Versuch einer IFN/Il-2-Therapie, von der Pat. extrem schlecht toleriert, so daß der Abbruch der Therapie erfolgte. Die Pat. lehnte im Verlauf
auch eine niedriger dosierte IFN/Il-2-Therapie ab
In den Staging-Untersuchungen trotzdem keine Progredienz nachweisbar
9/93, 1/94, 5/94, 9/94 und 1/95, die jeweils durchgeführten StagingUntersuchungen erbrachten keinen Hinweis auf ein Lokalrezidiv oder auf
ein Fortschreiten der pulmonalen Metastasierung, im Gegenteil erschienen
die Lungenrundherde zuletzt kaum noch nachweisbar zu sein (Im RöThorax 1/95)
4/95 Fernmündlich klinisch in gutem AZ
Fall 6 (B.H., m, 62 Jahre, Tumorstadium T3b, Nx, M1, G2)
5/92 Rechtsseitige Schulterschmerzen führen zum Nachweis einer Osteolyse und zur PE aus dem entsprechenden Bereich. Die weitere Diagnostik
führt zum Nachweis eines ossär metastasierten NZK
6/92 Tumornephrektomie links wegen Fernmetastasierung ohne Adrenalektomie, Veneneinbruch, Resektionsränder tumorfrei
7/92 Scapulateilresektion rechts
7/92 ASI mit aufgearbeitetem Tumormaterial (3 Immunisierungen)
12/92 und 6/93
Staginguntersuchungen ohne Anhalt für Rezidiv oder
Metastasierung
8/93 Im Thorax-CT, durchgeführt wegen persistierender Schulterschmerzen, zeigte sich eine tumoröse Raumforderung rechts infraklavikulär. Die
Histologie nach Resektion ergab eine LK-Metastase mit nekrotischen
Anteilen von NZK-Gewebe, dicht lymphozytär infiltriert. Der Befund wird
als Immunisierungsfolge gedeutet
9/93 Nachbestrahlung der rechten Schulterregion mit insg. 40 Gy
- 86 1/94 Im Staging (Abdomen-CT) Verdacht auf eine Nebennierenmetastase
links
7/94 Staging, Größenzunahme der Nebennierenmetastase, zudem Nachweis beginnender multipler Metastasierung (pulmonal und ossär)
10/94 Palliative Bestrahlung einer Metastase im 8. Brustwirbelkörper
wegen starker Schmerzsymptomatik, ansonsten keine wesentliche
Progredienz des Geschehens
12/94 Stationäre Aufnahme wegen starker Knochenschmerzen
4.12.1994
Exitus durch Herzinfarkt bei bekannter koronarer Herzkrankheit und Zustand nach einem Herzinfarkt
3.2.8
Anekdotische Darstellung eines Sonderfalls: Versagen der ASI bei einer Patientin mit
malignem Paragangliom
Patientin A. G.-L., Alter: 37 Jahre
3/92 Linksseitiger Flankenschmerz führt zur Diagnose eines großen, zystischen
Nierentumors
4/92 Tumornephrektomie links, präoperativ Nachweis von paraaortalen LKMetastasen sowie von pulmonalen metastasenverdächtigen Rundherden
Veneneinbruch, komplizierter OP-Verlauf, in dessen Folge eine Milzexstirpation
erfolgen muß
Mittels diverser Spezialuntersuchungen erfolgt die histologische Einordnung als
malignes Paragangliom, am ehesten vom Nebennierengewebe ausgehend
5/92 Entschluß zum Versuch der ASI, auch mangels therapeutischer Alternativen
(1 Immunisierung)
6/92 Multiple hepatische und pulmonale Metastasierung, Abbruch der ASI, Beginn einer Polychemotherapie
7/92 Exitus im Rahmen einer sekundären Pneumonie bei Panzytopenie, Lungenödem und akutem Nierenversagen
Die Paragangliome sind extrem seltene Tumoren, die von den Paraganglien (Katecholamin-sezernierende Zellen besonders in der Nebenniere und dem
Grenzstrang) ausgehen.
Etwa 10% der Paragangliome sind maligne, Metastasierungen sind jedoch im allgemeinen selten.
Die Symptomatik wird vom endokrinen Verhalten, von der Größe und von der Lokalisation des Tumors bestimmt.
- 87 -
Die Therapie der Wahl ist die möglichst komplette chirurgische Resektion des Tumors, Paragangliome gelten als ausgesprochen strahlen- und chemosensibel. Dennoch sollte vor allem bei nachgewiesener Metastasierung eine Chemo- und/oder
Radiotherapie versucht werden, weil immer wieder von Wirksamkeit in
Einzelfällen berichtet wird.
Die von uns nach einiger Diskussion mit allen Beteiligten probeweise
durchgeführte Immunisierung mit einer Vakzine aus autologen Tumorzellen hat
keinerlei nachweisbare Wirkung gezeigt, wobei der Krankheitsverlauf allerdings
auch auf einen Tumorprozeß von außergewöhnlich aggressiver maligner Potenz
hinweist, der sich sicherlich von vorneherein therapeutischen Maßnahmen
gegenüber weitgehend resistent präsentierte.
3.3
3.3.1
Experimenteller Teil. Ergebnisse Immunfluoreszenz
Gefrierschnitte
Nach jeder Aufarbeitung waren Tumorstückchen zur Dokumentation abgenommen
und eingefroren worden, von denen in den vorliegenen Experimenten zunächst Gefrierschnitte von 7µm Dicke verwendet wurden. Als Kontrollen dienten ebensolche
Gefrierschnitte von normalem menschlichen Nierengewebe, das freundlicherweise
von anderen Mitarbeitern der AG Falkenberg zur Verfügung gestellt wurde.
Trotz sorgfältigster Technik und Blockade der unspezifischen endogenen
Antikörper mit passenden Fab-Fragmenten, wie beschrieben, gelang es nicht, das
"Hintergrundrauschen" ausreichend zu unterdrücken. Die mittels Immunfluoreszenz
nachweisbaren Reaktionen auf den Gewebeschnitten konnten in keinem Fall wie
vorgegeben einer spezifischen Antigen-Antikörperreaktion zugeordnet werden,
sodaß diese Technik in der Folge rasch wieder verlassen werden mußte.
3.3.2
Zellzentrifugate
Insgesamt sieben verschiedene in der AG Falkenberg hergestellte murine monoklonale Antikörper gegen Antigene der menschlichen Niere und des Nierenkarzinoms
wurden an Zellzentrifugaten verschiedener NZK (hierzu wurden "übriggebliebene"
- 88 nicht zu Immunisierungen verwendete Vakzinezellen genutzt) sowie an Lymphozytensuspensionen ausgetestet. Ziel der Untersuchungen war es, die Tumoren antigenisch näher zu charakterisieren und somit vielleicht ein Detektorsystem zu
entwic??keln, das in der Lage ist, Tumorzellen von anderen zellulären
Bestandteilen im Tumor (v.a. Lymphozyten) sicher zu unterscheiden.
In einem zweiten Schritt hätte auch dieses System zur möglichen Quantifizierung
einer Ak-Reaktion gegen Tumorzellen aus den verschiedenen Seren der
behandelten ASI-Patienten dienen sollen. Eine entsprechende Quantifizierung war
von Breul [11] beschrieben worden. Er hatte Antigene des Nierenzellkarzinoms
fluoreszenzmikroskopisch dargestellt und eine Quantifizierung von Antikörpern im
Serum der entsprechenden Patienten über den reziproken Wert der Belichtungszeit
vom Präparat angefertigter Fotografien versucht.
Alle eingesetzten MAK zeigten eine ihrer Spezifität entsprechende Reaktivität an
gleichzeitig ausgetesteten Gefrierschnitten normalen humanen Nierenparenchyms.
Die Beurteilung der Intensität der Fluoreszenz erfolgte zunächst nach subjektiver
Einschätzung am Mikroskop im Vergleich zu den Kontrollen (Negativkontrollen:
PBS statt Zweit-AK; Positivkontrollen mit ANA-positiven humanen Seren) in fünf
Kategorien:
=
keine Fluoreszenz
Negativkontrollen
(+)
=
sehr schwache Fluoreszenz
+
=
schwache Fluoreszenz
++
=
mittlere bis starke Fluoreszenz
+++ =
sehr starke Fluoreszenz
Positivkontrollen
- 89 Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle
MAK
Verdünnung
Lymphozyten
Tumorzellen
PM I 8 A1
1:50
-
++
PM I 26 D1
1:50
+
(+)
PM II 20 E7
1:50
(+)
++
PM II 43 A3
1:70
(+)
+
PM II 48 C1
1:70
+
++
PM II 63 E9
1:50
+
+
NICA II 37 G10
1:70
-
++
TAB.21: ERGEBNISSE FLUORESZENZMIKROSKOPIE
Die beiden MAK PM I 8 A1 und NICA II 37 G10 zeigten also hinreichende Spezifität bei der Differenzierung von Tumorzellen und Lymphozyten und könnten zur
Detetektion eingesetzt werden.
Bei der Belichtung darauffolgend angefertigter Fotografien stellte sich schnell heraus, daß der reziproke Wert der Belichtungszeit nicht zur Quantifizierung der Antikörperreaktion verwendet werden konnte: das zu erwartende Ergebnis auch in den
Kontrollexperimenten stimmte äußerst selten mit dem festgestellten Ergebnis
überein und selbst dasselbe Präparat konnte, zu verschiedenen Zeiten gemessen,
vollkommen verschiedene Belichtungszeiten aufweisen. Auf den Versuch einer
Quantifizierung der Antikörperreaktion gegen autologes NZK-Gewebe in den Seren
behandelter Patienten mußte daraufhin verzichtet werden.
3.4
3.4.1
Experimenteller Teil: Elektronenmikroskopie
Präparate
Die Herstellung der Suspensionen NDV-modifizierter Tumorzellen erfolgte analog
der Vorschrift zur Herstellung von Patientenvakzinen. Es wurden verschiedene im
Rahmen dieser Studie gewonnene Tumorzellsuspensionen dazu verwendet, die aus
den unterschiedlichsten Gründen (z.B. Abbruch der ASI-Therapie) nicht zur Vakzinierung verwendet worden waren. Diese Maßnahmen sollten die Repräsentanz der
festgestellten Ergebnisse sicherstellen.
- 90 Um die Dynamik in der Adsorption der Viruspartikel an die Tumorzellen untersuchen zu können, wurde der Inkubationsprozeß zu zwei verschiedenen Zeitpunkten
durch Fixierung der Zellen unterbrochen: nach 10 min und nach 30 min. Nach 10
min finden sich laut Meiselmann et al. [76] elektronenmikroskopisch verschiedene
Phasen der Virusadsorption bei den von ihnen untersuchten menschlichen
Zelltypen; nach 30 min gilt die Aufnahme der Viruspartikel in die Zelle als
abgeschlossen.
In enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Prof. Morgenroth) wurden die Präparate in einem institutsüblichen Standardverfahren für die
Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet.
Das Mikroskopieren, die fotografische Dokumentation und die Interpretation der
gefundenen Strukturen erfolgte gemeinsam mit Prof. Morgenroth, durch dessen außerordentlich reiche elektronenmikroskopische Erfahrung die berichteten
Ergebnisse fachlich fundiert und objektiviert dargestellt werden können.
3.4.2
Ergebnisse
Die Abbildungen dokumentieren die Virusadsorption:
Abb.11: Inkubationszeit 10 Minuten I
- 91 -
Abb.12: Inkubationszeit 10 Minuten II
Abb.13: Inkubationszeit 10 Minuten III
- 92 -
Abb.14: Inkubationszeit 30 Minuten I
- 93 -
Abb.15: Inkubationszeit 30 Minuten II
Abb.16: Inkubationszeit 30 Minuten III
- 94 Auf den Abbildungen 11-13 ist zunächst eine Tumorzelle zu sehen, die eine glatte
Oberfläche zeigt. Nur durch plattenförmige Auflagerungen des Nährmediums wirkt
diese leicht unregelmäßig. Nach 10 min Inkubation finden sich im wesentlichen
diese Zellen, bei näherem Hinsehen zeigen sich Zellausläufer verschiedener Länge,
die in Kontakt treten mit einer Ansammlung sphärischer Partikel mit einem
Durchmesser zwischen 0,1 und 0,4 µm, bei denen es sich zweifellos um die
Viruspartikel (durch Umhüllung mit Medium verschieden groß wirkend) handelt.
Die Größe der Viruspartikel entspricht der erwarteten Größe, die auch in
verschiedenen elektronenmikroskopischen Studien über das NDV [76; 83; 109]
festgestellt wurden.
In der Studie von Meiselman et al. [76], die sich besonders mit dem Mechanismus
der Penetration der Viren in Zellen befaßt, wird beschrieben, daß die
Virusaufnahme in die meisten menschlichen Zellen durch eine Art
Phagozytosemechanismus erfolgt. Daß dies auch für Tumorzellen gilt, kann hier
deutlich demonstriert werden.
Die Abbildungen 14-16 zeigen die virusmodifizierten Tumorzellen nach einer Inkubationszeit von 30 min. Deutlich ist die veränderte Oberfläche der Zellen zu erkennen, neben sphärischen Ausläufern mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 0,4
µm sieht man nun auch mehr längliche Strukturen mit bis zu 0,5 µm Länge. Auch
andere Autoren beschreiben neben den sphärischen Viruspartikeln pleomorphe,
mehr längliche Viruspartikel mit eben diesen Ausmaßen [113].
Legende zu den weißen Maßstabbalken:
Abb.11: 1µm
Abb.12: 1µm
Abb.13: 1µm
Abb.14: 1µm
Abb.15: 500nm
Abb.16: 200nm
- 95 -
4 Diskussion
Der vorliegenden Arbeit liegt eine Phase-II-Studie zugrunde mit 30 Patienten, die
an fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom erkrankt waren und die nach Nephrektomie mit autologen Tumorzellpräparaten immunisiert wurden.
In der folgenden Diskussion wird zunächst die Durchfürbarkeit der von Schirrmacher [124] und Pomer [96] beschriebenen Methode und deren Weiterentwicklung erörtert. Dann wird die Wirksamkeit der Therapie bei den behandelten
NZK-Patienten beschrieben und dabei auch Einzelfälle dargestellt.
Schließlich werden die Ergebnisse ergänzender fluoreszenz- und rasterelektronenmikroskopischer Experimente besprochen.
4.1
Klinische Studie: Weiterentwicklung der Methodik
Die Aktive Spezifische Immunisierung (ASI) ist eine Therapieform, bei der für
jeden Patienten eine Vakzine aus autologen Tumorzellen hergestellt werden muß.
Für eine solche Therapie müssen höchste Anforderungen an die Methode der
Aufarbeitung gestellt werden, vor allem was die Charakterisierung und Qualitätskontrolle dieser naturgemäß immer unterschiedlichen individuellen Präparate anbelangt. In kleinen Schritten wurde die Methodik so modifiziert, daß zuverlässig
und standardisiert Einzelzellsuspensionen aus NZK-Gewebe gewonnen werden
können (siehe auch [42]).
Die logistische Zusammenarbeit der einzelnen an der Vakzineherstellung und
Anwendung Beteiligten mußte zeitlich und konzeptionell koordiniert werden.
Sodann wurde die Methodik labortechnisch, wie unten beschrieben, soweit vereinfacht und gestrafft, daß die Aufarbeitung sowohl schneller, als auch mit einer
höheren Zellausbeute vonstatten ging.
- 96 4.1.1
Entnahme und Transport
In allen Fällen wurde versucht, die Aufarbeitung von der Entnahme des Operationspräparates bis zum Einfrieren der fertigen Zellportionen so schnell wie möglich
durchzuführen. In der Regel dauerte es 6-8 Std. von der Tumorentnahme im
Operationssaal bis zum Einfrieren der fertigen Tumorzellsuspensionen. Bei längerer
Dauer von Transport und Aufarbeitung ist zu befürchten, daß der Anteil vitaler
Zellen in der Suspension abnimmt, was wegen der allgemein geringeren Immunogenität abgestorbener gegenüber lebenden Zellen [97] unerwünscht ist. Die
Präparate wurden daher aus dem Marienhospital Herne durch Institutsmitarbeiter
und aus der Uniklinik Münster mit dem Fahrdienst des Deutschen Roten Kreuzes
ins Labor transportiert.
4.1.2
Pathologische Diagnostik
Es erfolgte eine Begutachtung des gesamten Resektates durch einen eingewiesenen
Pathologen unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Air-Flow-Werkbank.
Nach Musterung und makroskopischer Beurteilung erfolgte die Entnahme von zur
pathologischen Diagnostik geeigneten Gewebeproben und ggf. eine Schnellschnittdiagnose. Es muß dazu ständig ein pathologisches Instrumentarium als sterilisiertes Set zur Verfügung stehen.
Aus dem organisatorischen Aufwand erwachsen Vorteile für die Beteiligten:
"
"
"
"
Der Pathologe sieht nicht, wie bisher, nur die Hälfte des Präparates, was ihm
im Einzelfall das genaue „Staging“ erschwert, sondern kann selbst am
vollständigen Präparat seine Diagnostik lege artis durchführen
Für Mitarbeiter, die im OP das Tumorpräparat teilen, löst dies das Problem,
als Nicht-Pathologe im Einzelfall über eine recht willkürliche Teilung des
Präparates entscheiden zu müssen
Da der Pathologe in aller Regel nur einen Teil des Tumor-Resektates zur
histologischen Begutachtung entnimmt, steht für die Aufarbeitung eine
größere Tumormenge zur Verfügung; Präparationen, die nicht ausreichend
Material ergeben, konnten dadurch fast vollständig vermieden werden
In Einzelfällen unklarer makroskopischer Aspekte (z.B. in Fällen von
Phäochromozytomen und Lipomen) können durch eine Schnellschnittdiagnose unnötige Aufarbeitungen vermieden werden
- 97 "
4.1.3
Weitergehende Zusammenarbeit könnte z.B. auf dem Gebiet der immunhistochemischen Frühdiagnostik erfolgen (denkbar wäre z.B. der Nachweis
epithelialer Marker im Knochenmark der Patienten als frühzeitiger Hinweis
auf Mikrometastasierung [93; 104; 129; 130])
Zellvereinzelung
Für die Aufarbeitung von Tumormaterial zu einer Einzelzellsuspension ist die
Einrichtung eines Zelllabors mit sterilen Arbeitsplätzen notwendig. Die von Pomer
[96] übernommene und von Hinkel [42] weiterentwickelte Methodik der
Aufarbeitung mußte wie unten beschrieben modifiziert werden:
Für die Aufarbeitung von Tumorgewebe mit dem Ziel der Gewinnung von Einzelzellsuspensionen sind verschiedene Methoden beschrieben. Diese umfassen im
wesentlichen rein mechanische oder rein enzymatische sowie kombinierte Ansätze.
Die in der AG etablierte Aufarbeitungsmethode ist auf die besonders fragilen (und
damit gegenüber aggressiven mechanischen Verfahren besonders empfindlichen)
Zellen des häufigsten NZK-Typs (Hellzelliges NZK, s.o.) zugeschnitten. Eine
maximale Ausbeute vitaler Zellen konnte so gesichert werden.
Nach Präparation und grober Zerkleinerung des Tumorgewebes mit dem Skalpell
erfolgt das Abspülen des Gewebes mit sterilem Medium zur Entfernung der
Blutreste sowie der Antibiotikazusätze. Ein weiterer mechanischer Zerkleinerungsschritt, das Ausquetschen der Tumorstückchen durch ein sterilisiertes Metallsieb, wurde in der Anfangsphase der Studie von den Aufarbeitenden praktiziert,
bot aber letztlich bei großem Arbeitsaufwand keine Vorteile bezüglich Ausbeute
und Vitalität der Tumorzellen.
Statt einer enzymatischen Kurzdissoziation von 30 min. wurde jetzt eine schonende
enzymatische Langzeitdissoziation über Nacht bei 37°C unter vorsichtigem
Schütteln angeschlossen. Das Rühren der Gewebestücke-Suspension auf einem
Magnetrührer hatte sich als unbrauchbar erwiesen, da sich nach der Behandlung
mittels Trypanblau-Färbung keine vitalen Zellen mehr nachweisen ließen. Offenbar
wurden die enzymatisch vereinzelten Zellen vom Rührmagneten zerquetscht.
Die verwendeten Enzyme sind bei 37°C nur einige Stunden lang katalytisch aktiv,
sie sollten daher erst unmittelbar vor der Dissoziation in Medium 199 aufge-
- 98 nommen und sterilfiltriert werden; längere Inkubationszeiten von Enzymlösung und
Tumorgewebesuspension über 8-10 Std. hinaus sind aus dem selben Grund nicht
sinnvoll.
Vor dem Einfrieren der Tumorzellen wird ein Aliquot der Lösung entnommen,
diese Zellen wurden in FCS-haltigem Medium kultiviert. Schon nach wenigen
Tagen hat man damit eine expandierte Fraktion in-vitro vermehrter Tumorzellen zur
Verfügung, die z.B. für die Herstellung weiterer Vakzineportionen genutzt werden
kann. Die Zellen werden hierzu in 25-ml-Kulturflaschen (Falcon) überführt und mit
RPMI-Medium mit 15% FCS (Fetal calf serum) kultiviert. Die adhärierten Zellen
werden alle zwei Tage mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in neue
Kulturflaschen umgesetzt. Die Inkubation findet im Brutschrank bei 37°C in einer
5% CO2 enthaltenden Atmosphäre statt. Das Einfrieren der Zellen, die Lagerung,
das Auftauen und die Bereitung der späteren Vakzinierungssuspensionen erfolgt
wie beschrieben.
Die Gewinnung von Tumorzellen durch in-vitro Kultivierung hat durchaus widersprüchliche Aspekte: einerseits werden in der Kulturflasche eben Zellen jener
Zellklone einer durch vielfache Mutationen heterogenen Tumorzellsuspension angereichert, die (noch) proliferationsfähig sind. Es gibt gute Gründe anzunehmen,
daß sich aus diesen “Wachstumsfraktionen“ die Tumorzellen rekrutieren, die
potentiell zur Metastasierung in vivo fähig sind [104]. Eine ASI ist am besten gegen
frühe Metastasenstadien wirksam [44]. Es könnte also theoretisch eine bessere
Spezifität in bezug auf die Oberflächenantigene bei den durch Kultivierung
gewonnenen Tumorzelllinien angenommen werden.
Andererseits kann es durch die in-vitro Proliferation zur Einschränkung und/oder
zur Veränderung der Antigenität der Tumorzelloberfläche kommen. Zur Proliferation fähige Tumorzellen können beispielsweise Antigene verlieren [117]. Das
Antigenspektrum des dann vorliegenden Tumorzellgemisches wird dann mit zunehmender Expansionsrate immer dem des ursprünglichen Gemisches entsprechen.
Von Hanna und Schirrmacher wurde die Notwendigkeit des kontrollierten Einfrierens der Zellsuspensionen für die Konservierung ihrer Immunogenität betont
[94]. Da keine Vorrichtung zum temperatur- und zeitkontrollierten Einfrieren zur
Verfügung stand, wurden in der vorliegenden Arbeit die Zellen nach der in der AG
Falkenberg etablierten Methode eingefroren, die sich für Hybridomzellen bewährt
hat.
- 99 -
4.1.4
Herstellung der Vakzine
Das Auftauen der Zellen sollte rasch erfolgen, da das DMSO-haltige Einfriermedium zelltoxisch ist. Die Aufnahme in 50 ml DNAse-haltigem Medium gewährleistet neben der Verdünnung des Einfriermediums (1:50) den enzymatischen Abbau
freier DNA-Fragmente. Letztere entstehen beim Zelluntergang und erschweren die
weiteren Arbeitschritte, da sie mit ihren freien Enden („sticky ends“) Zellen zum
Verklumpen bringen.
Die Augmentation der Immunogenität der Vakzine erfolgte in der vorliegenden
Studie mit NDV, Strain Ulster. NDV wurde von Schirrmacher als immunmodulatorisch aktiv beschrieben, ohne dabei humanpathogene Risiken zu bergen [114].
Die Inkubation der Tumorzellen mit den Viruspartikeln (1x107 Tumorzellen mit 32
HAU NDV) erfolgte nach dem Auftauen. Nach der Inkubation sind Viruspartikel an
der Oberfläche der Tumorzellen elektronenoptisch nachweisbar. Die Virusantigene
wirken auf verschiedenen Tumorzellen als kostimulatorische Antigene neben den
tumorspezifischen und führen darüber hinaus über eine unspezifische Freisetzung
von Zytokinen und Schockmediatoren (z.B. IFN, TNF) zu einer Verstärkung der
Induktion einer CTL-abhängigen Immunantwort [68; 120; 161].
Um zu verhindern, daß aus den applizierten Tumorzellen am Injektionsort Tumoren
anwachsen, müssen sie wirksam inaktiviert werden. Gleichzeitig betonen Hanna
und Schirrmacher die deutlich höhere Immunogenität vitaler Zellen gegenüber
abgetöteten Zellen oder Membranfragmenten [35; 122; 125]. Die Fähigkeit der
Tumorzellen zur Antigenpräsentation über MHC-I-Peptidkomplexe ist offenbar eng
mit der Integrität der Zellen verbunden.
Für die Zellen des NZK sind außer dem Antigen, das als Target des MAK G250
beschrieben wurde, bislang keine weiteren tumorspezifischen Antigene sicher
identifiziert worden. Es muß jedoch davon ausgegangen werden, daß weitere solcher Antigene existieren, denn ohne sie ist eine effektive Immunabwehr, die experimentell bereits nachgewiesen werden konnte, nicht denkbar.
In der vorliegenden Studie wurden die Zellen mittels eines Linearbeschleunigers
mit einer Dosis von 100 Gy bestrahlt. Für die Bestrahlungsdauer von ca. 20 min
wurden die 5x50 mm großen Borosilikatröhrchen mit den Präparaten in ein spezi-
- 100 elles Phantom eingespannt. Die Tumorzellen werden dadurch inaktiviert, können
aber bis zum Zelltod in Kultur noch einige wenige Teilungen vollziehen.
Die Bestrahlung mit so hohen Dosen in relativ kurzer Zeit stellt für den Linearbeschleuniger eine hohe Belastung dar, so daß, auch angesichts von Terminproblemen
bei größeren Fallzahlen, im praktischen Klinikalltag die Zellen in Zukunft zunehmend mit Gammastrahlern (z.B. Kobaltquellen) bestrahlt werden sollen.
4.1.5
Qualitätssicherung
Qualitätskontrollen wurden bei verschiedenen Arbeitsschritten der Vakzineherstellung implementiert:
So wurde zweimal, direkt nach der Zellvereinzelung und unmittelbar vor der
Applikation, der Anteil an intakten vitalen Zellen in der Suspension mikroskopisch
in der Zählkammer bestimmt. Analog der Arbeiten von Schirrmacher [33] wurden
nur Präparate mit mehr als 50% Tumorzellen und mehr als 70% vitalen Zellen
verwendet.
Die erfolgte Virusadsorption wurde in ausgewählten Proben (s.u.) direkt mittels
Elektronenmikroskopie kontrolliert. Hierzu wurden in Analogie zur Vakzine bereitete Tumorzellsuspensionen sowohl mit, als auch ohne Inkubation mit den
Viruspräparaten elektronenoptisch mit einem erfahrenen Pathologen durchgemustert und verglichen. Die Virusadsorption und die resultierende Oberflächenveränderung der Tumorzellen konnte so demonstriert werden.
Der Ausschluß mikrobieller Kontamination wurde umfassend sichergestellt. Der
Transport der Gewebestücke erfolgte in sterilisierten Glasflaschen mit antibiotikahaltigem Medium (Penicillin/Streptomycin). Nach steriler Überführung der
Tumorstücke in die Flaschen erfolgte der Transport auf Eis gekühlt. Die verwendete
Antibiotikakombination und -dosis hat sich als wirksam zur Verhütung von
bakteriellen Kontaminationen während der Weiterverarbeitung erwiesen, lediglich
in zwei Fällen wurde im Verlauf der Aufarbeitung Keimwachstum festgestellt.
Zu Beginn und am Ende einer jeden Aufarbeitung erfolgten Sterilkontrollen. Sowohl die Transportlösungen, als auch die fertigen Vakzinesuspensionen wurden
nach einem Standardschema des hiesigen mikrobiologischen Institutes auf verschiedenen Nährböden ausgestrichen. Nur vollständig sterile Präparate wurden zur
- 101 Immunisierung verwendet. Die nach der Kontamination zweier Vakzinen angestellte Überlegung, diese unter spezifischem Antibiotikaschutz dennoch einzusetzen, wurde nach ausgiebiger Diskussion mit den Mikrobiologen verworfen.
Die erfolgte Inaktivierung der Tumorzellen in der Vakzine durch Bestrahlung mit
ionisierenden Strahlen unmittelbar vor der Applikation wurde anfangs durch
Wachstumstests nachgewiesen. Hierbei wurden routinemäßig bereitete Vakzine
bestrahlt und ein kleiner Teil der Tumorzellen entnommen. Dieser wurde in Standardnährlösungen überführt und bei 37°C bebrütet. In keinem Fall ließ sich eine
Weitervermehrung der Zellen demonstrieren.
Die Stabilität des Impfstoffes unter den verschiedenen Lagerungsbedingungen ergibt
sich aus den Vitalbestimmungen unmittelbar vor Applikation. Hierbei sei erwähnt,
daß bei der Bereitstellung von Eis zur Kühlung beim Transport darauf zu achten ist,
daß es sich um gefrorenes Wasser und nicht, wie häufig üblich, um gefrorene
Kochsalzlösung handelt. Bei Letzterer liegt der Gefrierpunkt unter 0°C, was für die
Zellen die Gefahr des Einfrierens und damit der Schädigung durch intrazelluläre
Eiskristallbildung in sich birgt.
Wünschenswert wäre darüber hinaus eine Methode zur Befreiung der Tumorzellen
von kontaminierenden Lymphozyten, sodaß der Einsatz reiner Tumorzellsuspensionen möglich wird (z.B. MAK-gekoppelte Magnet-Beads nach Schirrmacher et
al.). Dies scheint auch durch Kultivierung der Tumorzellen in speziellen Medien
möglich zu sein.
- 102 Die Qualitätssicherung in der Dokumentation könnte noch erhöht werden, so daß
nach den Erfahrungen dieser Studie vorzuschlagen wäre:
"& Die Aufnahme des Operationsprotokolls in die Routinedokumentation
"& Das Anfordern der radiologischen Originalbefunde in allen Zweifelsfällen, ggf.
mit Bildern mit der Möglichkeit einer unabhängigen Nachbefundung
"& Die Möglichkeit einer Referenzhistologie in allen Zweifelsfällen
"& Die schriftliche Dokumentation, auch z.B. von mit Hausärzten geführten Telefonaten
4.2
4.2.1
Klinische Studie: Diskussion der Patientenergebnisse
Immunisierung und Adjuvantien
Es wurde eine dreimalige Vakzinierung mit autologen Tumorzellen angestrebt, die
Injektionen erfolgten intrakutan, wobei eine Quaddel auf Hautniveau entstehen
mußte. Nur in der Epidermis befinden sich die Langerhans’schen Zellen, die als
äußerst effektive antigen-präsentierende Zellen (APC) fungieren. Einer der
grundlegenden physiologischen Mechanismen, mit denen Menschen sich mit Antigenen aus ihrer Umwelt auseinandersetzen, sollte hierbei genutzt werden.
Im Tierversuch hatten sich nach vielfachen Studien Injektionen in die Bauchhöhle
als optimal bezüglich der immunologischen Reagibilität erwiesen. Gerade in der
Restimulation bereits sensibilisierter Tiere hatten sich hier optimale Ergebnisse
erzielen lassen. Die intraperitoneale Applikation von Tumorzellen beim Menschen
ist jedoch wegen der vielfältigen Risiken (Infektion, Fibrose u.a.) abzulehnen.
Die in verschiedenen Untersuchungen z.B. [128] bei der aktiven spezifischen Immuntherapie beobachtete Immunantwort vom verzögerten Typ (DTH- oder Typ-4Reaktion) konnte auch in der vorliegenden Studie regelmäßig nachgewiesen
werden. Hautindurationen waren 24, bzw. 72 Stunden nach Applikation sicht- und
tastbar. Eine Korrelation zwischen Ausprägung der Reaktion und dem
krankheitsfreien Intervall, die von verschiedenen Autoren beschrieben wurde [72;
73], konnte in der vorliegenden Studie nicht demonstriert werden.
Als Adjuvantien zur Verstärkung der Immunreaktion gegenüber der autologen
Tumorzellvakzine wurden in der vorliegenden Studie das NDV und geringe Dosen
- 103 an rekombinantem IL-2 eingesetzt. Seit langem ist bekannt, daß verschiedene
Viren, speziell auch das NDV, in der Lage sind, unter bestimmten Umständen auf
Tumorerkrankungen einen günstigen Einfuß zu nehmen. Lange galt das NDV selbst
als antineoplastisch wirksam [15], neuere Studien konnten diese Wirkungen als
adjuvante Immunstimulation interpretieren.
Beispielsweise wies Schirrmacher eine Veränderung der Tumorzelloberfläche
durch Exposition von NDV-Antigenen nach [115; 120], ein Ergebnis, das unter
anderem durch die elektronenmikroskopischen Experimente der vorliegenden
Studie bestätigt werden konnte.
Es konnte auch gezeigt werden, daß NDV die Freisetzung von Zytokinen und
anderen Mediatoren (TNF, ACTH u.a.) induziert [127]. Das Virus bindet über
Hämagglutinin-Neuraminidase an die Zelle und kann mit ihr mittels eines Fusionsproteins verschmelzen. Nach Genomreplikation erscheinen Virushüll-Antigene
an der Tumozelloberfläche. Durch das Einbringen neuer Oberflächenantigene in die
Tumorzellmembran wird deren Antigenität ganz offensichtlich erhöht, was mittels
des Nachweises einer deutlich gesteigerten tumorspezifischen T-Zell-Antwort
nachgewiesen werden konnte [114; 161].
IL-2 stimuliert nicht-antigenspezifisch die Proliferation und Entwicklung von spezifisch geprägten Efektor-T-Zellen [88]. Zudem steigert es die Zytotoxizität sowohl
von Effektor-T-Zellen, als auch von NK-Zellen [36; 69]. Auch bei der aktiven
spezifischen Immuntherapie werden Zytokine wie das IL-2 zur Verstärkung der
Immunantwort auf eine Vakzine eingesetzt. In der vorliegenden Studie wurde die
Vakzine mit einer geringen, nicht systemisch wirksamen Dosis IL-2 (450.000 i.E.)
versetzt. IL-2 ist auch in dieser Dosierung bei intrakutaner Applikation in der Lage,
eine gesteigerte Entzündungsreaktion hervorzurufen.
Ganz optimal ist die für die IL-2-Wirkung gewählte adjuvante Applikationsform
allerdings nicht. Der Abbau von IL-2 durch renale und intrahepatische Clearance
sowie durch Gewebsenzyme geschieht so rasch, daß die Halbwertzeit des IL-2 in
bezug auf die adjuvante Immunstimulation bei der Vakzine-Applikation auf höchstens 30 Minuten begrenzt ist. Notwendig für die Generierung einer effektiven
Antitumorantwort durch T-Lymphozyten wäre, daß IL-2 in ausreichenden Mengen
für die gesamte Dauer des Kontaktes von T-Zellen mit den Tumorzellen vor Ort zur
Verfügung steht [162].
- 104 Für die Dauer bis zur Ausbildung einer Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten
Typ, müßte IL-2 eigentlich über einige Tage kontinuierlich ausgeschüttet werden.
Eine Möglichkeit liegt in der Verwendung von Liposomen als „drug delivery
system“. Liposomen sind Vesikel, in denen eine wäßrige Lösung ganzheitlich von
einer Lipiddoppelmembran umschlossen ist.
Ihre Anwendung mit IL-2 als Inhalt in der Tumorimmunologie wurde unter anderem von Reimer 1994 beschrieben [101]. Auch sie ging davon aus, daß das zusammen mit den abgetöteten Tumorzellen applizierte IL-2 infolge seiner kurzen
Halbwertzeit nur eine geringe Wirkung erzielt. Sie koppelte Liposomen chemisch
an Tumorzellen und wies nach, daß das Zytokin am Ort der Injektion als Depot
verbleibt, aus dem es, als Folge des langsameren Abbaus der Liposomen, über einen
längeren Zeitraum in geringen Dosen freigesetzt wird. Daß diese Zytokin-Depots in
Verbindung mit bestrahlten autologen Tumorzellen eine effektive Vakzine bilden,
demonstrierten Krup et al. bereits im Maus-Modell [61].
4.2.2
Therapieergebnisse primär metastasenfreier Patienten
Die in dieser Arbeit durchgeführte Studie wurde als Phase-II-Studie ausgelegt, d.h.
es erfolgte keine Randomisierung in eine Therapiegruppe und eine Kontrollgruppe.
Erst retrospektiv wurde die Kontrollgruppe wie beschrieben aus dem Krankengut
der Urologischen Klinik des Marienhospitals Herne gebildet, wobei mit Hilfe der
"Match-pairs-Technik" eine Gruppe von nichtvakzinierten NZK-Patienten
zusammengestellt wurde.
Die Patienten mit präoperativ nicht metastasierten Tumoren wurden in fünf Prognosegruppen eingeteilt. Legte man bei diesen Patienten die Robson-Klassifikation
(s.o.) zugrunde, so ergibt sich folgende Situation:
Diese rein nach der anatomischen Ausbreitung erfolgte Einteilung hat verschiedenen Autoren zufolge [6; 20] die nach wie vor größte klinische Relevanz. Die
Zehnjahresüberlebensrate im Stadium I geben die verschiedenen Autoren mit
50-60 % an, im Stadium II mit 25-30 %. Im Stadium III soll die Dreijahresüberlebensrate um 30 % liegen. Formuliert man für die Patienten daraus eine vergleichende Gesamtprognose, so ergibt sich eine Zehnjahresüberlebensrate zwischen
25 und 30 %.
- 105 Im Auswertungszeitraum traten in der ASI-Gruppe vier Rezidive und in der
Kontrollgruppe acht Rezidive auf. Von den ASI-Patienten mit Rezidiv waren drei
zum Auswertungszeitpunkt bereits an ihrem Tumorleiden verstorben, ein Patient
hatte bereits 43 Monate mit einem langsam progredienten Lokalrezidiv überlebt.
Von den acht Patienten der Kontrollgruppe, die zum Auswertungszeitpunkt ein
Rezidiv erlitten hatten, hatten zwei Patienten 21 bzw. 43 Monate den Progreß ihres
Tumorleidens überlebt. Die übrigen sechs waren infolge der Tumorprogredienz
verstorben.
Der Vergleich der im Ergebnisteil vorgestellten Kaplan-Meier-Kurven für das
Krankheitsfreie Intervall bei den primär metastasenfreien Patienten läßt eine Tendenz zugunsten der mit ASI behandelten Patienten erkennen. Von Beginn des
Untersuchungszeitraumes an zeigte sich in der nichtbehandelten Gruppe schnellere
Progredienz, abzulesen an den früheren und häufigeren Rezidiven in dieser
Patientengruppe. Das festgestellte tendenziell bessere Behandlungsergebnis bei den
ASI-Patienten deutete sich schon in den Vorauswertungen durch A. Hinkel [42] an,
in der vorliegenden Endauswertung zeigt sich der Vorteil der behandelten Gruppe
deutlicher, jedoch weiterhin nicht mit statistischer Signifikanz.
Nach der durchschnittlich über dreijährigen Beobachtungszeit in beiden Patientengruppen überlebten bis dato noch 81 % der Patienten aus der ASI-Gruppe
krankheitsfrei, wohingegen dieser Anteil in der Kontrollgruppe bei 65 % der Patienten liegt. Nicht wesentlich beeinflußbar durch die aktive Immunisierung erscheinen die Überlebenszeiten der Patienten, die ein Rezidiv erlitten. So betrug die
durchschnittliche Überlebenszeit der an einem Rezidiv verstorbenen ASI-Patienten
23 Monate und die in der Vergleichsgruppe 25 Monate. In Studien ähnlichen
Designs werden diese Ergebnisse im wesentlichen bestätigt [53; 102].
Um eine bessere Vergleichbarkeit und Aussagekraft zu gewährleisten, umfaßte die
weitere Auswertung zwei weitere Zusatzkategorien: die Unterschiede im
Metastasierungsmuster der Patienten mit Rezidiv und die Auswertung der Ergebnisse bezüglich der oben erwähnten Prognosegruppen.
Es konnte festgestellt werden, daß die Patienten der ASI-Gruppe trotz Rezidivs
prognostisch günstigere Metastasierungsmuster entwickelten (Lokalrezidiv, solitäre
Lungenmetastasen), wohingegen bei den Patienten der Kontrollgruppe häufiger und
früher die prognostisch ungünstigeren Hirn- und Knochenmetastasen auftraten.
- 106 Die klinische Bedeutung dieser Auswertungskategorie ergibt sich aus den therapeutischen Optionen: So stehen bei den Patienten der günstigeren Metastasierungsgruppe immer noch sekundäre therapeutische Maßnahmen von Relevanz zur
Verfügung (Exstirpation eines Lokalrezidivs oder Chemotherapie der Lungenmetastasen), mit deren Hilfe eine weitere Lebenszeitverlängerung und/oder eine
Verbesserung der Lebensqualität erreicht werden kann. Zum zweiten sind die
Auswirkungen von Hirnmetastasen (Krampfanfälle, Wesensveränderungen, Lähmungen etc.) und von Knochenmetastasen (pathologische Frakturen, therapierefraktäre Schmerzsyndrome) in der Regel für den Patienten mit weitaus einschneidenderen Folgen für die Lebensqualität verbunden.
Das Ergebnis der Zusatzauswertung in bezug auf die Prognosekategorien bestätigt
den (statistisch nicht signifikanten) Trend:
In jeder einzelnen Prognosekategorie ist der Anteil der Patienten mit Rezidiv bei
den immunisierten Patienten deutlich niedriger als bei den nicht immunisierten
Patienten. Bei den Patienten mit präoperativ ungünstigeren Prognosevorzeichen ist
diese Tendenz noch deutlicher zu erkennen.
Diese Ergebnisse können durch neuere klinische Phase-II-Studien ähnlichen Designs bestätigt werden; so finden Kirchner et al. [53] bei 208 Patienten mit lokal
fortgeschrittenen, primär metastasenfreien Tumoren eine Steigerung des
Krankheitsfreien Intervalls bei den mit ASI nachbehandelten Patienten gegenüber
den Patienten einer Kontrollgruppe. Repmann et al. [102] finden bei 116 Patienten
bei den mittleren Prognosegruppen (Robson II u. III) sogar statistisch signifikante
Vorteile zugunsten der Therapiegruppe.
4.2.3
Therapieergebnisse bei den Patienten mit primär metastasierten Tumoren
Wie oben beschrieben ist bei den Patienten der mittels ASI-behandelten Gruppe
eine ungünstigere Ausgangsposition festzustellen. Diese betrifft sowohl das Staging, als auch das Metastasierungsmuster der betreffenden Tumore. Trotzdem
ergibt sich am Ende des Beobachtungszeitraumes ein etwas besseres Ergebnis für
die mit ASI therapierten Patienten im Vergleich zu den nichttherapierten Patienten.
Einem Patienten aus der Kontrollgruppe, der mit 44 Monaten am längsten überlebt
hat, stehen drei Patienten aus der ASI-Gruppe gegenüber, die nach 50 Monaten
Beobachtungszeit weiterhin am Leben sind. Auch die in den klinischen Studien der
- 107 Fachliteratur untersuchten Fallzahlen sind in bezug auf diese Patientengruppe so
klein, daß die Autoren allenfalls von ermutigenden Tendenzen berichten, wie in
dieser Studie aber ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede fanden
[102].
In diesem Zusammenhang sei bei aller Vorsicht in bezug auf die Interpretation der
Ergebnisse vor allem der Patient G.F. anekdotisch erwähnt, bei dem sich
computertomographisch mehrfach nachgewiesene Lymphknotenmetastasen unter
der Therapie zurückgebildet haben. Radiologische Lehrbücher weisen der
Computertomographie eine Sicherheit von etwa 95 % im Nachweis intraabdominaler Lymphknotenmetastasen zu, mit mehrmaligen Untersuchungen erhöht sich die
Zuverlässigkeit dieses Nachweises weiter. Wegen der vermeintlich ungünstigen
Prognose wurde beim Patienten zunächst eine Tumorembolisation und dann später
erst die Nephrektomie durchgeführt. Der zunächst geäußerte Verdacht auf eine
pulmonale Metastasierung ("feinnoduläre Strukturen" im Röntgenbild des Thorax)
konnte später nicht bestätigt werden. Hier wäre auch denkbar, daß sich kleinste
Lungenmetastasen unter der Therapie zurückgebildet haben könnten. Bei dem
Patienten kann angesichts von 48 Monaten Remissionsdauer mittlerweile von einer
definitiven Heilung ausgegangen werden.
Der Effekt einer dreimaligen Immunisierung bei sehr fortgeschrittenem Tumorleiden scheint angesichts der nach Operation noch verbleibenden makroskopischen
Tumorreste allerdings insgesamt gering zu sein. Kontinuierlich durchgeführte
Vakzinierungen, wie sie beispielsweise technisch durch In-vitro-Vermehrung der
Tumorzellen möglich wären, könnten vielleicht eine Verbesserung der
Immunstimulation auch bei größeren systemischen Tumorzellmassen erreichen.
Die Patienten mit metastasiertem NZK wurden in eine günstigere und eine ungünstigere Prognosegruppe eingeteilt [20]. Beim Verhältnis von 3:3 in der günstigeren und 4:6 in der ungünstigeren Prognosegruppe findet sich hier ein Ungleichgewicht zuungunsten der ASI-Gruppe. Dieses resultiert unter anderem aus der
Tatsache, daß im betreffenden Zeitraum in der urologischen Universitätsklinik
Herne nur wenige Patienten mit fortgeschrittenen NZK nephrektomiert wurden. Da
es sich aber hierbei um tendenziell negativere präoperative Voraussetzungen für die
Therapiegruppe handelte, wurden in der vorliegenden Studie die Gruppen
verglichen.
- 108 Zum Schluß seien aus der Immunisierungsgruppe der Patienten mit metastasiertem
NZK zwei weitere Patienten erwähnt, die trotz infauster Prognose (Knochenmetastasierung) einen relativ günstigen Krankheitsverlauf zeigten.
Bei der Patientin H.D. zeigte sich nach stabilem Krankheitsverlauf 14 Monate
postoperativ eine pulmonale Filialisierung. Unter der eingeleiteten IL-2/IFNKombinationstherapie kam es zu deren Regression und im weiteren Verlauf zur
kompletten Remission. Es ist durchaus möglich, daß das prompte Ansprechen der
Patientin auf die Zytokin-Therapie durch die vorausgegangene Immunstimulation
mittels ASI mitbedingt sein könnte. Neuere Studien von Atzpodien und Kirchner
stützen diese Annahme [53].
Der zweite Patient (B.H.) befand sich nach initialer Entfernung einer Knochenmetastase und Tumornephrektomie in gutem Allgemeinzustand. 15 Monate nach
Vakzinierung konnte in einem chirurgisch entfernten Lymphknoten nur nekrotisches, lymphozytär infiltriertes Tumorgewebe nachgewiesen werden. Dieses
histologische Bild wurde als Immunisierungsfolge gedeutet.
4.2.4
Stellenwert der Immuntherapien in der Therapie des NZK
Das NZK ist ein Tumor mit sehr schlechter Prognose. Die allgemein akzeptierte
Standardtherapie bei Patienten ohne nachgewiesene Metastasen ist die radikale
Tumornephrektomie mit kurativer Zielsetzung [20; 166]. Bei den Patienten mit
primär metastasiertem Tumorleiden existiert kein einheitliches Therapiekonzept.
Fortschritte konnten bei der Identifikation von Risikofaktoren erzielt werden,
wohingegen sichere Marker, die bei lokalisierten Tumoren nach Nephrektomie
zwischen hohem und niedrigem Risiko in bezug auf Rezidiv oder Metastasierung
differenzieren, weiter fehlen [27].
Die früher angewendeten postoperativen adjuvanten Verfahren (Chemotherapie,
Radiotherapie und Hormontherapie) werden nach enttäuschenden Ergebnissen
kaum noch angewandt [6; 45].
Die hohe Spontanremissionsrate des NZK und die Hauptmetastasenlokalisation in
immunologisch aktiven Organen legten schon lange die Vermutung nahe, daß dem
Immunsystem eine besondere Rolle bei der Abwehr des NZK zukommt [50].
- 109 Sowohl spezifische als auch unspezifische Immuntherapien wurden seitdem
experimentell zur postoperativen adjuvanten Therapie des NZK eingesetzt.
Am umfassendsten ist in der Literatur die kombinierte IL-2/IFN!-Therapie beschrieben worden, sie schließt sich als postoperative adjuvante Therapie an eine
Nephrektomie zur Reduktion der Tumorzellmasse an und kann gegebenenfalls noch
mit einem Chemotherapeutikum (z.B. Vinblastin) kombiniert werden. Es wird in
diesen Verfahren von Remissionsraten zwischen 30 % [2] und 48 % [4] berichtet.
Die Dauer der Remission ist sehr unterschiedlich, und die Gründe für ein NichtAnsprechen sind Gegenstand der Diskussion [63].
Ein weiteres postoperatives Therapieverfahren ist die Infusion von IL-2 mit invitro-expandierten TIL (mit IL-2), in denen eine Lymphzellpopulation mit relativer
Spezifität in bezug auf die Antigene des infiltrierten Tumorgewebes zu vermuten
ist. Die Studien berichten für das NZK von Remissionsraten um 20 % [37], beim
Melanom teils von deutlich besseren Ergebnissen [51; 92].
Weitere interessante Entwicklungen bei den Immuntherapien wurden durch die
Charakterisierung NZK-spezifischer Antigene (G250) und durch die Gentechnik
ermöglicht. Letztere erreicht beim NZK durch Transfektion von Tumorzellen mit
Zytokin-Genen eine Vestärkung der Immunogenität der betreffenden Zellen [47].
Die gentransfizierte Tumorzelle gleicht einer Effektorzelle des Immunsystems und
lockt durch die Zytokinproduktion körpereigene Effektorzellen an. Das Konzept
wird allerdings durch die notwendige Inaktivierung der transfizierten Zellen
geschwächt.
Die Charakterisierung tumorspezifischer bzw. tumorassoziierter Antigene
(v.a.G250) ermöglicht die Entwicklung spezifischer MAK und insbesondere auch
chimärer bispezifischer MAK mit weitreichenden diagnostischen und therapeutischen Implikationen. Neben Studien zu wichtigen histochemischen Nachweismethoden [137; 139; 140] konnten auch solche zu ersten (Phase I/II) immun- und
radioimmuntherapeutischen Anwendungen beim humanen NZK vorgelegt werden
[23; 138]. Die Ergebnisse werden noch sehr vorsichtig beurteilt.
4.2.5
Stellenwert der ASI in der Therapie des NZK
Ausgehend von den umfangreichen Studien von Tallberg und Tykkä seit 1971 [146;
147] haben verschiedene Autoren die Möglichkeit der aktiven spezifischen
Immunisierung als postoperative adjuvante Therapie bei Patienten mit Nieren-
- 110 zellkarzinom systematisch untersucht. In verschiedenen Tiermodellen wurde die
Methodik der Aufarbeitung und die Wahl des geeigneten Adjuvans optimiert [33;
124]. So lehnten sich die dargestellten Versuche an die von Schirrmacher am
Mausmodell entwickelte Methodik der Tumoraufarbeitung zur aktiven spezifischen
Immunisierung an.
In theoretisch-immunologischen Studien konnten zytotoxische T-Lymphozyten als
Träger dieser Immunität nachgewiesen werden [38; 123; 160; 161]. In jüngster Zeit
konnten verschiedene Arbeitsgruppen um Schirrmacher weitere Aspekte der
pleiotropen immunstimulierenden Eigenschaften virusmodifizierter Tumorzellen
charakterisieren [115]. Sie beschreiben zwei der sechs viralen Gene (HN und F), die
mit ihren Produkten die Tumorzelloberfläche dergestalt modifizieren, daß neue
Adhäsionsmoleküle für die Interaktion mit Lymphozyten eingeführt werden.
Nach Optimierung der von Schirrmacher übernommenen Methodik zur Tumoraufarbeitung für die Anwendung am menschlichen Nierenzellkarzinom wurde die
ASI in der vorliegenden Phase-II-Studie zur adjuvanten Therapie nach
Nephrektomie angewandt [42].
Trotz der niedrigen Fallzahlen und der Probleme bezüglich der statistischen Interpretation ist sowohl bei den Patienten mit primär nicht metastasiertem Tumorleiden, als auch bei den Patienten mit metastasiertem NZK festzustellen, daß
die im Rahmen der Studie gewonnenen Daten für eine Wirksamkeit der Therapie
sprechen. So konnte sich die Rezidivhäufigkeit bei den lokalisierten Tumoren senken lassen. Dies ließ sich nicht nur anhand der Gesamtfallzahlen feststellen, sondern trifft auch für jede einzelne der präoperativen Prognosegruppen zu.
Für die Patienten mit primär metastasiertem NZK lassen sich die Zahlen mit entsprechenden Daten anderer Studien vergleichen. Mit einer kompletten und drei
partiellen Remissionen konnte somit eine objektive Ansprechrate von 44 % erzielt
werden. Dieses Ergebnis ist damit etwa mit Ergebnissen der Studien mit IL-2/IFN!
zu vergleichen [4; 37; 165]. Die Dauer der Remission ist wegen der allgemeinen
Inkonstanz der Angaben hierbei nicht berücksichtigt. Von kompletten Remissionen
über einen längeren Zeitraum kann jedoch kaum berichtet werden.
Auch bezüglich des Metastasierungsmusters ist ein Vorteil der ASI-Gruppe dahingehend festzustellen, daß eine Progredienz des Tumorgeschehens unter ASI für den
Patienten prognostisch günstiger erfolgt. Kombinationstherapien mit verschiedenen
- 111 immuntherapeutischen Ansätzen (ASI und IFN!/IFN$) werden in jüngster Zeit auf
ihren Vorteil gegenüber Monotherapien untersucht. Schwaab et al. fanden in einer
Phase-II-Studie keine klaren klinischen Unterschiede, aber Hinweise für
bedeutsame immunmodulatorische Effekte [133]. Zudem kann die ASI
möglicherweise die Wirksamkeit nachfolgender postoperativer Immuntherapien
bzw. kombinierter Chemoimmuntherapien verstärken [52].
Die statistischen Ergebnisse dokumentieren lediglich tendenzielle Unterschiede der
Therapieergebnisse zwischen den behandelten und den nicht-behandelten Patienten
in beiden Therapiegruppen. Statistisch signifikante Unterschiede ließen sich angesichts der geringen Patientenzahlen erwartungsgemäß nicht ermitteln.
Eine Weiterentwicklung der aktiven spezifischen Immuntherapien ist in mehreren
Bereichen denkbar. So kann zum einen eine weiter optimierte Aufarbeitungsmethode durch eine weitere Erhöhung von Vakzinequalität und Zellausbeute dazu
führen, daß hochwertigere Vakzinierungen in regelmäßigen Abständen möglich
werden. Zum zweiten könnte die Zytokin-Wirkung des eingesetzten Interleukin-2
entscheidend verbessert werden, wenn man durch Depotformulierungen die
Wirkung prolongiert. Chemotaxis und die Aktivierung von Lymphozyten am Ort
der Vakzinierung könnten somit verstärkt werden. Versuche zu einer solchen
Verlängerung der Zytokinwirkung am Vakzinierungsort selbst wurden bereits
erfolgreich durchgeführt [61; 101]. Weitere Entwicklungsmöglichkeiten ergeben
sich durch die Untersuchung besser validierbarer Prognosekriterien des NZK. So
sollte es beispielsweise u.a. anhand immunologischer Kriterien auch möglich sein,
die Ansprechbarkeit eines konkreten Tumors auf Immuntherapie zu prognostizieren
und eine Indikation somit differenzierter stellen zu können. Das Vorhandensein des
tumorassoziierten Antigens G250 ist ein Beispiel für einen solchen Prognosemarker
[140].
Zellen menschlicher Tumoren, die ja meist über Jahre hinweg gewachsen sind,
unterscheiden sich von denen im Tiermodell verwendeten insbesondere durch ihre
phäno- und genotypische Inhomogenität. Das bedeutet, daß das Spektrum an tumorspezifischen und tumorassoziierten Antigenen auf Zellen desselben Tumors
durchaus verschieden sein kann. Aufgrund dieser Überlegungen behält die ASI, die
sich im Idealfall ja der körpereigenen Immunantwort auf ein konkretes Antigengemisch zur Induktion einer zytotoxischen Reaktion bedient, auch theoretisch
ihre Berechtigung neben hochspezifischen Immuntherapien mit MAK.
- 112 4.3
4.3.1
Experimente
Immunfluoreszenz
Als Ergebnis der Immunfluoreszenzexperimente ist festzuhalten, daß in der Arbeitsgruppe Falkenberg 2 monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen, die in der
Lage sind, Zellen der untersuchten NZK von Lymphozyten zu differenzieren.
Die immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen haben sich als nicht geeignet erwiesen, eine Antikörperreaktion gegen autologes Tumorgewebe im entsprechenden Patientenserum nachzuweisen. Die unspezifische Fluoreszenz (u.a.
Debridement) überwiegt die spezifische in diesen Versuchen bei weitem. Die einzige Möglichkeit diesbezüglich ergäbe sich durch die Untersuchung von gereinigten
Suspensionen expandierter Zellen.
Ein spezifischerer Nachweis sowohl von Tumorzellen, als auch einer Immunreaktion im Organismus gelingt nach der Charakterisierung tumorspezifischer oder
tumorassoziierter Antigene (z.B. G250) mittels MAK. So zeigen die Arbeitsgruppen um Steffens, daß mit Jod-131-markierten MAK G250 eine exzellente
Visualisation von Tumorläsionen in der Immunszintigraphie möglich wird [138;
140]. Nach in-vitro- Studien und tierexperimentellen Untersuchungen [70; 159]
werden bereits Berichte über einen therapeutischen Einsatz dieser MAK-vermittelten (Radio-) Immuntherapie veröffentlicht [23].
4.3.2
Elektronenmikroskopie
In der elektronenmikroskopischen Studie konnte eine Adsorption der Viruspartikel
an die Tumorzellen nachgewiesen werden. In verschiedenen Phasen dieses
Adsorptionsmechanismus werden Annäherung, Kontaktaufnahme, Adsorption und
Internalisation der Viruspartikel demonstriert. Im Anschluß an die Virusadsorption
und -aufnahme präsentieren sich die Tumorzellen im elektronenmikroskopischen
Bild mit veränderter Oberfläche.
Auch Schirrmacher wies eine Veränderung der Tumorzelloberfläche durch Exposition von NDV-Antigenen nach [120], ein Ergebnis, daß unter anderem durch die
elektronenmikroskopischen Experimente der Arbeiten von Liebrich et al. bestätigt
- 113 werden konnte [65]. Analog zu den vorliegenden Ergebnissen beschreibt er
Viruspartikel sowohl an der Oberfläche der verwendeten epithelialen Zellen (eines
Kolorektalen Karzinoms), als auch an Membranfragmenten und in Aggregaten
zwischen den Zellen. Es werden zwei der sechs viralen Gene (HN und F)
beschrieben, die mit ihren Produkten die Tumorzelloberfläche dergestalt modifizieren, daß neue Adhäsionsmoleküle für die Interaktion mit Lymphozyten eingeführt werden [115].
Die Virusantigene wirken auf verschiedenen Tumorzellen als kostimulatorische
Antigene neben den tumorspezifischen und führen darüber hinaus über eine unspezifische Freisetzung von Zytokinen und Schockmediatoren (z.B. IFN!, TNF) zu
einer Verstärkung der Induktion einer CTL-abhängigen Immunantwort [68; 120;
161]. Daß es sich bei diesen Oberflächenausläufern um nukleinsäurehaltige
komplette Viruspartikel handelt, konnte Liebrich transmissionselektronenmikroskopisch nachweisen [65].
- 114 LITERATURVERZEICHNIS
1. Ahlert T, Bastert G, Kaul S, Schirrmacher V (1989): Induktion antitumoraler
Immunantwort beim Ovarialkarzinom mit virusmodifizierten autologen
Tumorzellen. Archives of Gynecology and Obstetrics 245:631-632.
2. Altwein JE, Rübben H (1993): Tumoren/Nierenparenchym. In: Urologie, 4 Ed.,
Enke, ed. Enke-Verlag, Stuttgart, pp. 172-189.
3. Atzpodien J, Hänninen EL, Kirchner H, Poliwoda H (1995): Multiinstitutional
Home-Therapy Trial of Recombinant Human Il-2 and IFN-alpha-2 in
Progressive RCC. J Clin.Oncol. 13 No.2:497-501.
4. Atzpodien J, Kirchner H, Poliwoda H (1993a): European Studies of Il-2 in
Metastatic Renal Cell Carcinoma. Semin.Oncol. 20 No. 6 Suppl. 9:22-26.
5. Atzpodien J, Kirchner H, Poliwoda H (1993b): Expansion of Peripheral Blood NKCells Correlates with Clinical Outcome in Cancer Patients Receiving rIl-2
and IFN alpha-2. Tumor Biology 14:354-359.
6. Avisrror MU (1992): Renal Cell Carcinoma and other Tumours. In: Oxford
Textbook of Clinical Nephrology, 3 Ed., S Cameron, AM Davison, JP
Grünfeld, D Kerr, E Ritz, eds. Oxford University Press, Oxford, New York,
Tokyo, pp. 2237-2253.
7. Baron D (1990): MAK und Mediatoren- Immunologische Tumortherapie.
Naturwissenschaften 77:405-411.
8. Beverly PCL, Lowenthal RM, Tyrell DAJ (1972): Immune Responses in Mice to
Tumour Challenge after Immunisation with NDV-Infected or X-Irradiated
Tumour Cells or Cell Fractions. xxx x:212-223.
9. Bloom HJ (1973): Hormone induced and spontaneous regression of metastatic renal
cancer. Cancer 32:1006
10. Bohle W, Schlag P, Liebrich W, Hohenberger P, Manasterski M, Moller P,
Schirrmacher V (1990): Postoperative active specific immunization in
colorectal cancer patients with virus-modified autologous tumor-cell
vaccine. First clinical results with tumor-cell vaccines modified with live
but avirulent Newcastle disease virus. Cancer. 66:1517-1523.
- 115 11. Breul J (1986): Nachweis und Quantitative Bestimmung von Antikörpern gegen
Strukturen des Nierenzellkarzinoms in Seren von Tumorpatienten.
Dissertation Uni Bochum/Medizinische Fakultät
12. Bukowski RM, Goodman P, Crawford ED, Sergi JS, Redman BG, Whitehead RP
(1990): Phase II trial of high-dose intermittent interleukin-2 in metastatic
renal cell carcinoma: a Southwest Oncology Group study.
J.Natl.Cancer.Inst. 82:143-146.
13. Burnet FM (1970): The Concept of Immunological Surveillance. Progr.exp.Tumor
Res. 13:1-27.
14. Carpinto GA, Osband ME, Krane RJ (1984): An Immunodiagnostic Assay to
Detect Metastatic RCC based on Phenotypic Analysis of Tumor Antigenspecific Adherent Lymphocytes. J.Urol. 131:227
15. Cassel WA, Garrett RE (1965): Newcastle Disease Virus as an Antineoplastic
Agent. Cancer 18:863-868.
16. Cassel WA, Murray DR, Phillips HS (1983): A phase II study on the postsurgical
management of Stage II malignant melanoma with a Newcastle disease
virus oncolysate. Cancer. 52:856-860.
17. Cetto GL, Franceschi T, Turrina G, Chiarion Sileni V, Capelli MC, Bellini A,
Paccagnella A, Bassetto MA, Molino AM, de Sandre G (1988):
Recombinant alpha-interferon and vinblastine in metastatic renal cell
carcinoma: efficacy of low doses. Semin.Surg.Oncol. 4:184-190.
18. Chiou RK (1991): The impact of tumor size on the efficacy of monoclonal
antibody- targeted radiotherapy: studies using a nude mouse model with
human renal cell carcinoma xenografts. J Urol 146:232-237.
19. Chiou RK, Vessella RL, Limas C, Shafer RB, Elson MK, Arfman EW, Lange PH
(1988): Monoclonal antibody-targeted radiotherapy of renal cell carcinoma
using a nude mouse model. Cancer. 61:1766-1775.
20. De Kernion J, Belldegrun A (1992): Malignant Renal Tumors. In: Campbell's
Urology, PC Walsh, AB Retik, TA Stamey, ED Vaughan, eds.
W.B.Saunders Company, Philadelphia, pp. 1062-1093.
- 116 21. De Kernion J, Ramming KP, Smith RB (1978): The Natural History of Metastatic
renal cell carcinoma. J.Urol. 148:
22. Ditzel H, Erb K, Nielsen B, Borup Christensen P, Jensenius JC (1990): A method
for blocking antigen-independent binding of human IgM to frozen tissue
sections when screening human hybridoma antibodies. J.Immunol.Methods.
133:245-251.
23. Divgi CR, Bander NH, Scott AM, O´Donoghue JA, Sgouros G, Welt S, Finn RD,
Morrissey F, Capitelli P, Williams JM, Deland D, Nakhre A, Oosterwijk E,
Gulec S, Graham MC, Larson SM, Old Lj (1998): Phase I/II
radioimmunotherapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody
G250 in metastatic renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research 4:27292739.
24. Fossa SD (1988): Is interferon with or without vinblastine the "treatment of choice"
in metastatic renal cell carcinoma? The Norwegian Radium Hospital's
experience 1983-1986. Semin.Surg.Oncol. 4:178-183.
25. Fowler JEJ (1986): Failure of immunotherapy for metastatic renal cell carcinoma.
J.Urol. 135:22-25.
26. Freedman RS, Bowen JM, Herson JH, Wharton JT, Edwards CL, Rutledge FN
(1983): Immunotherapy for vulvar carcinoma with virus-modified
homologous extracts. Obstet.Gynecol. 62:707-714.
27. Godley PA EM (1998): Renal cell carcinoma. Curr Opin Oncol 10:261-265.
28. Gorer PA (1938): The Antigenetic Basis of Tumour Transplantation. J Path.Bact.
47:231
29. Greiner JW, Hand PH, Schlom J (1984): Enhanced Expression of TAA on Human
Breast and Colon TumorCells after recombinant alpha-Interferon treatment.
Cancer Res. 44:3208
30. Griffin T, Rybak E, Giordano L (1989): Monoclonal Antibodies as New Antitumor
Agents. In: Monoclonal Antibodies: Production and Application, I Alan
R.Liss, ed. pp. 335-358.
31. Gross L (1943): Intradermal Immunization of C3H-Mice against a Sarcoma that
originates in an Animal of the same Line. Cancer Res. 3:326
- 117 32. Grothey A (1988): Versuche zur aktiven Immuntherapie des fortgeschrittenen
Nierenzellkarzinoms. Dissertation Uni Bochum/Medizinische Fakultät,
33. Hanna MG, Brandhorst JS, Peters LC (1979): Active specific immunotherapy of
residual micrometastasis. cancer immunol.immunother. 7:165-173.
34. Hanna MG, Hoover HC, Peters LC (1987): Fundamental and Applied Aspects of
Successful Active Specific Immunotherapy of Cancer.
Cancer
Biotherapy,Principles and Practice Raven Press,New York:195-221.
35. Hanna MG, Peters LC, Brandhorst JS, Pollack VA (1980): Postoperative
spezifische Immuntherapie von Rest-Mikrometastasen: Ergebnisse eines
experimentellen Modells. S.M 2:67-75.
36. Hefeneider SA, Conlon PJ, Henney CS, Gillis S (1983): In Vivo Il-2
Administration augments the Generation of Alloreactive Cytolytic TLymphocytes and Resident Natural Killer Cells. J Immunol. 130:222
37. Heicappell R, Ackermann R (1990): Rationale for immunotherapy of renal cell
carcinoma. Urol.Res. 18:357-372.
38. Heicappell R, Schirrmacher V, von Hoegen P, Ahlert T, Appelhans B (1986):
Prevention of metastatic spread by postoperative immunotherapy with
virally modified autologous tumor cells. I. Parameters for optimal
therapeutic effects. Int.J.Cancer. 37:569-577.
39. Hellsten S, Johnsen J, Berge T, Linell F (1990): Clinically unrecognized renal cell
carcinoma. Diagnostic and pathological aspects. Eur.Urol. 18 Suppl 2:2-3.
40. Hersey P, Edwards A, D'Alessandro G, MacDonald M (1986): Phase II study of
vaccinia melanoma cell lysates (VMCL) as adjuvant to surgical treatment of
stage II melanoma. II. Effects on cell mediated cytotoxicity and leucocyte
dependent antibody activity: immunological effects of VMCL in melanoma
patients. Cancer.Immunol.Immunother. 22:221-231.
41. Hersey P, Edwards A, Milton G (1987): Evidence that Treatment with VMCL may
improve Survival of Patients with Stage-II-Melanoma.
cancer
immunol.immunother. 25:257-265.
- 118 42. Hinkel A (1995): Aktive spezifische Immuntherapie mit Newcastle-Disease-Virus
(NDV)-modifizierten Tumorzellen als postoperative Therapie bei Patienten
mit Nierenzellkarzinom (NZK).
43. Hollinshead A, Stewart TH, Takita H, Dalbow M, Concannon J (1987): Adjuvant
specific active lung cancer immunotherapy trials. Tumor- associated
antigens. Cancer. 60:1249-1262.
44. Hoover HCJ, Surdyke MG, Dangel RB, Peters LC, Hanna MGJ (1985):
Prospectively randomized trial of adjuvant active-specific immunotherapy
for human colorectal cancer. Cancer. 55:1236-1243.
45. Hrushesky WJ, Murphy GP (1977): Current Status of the Therapy of Advanced
Renal Carcinoma. J Surg.Oncol. 9:277
46. Itoh K, Balch CM (1993): Therapeutic Applications of Interleukin-2. Marcel
Dekker, New York, pp. 39-48.
47. Jaffee EM. (1999): Immunotherapy of cancer. Ann N Y Acad Sci 886:67-72.
48. Jolles P, Paraf A (1973): Mechanisms of Adjuvant Activity. In: Molacular Biology,
Biochemistry and Biophysics, 13 Ed., Kleinzeller et al., ed. Springer,
Berlin, pp. 81
49. Kabat EA, Bezer AE (1958): The Effect of Variation in Molecular Weight on the
Antigenicity of Dextran in Man. Archs Biochem.Biophys. 78:306
50. Katz SE, Strapira He (1982): Spontaneous Regression of Genitourinary Cancer-an
Update. J.Urol. 128:1-4.
51. Kawakami Y, Rosenberg SA (1998): Identification of new melanoma epitopes on
melanosomal proteins recognized by tumor infiltrating T lymphocytes
restricted by HLA-A1, -A2, and A3-alleles. J.Immunol. 161:6985-6992.
52. Kirchner H (1982): Interferons as Antitumor Agents. J Cancer Res.clin.Oncol.
103:1
53. Kirchner H, Anton P, Atzpodien J (1995): Adjuvant treatment of locally advanced
renal cancer with autologous virus-modified tumor vaccines. World J Urol
13:171-173.
- 119 54. Kjaer
M (1976): Prognostic Value of Tumor-directed Cell-mediated
Hypersensitivity detected by Means of the Leucocyte Migration Technique
in Patients with Renal Carcinoma. Eur.J.Cancer. 12:889
55. Klein G, Sjögren HO, Hellström KE (1960): Demonstation of Resistance against
Methyl-cholanthrene-induced Sarcomas in the Primary Authochtonous
Host. Cancer Res. 20:1561
56. Klein J (1991): Immunologie. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim,
57. Klippel KF, Jacobi GH, Schulte-Wissermann H (1981): Aktive Immuntherapie
beim metastasierenden Hypernephrom. Aktuelle Urologie 12:161-165.
58. Kochevar J (1990): Blockage of autonomous growth of ACHN cells by anti-renal
cell carcinoma monoclonal antibody 5F4. Cancer.Res. 50:2968-2972.
59. Kovacs G, Szucs S, de Riese W, Baumgartel H (1987): Specific chromosome
aberration in human renal cell carcinoma. Int.J.Cancer. 40:171-178.
60. Krech RH, Fonatsch C, Peters B, Löhrs U (1989): Morphologie und
Wachstumsfraktion von Nierenzellkarzinomen des Menschen in Korrelation
zu zytogenetischen Daten. Verh.Dtsch.Ges.Pathol. 73:409-414.
61. Krup OC, Kroll I, Bose G, Falkenberg FW (1999): Cytokine depot formulations as
adjuvants for tumor vaccines. Liposome-encapsulated Il-2 as a depot
formulation. J Immunother 22:525-538.
62. La Vecchia C, Levi F, Lucchini F, Negri E (1992): Descriptive Epidemiology of
Kidney Cancer in Europe. Journal of Nephrology 5 No. 1:37-43.
63. Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC (1998): Patterns of relapse
and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal
cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy.
Cancer J Sci Am. 4:86-93.
64. Lehner B, Schlag P, Liebrich W, Schirrmacher V (1990): Postoperative active
specific immunization in curatively resected colorectal cancer patients with
a
virus-modified
autologous
tumor
cell
vaccine.
Cancer.Immunol.Immunother. 32:173-178.
- 120 65. Liebrich W, Schlag P, Manasterski M, Lehner B, Stohr M, Moller P, Schirrmacher
V (1991): In vitro and clinical characterisation of a Newcastle disease virusmodified autologous tumour cell vaccine for treatment of colorectal cancer
patients. Eur.J.Cancer. 27:703-710.
66. Ljungberg B, Roos G (1990): Value of DNA analysis for treatment of renal cell
carcinoma. Eur.Urol. 18 Suppl 2:31-32.
67. Loh A, Sgouros G, O´Donoghue JA, Deland D, Puri D, Capitelli P, Humm JL,
Larson SM, Old LJ, Divgi CR (1998): Pharmacokinetic model of iodine131-G250 antibody in renal cell carcinoma. Journal of Nuclear Medicine
39:484-489.
68. Lorence RM, Rood PA, Kelley KW (1988): Newcastle disease virus as an
antineoplastic agent: induction of tumor necrosis factor-alpha and
augmentation of its cytotoxicity. J.Natl.Cancer.Inst. 80:1305-1312.
69. Lotze MT, Chang AE, Rosenberg SA (1986): High dose rIl-2 in the Treatment of
Patients with Disseminated Cancer. J.Am.Med.Assoc. 256:3117-3124.
70. Luiten RM, Coney LR, Fleuren GJ, Warnaar SO, Litvinov SV (1996): Generation
of chimeric bispecific G250/anti-CD3 monoclonal antibody, a tool to
combat renal cell carcinoma. Br.J Cancer 74:735-744.
71. Maloney KE, Norman RW, Lee CL, Millard OH, Welch JP (1991): Cytogenetic
abnormalities associated with renal cell carcinoma. J Urol 146:692-696.
72. McCune CS, deKernion J, Huben RP, Pontes JE (1984): Specific Immunotherapy
vs. Megace for Metastatic Renal Cell Carcinoma. A Prospective
Randomized Trial. J.Urol. part 2:178A, abstract 300.
73. McCune CS, O'Donnell RW, Marquis DM, Sahasrabudhe DM (1990): Renal cell
carcinoma treated by vaccines for active specific immunotherapy:
correlation of survival with skin testing by autologous tumor cells.
Cancer.Immunol.Immunother. 32:62-66.
74. McCune CS, Patterson WB, Henshaw EC (1979): Active specific immunotherapy
with tumor cells and Corynebacterium parvum: a phase I study. Cancer.
43:1619-1623.
- 121 75. McCune CS, Schapira DV, Henshaw EC (1981): Specific immunotherapy of
advanced renal carcinoma: evidence for the polyclonality of metastases.
Cancer. 47:1984-1987.
76. Meiselman N, Kohn A, Danon D (1967): Electron Microscopic Study of
Penetration of NDV into Cells.. Journal of Cell Science 2:71-76.
77. Minasian LM, Motzer RJ, Gluck L, Mazumdar M, Vlamis V, Krown SE (1993):
Interferon alfa-2a in advanced renal cell carcinoma: treatment results and
survival in 159 patients with long-term follow-up. J Clin.Oncol. 11:13681375.
78. Morrison SL, Schlom J (1990): Recombinant Chimeric Monoclonal Antibodies.
Oncology. 3-18.
79. Mostofi FK (1981): Histological Typing of Kidney Tumours. International
Histological Classification of Tumours No. 25 WHO Geneva:
80. Murphy GP, Mostofi FK (1965): The Significance of Cytoplasmic Granularity in
the Prognosis of Renal Carcinoma. J Urol 48-54.
81. Murray DR, Cassel WA, Moore ME (1977): Viral Oncolysate in The Management
of Malignant Melanoma. Cancer 40:680-686.
82. Muss
HB (1988): Interferon therapy of
Semin.Surg.Oncol. 4:199-203.
metastatic renal cell cancer.
83. Nagy E, Huber P, Krell.P.J., Derbyshire JB (1991): Sythesis of NDV-like
Envelopes in insect-cells. Journal of General Virology 72:753-756.
84. Nakano E, Fujioka H, Sonoda T (1984): Autologous MLC in Patients with Renal
Cell Carcinoma. J.Urol. 131:48
85. Namba M, Miyoshi T, Kanamori T, Ogawa S (1982): Combined effects of 5-FU
and Interferon on Proliferation of Human Neoplastic Cells in Culture. J
Cancer Res 73:819-824.
86. Neidhart JA, Murphy SG, Hennick LA, Wise HA (1980): Active specific
immunotherapy of stage IV renal carcinoma with aggregated tumor antigen
adjuvant. Cancer. 46:1128-1134.
- 122 87. Nielsen B, Borup Christensen P, Erb K, Jensenius JC, Husby S (1987): A method
for the blocking of endogenous immunoglobulin on frozen tissue sections in
the screening of human hybridoma antibody in culture supernatants.
Hybridoma. 6:103-109.
88. O'Garra A (1989): Interleukins and the immune system 2. Lancet. 1:1003-1005.
89. Oettgen HF, Hellström KE (1989): Principles of Immunology. Cancer Medicine
1029
90. Oosterwijk E, Ruiter DJ, Hoedemaeker PJ, Pauwels EKJ, Jonas U, Zwartendijk J,
w, Warnaar SO (1986): Monoclonal antibody G 250 recognizes a
determinant present in renal.cell carcinoma and absent from normal kidney.
Int.J Cancer 38:489-494.
91. Oosterwijk E, Warnaar SO, Zwartendijk J, van der Velde EA, Fleuren GJ,
Cornelisse CJ (1988): Relationship between DNA ploidy, antigen
expression and survival in renal cell carcinoma. Int.J.Cancer. 42:703-708.
92. Panelli MC, Bettinotti MP, Lally K, Ohnmacht GA, Li Y, Robbins P, Riker A,
Rosenberg SA, Marincola SM (2000): A tumor-infiltrating lymphocyte from
a melanoma metastasis with decreased expression of melanoma
differentiation antigens recognizes MAGE-12. J.Immunol. 164:4382-4392.
93. Pantel K, Izbicki JR, Angstwurm M, Braun S, Passlick B, Karg O, Thetter O,
Riethmuller G (1993): Immunocytological detection of bone marrow
micrometastasis in operable non-small cell lung cancer. Cancer Res.
53:1027-1031.
94. Peters LC, Hanna MGJ (1980): Active specific immunotherapy of established
micrometastasis: effect of cryopreservation procedures on tumor cell
immunogenicity in guinea pigs. J.Natl.Cancer.Inst. 64:1521-1525.
95. Pomer S., Thiele R, Schirrmacher V, Staehler G (1991): Sequential treatment of
patients with advanced renal cell carcinoma with autologous tumor vaccine
and subcutaneous administration of recombinant interleukin-2 and
interferon alpha 2b. World J Urol 9:223-227.
96. Pomer S., Thiele R, Staehler G (1989): Die Behandlung des fortgeschrittenen NZK
mittels kombinierter Vakzinierung mit modifiziertem autologen
- 123 Tumormaterial und Il-2; Methodencharakterisierung und vorläufige
Ergebnisse. Aktuelle Onkologie 57:28-37.
97. Prager MD, Baechtel FS (1973): Methods for Modification of Cancer Cell to
Enhance their Antigenicity. In: Methods in Cancer Research, 9 Ed.,
Academic Press, ed. New York, pp. 339
98. Prager MD, Baechtel FS, Greene C (1981): Specific Immunotherapy of Human
Metastatic Renal Cell Carcinoma. Clinical Investigations abstract:163
99. Quesada JR, Gutterman JU (1986): Clinical Toxicity of Interferons in Cancer
Patients. J Clin.Oncol. 4:234-243.
100. Rauschmeier HA (1988): Immunotherapy
Semin.Surg.Oncol. 4:169-173.
of
metastatic
renal
cancer.
101. Reimer M (1996): Herstellung von IL-2 enthaltenden Liposomen und deren
Koppelung an B-16 Tumorzellen.
102. Repmann R, Wagner, Richter A (1997): Adjuvant therapy of renal cell carcinoma
with active-specific-immunotherapy (ASI) using autologous tumor vaccine .
Anticancer Res 17:2879-2882.
103. Reuter VE (1990): Antigen Expression in Renal Cell Carcinoma. Eur Urol 18
(suppl.2):4-5.
104. Riethmuller G, Schlimok G, Pantel K, Angstwurm M, Izbicki J, Karg O, Stade BG,
Johnson JP (1992): Metastasis formation in human solid tumors: phenotypic
characteristics of early metastatic cells. Behring.Inst.Mitt. 204-209.
105. Roitt IMeal (1992): Encyclopedia of Immunology. Academic press,
106. Roos G, Ljungberg B (1990): DNA content in renal cell carcinoma and its clinical
significance. Eur.Urol. 18 Suppl 2:29-30.
107. Rosenberg SA (1990): Adoptive Immuntherapie von Krebs.
Wissenschaft Juli:56-64.
Spektrum der
108. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, Chang AE, Ettinghausen SE,
Matory YL, Skibber JM, Shiloni E, Vetto JT, et al (1985): Observations on
the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells
- 124 and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer.
N.Engl.J.Med. 313:1485-1492.
109. Rott R (1965): Untersuchungen über die Feinstruktur des infektiösen Partikels der
Newcastle-Disease. Zentralblatt der Veterinärmedizin 12:74-116.
110. Russel SJ (1990): Lymphokine Gene Therapy for Cancer. Immunol.Today. 11,
No.6:196-200.
111. Sarna G, Figlin R, De Kernion J (1987): Interferon in Renal Cell Carcinoma.
Cancer 59:610-612.
112. Scharfe T, Becht E, Hohenfellner R (1986): active immunotherapy of stage 4 renal
cell cancer using autologous tumor cells. World J Urol 3:245-248.
113. Schemera B, Toro H, Herbst W, Kaleta EF (1987): Konjunktivitis und Störungen
des Allgemeinbefindens beim Menschen durch Infektion mit dem Virus der
Newcastle-Krankheit. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 94:383-384.
114. Schild H, von Hoegen P, Schirrmacher V (1989): Modification of tumor cells by a
low dose of Newcastle disease virus. II. Augmented tumor-specific T cell
response as a result of CD4+ and CD8+ immune T cell cooperation.
Cancer.Immunol.Immunother. 28:22-28.
115. Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, Ahlert T, Gerhards R, Ertel C (1999): Human
tumor cell modification by virus infection: an efficient and safe way to
produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties
when using Newcastle disease virus. Gene Ther 6:63-73.
116. Schirrmacher V (1979): Tumor metastases and cell-mediated immunity in a model
system in DBA/2 mice. V. Transfer of protective immunity with H-2
identical immune T cells from B10.D2 mice. Int.J.Cancer. 24:80-86.
117. Schirrmacher V (1990): Krebsimpfung mit Tumorzellen.
Wissenschaft Januar:38-50.
Spektrum der
118. Schirrmacher V (1991): Immunologie. Thieme, pp. 185-203.
119. Schirrmacher V (1992): Immunity and metastasis: in situ activation of protective T
cells by virus modified cancer vaccines. Cancer.Surv. 13:129-154.
- 125 120. Schirrmacher V, Ahlert T, Heicappell R, Appelhans B, von Hoegen P (1986):
Successful Application of non-Oncogenic Virusses for Antimetastatic
Cancer Immunotherapy. Cancer Rev. 5:19-49.
121. Schirrmacher V, Bosslet K, Shantz G, Clauer K, Hubsch D (1979): Tumor
metastases and cell-mediated immunity in a model system in DBA/2 mice.
IV. Antigenic differences between a metastasizing variant and the parental
tumor line revealed by cytotoxic T lymphocytes. Int.J.Cancer. 23:245-252.
122. Schirrmacher V, Griesbach A, Zangemeister U (1994): Gamma-Irradiated Viable
Tumor Cells as Whole-Cell Vaccines can stimulate in Situ Syngeneic
Antitumor Cytotoxic T-Lymphocytes and Delayed-Type Hypersensitivity
whereas Tumor Cell Lysates elicit only Delayed-Type Hypersensitivity
Reactivity. Vaccine Research 3:31-48.
123. Schirrmacher V, Heicappell R (1987): Prevention of Metastatic Spread by
Postoperative Immunotherapy with Virally Modified Autologous Tumour
Cells. II. Establishment of Specific Systemic Antitumour Immunity.
Clin.Exp.Metastasis. 5:147-156.
124. Schirrmacher V, Shantz G, Clauer K, Komitowski D, Zimmermann HP, Lohmann
Matthes ML (1979): Tumor metastases and cell-mediated immunity in a
model system in DBA/2 mice. I. Tumor invasiveness in vitro and metastasis
formation in vivo. Int.J.Cancer. 23:233-244.
125. Schirrmacher V, von Hoegen P (1993): Importance of Tumor Cell Membrane
Integrity and Viability for Cytotoxic T-Lymphocyte Activation by Cancer
Vaccines. Vaccine Research 2:183-196.
126. Schirrmacher V, von Hoegen P, Griesbach A, Schild HJ, Zangemeister Wittke U
(1991): Specific eradication of micrometastases by transfer of tumourimmune T cells from major-histocompatibility-complex congenic mice.
Cancer.Immunol.Immunother. 32:373-381.
127. Schirrmacher V, von Hoegen P, Schlag P, Ahlert T, Bastert G (1989): Cancer
Metastasis. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 157-170.
128. Schlag P, Manasterski M, Gerneth T, Hohenberger P, Dueck M, Herfarth C,
Liebrich W, Schirrmacher V (1992): Active specific immunotherapy with
Newcastle-disease-virus- modified autologous tumor cells following
- 126 resection of liver metastases in colorectal cancer. First evaluation of clinical
response of a phase II-trial. Cancer.Immunol.Immunother. 35:325-330.
129. Schlimok G, Funke I, Holzmann B, Gottlinger G, Schmidt G, Hauser H, Swierkot
S, Warnecke HH, Schneider B, Koprowski H, et al (1987): Micrometastatic
cancer cells in bone marrow: in vitro detection with anti-cytokeratin and in
vivo
labeling
with
anti-17-1A
monoclonal
antibodies.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84:8672-8676.
130. Schlimok G, Funke I, Pantel K, Strobel F, Lindemann F, Witte J, Riethmuller G
(1991): Micrometastatic tumour cells in bone marrow of patients with
gastric cancer: methodological aspects of detection and prognostic
significance. Eur.J Cancer 27:1461-1465.
131. Schreiber H (1989): Fundamental Immunology. Raven press Ltd., New York, pp.
923-955.
132. Schumacher K (1989): New immunologic methods in cancer therapy.
Versicherungsmedizin. 41:42-48.
133. Schwaab T, Heaney JA, Schned AR, Harris RD, Cole BF, Noelle RJ, Phillips DM,
Stempowsky L, Ernstoff MS (2000): A randomized phase-II-trial comparing
two different sequence combinations of autologous vaccine and human
recombinant interferon gamma and human recombinant interferon alpha2B
therapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: clinical outcome
and analysis of immunological parameters. J Urol 163:1322-1327.
134. Shawler DL, Bartholomew RM, Smith LM, Dillman RO (1985): Human immune
response to multiple injections of murine monoclonal IgG. J.Immunol.
135:1530-1535.
135. Singh M, Kralovec J, Mezei M, Ghose T (1989): Inhibition of Renal Cancer by
Methotrexate Linked to a Monoclonal Antibody. J.Urol. 141:428-431.
136. Skinner DG, Colvin RB, Vermillion CD, Pfister RC, Leadbetter WF (1971):
Diagnosis and Management of Renal Cell Carcinoma. Cancer 28:11651177.
137. Steffens MG, Boermann OC, Oosterwijk-Wakka JC, Oosterhoff GO, Witjes JA,
Koenders EB, Oyen WJ, Buijs WC, Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk
- 127 E (1997): Targeting of renal cell carcinoma with iodine-131-labeled
chimeric monoclonal antibody G250. J.Clin.Oncol. 15:1529-1537.
138. Steffens MG, Boermann OC, Oyen WJ, Kniest PH, Witjes JA, Oosterhoff GO, van
Leenders GJ, Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk E, Oosterwijk E
(1999): Intratumoral distribution of two consecutive injections of chimeric
antibody G250 in primary renal cell carcinoma: implications for fractioned
dose radioimmunotherappy. Cancer.Res. 59:1615-1619.
139. Steffens MG, Oosterwijk-Wakka JC, Zegwaart-Hagemeier NE, Boermann OC,
Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk E (1999): immunohistochemical
analysis of tumor antigen saturation following injection of monoclonal
antibody G250. Anticancer research 19 (2A):1197-1200.
140. Steffens MG, Oosterwijk E, Zegwaart-Hagemeier NE, van´t Hoff MA, Debruyne
FM, Corstens FH, Boermann OC (1998): Immunohistochemical analysis of
intratumoral heterogeneity of [131I]cG250 antibody uptake in primary renal
cell carcinomas. Br.J.Cancer. 78:1208-1213.
141. Steplewski Z, Chang TH, Koprowski H (1981): Release of Monoclonal Antibodydefined Antigens by Human Carcinoma Cells. Cancer Res. 41:2723
142. Storkel S, Thoenes W, Jacobi GH, Engelmann U, Lippold R (1990): Prognostic
parameters of renal cell carcinoma. Eur.Urol. 18 Suppl 2:36-37.
143. Swanson D, Quesada JR (1988): Interferon Therapy for Metastatic Renal Cell
Carcinoma. Semin.Surg.Oncol. 4:174-177.
144. Tallberg T, Kalima T, Dabek J (1987): Postoperative ASI with Supportive
Biomodulating Measures in Patients Suffering from Malignant Gastric
Cancer. TumorDiagnostik und Therapie 8:49-53.
145. Tallberg T, Kalima T, Halttunen P, Tykka H, Mahlberg K, Matous B, Sundell B
(1986): Postoperative active specific immunotherapy with supportive
measures in patients suffering from recurrent metastasized melanoma: case
reports of six patients. J.Surg.Oncol. 33:115-119.
146. Tallberg T, Tykka H (1986): Specific Active Immunotherapy in Advanced Renal
Cell Carcinoma: A Clinical Longterm Follow-Up Study. World J Urol
3:234-244.
- 128 147. Tallberg T, Tykka H, Mahlberg K, Halttunen P, Lehtonen T, Kalima T, Sarna S
(1985): Active specific immunotherapy with supportive measures in the
treatment of palliatively nephrectomized, renal adenocarcinoma patients. A
thirteen-year follow-up study. Eur.Urol. 11:233-243.
148. Tallberg T, Tykkä H (1986): specific active immunotherapy in advanced renal cell
carcinoma: A clinical longterm follow-up study. World J Urol 3:234-244.
149. Teyssier JR, Ferre D (1990): Chromosomal Changes in Renal Cell Carcinoma.
Cancer.Genet.Cytogenet. 45:197-205.
150. Thoenes W, Rumpelt HJ, Storkel S (1990): Classification of renal cell
carcinoma/tumors and their relationship to the nephron-collecting tubules
system. Klin.Wochenschr. 68:1102-1111.
151. Thoenes W, Storkel S, Rumpelt HJ (1986): Histopathology and classification of
renal cell tumors (adenomas, oncocytomas and carcinomas). The basic
cytological and histopathological elements and their use for diagnostics.
Pathol.Res.Pract. 181:125-143.
152. Thoenes W, Storkel S, Rumpelt HJ, Jacobi GH (1986): Renal cell carcinoma-a
classification based on cytomorphological criteria. Zentralbl.Allg.Pathol.
132:503-513.
153. Topalian SL, Rosenberg SA (1990): Tumor-Infiltrating Lymphocytes. Oncology.
19-41.
154. Topalian SL, Solomon D, Avis FP, Chang AE, Freerksen DL, Linehan WM, Lotze
MT, Robertson CN, Seipp CA, Simon P, et al (1988): Immunotherapy of
patients with advanced cancer using tumor- infiltrating lymphocytes and
recombinant interleukin-2: a pilot study. J.Clin.Oncol. 6:839-853.
155. Tykka H, Oravisto KJ, Lehtonen T, Sarna S, Tallberg T (1978): Active specific
immunotherapy of advanced renal-cell carcinoma. Eur.Urol. 4:250-258.
156. Tykkä H, Hjelt L, Tallberg T (1974): Disappearance of Lung-Metastases during
Immunotherapy in five Patients Suffering from Renal Carcinoma. Scand J
Resp Dis 89 (suppl.):123-134.
- 129 157. Urba WJ, Steis RG, Longo DL, Kopp WC, Maluish AE, Marcon L, Nelson DL,
Stevenson HC, Clark JW (1990): Immunomodulatory properties and
toxicity of interleukin 2 in patients with cancer. Cancer.Res. 50:185-192.
158. van der Hout AH, Kok K, van den Berg A, Oosterhuis JW, Carritt B, Buys CH
(1988): Direct molecular analysis of a deletion of 3p in tumors from patients
with sporadic renal cell carcinoma. Cancer.Genet.Cytogenet. 32:281-285.
159. van Dijk J, Warnaar SO, van Eendenburg JD, Thienpont M, Braakman E, Boot JH,
Fleuren GJ, Bolhuis RL (1989): Induction of tumor-cell lysis by bi-specific
monoclonal antibodies recognizing renal-cell carcinoma and CD3 antigen.
Int.J Cancer 43:344-349.
160. von Hoegen P, Heicappell R, Griesbach A, Altevogt P, Schirrmacher V (1989):
Prevention of metastatic spread by postoperative immunotherapy with
virally modified autologous tumor cells. III. Postoperative activation of
tumor-specific CTLP from mice with metastases requires stimulation with
the specific antigen plus additional signals. Invasion.Metastasis. 9:117-133.
161. von Hoegen P, Weber E, Schirrmacher V (1988): Modification of tumor cells by a
low dose of Newcastle disease virus. Augmentation of the tumor-specific T
cell response in the absence of an anti-viral response. Eur.J.Immunol.
18:1159-1166.
162. Waldmann TA (1993): The IL-2/IL-2 receptor system: A target for rational immune
intervention. Immunol.Today. 14:264-270.
163. Weaver DJ, Michalski K, Miles J (1988): Cytogenetic analysis in renal cell
carcinoma: correlation with tumor aggressiveness. Cancer.Res. 48:28872889.
164. Wei#müller J, König HJ, Schrott KM (1990): Vindesin und Ifosfamid mit und ohne
IFN-alpha 2b in der Behandlung des progredient metastasierenden NZK.
Aktuelle Onkologie 57:23
165. Williams RD (1990): Immunotherapy of advanced renal cancer. Eur.Urol. 18 Suppl
2:46-47.
166. Wolchok JD MR (2000): Management of renal cell carcinoma.
(Huntingt). 14:29-34.
Oncology
- 130 167. Wunderlich M, Schiessel R, Rainer H, Rauhs R, Kovats E, Schemper M, Dittrich
C, Micksche M, Sedlacek HH (1985): Effect of adjuvant chemo- or
immunotherapy on the prognosis of colorectal cancer operated for cure.
Br.J.Surg. 72 Suppl:107-110.
168. Zangemeister Wittke U, Kyewski B, Schirrmacher V (1989): Recruitment and
activation of tumor-specific immune T cells in situ. CD8+ cells predominate
the secondary response in sponge matrices and exert both delayed-type
hypersensitivity-like and cytotoxic T lymphocyte activity. J.Immunol.
143:379-385.
169. Zangemeister U, Thiede K, Schirrmacher V (1989): Recruitment and activation of
tumor-specific immune T cells in situ: functional studies using a sponge
matrix model. Int.J.Cancer. 43:310-316.
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Opferkuch für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
Ganz besonders danke ich Herr Prof. Dr. F.W. Falkenberg, nicht alleine für die
Überlassung des Themas, sondern auch für die ständige Diskussionsbereitschaft
und für die freundliche, engagierte und versierte Betreuung der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Senge und Herrn Prof. Dr. Hertle danke ich für die klinische
Unterstützung und Begleitung meiner Arbeit.
Herrn Dr. J. Alefelder danke ich herzlich für seinen wirklich unermüdlichen
Einsatz, neben ihm danke ich Herrn Priv.-Doz. Dr. de Riese und Herrn Dr.
Brinkmann für die Arbeit mit den Patienten.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Morgenroth und seiner Mitarbeiterin Frau A.
Koch vom Institut für Pathologie der RUB, die entscheidend zum Gelingen der
elektronenmikroskopischen Experimente beigetragen haben.
Ein besonderes Dankeschön gilt meinem Studienkollegen und Vorreiter in dieser
Studie, Herrn Dr. A. Hinkel, der wichtige methodische Vorarbeit geleistet hat
und mit dem ich Teile der Studie gemeinsam erarbeitet habe.
Herrn Dr. O. Krup danke ich herzlich für die kritische Durchsicht des Manuskripts
und für viele wertvolle Hinweise, darüber hinaus gilt mein Dank allen
Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Falkenberg für ihre Hilfsbereitschaft und
Unterstützung.
Herrn Dr. S. Pickelmann möchte ich ganz besonders herzlich danken für die
ständige `Online-Hilfe´ in allen Fragen zur Abfassung wissenschaftlicher Texte,
unverzichtbar war mir seine Hilfe insbesondere bei der Statistik und der
Literaturverwaltung.
Meinem Bruder Severin Laumann danke ich für die Hilfe beim Layout und seinen
Schwiegereltern für die Überlassung des multimedialen Büros.
Meinen Eltern danke ich für die Korrektur des Manuskripts.
Der letzte aber innigste Dank gilt meiner Frau Annette Laumann, die mich nicht
nur immer wieder neu motiviert und unterstützt hat, sondern die auch selbst
viel Zeit investierte, indem sie mich zu bestimmten Zeiten immer wieder meiner
väterlichen Pflichten entband.
Curriculum vitae
Name:
Dominik Thomas Heinrich Laumann
Geburtsdatum:
8. Dezember 1966
Geburtsort:
Kenzingen/Breisgau
Eltern:
Agnes Maria Laumann, geb. Bohne, Lehrerin
Klemens August Laumann, Oberstudienrat
Konfession:
Römisch-Katholisch
Familienstand:
verheiratet seit dem 19.6.1992 mit Annette Laumann, geb. Pielhau,
drei Kinder
Grundschule:
1972 - 1976
Gymnasium:
1976 - 1985
Zivildienst:
1985 - 1987
Alten- und Krankenpflege im Dietrich-BonhoefferAltenzentrum, Lüdenscheid
Studium:
1987 - 1992
Studium der Humanmedizin an der Ruhruniversität
Bochum, Physikum, 1. Abschnitt ärztliche Prüfung
1991/92
Auslandsjahr an der Université Louis-Pasteur-France in
Straßburg/Frankreich
1992 - 1994
Fortsetzung des Studiums an der Universität zu Köln,
2.Abschnitt ärztliche Prüfung
1994
Praktisches Jahr im Krankenhaus Merheim und im
Hôpital La Chaux de Fonds, Schweiz, Wahlfach
Neurologie, 3. Abschnitt ärztliche Prüfung
Grundschule Langeoog und Albert-SchweitzerGrundschule Lüdenscheid
Bergstadt-Gymnasium Lüdenscheid,
abgeschlossen mit dem Abitur 6/85
Approbation:
Dezember 1994, Vollapprobation 12/1996
Ärztl. Tätigkeit: 1995/96
Arzt im Praktikum der Neurologischen Abteilung des
Krankenhauses Köln-Merheim
Weiterbildungsassistent im Fach Psychiatrie in der
Evangel. Nervenklinik Stiftung Tannenhof Remscheid
Weiterbildungsassistent im Fach Psychiatrie in den
Rheinischen Kliniken Köln
1996/97
seit 1997
Ich versichere hiermit, daß die Arbeit selbständig und ohne unerlaubte Hilfe durchgeführt,
verfaßt und in dieser oder ähnlicher Form noch bei keiner anderen Abteilung oder
entsprechenden Einrichtung einer Hochschule eingereicht worden ist.
Köln, 03.06.00
_____________________________________
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Aktive spezifische Immunisierung (ASI) - Ruhr