Aktive spezifische Immunisierung (ASI) - Ruhr
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Dominik Laumann Aktive Spezifische Immunisierung (ASI) als postoperative adjuvante Tumortherapie bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (NZK) Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum Institutsleiter: Prof. Dr. Sören G. Gatermann Aktive Spezifische Immunisierung (ASI) als postoperative adjuvante Tumortherapie bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (NZK) Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Dominik Laumann aus Kenzingen im Jahr 2000 Dekan: Prof. Dr. G. Muhr Referent: Prof. Dr. F. W. Falkenberg Koreferent: PD Dr. B. M. J. Sanner Tag der mündlichen Prüfung: 03.Mai 2001 Meinen Eltern und meiner Frau in Liebe und Dankbarkeit gewidmet INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS 4 TABELLENVERZEICHNIS 5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6 1 EINLEITUNG 8 1.1 THEMA UND PROBLEMATIK DER VORLIEGENDEN ARBEIT 8 1.2 DAS NIERENZELLKARZINOM 9 1.2.1 EPIDEMIOLOGIE UND ÄTIOLOGIE 9 1.2.2 PATHOLOGIE UND STADIENEINTEILUNG 9 1.2.3 DIGNITÄT UND PROGNOSE 12 1.2.4 KLINIK UND DIAGNOSTIK 14 1.2.5 THERAPIE 15 1.2.5.1 Chirurgische Therapie 15 1.2.5.2 Chemotherapie 16 1.2.5.3 Hormontherapie 16 1.2.5.4 Immuntherapie des NZK 17 1.3 TUMORIMMUNOLOGIE 17 1.3.1 TUMORANTIGENE 17 1.3.2 IMMUNREAKTION GEGEN TUMOREN 18 1.3.3 AUSWEICHEN DES TUMORS VOR DER IMMUNANTWORT (IMMUNE-ESCAPE) 19 1.3.4 TUMORIMMUNDIAGNOSE 20 1.3.5 TUMORIMMUNOLOGIE DES NZK 20 1.4 1.4.1 TUMORIMMUNTHERAPIEN MONOKLONALE ANTIKÖRPER 22 22 1.4.1.1 Allgemeines 22 1.4.1.2 Bedeutung von MAK in der Therapie NZK 23 1.4.2 ZYTOKINE 24 1.4.2.1 Allgemeines 24 1.4.2.2 Bedeutung der Zytokine in der Therapie des NZK 26 1.4.3 ADOPTIVE IMMUNTHERAPIEN MIT LAK BZW. TIL 28 1.4.3.1 Allgemeines 28 1.4.3.2 Bedeutung von LAK und TIL in der Therapie des NZK 29 1.4.4 1.4.4.1 AKTIVE SPEZIFISCHE IMMUNTHERAPIEN Allgemeines 30 30 -21.4.4.2 Tiermodelle für eine Tumorimmunisierung 31 1.4.4.3 Adjuvantien in der Tumortherapie 33 1.4.4.4 NDV als Adjuvans - Struktur und immunologische Funktion 33 1.4.4.5 ASI in der Therapie verschiedener Tumoren 35 1.4.4.6 ASI beim NZK 36 2 METHODEN UND MATERIALIEN 2.1 KLINISCHE STUDIE, VORPHASE 39 39 2.1.1 PLANUNG DES STUDIENKONZEPTES 39 2.1.2 EIN- UND AUSSCHLUßKRITERIEN DER STUDIE 40 2.1.3 PATIENTEN 40 2.1.4 KONTROLLGRUPPE 42 2.2 KLINISCHE STUDIE: DIE AUTOLOGE TUMORVAKZINE 42 2.2.1 NEPHREKTOMIE UND TRANSPORT 42 2.2.2 TUMORAUFARBEITUNG 43 2.2.2.1 Präparation und Dissoziation 43 2.2.2.2 Reinigung des Pellets 43 2.2.2.3 Bestimmung von Zahl und Vitalität der Tumorzellen 43 2.2.2.4 Einfrieren der Zellen in Kryotubes 44 2.2.3 2.3 STERILKONTROLLEN KLINISCHE STUDIE, IMMUNISIERUNG 44 45 2.3.1 VORBEREITUNG DER VAKZINE ZUR APPLIKATION 45 2.3.2 IMMUNISIERUNGEN 46 2.4 KLINISCHE STUDIE, NACHSORGE 47 2.4.1 ROUTINE-FOLLOW-UP 47 2.4.2 HAUSÄRZTLICHE NACHSORGE 47 2.4.3 DOKUMENTATION 48 2.4.4 STATISTIK 48 2.5 KLINISCHE STUDIE: MATERIAL 49 2.5.1 CHEMIKALIEN 49 2.5.2 VERBRAUCHSMATERIAL 49 2.5.3 GERÄTE 50 2.5.4 GEBRAUCHSLÖSUNGEN 51 2.6 EXPERIMENTE I, ELEKTRONENMIKROSKOPIE 53 2.6.1 HERKUNFT DER PRÄPARATE 53 2.6.2 HERSTELLUNG DER PRÄPARATE FÜR DAS RASTERELEKTRONENMIKROSKOP 53 2.6.3 MATERIAL 54 -32.6.3.1 Chemikalien und Gebrauchslösungen 54 2.6.3.2 Geräte 54 2.7 EXPERIMENTE II, IMMUNFLUORESZENZ 55 2.7.1 HERSTELLEN VON GEFRIERSCHNITTEN 55 2.7.2 HERSTELLEN VON ZELLZENTRIFUGATEN 55 2.7.3 GEWINNUNG VON LYMPHOZYTENSUSPENSIONEN 55 2.7.4 IMMUNFLUORESZENZ 56 2.7.5 MATERIAL 57 2.7.5.1 Chemikalien 57 2.7.5.2 Puffer 57 2.7.5.3 Geräte 58 3 ERGEBNISSE 3.1 KLINISCHE STUDIE: WEITERENTWICKLUNG DER METHODIK 59 59 3.1.1 INTERDISZIPLINÄRE ZUSAMMENARBEIT 59 3.1.2 METHODISCHE VEREINFACHUNG 60 3.1.3 ZELLKULTUREN 61 3.2 3.2.1 KLINISCHE STUDIE:PATIENTENERGEBNISSE PATIENTEN 62 62 3.2.1.1 ASI-Therapiegruppe 62 3.2.1.2 Kontrollgruppe 64 IMMUNISIERUNGEN 65 3.2.2 3.2.2.1 Durchführung 65 3.2.2.2 Probleme 65 3.2.2.3 Nebenwirkungen 66 3.2.3 PROGNOSEKATEGORIEN 66 3.2.4 AUSWERTUNG BEI DEN PRIMÄR METASTASENFREIEN PATIENTEN 69 3.2.4.1 Rezidive des NZK 69 3.2.4.2 Krankheitsverlauf mit und ohne ASI 70 3.2.4.3 Statistik 71 3.2.4.4 Metastasierungsmuster und Zusatztherapien 73 3.2.4.5 Prognose und Rezidiv 74 3.2.5 AUSWERTUNG BEI DEN PRIMÄR METASTASIERTEN PATIENTEN 75 3.2.5.1 Überlebenszeit mit und ohne ASI 75 3.2.5.2 Statistik 76 3.2.5.3 Krankheitsverlauf unter ASI 77 3.2.5.4 Krankheitsverlauf ohne ASI 79 -43.2.5.5 Zusatztherapien in der ASI-Gruppe 79 3.2.6 DTH ALS PARAMETER 80 3.2.7 EINZELFALLDARSTELLUNGEN 82 3.2.8 ANEKDOTISCHE DARSTELLUNG EINES SONDERFALLS: VERSAGEN DER ASI BEI EINER PATIENTIN MIT MALIGNEM PARAGANGLIOM 86 3.3 87 EXPERIMENTELLER TEIL. ERGEBNISSE IMMUNFLUORESZENZ 3.3.1 GEFRIERSCHNITTE 87 3.3.2 ZELLZENTRIFUGATE 87 3.4 EXPERIMENTELLER TEIL: ELEKTRONENMIKROSKOPIE 89 3.4.1 PRÄPARATE 89 3.4.2 ERGEBNISSE 90 4 DISKUSSION 4.1 KLINISCHE STUDIE: WEITERENTWICKLUNG DER METHODIK 95 95 4.1.1 ENTNAHME UND TRANSPORT 96 4.1.2 PATHOLOGISCHE DIAGNOSTIK 96 4.1.3 ZELLVEREINZELUNG 97 4.1.4 HERSTELLUNG DER VAKZINE 99 4.1.5 QUALITÄTSSICHERUNG 4.2 KLINISCHE STUDIE: DISKUSSION DER PATIENTENERGEBNISSE 100 102 4.2.1 IMMUNISIERUNG UND ADJUVANTIEN 102 4.2.2 THERAPIEERGEBNISSE PRIMÄR METASTASENFREIER PATIENTEN 104 4.2.3 THERAPIEERGEBNISSE BEI DEN PATIENTEN MIT PRIMÄR METASTASIERTEN TUMOREN 106 4.2.4 STELLENWERT DER IMMUNTHERAPIEN IN DER THERAPIE DES NZK 108 4.2.5 STELLENWERT DER ASI IN DER THERAPIE DES NZK 109 4.3 EXPERIMENTE 112 4.3.1 IMMUNFLUORESZENZ 112 4.3.2 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 112 LITERATURVERZEICHNIS 114 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb.1: NZK-Subtypen, eigene Grafik..................................................................................10 Abb.2: Diagnostik beim NZK ..............................................................................................15 Abb.3: Immunologische Tumorabwehr ...............................................................................18 -5Abb.4: Tumorantigene, eigene Grafik..................................................................................22 Abb.5: Tiermodelle ..............................................................................................................32 Abb.6: Prognosekategorien I................................................................................................67 Abb.7: Prognosekategorien II...............................................................................................68 Abb.8: KFI Metastasenfreie Pat. ..........................................................................................70 Abb.9: Prognose und Rezidiv ..............................................................................................74 Abb.10: Überlebenszeit prim. metastasierte Pat. .................................................................75 Abb.11: Inkubationszeit 10 Minuten I .................................................................................90 Abb.12: Inkubationszeit 10 Minuten II ................................................................................91 Abb.13: Inkubationszeit 10 Minuten III...............................................................................91 Abb.14: Inkubationszeit 30 Minuten I .................................................................................92 Abb.15: Inkubationszeit 30 Minuten II ................................................................................93 Abb.16: Inkubationszeit 30 Minuten III...............................................................................93 TABELLENVERZEICHNIS Tab.1: TNM-Klassifikation..................................................................................................11 Tab.2: Robson-Klassifikation ..............................................................................................11 Tab.3: V-Stadien ..................................................................................................................12 Tab.4: Klinische Symptome.................................................................................................14 Tab.5: Zytokine ....................................................................................................................24 Tab.6: Ergebnisse von Studien zu Zytokintherapien............................................................27 Tab.7: Erste Studienphase, Patientendaten ..........................................................................41 Tab.8: Nicht-ausgewertete Patienten....................................................................................62 Tab.9: TNM-und G-Stadien ASI-Gruppe ............................................................................63 Tab.10: TNM-und G-Stadien Kontrollgruppe .....................................................................64 Tab.11: Metastasen ASI-Gruppe, n=9..................................................................................68 Tab.12: Metastasen Kontrollgruppe, n=7.............................................................................68 Tab.13: Rezidive ASI-Gruppe..............................................................................................69 Tab.14: Rezidive Kontrollgruppe.........................................................................................69 Tab.15: Statistik; KFI/ASI ...................................................................................................71 Tab.16: Statistik; KFI/Kontrollgruppe .................................................................................72 Tab.17: Statistik; ÜZ/ASI ....................................................................................................76 Tab.18: Statistik; ÜZ/Kontrollgruppe ..................................................................................77 Tab.19: DTH Nicht-metastasierte Pat. .................................................................................81 Tab.20: DTH metastasierte Pat. ...........................................................................................81 Tab.21: Ergebnisse Fluoreszenzmikroskopie.......................................................................89 -6ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A. A.dest. ACTH Ak APC ASI AZ BHI CD CR DMEM DMSO DNase DTH EDTA Fab Fc FITC FITC Gy HAU HBSS HE HEPES HLA I.E. IFN Ig IL LAK LK m MAK, MAb MHC Arteria Aqua destillata Adreno-kortikotropes Hormon Antikörper Antigen-präsentierende Zelle Aktive Spezifische Immunisierung Allgemeinzustand Brain-Heart-Infusion Cluster of Differentiation Complete Response, komplette Remission Dulbecco´s modified eagle medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonuclease Delayed Type of Hypersensitivity; Immunreaktion vom verzögerten Typ Ethylendiamin-Tetraessigsäure Fragment der Antigen-Bindung konstantes Fragment Fluoresceinisothiocyanat Fluoreszeinisothiocyanat Gray Hämagglutinierende Einheiten Hanks balanced salt solutions Hämatoxilin-Eosin Färbung N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2ethansulfonicacid Human Leukocyte Antigen Internationale Einheiten Interferon Immunglobulin Interleukin Lymphokin-Activated Killer Cells Lymphknoten männlich Monoklonale Antikörper Haupthistokompatibilitätskomplex -7min NDV NK-Zellen NZK OP OR PBS PBS-G. PE PR rIL-2 TATA TIL TNF TNM TSTA UICC V. w WHO Z!HuIg Minuten Newcastle Disease Virus Natürliche Killer-Zellen Nierenzellkarzinom Operation Objective Response Phosphate-buffered saline -Gebrauchslösung Probeexzision Partial Response Rekombinantes Interleukin-2 Tumorassoziierte Transplantationsantigene Tumor-Infiltrating Lymphocytes Tumor Nekrose Faktor Tumorklassifikationssystem der WHO/UICC Tumorspezifische Transplantationsantigene Unio Internationalis contra Cancrum Vena weiblich World Health Organization Ziege-anti-humane Immunglobuline -8- 1 Einleitung 1.1 Thema und Problematik der vorliegenden Arbeit Thema der folgenden Arbeit ist die Durchführung und Auswertung einer Phase-IIStudie, in der Patienten mit fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen (NZK) postoperativ mit einer autologen Vakzine aus Newcastle-Disease-Virus (NDV)modifizierten Tumorzellen nachbehandelt wurden. In Vorstudien mußte zunächst sichergestellt werden, daß mit der verwendeten Methodik reproduzierbare Suspensionen ausreichend vitaler Tumorzellen hergestellt werden konnten. Ziel dieser Arbeit war es nachzuweisen, ob diese Therapie den Verlauf der Erkrankung bei den entsprechenden Patienten im Vergleich zu Patienten einer Kontrollgruppe günstig beeinflussen kann. Im weiteren Verlauf der Arbeit wird die Wirksamkeit dieses Therapieansatzes im Vergleich zu anderen aus der Literatur bekannten Behandlungsstrategien erörtert und versucht, seinen Stellenwert in der Therapie des NZK zu ermitteln. Darüber hinaus geht es, wie in jeder Phase-II-Studie zu einer neuen Behandlungsmethode üblich, um die Beobachtung und Dokumentation der möglichen Nebenwirkungen. Parallel dazu wurde in einer elektronenmikroskopischen Studie der Frage nachgegangen, ob und wie das NDV in der Inkubationszeit von 30 min die Oberflächen der Tumorzellen elektronenoptisch nachweisbar verändert. Mittels Immunfluoreszenz wurde zudem versucht, möglichst spezifische murine MAK gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte NZK-Antigene (Ag) zu entdek??ken. Außerdem wurde versucht, eine gegen Tumorantigene gerichtete Antikörperantwort im Serum betroffener Patienten nachzuweisen und diese mit dem Krankheitsverlauf zu korrelieren. -91.2 1.2.1 Das Nierenzellkarzinom Epidemiologie und Ätiologie Obwohl seine Inzidenz nach neuesten WHO-Daten in fast allen untersuchten Staaten deutlich ansteigt, ist das NZK mit einem Anteil von ca. 2% an der Mortalität aller Malignome nach wie vor ein relativ seltener bösartiger Tumor. Trotzdem erhält es besonders in Mitteleuropa eine zunehmende Bedeutung mit Zuwachsraten in der Inzidenz zwischen 10% (Schottland) und 150% (Tschechien, Italien, [62]). Das NZK kommt vor allem bei der Stadtbevölkerung vor und ist bei Männern durchschnittlich mehr als doppelt so häufig anzutreffen wie bei Frauen. Der Tumor ist eine Erkrankung des Erwachsenenalters mit einem Häufigkeitsgipfel zwischen der 5. und der 7. Lebensdekade. NZK leiten sich ebenso wie die Nierenadenome von den Zellen der Tubuli und Sammelrohre ab (s.u.). Sichere ätiologische Faktoren konnten bislang, obwohl im Tiermodell postuliert, für das humane NZK nicht eruiert werden. Als mögliche Faktoren werden diskutiert: Tabakgenuß, bzw. das Kadmium im Zigarettenrauch [2], Kaffeegenuß, genetische (von-Hippel-Lindau´sche Krankheit, polyzystische Nieren), hormonelle (Geschlechtsprädisposition) und alimentäre (fett-und fleischreiche Kost) Einflüsse [62]. 1.2.2 Pathologie und Stadieneinteilung Seit Grawitz1 "versprengte Keime der Nebennierenrinde" für das Ausgangsgewebe der NZK gehalten hat, wurden diese als Grawitz-Tumoren oder Hypernephrome bezeichnet. Seit etwa 10 Jahren wird von der WHO der Begriff "Nierenzellkarzinom" empfohlen [79], der unmißverständlich die epithelialen Tumoren, die von den Harnkanälchen ihren Ursprung nehmen, in den Mittelpunkt des Begriffs rückt. Die mittlerweile weltweit zunehmend anerkannte pathologische Systematik stammt von Thoenes [151; 152] und wurde 1990 noch einmal erweitert [150]. Sie unterscheidet fünf Subtypen, die sich in der Regel auch ganz bestimmten Zellgruppen als Ursprungsgewebe zuordnen lassen. Daneben stellt sie noch einen spindelzellig pleomorphen Typ, der als anaplastische Variante eines der fünf Grundtypen zählt. 1Grawitz, P. "Die sogenannten Lipome der Niere" 1883 - 10 So findet Thoenes am häufigsten das klarzellige NZK, dessen Grundzelltyp durch einen hohen Glykogengehalt im HE-Präparat ein "klares" Zytoplasma zeigt. Es stellt mit einem Anteil von 75% der NZK den Haupt-Subtyp dar, wächst hauptsächlich solide und leitet sich von den Zellen des proximalen Tubulus ab. Am zweithäufigsten (11%) findet sich das chromophilzellige NZK, dessen Zellen weitgehend glykogenfrei sind und das wegen seines meist tubulo-papillären Wachstums früher als "papilläres NZK" bezeichnet wurde. Der Grundzelltyp stammt hierbei ebenfalls aus dem proximalen Tubulus. Das chromophobzellige NZK (Häufigkeit 2-5%) stammt von den Zellen des Verbindungsstückes, das sehr seltene Duct-Bellini-Karzinom (ca. 1% der NZK) von den Schaltzellen des Sammelrohres ab (Siehe auch Abb. 1). Hiervon abzugrenzen ist das Onkozytom der Niere (Häufigkeit ca. 5%), das aus mitochondrienreichen eosinophilen Zellen (Onkozyten im Sinne Hamperls2) besteht und eine selbst definierte Tumorentität mit guter Prognose darstellt. Die restlichen NZK sind dem spindelzellig-pleomorphen Typ, also der entdifferen-zierten Variante der anderen Typen zuzuordnen. Glomerulus Sammelrohr prox. Tubulus dist. Tubulus Verbindungsstück Henle-Schleife Typ Häufigkeit klarzellig 75% chromophilzellig 11% chromophobzellig Onkozytom 5% 5% Rest: spindelzellig pleomorph (entdifferenziert) Abb.1: NZK-Subtypen, eigene Grafik 2Hamperl, H., 1931, Virchows Arch path Anat 282: 724-736 Duct-Bellini 1% - 11 Die gängige Stadieneinteilung (Staging) wird nach der TNM-Klassifikation der UICC vorgenommen, wobei T die Ausbreitung des Primärtumors, N den Lymphknotenbefall und M die Fernmetastasierung bezeichnet. T-Stadien Tx T1 T2 T3 T3a T3b T4 Primärtumor nicht beurteilbar Tumor unter 2,5 cm, auf die Niere begrenzt Tumor über 2,5 cm, auf die Niere begrenzt Tumor infiltriert größere Venen oder Gerota-Faszie Tumor infiltriert perirenales Gewebe oder Nebenniere Tumor mit Ausbreitung in Nierenvenen oder V. cava Tumor überschreitet die Gerota-Faszie N-Stadien Nx Lymphknotenmetastasen nicht beurteilbar N0 N1 N2 N3 M-Stadien Mx M0 M1 Keine regionären Metastasen Eine Metastase bis 2 cm Durchmesser Eine oder mehrere Metastasen von 2 - 5 cm Metastasen über 5 cm Fernmetastasen nicht beurteilbar Keine Fernmetastasen Fernmetastasen TAB.1: TNM-KLASSIFIKATION Den Zusatz "p"erhält das T-Stadium nach histopathologischer Begutachtung. Das vor allem im angloamerikanischen Schrifttum verbreitete Klassifikationsschema zum Staging der NZK stammt von Robson et al. (1968/1973) und stellt die anatomische Ausbreitung in den Vordergrund. Stadium I Tumor respektiert die Nierenkapsel Stadium II Infiltration des perirenalen Fettes, Begrenzung durch die Gerota-Faszie Stadium III Einbeziehung der regionalen Lymphknoten und/oder Einbruch in die Venen (V. renalis u./o. V cava) Stadium IV Einbruch in benachbarte Organe /Fernmetastasen TAB.2: ROBSON-KLASSIFIKATION - 12 - Die Stadien wurden von Hermanek ergänzt, der den Einbruch des Tumors in eine Nierenvene für ein entscheidendes prognostisches Kriterium hielt. V0 Kein Einbruch in eine Nierenvene V1 Einbruch in die Vena renalis V2 Einbruch in die Vena cava TAB.3: V-STADIEN 1.2.3 Dignität und Prognose Wesentliche Charakteristika des NZK sind seine schlechte Prognose durch frühzeitiges Metastasieren bei langem asymptomatischen Verlauf und die nahezu fehlenden prognostischen Parameter in nicht-metastasierten Fällen. So treten nach Nephrektomie in mindestens 50% der nicht-generalisierten Fälle im Laufe des ersten Jahres nach der OP Metastasen auf [21], in Studien an autoptischem Material liegt diese Zahl laut Information aus demselben Artikel noch höher. Zur Abschätzung der Dignität hat sich das früher herangezogene Größenkriterium allein (Bell´sche Regel: <3cm Adenom, >3cm Karzinom) als nicht zuverlässig erwiesen. Auch der Nachweis invasiven und infiltrativen Wachstums (Staging) hat in Bezug auf nicht organüberschreitende NZK keine wesentliche Bedeutung erlangt, da auch ganz eindeutige Karzinome häufig durch eine Kapsel begrenzt sind, welche trotz vorhandener Fernmetastasen häufig lokal nicht überschritten wird. Da zudem auch das Wachstumsmuster allenfalls als sekundäres Merkmal herangezogen werden kann, bleiben zytomorphologische, insbesondere nukleäre Kriterien (Grading), um die Dignität eines NZK einzuschätzen [136; 142; 151]. Das Grading erfolgt durch einen Pathologen mittels visueller Abschätzung des Ausmaßes der Kernatypie: " GI Tumoren, deren Zellen kleine, weitgehend runde Kerne mit geringen Größenschwankungen und kaum nachweisbaren Nukleolen zeigen und extrem selten Mitosen aufweisen - 13 " " (" G II Tumoren, die sich in der Differenzierung zwischen G-I und G-III befinden, also mittelmäßig differenziert sind G III Tumoren, deren Zellen entrundete polymorphe Kerne mit deutlichen großen Nukleolen zeigen und sehr häufig Mitosen aufweisen G IV entdifferenzierte Tumoren, nicht von allen Autoren gebraucht) Die Prognose des NZK ist im allgemeinen schwierig zu stellen. Unbestritten ist allein, daß sie mit steigendem Grade ernster wird und daß wachsende anatomische Ausbreitung (Stage) die Prognose ebenfalls tendenziell negativ beeinflußt. Während im Stadium I nach Robson 66-90% der Patienten 5 Jahre nach der OP noch leben, sinkt diese Zahl für das Stadium IV auf ca. 10% [32]. Die Granularität der Zellen des NZK weist auf relativen Mitochondrienreichtum hin und ist entgegen früheren Auffassungen per se kein Kriterium zur Abschätzung der Dignität, obwohl es tatsächlich so ist, daß das nukleäre Grading bei diesen mitochondrien-reichen Zellvarianten eher höher liegt [80]. Zytogenetische Auffälligkeiten lassen sich zwar in fast jedem Fall eines NZK nachweisen, ob und wie sie jedoch mit der Prognose korrelieren, ist in der Literatur umstritten [59; 71; 149]. Häufigste chromosomale Aberration ist der Verlust eines Teils des p-Arms von Chromosom 3, so daß verschiedene Autoren hier einen Zusammenhang zu Tumorgenese und Wachstumsprogredienz herstellen (Verlust eines Suppressorgens oder Antionkogens) [59; 158]. Zum Stadium der Erkrankung besteht aber offensichtlich kein Zusammenhang [71; 149], obwohl es auch Studien mit anderen Ergebnissen gibt [163]. Dagegen scheint ein Zusammenhang zwischen dem DNA-Gehalt der Zellen, der Antigenexpression auf ihrer Oberfläche und der Prognose der Tumorerkrankung zu bestehen, dergestalt, daß aneuploide Zellinien generell zu verminderter Antigenexpression neigen, Fernmetastasen daher aggressiver wachsen als Metastasen diploider Zellinien [91; 103; 106]. Die mit dem MAK Ki-67 nachgewiesenen sog. Wachstumsfraktionen (der Antikörper ist gegen ein nukleär assoziiertes Proliferationsantigen gerichtet) konnten die erhoffte lineare Korrelation mit der malignen Potenz des Tumors nicht zeigen [60]. Diese Arbeiten rücken vor allem deswegen mehr und mehr in den Vordergrund, weil die objektive Einschätzung der malignen Potenz eines konkreten NZK in - 14 nächster Zukunft allergrößte Bedeutung Differentialtherapien anwenden zu können. erhalten wird, um rationale Bei der heutigen Praxis, im Prinzip nur T4-(G3-)Tumoren mit Fernmetastasen in die ungünstigste Prognosegruppe einzustufen, übersieht man die nahezu 50% der "kurativ" resezierten NZK-Patienten mit T3/2-(G2-) Tumoren, die innerhalb eines Jahres nach Nephrektomie Fernmetastasen entwickeln [21] und denen "dann erst" eine schlechtere Prognose zugeteilt wird. Diese Fälle, die bis dato noch mit keinem sicheren prognostischen Kriterium von der anderen Hälfte der Tumorpatienten (die ja mitunter tatsächlich lebenslang tumorfrei bleiben) unterschieden werden können, stellen die eigentliche diagnostische und therapeutische Herausforderung dar. 1.2.4 Klinik und Diagnostik Das NZK ist meist symptomarm, 50% der Tumoren rufen Fremdsymptome in anderen Organsystemen hervor [2]. Die klassische Symptomentrias Hämaturie, Flankenschmerz und palpabler Tumor findet sich nur in 11% der Fälle; Symptom Häufigkeit Schmerzen Hämaturie Tastbare Resistenz Gewichtsabnahme Bluthochdruck Fieber Klassische Trias 48% 40%-60% 25%-40% 37% 22% 19% 11% Varikozele Keine 1% 5% TAB.4: KLINISCHE SYMPTOME [6; 20] Die häufigsten Laborbefunde sind neben der Hämaturie die Erhöhung der Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BSG), eine Anämie und eine Hyperkalzämie; als Tumormarker sind erhöhte Plasma-Renin-Spiegel, sowie ein Ansteigen des Erythropoetins zu werten. Gelegentlich werden sowohl bei den metastasierten, als auch bei - 15 den nicht-metastasierten Fällen, paraneoplastische Syndrome beobachtet (StaufferSyndrom, eine Leberdysfunktion, ektope Hormonproduktion, hyperreninämische Hypertonie). In der Diagnostik hat die Abdomensonographie als sicheres nicht-invasives Verfahren in den letzten Jahren die zentrale Bedeutung bekommen, und zwar sowohl als Instrument zur Diagnosestellung bei Verdacht auf NZK, als auch als Screeningmethode in Routineuntersuchungen. Schon jetzt nimmt dadurch die Anzahl der frühzeitig entdeckten Tumoren erfreulicherweise zu. Sonographie/Urographie pathologischer Befund Zyste solider Tumor fragliche Dignität Computertomographie fraglich Angiomyolipom Milzbuckel, etc. maligne Angiographie Magnetresonanztomographie Abb.2: Diagnostik beim NZK [32] 1.2.5 1.2.5.1 Therapie Chirurgische Therapie Bei lokalisiertem Krankheitsgeschehen ist die radikale Entfernung der tumortragenden Niere samt perirenalem Fettgewebe, den regionalen Lymphknoten und der Nebenniere bei frühzeitiger Ligatur der A. renalis die Methode der Wahl [6; 20]. Im Falle des Nachweises von Tumorthromben in den Venen werden diese durch Cavotomie oder mittels Kathetern entfernt. Auch solitäre Fernmetastasen, besonders im Falle günstigerer Prognoseparameter des Primärtumors, wie mittlerer Grad oder diploider Chromosomensatz, stellen eine Indikation zu radikaler chirurgischer Therapie dar [2; 66]. - 16 Generalisierte Ausbreitung des Krankheitsgeschehens -als solche muß man neben Fernmetastasen auch Lymphknotenmetastasen und Fremdorganbefall (Stadium T4) ansehen [39]- stellt eine Kontraindikation zur chirurgischen Therapie dar, da weder eine Lebenszeitverlängerung, noch eine Verbesserung der Lebensqualität zu erreichen ist [2; 6]. Als symptomatisch-palliative Maßnahme bei sehr großen Tumoren kann eine Operation dennoch notwendig werden [20]. In großen, stark vaskularisierten Tumoren kann eine präoperative Katheterembolisation vorgenommen werden. 1.2.5.2 Chemotherapie Zur systemischen Therapie des metastasierten NZK existiert bisher keine etablierte Form der Chemotherapie. Einzig für Vinblastin (auch Vindesin) ist ein gewisser Effekt (ca. 15% Ansprechrate3[45]) beschrieben, den man unter Inkaufnahme teils erheblicher Nebenwirkungen durch Kombinationen mit Ifosfamid und !-Interferon noch etwas steigern kann [164]. Für 5-FU ist außerdem ein wirkungsverstärkender Effekt auf eine Interferon/Interleukin-Therapie experimentell gesichert [85]. Genaue Zahlen sind bei den letztgenannten Autoren nicht zu erhalten. Das NZK in fortgeschrittenen Stadien gilt also als ausgesprochen resistent gegenüber Chemotherapien, was u.a. an dem Auftreten eines Multi-Resistenz-Gens und der Expression entsprechender maskierender Proteine liegen könnte [6]. 1.2.5.3 Hormontherapie Nachdem in den 70-er Jahren die Steroidabhängigkeit des Nierengewebes und das Vorhandensein von Steroidrezeptoren auch an NZK-Zellen nachgewiesen wurde, unternahm man viele Studien mit Gabe von Hormonpräparaten als therapeutischem Ansatz. Nachdem Bloom 1973 in einem Übersichtsartikel von einer Ansprechrate von bis zu 15% geschrieben hatte (und dabei Studien mit völlig verschiedenen Designs in die Statistik miteinfließen ließ [9]), konnte deKernion 1978 in einer breiten retrospektiven Studie bei 110 Patienten in keinem Fall ein objektives Ansprechen auf eine Hormontherapie nachweisen [20]. 3Ansprechrate: Regredienz oder Stagnation der Gesamttumorzellmasse (soweit mit bildgebenden Verfahren erfassbar) unter der entsprechenden Therapie - 17 1.2.5.4 Immuntherapie des NZK Das NZK, besonders das metastasierende, zeigt sich also als besonders therapierefraktär, so daß schon früh andere therapeutische Prinzipien als die klassischen oben beschriebenen in den Mittelpunkt des Forschungsinteresses rückten. Aufgrund der Beobachtung, daß es im Mittel bei 1% der Patienten zu spontanen Remissionen der Metastasen nach Nephrektomie kommen kann [3; 50; 133], wurde schon frühzeitig eine Kontrolle des Tumorwachstums durch das patienteneigene Immunsystem vermutet und nach therapeutischen Ansätzen auf diesem Gebiet gesucht, s.u.. 1.3 1.3.1 Tumorimmunologie Tumorantigene Schon Paul Ehrlich vermutete die Existenz von Tumorantigenen. Den Beweis dafür führte Gorer 1937/38, er nannte die entdeckten Oberflächenantigene "tumorspezifische Transplantationsantigene (TSTA)" [28]. Mit Hilfe von Experimenten an Mäuse-Inzuchtstämmen wurde gezeigt, daß die Tiere durch Immunisierung mit Tumormaterial gegen das Anwachsen eines nachfolgenden Transplantats des gleichen Tumors geschützt sind [31]. Die TSTA sind "echte" Tumorantigene, die nur auf neoplastischen Zellen erscheinen. Daneben konnte man noch die "tumorassoziierten (Transplantations-) antigene" (TATA) nachweisen, die auf nicht-neoplastischen Zellen nur unter bestimmten Bedingungen der Immuntoleranz exprimiert werden (fetale Antigene etc.). Diese TATA werden auch Differenzierungsantigene genannt, da vermutet wurde, daß frühe Entwicklungsantigene durch den Verlust bestimmter Supressorgene auf den malignen Zellen wieder erscheinen, ja, gerade eine der möglichen Grundlagen der malignen Transformation darstellen [118]. Die Tumorantigene sind oft spezifisch für den Einzeltumor (z.B. bei chemisch induzierten, wie den durch Methylcholanthren hervorgerufenen Tumoren), teilweise aber auch gruppenspezifisch für bestimmte Tumorarten (v.a. virusinduzierte Tumoren). Spontantumoren dagegen scheinen zwar TSTA und/oder TATA zu exprimieren, können damit aber offenbar keine oder nur sehr geringe Immunreaktionen hervorrufen. Am Rande sei bereits hier erwähnt, daß deswegen gerade die - 18 Zellen von Spontantumoren oft Ziel experimentell-therapeutischer "Xenogenisierung", z.B. mittels Viren, geworden sind [105]. Gegen all diese antigenen Determinanten kann man naturgemäß auch eine humorale Immunantwort nachweisen. 1.3.2 Immunreaktion gegen Tumoren Die von Burnet [13] entwickelte Hypothese der "Immune Surveillance" besagt, daß entartete Zellen ("aberrant cells") vom Immunsystem des Wirtes erkannt und eliminiert werden. Demzufolge sollte die Entstehung eines Tumors im wesentlichen durch eine primäre oder sekundäre Insuffizienz des Immunsystems mitverursacht sein. Obwohl diese Hypothese nicht experimentell bestätigt werden konnte - die nicht erhöhte Tumorinzidenz bei "Nacktmäusen" gegenüber normalen Mäusen spricht z.B. dagegen [56] - wurde in den letzten zwanzig Jahren intensiv versucht, das Wechselspiel zwischen Tumor und Immunsystem zu erfassen, vorhandene Effektormechanismen gegen maligne entartete Zellen aufzuspüren sowie, wenn möglich, immuntherapeutische Ansätze daraus zu entwickeln. Das folgende Schema zeigt stark vereinfacht die Immunabwehr, wie sie im Prinzip auch für Tumorzellen als Antigene angewandt werden kann: ! " # Abb.3: Immunologische Tumorabwehr Die grundsätzliche Unterteilung der spezifischen Immunabwehr in humorale und zelluläre Abwehrmechanismen gilt auch für die Immunreaktion gegen Tumorzellen. - 19 Auch hier unterliegt das Zusammenspiel von T-Helfer-Zellen, T-Effektorzellen und Makrophagen letztlich der Kontrolle durch die Gene des "Major histocompatibility complex", die gekoppelt mit den jeweiligen Zielantigenen "selbst" und "nichtselbst" definieren und so die Immunantwort modulieren. Endergebnis der Reaktionen des Immunsystems auf fremde Antigene ist die Ausbildung von Effektorzellen und spezifischen Antikörpern. Der Befund, daß bei Mäusen eine Immunität gegen TSTA durch Übertragung von Lymphknoten- oder Milzzellen, nicht aber durch Serum zu übertragen war, legte nahe, daß diese Immunreaktion vorwiegend zellulär vermittelt ist. Effektorzellen sind die Zytotoxischen T-Lymphozyten, die Immunreaktion ist dem verzögerten Typ (DTH) zuzuordnen [55]. Auch bei Menschen mit Tumoren konnte mit autologen Tumorzellen eine DTH-Reaktion hervorgerufen werden, die in einigen Fällen sogar umgekehrt proportional zur Prognose war, d.h. je heftiger die Überempfindlichkeitsreaktion (systemisch und lokal) nach 36-72 Std. war, desto besser wurde der Tumor vom Immunsystem des Individuums bekämpft [89]. Es gibt allerdings Hinweise darauf, daß auch die Makrophagen und die Natürlichen Killer-(NK-) Zellen an der Tumorabwehr beteiligt sind, entweder unspezifisch oder im Rahmen der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (engl. ADCC) mittels spezifischer Antikörper und der mit Hilfe von Lymphokinen aktivierten T-Lymphozyten [56]. Die humoralen Effektormechanismen können -wie bei anderen Fremdzellen- die Tumorzellen durch Komplement antikörpervermittelt lysieren, durch Opsonisierung die Phagozytose vereinfachen oder durch Antikörper den Verlust der Zelladhäsion erreichen [118]. 1.3.3 Ausweichen des Tumors vor der Immunantwort (Immune-escape) Oft unterlaufen die Zellen eines Tumors die Immunabwehr, so daß es trotz nachzuweisender Immunogenität bestimmter Zellen zu weiterem Tumorwachstum kommt. Durch Antigenmodulation wechselt die Antigenität ständig, der durch Antikörper gegen Tumorantigene erzeugte Selektionsdruck führt sukzessive zur Ausbildung immer weniger immunogener Zellklone, so daß eine spezifische Immunantwort nur sehr insuffizient greift. Zudem wird vermutet, daß Tumorzellen die Suppressorzellreaktion stimulieren können und damit die spezifische Immunabwehr weiter schwächen [56]. - 20 Der Verlust vor allem der MHC-Klasse-I-Antigene ist signifikant mit gesteigertem Tumorwachstum und erhöhter Metastasierungsfähigkeit vergesellschaftet [131]. Tumoren können Antigene von der Zellmembran in ihre Mikroumgebung sezernieren ("Antigen shedding" [141]), diese können durch Blockade der Effektorzellen oder nach Bindung an Antikörper die Zytolyse der Tumorzellen verhindern. Des weiteren besagt die Theorie des "Wegschleichens" ("Sneaking through"), daß sehr kleine Tumorzellmengen das Immunsystem einfach quantitativ unterlaufen können: die Antigenmenge reicht dann für die Entwicklung einer effektiven Immunantwort nicht aus [105; 131]. Ist die Antigenmenge zu groß, führt der gegenteilige Effekt ("overriding") ebenfalls zu einer mangelhaften Kontrolle durch das Immunsystem. 1.3.4 Tumorimmundiagnose Die Immundiagnose von Krebserkrankungen kann auf zwei grundsätzliche Ansätze zurückgeführt werden. Der eine beschäftigt sich mit der Auffindung von Tumormarkern im Serum der Patienten zur Verlaufskontrolle der Erkrankung, während der andere sich mit dem Status der Wirt-Antitumor-Immunreaktion selbst beschäftigt. Die Bestimmung von Tumormarkern im Serum ist längst klinischer Alltag, die Detektion tumorspezifischer Antigene (z.B. im Serum oder im Knochenmark der Tumorpatienten) heute noch nicht möglich. Die Feststellung des Status der Immunreaktion, d.h. der Nachweis des Ausmaßes einer Immunantwort gegen bestimmte Antigene steht noch auf der Stufe des Tiermodells; in der vorliegenden Studie wurde u.a. versucht, eine Antikörperreaktion gegen Tumorzellen mittels Immunfluoreszenz nachzuweisen und, wenn möglich, im Krankheitsverlauf zu quantifizieren. 1.3.5 Tumorimmunologie des NZK Oosterwijk et al. beschrieben 1986 die Entdeckung eines G250 genannten MAK, der ein NZK-Membranantigen erkennt, welches sich in normalem Nierengewebe nicht findet [90]. 1989 beschreiben v. Dijk et al. die Induktion einer T-Zellvermittelten Zytotoxizität durch bi-spezifische MAK, die sowohl dieses NZKassoziierte Antigen G250, als auch das CD3-Antigen der T-Lymphozyten erkennen - 21 [159]. In jüngster Zeit befasst sich eine Anzahl von Studien mit dem diagnostischen und therapeutischen Einsatz von MAK gegen das NZK-assoziierte Antigen G250 [23; 67; 70; 137; 139], s.u. Es ist noch nicht klar, in welchem Maße weitere TSTA und TATA bei Zellen des NZK vorhanden sind. Allerdings lassen viele klinische Beobachtungen die Generierung Immunantwort gegen die Tumorzellen vermuten, so die hohe Rate von Spätrezidiven auch nach Nephrektomie und das oft ungewöhnliche Metastasierungsmuster. Nicht zuletzt diesbezüglich auffällig sind die mit einer Inzidenz von ca. 1% relativ häufigen Spontanremissionen, besonders auch von Metastasen nach Entfernung des Primärtumors [3; 50]. Zudem untermauern viele Studien diese Vermutungen experimentell, so fand Kjaer bei Patienten mit NZK im Gegensatz zu einer Kontrollgruppe in 58% der Fälle eine zelluläre Immunreaktion gegen autologes Tumorgewebe und sogar eine signifikante Korrelation zwischen der Stärke der Immunreaktion und der Abwesenheit von Metastasen [54]. Dies wird auch von anderen Untersuchern bestätigt, Nakano fand mit Hilfe der Mixed lymphocyte culture (MLC) eine Lymphozytenreagibilität gegen autologes Tumormaterial bei NZK-Patienten, die umso schwächer ausfiel, je entdifferenzierter der Tumor war [84]. Auch eine deutlich erhöhte Anzahl tumorspezifischer T-Helferzellen und TEffektorzellen konnte bei NZK-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen nachgewiesen werden [14]. Die Befunde und Versuche zeigen die Bedeutung immunologischer Faktoren für die Entwicklung und den Verlauf des NZK und belegen die potentielle Fähigkeit des Organismus, eine Immunabwehr gegen die Tumorzellen auszubilden. Auch das Hauptproblem der Immuntherapien zeigt sich hier deutlich: je weiter ein Tumor fortgeschritten ist, je entdifferenzierter er ist und je weiter auch eine Metastasierung fortgeschritten ist, desto weniger immunogen ist der Tumor tendenziell dann noch und desto geringer sind dann die Chancen, mit einer spezifischen Stimulation des körpereigenen Immunsystems die Progredienz zu beeinflussen. - 22 1.4 Tumorimmuntherapien Die wichtigsten derzeit erprobten Immuntherapien gegen malignes Tumorwachstum können etwa wie folgt unterteilt werden: 1. Passive Ansätze, bei denen Antikörper (z.B. MAK gegen TSTA/TATA) verwendet werden 2. Immunmodulatorische (restaurative) Ansätze, bei denen versucht wird, postulierte Defizienzen auszugleichen und das Immunsystem mittels Lymphokinen zu beeinflussen (z.B. Interleukin II, Interferone etc.) 3. Adoptive Ansätze, bei denen die Immunkapazität durch den Transfer aktivierter Lymphozyten erweitert werden soll (LAK, TIL) 4. Aktive Ansätze, bei denen das Immunsystem des Tumorträgers spezifisch oder unspezifisch stimuliert wird, um eine Tumorabstoßungsreaktion zu induzieren (ASI) 1.4.1 1.4.1.1 Monoklonale Antikörper Allgemeines Die Idee, die qualitativen und quantitativen Unterschiede der Antigenexpression zwischen normalen und neoplastischen Zellen immuntherapeutisch auszunutzen, ist nicht neu und wurde bereits von Paul Ehrlich erwähnt. Mit der Entwicklung der Hybridomtechnik durch Köhler und Milstein 1975 konnte eine Vielzahl meist muriner MAK in größeren Mengen hergestellt werden, die prinzipiell auch gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sein können. Letztere sind Antigene, die auf Tumorzellen in höherer Anzahl exprimiert sind als auf normalen Zellen [30]. Onkofetale Antigene CEA, CA 125 u.a. Differenzierungsantigene Onkogenprodukte C-RAS, u.a. 260 F9, T 65 u.a. Tumorspezifische Antigene Abb.4: Tumorantigene, eigene Grafik Wachstumsfaktorrezeptoren Transferrin-, EGF-Rezeptor, u.a. - 23 - Die Onkofetalen (Carcinoembryonalen) Antigene sind normalerweise nach der Embryonalentwicklung nicht mehr nachweisbar, werden aber bei einigen Tumoren erneut exprimiert und sogar in die Körperflüssigkeiten abgegeben. MAK gegen diese Antigene werden v.a. in der Verlaufskontrolle bestimmter Tumoren verwandt. Die Wachstumsfaktorrezeptoren, zu denen auch der IL-2-Rezeptor gehört, zeigen vor allem besser die Prognose individueller Tumoren, ihre Blockade kann aber auch das Wachstum der betreffenden Zelle hemmen [58]. Die Differenzierungsantigene und die onkofetalen Produkte sind besonders Ziel von MAK mit therapeutischer Zielsetzung geworden. Unkonjugierte MAK können hier komplementvermittelt oder via ADCC zytotoxisch wirken, mit zytotoxischen, radioaktiven oder biologisch aktiven Substanzen konjugierte MAK könnten die jeweiligen Wirkprinzipien direkt zu den Tumorzellen transportieren [30]. Probleme in der therapeutischen Anwendung von MAK beim Menschen sind v.a. in der murinen Herkunft der MAK begründet. Da Fremdproteine, also auch murine MAK, vom menschlichen Immunsystem sofort als "fremd" erkannt werden [134], wird eine körpereigene Antikörperreaktion hervorgerufen, die die Halbwertszeit der MAK im Körper extrem verkürzt [78]. Außerdem beobachtet man oft eine allergische Typ-III-Reaktion durch Immunkomplexreaktion zwischen Antigen (hier der murine MAK) und dem dagegen gerichteten humanen Antikörper (HAMA), die sich u.a. in Atembeschwerden, Tachykardie, Durchfall, etc. äußern kann und nicht selten zum Abbruch der Behandlung zwingt. Besser verträglich wären diesbezüglich der Einsatz humaner MAK oder gentechnologisch erzeugter chimärer "humanisierter" muriner MAK [7]. 1.4.1.2 Bedeutung von MAK in der Therapie NZK Wie auch in der Therapie anderer Tumoren sind die eingesetzten MAK gegen Antigene/Epitope gerichtet, die auf Tumorzellen nur häufiger (möglichst um einige Zehnerpotenzen) vorkommen als auf Normalzellen [7]. Einige dieser MAK wurden in experimentellen Studien am NZK erprobt, so von Singh et al., der die in-vitro Inhibition des NZK-Tumorzellwachstums durch den Methotrexat-konjugierten MAK DAL K29 beschrieb [135]. Gegen einen Wachstumsfaktorrezeptor war Kochevars MAK 5F4 gerichtet, er war in der Lage, in vitro die Proliferation von Zellen einer NZK-Zellinie zu hemmen [58]. Von Chiou et al. wurde der MAK A6H nach viel- - 24 versprechenden Versuchen im Nacktmausmodell auch bei Patienten mit NZK angewandt [18; 19]. Es verdichten sich die Hinweise, daß mit dem Antigen G250 ein NZK-assoziiertes Antigen charakterisiert werden konnte [90], verschiedene Autoren berichten über Studien zum Einsatz chimärer bi-spezifischer antiG250/antiCD3 MAK. Diese können die Bindung von T-Lymphozyten an G250-Antigen exprimierende NZKTargetzellen und darüber die Lyse der Tumorzellen ermöglichen. Therapiestudien wurden in-vivo allerdings durch die Immunreaktion gegen die injizierten murinen MAK erschwert (HAMA-response) [70; 159]. Diagnostische Anwendungsmöglichkeiten zeichnen sich durch die radioaktive Markierung der G250-MAK mit Jod 131 und nachfolgender Immunszintigraphie [67; 138], sowie durch die Entwicklung immunhistochemischer Nachweismethoden an [139; 140]. 1.4.2 1.4.2.1 Zytokine Allgemeines Für die Tumorbehandlung relevante Zytokine Lymphokine Leukozyten-Interferon (!-IFN) Fibroblasten-Interferon (#-IFN) Immun-Interferon ($-IFN) Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-!) Interleukine, v.a. der T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2 Wachstumsfaktoren (GF), z.B. Epidermal growth factor Platelet-derived growth factor Insulin-like growth factor Kolonie stimulierende Faktoren (CSF) Granulozyten-Makrophagen CSF (GM-CSF) Multi-CSF (Interleukin 3) Granulozyten-CSF (G-CSF) TAB.5: ZYTOKINE [132] - 25 Die beiden für die Tumortherapie momentan bedeutendsten Substanzen sind das Interleukin 2 und das Interferon-!. Sie sollen im Folgenden näher beschrieben werden. Interleukin 2 wurde 1976 von Morgan als T-Zell-Wachstumsfaktor entdeckt und ist ein von T-Helferzellen sezerniertes 15 kD Glycoprotein, das nicht-antigenspezifisch die Proliferation und Entwicklung von spezifisch geprägten Vorläuferzellen in Effektor-T-Zellen stimuliert [88]. Eine Steigerung der Zytotoxizität von T-Zellen, aber auch von NK-Zellen gegen Tumorzellen wurde nach Gabe von IL-2 zunächst bei Mäusen [36], dann auch beim Menschen beschrieben [69]. Atzpodien et al. beschreiben sogar einen signifikanten Anstieg der NK-Zell-Zahlen gerade bei solchen Patienten, die auf eine IL-2/IFN-Kombination mit einer Ansprechrate (= Objective Response, OR) reagiert haben [5]. IL-2 ist bei verschiedenen Tumoren als Monotherapie und in Kombinationen mit Interferon und/oder Zytostatika eingesetzt worden[157], zudem wird es zur in-vitroStimulierung von LAK (s.u.) verwendet. Die Toxizität einer IL-2-Therapie ist allerdings erheblich, beobachtet werden Fieber, Schüttelfrost, Erytheme, Alterationen des Zentralnervensystems und Leberfunktionsstörungen. Die schwerste Nebenwirkung unter IL-2-Therapie ist ein Syndrom der kapillären Leckage, das sich innerhalb von Stunden entwickeln kann und zu Wasseransammlungen im Gewebe, sowie zu intravasaler Hypovolämie führt [132]. IL-2 wird deswegen heute bevorzugt in Kombinationstherapien oder, so auch in der vorliegenden Studie , im Rahmen aktiver Verfahren sehr niedrig dosiert angewandt. Viele biologische Therapieverfahren, so auch die Lymphokintherapien, haben nach Schirrmacher ein Niedrigdosenoptimum und müssen nicht, wie z.B. die Chemotherapeutika, in Dosen gerade unterhalb der Toxizitätsgrenze angewandt werden [118]. Interferon-!, der zweite nicht-antigenspezifische Mediator, dessen tumortherapeutische Wirkung seit längerem präklinisch und klinisch untersucht wird (Übersicht bei [52]), zeigt als klassischer "Biological Response Modifier" ganz verschiedene Wirkmechanismen. So kann man neben einem direkten inhibitorischen Effekt auf das Zellwachstum allgemein eine Reihe immunmodulatorischer Wirkungen nachweisen, so z.B. eine Verstärkung der Zytotoxizität von T-Lymphozyten und NK-Zellen und eine Erhöhung der Antikörperantwort. - 26 Außerdem können Interferone Tumorzellen dazu bringen, mehr MHC-Klasse-IMoleküle und auch Tumorantigene auf der Oberfläche zu exprimieren und sie so angreifbarer für eine Immunreaktion machen [29]. Seit in den letzten zehn Jahren die Entwicklung der rekombinanten DNATechniken die Produktion großer Mengen hochgereinigter Zytokine erlaubt, wurden diese experimentell, dann aber auch im Rahmen zahlreicher Phase-I und -II-Studien in der Therapie vieler Tumoren eingesetzt. 1.4.2.2 Bedeutung der Zytokine in der Therapie des NZK Die ersten Studien mit einem Lymphokin als Monotherapeutikum beim NZK stammen von Quesada, der mit niedrig dosiertem Interferon-! eine OR von ca. 26% erzielte [143]. Dies konnte in späteren Studien nicht ganz bestätigt werden, die Ansprechraten (OR = Komplette Remission, CR, + Partielle Remission, PR) pendelten sich selbst bei Einschluß der minimalen Reaktionen nur bei etwa 16-20% ein [111], Übersicht bei [37]. In neueren Studien wird diese Zahl sogar auf ca. 10 % herabkorrigiert. Im Mittel dauern die Remissionsphasen etwa 10 Monate die für die Patienten erzielbare Lebensverlängerung ist minimal [77]. An Nebenwirkungen von IFN-Monotherapien sind neben Fieber, Abgeschlagenheit und Müdigkeit vor allem Hypotension und Leberschäden beschrieben worden, die zuweilen zum Abbruch der Therapie zwingen, aber in den allermeisten Fällen reversibel sind [99]. Monotherapien mit IL-2 werden aufgrund der hohen Toxizität trotz gewisser positiver Ergebnisse [12] weitgehend nicht mehr durchgeführt [132]. Schon Quesada aber auch viele andere haben früh versucht, Interferon-! mit Zytostatika (meist Vinblastin, einem Agens mit beschriebener anti-NZK-Wirkung) zu kombinieren. Obwohl es hierzu Studien mit beobachteten synergistischen Effekten gibt [17], überwiegen bei weitem diejenigen Studien, die vor allem auf längere Sicht hier keinen therapeutischen Vorteil feststellen konnten [24; 143]. - 27 Dagegen scheinen Kombinationen von !-IFN mit IL-2 die Toxizität gegenüber Monotherapien mit den beiden Präparaten nicht nur senken zu können, sondern auch die Wirkung synergistisch verbessern zu können [165]. Deswegen bilden diese Kombinationen zunehmend die Grundlage für zahlreiche Phase-II-Studien [20]. Atzpodien et al. berichteten 1993 sogar von einer Remissionsrate von 48% (17/35) bei Anwendung einer Kombinationstherapie aus IL-2, !-IFN und 5-Fluoruracil [4], eine kontrollierte Bestätigung bleibt hier abzuwarten. Agens, Dosis Pat.-zahl CR PR %OR !-IFN, 10x106 U/m² !-IFN, 30x106 U/m² 26 20 0 0 7 1 16,6 5,0 !-IFN, 36x106, Vin, 0,1 mg/kg, alle 3 Wo. !-IFN, 18x106, Vin, 0,1 mg/kg, alle 3 Wo. 18 18 0 0 6 2 33,3 11,1 IL-2, 5T. je 105 U/kg, dann LAK/IL-2/8-Std. IL-2, 5T. je 105 U/kg, dann LAK/IL-2/8-Std. 36 35 4 2 8 3 33,3 14,2 IL-2, 3x106 U/m², 5Tage/Wo., für 5 Wo. IL-2, 105 U/kg alle 8 Std. + tägl. Bolus 10 16 1 0 2 0 33,3 0 TAB.6: ERGEBNISSE VON STUDIEN ZU ZYTOKINTHERAPIEN [37] Abk.: U: Einheiten (Units) kg, bzw. m²: kg Körpergewicht, bzw. m² Körperoberfläche Vin: Vinblastin Die Tabelle soll zitathaft verdeutlichen, daß zu jeder ermutigenden Zytokin-Studie jedweder Kombination mindestens eine ernüchternde zu finden ist und daß aufgrund der geringen Patientenzahlen bisher keinesfalls allgemeingültige Aussagen zu machen sind. Wie bei den meisten Immuntherapien zu beobachten, existieren besonders bei den Lymphokintherapien bestimmte prognostische Parameter, die für hohe Ansprechraten besonders prädestinieren: Patienten mit hohem Karnowsky-Index (>80%), solche, die solitäre Lungenmetastasen aufweisen, aber interessanterweise auch Patienten, die im Jahr vor der Immuntherapie nephrektomiert wurden, schneiden im Therapieergebnis signifikant besser ab [77; 111]. Muss bringt die damit verbundenen Probleme auf den Punkt: die idealen Immuntherapie-Patienten sind eigentlich die mit normalem Karnowsky-Index und begrenzten - 28 kleinen Metastasen, die also auch ohne Therapie noch lange weitgehend asymptomatisch weiterleben würden. Gerade diesen aber schlägt man dann bevorzugt eine langwierige stark beeinträchtigende Therapie zur zweifelhaften Verbesserung der Langzeitprognose vor [82]. 1.4.3 1.4.3.1 Adoptive Immuntherapien mit LAK bzw. TIL Allgemeines 1985 berichteten erstmals Rosenberg et al. von Ergebnissen einer neuen adoptiven Immuntherapie bei fortgeschrittener Tumorerkrankung mit Lymphokin-aktivierten Killer-Zellen (LAK), die zusammen mit IL-2 gegeben wurden. LAK sind lymphatische Zellen (wahrscheinlich eine Subpopulation der Natürlichen Killer-Zellen, NK), die nach in-vitro-Kultivierung über mehrere Tage in Anwesenheit von IL-2 die Fähigkeit erwerben, Tumorzellen abzutöten Die Lymphozyten wurden durch Leukapherese des Patientenblutes und eine anschließende Ficoll-Gradientenzentrifugation gewonnen und zusammen mit recht hohen Dosen von bis zu 3*106U/m² Körperoberfläche IL-2 täglich reinfundiert. Zunächst wurden bei 25 Patienten Remissionsraten von fast 50% (10 PR bei einer CR) beschrieben [108]. Bis 1988 konnten dann 139 Tumorpatienten, davon 54 mit NZK, behandelt werden. Die nach den Anfangserfolgen hohen Erwartungen konnten auch hier wieder nicht ganz erfüllt werden. Denn trotz einer OR von etwa 33% waren die Remissionen von so kurzer Dauer, daß der Einsatz eines so aufwendigen und auch belastenden Verfahrens in Frage gestellt werden mußte [110]. Wegen der sehr kurzen Halbwertzeit des rekombinanten humanen IL-2, die in vivo ca. 5 min beträgt, ist eine kontinuierliche i.v.-Dauerinfusion hoher Dosen notwendig, um den aktivierten tumoriziden Status der adoptiv transferierten Zellen aufrechtzuerhalten. Die Dosen und damit auch die toxischen Nebenwirkungen reichen an die einer IL-2-Monotherapie heran. Eine vielversprechendere Anwendung von adoptivem Zelltransfer mit IL-2 scheint dagegen die Kombination mit Tumor-infitrierenden Lymphozyten (TIL) zu sein, eine Lymphzytenpopulation, die nach längerdauernder Kultivierung von enzymatisch präparierten Tumorzellsuspensionen mit IL-2 gewonnen wird. Dabei - 29 werden die Tumorzellen nach kurzer Zeit von den stimulierten proliferierenden TLymphozyten lysiert und man erhält eine Lymphozytensuspension, von der man eine gleiche zytotoxische Wirkung auch in vivo erwartet. Topalian beschrieb 1988 erstmals ihre therapeutische Anwendung bei humanen Tumoren [154]. Immunologische Grundlage dieser Präparationstechnik ist die Beobachtung, daß die meisten Tumoren mehr oder weniger stark von lymphoiden Zellen infiltriert sind, die, im Gegensatz zur Zusammensetzung des peripheren Blutes, eine eindeutige Prädominanz für aktivierte CD8+ T-Lymphozyten aufweisen. Es konnten auf ihnen zahlreiche Marker der T-Zell-Aktivierung, wie das MHC II-Molekül HLA-DR, der Transferrin-Rezeptor oder das CD25-Antigen (IL-2-Rezeptor) nachgewiesen werden [153], so daß der Schluß nahe lag, hier eine durch Tumorantigene sensibilisierte Lymphozytensubpopulation zu vermuten. Während es sich also bei den LAK hauptsächlich um aktivierte NK-Zellen handelt, sind TIL wahrscheinlich spezifisch aktivierte zytotoxische T-Lymphozyten, die größere Spezifität gegenüber dem Target aufweisen und die in der Lage sind, im Körper zu rezirkulieren und verbliebene Tumorzellen zu finden und zu lysieren[20]. Schirrmacher et al. haben dies 1991 auch im Tiermodell (ESb-Lymphom bei Mäusen) nachweisen können, indem sie MHC-syngene anti-ESb-T-Zellen transferierten und damit Mikrometastasen spezifisch eliminieren konnten [126]. 1.4.3.2 Bedeutung von LAK und TIL in der Therapie des NZK Unter den ersten Patienten mit Teilremissionen in der Pilotstudie von Topalian befand sich auch ein NZK-Patient, bei dem durch die Behandlung die Masse eines Lymphknotenmetastasenpaketes eindeutig reduziert werden konnte. Daraufhin konnten einige Phase I/II-Studien begonnen werden, die von tendenziell um 20% Remissionsraten -bei allerdings sehr kleinen Patientenkollektiven- berichten [37]. Allerdings gibt es mittlerweile auch Autoren, die die Spezifität von TIL nach in-vitro-Versuchen gerade bei NZK-Zellen bezweifeln [46]. Belldegrun und de Kernion haben 1992 eine Pilotstudie begonnen, die die Antitumor-Aktivität einer Kombination von TIL, in vivo mit Interferon vorbereitet, einer kontinuierlichen IL-2-Infusion und subkutan injiziertem IFN-! beim NZK untersuchen soll [20]. - 30 Rosenberg hat sich in neueren Studien mehr auf die Therapie des Melanoms konzentriert [51]. Auch die experimentelle Möglichkeit einer Therapie mit genmanipulierten, z.B. mit dem Interleukin-2-Gen transfizierten TIL, steckt noch in der vorklinischen Erprobungsphase [107; 110]. 1.4.4 1.4.4.1 Aktive spezifische Immuntherapien Allgemeines Schutzimpfungen sind eine der größten Errungenschaften der Medizin im Kampf gegen gefährliche Infektionskrankheiten; die Krankheitserreger, gegen die immunisiert wurde, werden bei einer Infektion sofort vom Immunsystem erkannt und bekämpft. Die Immunogenität von Tumorzellen dagegen ist im allgemeinen so schwach ausgeprägt, daß eine mögliche Immunantwort das Tumorwachstum nicht stoppen kann. Diesem Dilemma versucht man durch geeignete Manipulationen entgegenzuwirken. Durch Infektion der Tumorzellen mit bestimmten Viren oder durch Zugabe bestimmter immunologischer Adjuvantien soll erreicht werden, daß die Immunogenität der Tumorzellen erhöht wird [117]. Voraussetzungen für die Entwicklung von Tumorvakzinen, die im praktisch klinischen Alltag anwendbar sind: " " " " Die Vakzine sollte sicher sein, also nicht ihrerseits Risiken z.B. der Infektion bergen und nur geringe Nebenwirkungen hervorrufen Die Vakzine sollte so viele tumorassoziierte Antigene wie möglich enthalten, wenn nötig zusammen mit immunstimulierenden Adjuvantien Vakzinen mit einem breiten Antigenspektrum sind erforderlich, um dem Problem der antigenen Heterogenität und der Selektion von Immune-escapeVarianten zu begegnen Zeit und Arbeitsaufwand zur Vakzineherstellung sollte die klinische Überprüfung in größeren Patientenkollektiven erlauben - 31 1.4.4.2 Tiermodelle für eine Tumorimmunisierung Schon früh wurde versucht, geeignete Tiermodelle für die Erprobung einer Tumorimmunisierung zu entwickeln. Die beiden wichtigsten sind in Abb.5 dargestellt, es handelt sich um das L10-Leberkarzinom des Meerschweinchens, beschrieben von Hanna et al. [33; 35] und das ESb-Lymphom der Maus, das von Schirrmacher et al. verwendet wurde [124]. Aus der Literatur und aus den Modellversuchen ließen sich folgende Postulate für eine aktive spezifische Immunisierung mit autologen Tumorzellen herleiten: Die Immunogenität eines Antigens korreliert offenbar mit dessen Größe [49] und wird durch die Art des Adjuvans entscheidend mitbestimmt [48]. Deswegen wurden für Immunisierungsversuche meist komplette autologe Tumorzellen verwendet, wobei sich lebende Zellen wiederum stärker immunogen zeigten als abgetötete Zellen [97]. Wegen der Gefahr des Anwachsens müssen sie allerdings unbedingt inaktiviert sein [33]. Suspensionen aus Zellmembranfragmenten waren nicht in der Lage, eine äquivalente Wirkung zu erzielen, gemessen an der DTH und der Anzahl und dem Aktivierungsgrad [169] von zytotoxischen T-Lymphozyten in der Bauchhöhle der gesundeten Tiere. Im Schwamm-Matrix-Modell Schirrmachers wurden diese als Effektorzellen der antineoplastischen Immunantwort nachgewiesen [168]. In den unterschiedlichen Tumorsystemen scheint ein Adjuvans, bestehend aus etwa 107Tumorzellen und den adjuvanten Agentien, intradermal appliziert, die beste Wirkung zu erzielen [119]. - 32 - Tier-Tumor-Modell Maus Meerschweinchen mit L-10-Leberkarzinom; metastasiert mit ESb-Lymphom; metastasiert hämatogen lymphogen bevorzugt in die Lunge bevorzugt in Leber, Knochen und Lunge Tumorzellen zur Impfstoff-Herstellung Gewinnung aus Tumor durch enzym.Vereinzelung der Zellen oder Aszites-Zellen Aszites-Zellen oder kultivierte Tumorzellen Lagerung in flüssigem Stickstoff (-196°C) in flüssigem Stickstoff (-196°C) Inaktivierung Strahlendosis von 200 Gray Strahlendosis von 100 - 200 Gray Verstärkung der Immunogenität Zumischen von Bakterien: Infektion mit Viren: 10-100 mio. BCG auf 10 Mio. 10-100 Mio. NDV auf 10 Mio. Tumorzellen pro Einzeldosis Tumorzellen pro Einzeldosis Impfung am Primärtumor operierte Tiere mit Metastasen keine Impfung 5% Überlebende Impfung 2-3 mal in die Haut 45% Überlebende Abb.5: Tiermodelle [33; 35; 124] Impfung 2-3 mal in die Bauchhöhle 50-80% Überlebende keine Impfung 0-20% Überlebende - 33 1.4.4.3 Adjuvantien in der Tumortherapie Adjuvantien (lat.: adiuvare = helfen) sind Substanzen, die eine spezifische Immunantwort auf ein Antigen unspezifisch verstärken, wenn sie mit diesem zusammen dem Organismus zugeführt werden. Für die maximale Wirkung sollte das Adjuvans mit dem Antigen zusammen intradermal oder intramuskulär appliziert werden. Seit den zwanziger Jahren hat man immer wieder Rückbildungen von Tumoren im Zusammenhang mit Virusinfektionen (wie z.B. Masern oder Mumps) beobachtet. Man untersuchte verschiedene Virusarten auf ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit. Cassel ging davon aus, daß Viren diese über einen onkolytischen Mechanismus bewerkstelligen [15]. Die moderne Immunologie konnte jedoch nachweisen, daß es sich um eine immunologische Tumorbekämpfung handelt, in der die Viren als Adjuvantien anzusehen sind. Neben dem unten näher beschriebenen NDV wurden hierbei noch eine Reihe anderer Substanzen eingesetzt, wie z.B. Bakterienextrakte (Corynebakterium parvum, Bacillus Calmette-Guérin u.a.), Levamisol, Hefeextrakte (Candida albicans) und Mineralsalze wie Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDA). Klassische immunologische Adjuvantien, wie z.B. das Freund´sche Adjuvans, sind für die intradermale Vakzinationstherapie dagegen meist zu toxisch für den Patienten. 1.4.4.4 NDV als Adjuvans - Struktur und immunologische Funktion Das NDV gehört zur Gruppe der Myxoviridae und ist ein RNA-Virus, das mit einer Doppellipidschicht umgeben ist [109]. Es trägt auf seiner Oberfläche spikeförmig aus der Membran hervorragende Moleküle, vor allem das Adhäsionsmolekül Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und ein Fusionsprotein. Ersteres agglutiniert z.B. Hühnererythrozyten, was einen gut quantifizierbaren Vorgang darstellt. Als Maß für die Virusmenge wurde daher die "Hämagglutinierende Einheit" (engl. HAU) eingeführt. Das intakte Viruspartikel ist nahezu sphärisch und weist einen Durchmesser von ca. 100 nm auf. Bei der elektronenoptischen Beobachtung sind aber auch Ausziehungen bis zu 500 nm Länge aufgefallen, die vermutlich durch die Präparation zustande kommen [4]u.a.. Der Vorgang der Adhäsion, Fusion und Penetration der Viren nimmt nur wenige Minuten in Anspruch [76], so daß davon - 34 auszugehen ist, daß nach 30 min langer Inkubation (wie z.B. in der hier berichteten Studie) die Viruscapside mit der Zelloberfläche verschmolzen sind und die RNA sich bereits in DNA umgewandelt repliziert. Der in unserer Studie verwendete NDV-Stamm "Ulster" hat zudem noch die Eigenschaft, daß nach Erstinfektion keine kompletten Viruspartikel mehr gebildet werden können. Das Virus hat ein breites Wirtsspektrum unter Vögeln, ist aber beim Menschen in aller Regel apathogen und ruft nur sehr ausnahmsweise bei besonders exponierten Personen Konjunktivitis und eine Störung des Allgemeinbefindens hervor [113]. Der Stamm "Ulster" ist selbst diesbezüglich unbedenklich, dauerhafte Schäden sind noch nie beschrieben worden. Cassel beschrieb das NDV bereits 1965 als antineoplastisches Agens [15]. Beverley berichtete von Tiermodellstudien, in denen er nach Immunisierung mit einer Vakzine aus Tumorzellen und NDV in Mäusen Immunität gegen die vitalen Tumorzellen nachweisen konnte [8]. Cassell legte vor allem Studien über die Anwendung der Viren in der Therapie des malignen Melanoms vor[16]. Schirrmacher veröffentlichte mehrfach Ergebnisse von Studien zum Substrat dieser antineoplastischen Eigenschaften des NDV. Er fand neben der "Xenogenisierung" der Tumorzellen durch Expression von NDV-Antigenen [120] eine deutliche Erhöhung der tumorspezifischen T-Zell-Antwort, ohne daß eine spezifische anti-virale Immunantwort nachgewiesen werden konnte [114; 161]. Zudem erhöht eine NDV-Infektion offenbar die Produktion des Tumor-Nekrosefaktor-! (TNF-!) sowohl bei menschlichen Blutmonozyten, als auch bei Milzzellen von Ratten und erhöht die Sensibilität der Tumorzellen gegenüber den zytolytischen Effekten dieses Zytokins[68]. Außer der Bildung von TNF induziert es auch die Produktion von IFN, ACTH, Stress-Proteinen u.a. [127]. Die Anwesenheit von virusinfizierten Zellen regt zudem die Produktion von Interleukinen und Interferonen an, ein durchaus nützlicher Nebeneffekt. In einer umfangreichen "Charakterisierung einer NDV-modifizierten Tumor-ZellVakzine" demonstrierte Liebrich die molekularbiologischen und labortechnischen Eigenschaften einer Vakzine mit dem Stamm "Ulster" des NDV: Adsorption und Penetration in Zellmembranen von Zielzellen wies er durch elektronenmikroskopische Beobachtungen nach. Mit entsprechenden MAK zeigte er, daß auf den dissoziierten Tumorzellen die MHC-Moleküle in gleicher Weise wie auf Gefrierschnitten - 35 des Tumors exprimiert sind. Bei bestrahlten Tumorzellen zeigte er deren Unfähigkeit zur Proliferation. Bei gleichwohl einem guten Drittel der Zellen war die metabolische Aktivität erhalten [65]. 1.4.4.5 ASI in der Therapie verschiedener Tumoren Seitdem Anfang der siebziger Jahre Tallberg u. Tykkä beim NZK und Cassel beim malignen Melanom die ASI erstmals als adjuvante Therapie am Menschen erprobt hatten, wurden Studien mit unterschiedlichen Ansätzen bei verschiedenen Tumoren durchgeführt. In bezug auf das maligne Melanom konnte Cassel nach mehrjährigen (allerdings nicht prospektiv randomisierten) Studien eine signifikant verringerte Progressionsgeschwindigkeit des Tumorleidens in der ASI-Therapiegruppe gegenüber einer Kontrollgruppe nachweisen. Er setzte hierbei ein NDV-Onkolysat von Lymphadenektomiepräparaten als Vakzine ein, das er durch Inkubation der Tumorzellen mit Viruspartikeln eines lytischen NDV-Stammes gewinnen konnte [16; 81]. Davon ausgehend haben Hersey et al. Patienten mit einem Vaccinia-Melanom-ZellLysat mit ähnlich ermutigenden Erfolgen behandelt [40; 41], was auch mehrere Autoren bestätigen konnten [145]; u.a., so daß man bezüglich des Melanoms sicherlich noch ausgedehntere Studien erwarten kann. Auch zum Colorektalen Karzinom haben v.a. die Arbeitsgruppen von Hanna und Schirrmacher die ASI in zahlreichen Studien erprobt, teilweise mit ebenfalls recht ermutigenden Ergebnissen [10; 44; 64; 128]. Die einzige Studie mit größeren Patientenzahlen von Wunderlich et al. konnte allerdings keinen Vorteil der Patienten der ASI-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe feststellen [167]. Zu Vakzinierungen in der Zusatztherapie verschiedener anderer humaner Karzinome liegen meist Phase-I-Studien vor, so u.a. zum Scheidenkarzinom [26], dem Bronchialkarzinom [43], dem Magenkarzinom [144] und dem Ovarialkarzinom [1], ohne daß der ASI eine eindeutige prognoseverbessernde Wirksamkeit bei diesen Tumoren zugesprochen werden konnte. - 36 1.4.4.6 ASI beim NZK Tallberg und Tykkä hatten schon seit 1971, angeregt durch Berichte bei anderen Tumoren, damit begonnen, die NZK-Patienten in fortgeschritteneren Stadien nach Nephrektomie mit einer aktiven Immunisierung nachzubehandeln. Sie stellten aus den Zellen des Primärtumors Homogenisate her und versetzten sie mit Tuberkulin-, bzw. Candida-albicans-Antigenen. Die Patienten wurden monatlich bis zu 2 Jahre lang mittels intrakutaner Injektionen behandelt. Hauptkriterium für die Aufnahme in die Studie war der fortgeschrittene Status des Tumorleidens (Patienten nach "eindeutig palliativer Nephrektomie"). Als Kontrollgruppe diente retrospektiv eine nicht mit ASI behandelte Patientengruppe mit möglichst ähnlichen Tumordaten. Sowohl erste Zwischenergebnisse [155; 156], als auch die von 1984 an regelmäßig erscheinenden "Long-term-follow-up´s" [146; 147] wiesen eine signifikante Verbesserung der Prognose des Tumorleidens in der mit ASI nachbehandelten Gruppe nach. So berichteten sie von einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 25% gegenüber ca. 5% in der Kontrollgruppe. Die gesamte durchschnittliche Überlebenszeit lag mit ca. 45 Monaten mehr als doppelt so hoch wie in der Vergleichsgruppe (ca. 20 Monate). Aufgrund dieser recht guten Ergebnisse folgte eine ganze Reihe ähnlicher Studien, Neidhart setzte BCG als Adjuvans ein [86], andere Studien verwendeten Dimethydioctadecylammoniumbromid (DDA) [98] oder Candida albicans [57; 100] in jeweils ähnlichen Studiendesigns als adjuvante Substanzen. Die Ergebnisse wurden jeweils als vorsichtig ermutigend eingestuft. McCune et al. führten erstmals prospektiv randomisierte Studien zur ASI mit bestrahlten Tumorzellen und Corynebakterium parvum als Adjuvans bei Patienten mit metastasierten NZK durch. Diese wurden versus Hormontherapie durchgeführt und konnten eine signifikante Lebensverlängerung in der ASI-Gruppe bei gleichwohl geringer Ansprechrate nachweisen. So lebten nach 24 Monaten noch 18 von 56 Patienten der ASI-Gruppe (2/20 Pat. der Hormongruppe), während die Ansprechrate nur 6/56 (1/20) betrug [73-75]. Mitte der achtziger Jahre kamen einige ernüchternde Studien zur Veröffentlichung, so z.B. die Arbeit von Fowler, der bei 23 mit ASI nach der Tallberg´schen Methode nachbehandelten NZK-Patienten nur von 2 "minimalen Respondern" berichtet [25], und die von Rauschmeier, der die berichteten Lebenszeitverlängerungen in seiner Studie nicht bestätigt sah [100]. - 37 Kurth et al. berichteten 1987 bei 33 Patienten, die mit einer autologen Tumorvakzine mit Corynebakterium parvum als Adjuvans behandelt wurden, von einer objektiven Ansprechrate von 24%, ohne statistisch signifikante Unterschiede bei der mittleren Überlebenszeit zu beobachten. Festzuhalten bleibt jedoch, daß die Studien mit großen Patientenzahlen [112; 148] eher positive Ergebnisse im Sinne der Wirksamkeit der ASI beim NZK liefern. Da gleichzeitig Mitte der achtziger Jahre die immunologisch-theoretischen Grundlagen der ASI anhand von Tierversuchen untersucht und ihre Wirksamkeit theoretisch bewiesen werden konnte [33; 124], s.o., war besonders in bezug auf das NZK die Grundlage für zahlreiche weitere Phase-II-Studien geschaffen. So erzielten z.B. Schärfe et al. besonders gute Ergebnisse in der Behandlung von NZK-Patienten mit Leber- und Lungenmetastasierung, während Patienten mit Knochen- oder ZNS-Metastasen kaum reagierten [112], eine Beobachtung, die sich mit den Ergebnissen anderer Immuntherapien deckt, s.o.. McCune wies 1990 mit einer Corynebakterium-parvum-Vakzine nach, daß Patienten mit positiver Hautreaktion (DTH) nach intrakutaner Injektion der Vakzine den deutlich besseren Krankheitsverlauf zeigen, verglichen mit Patienten mit kleiner oder ohne DTH. Er schließt daraus, daß mit Hautreaktionstests auf autologe Tumorzellen diejenigen Patienten selektiert werden könnten, die besonders gut auf eine ASI ansprechen. In neuester Zeit sind es vor allem die Arbeitsgruppen von Pomer (Heidelberg) und Atzpodien (Hannover), die die Studien mit der ASI am NZK vorantreiben. Erstmals nehmen beide Gruppen auch nicht-metastasierte Fälle ins Studiendesign mit auf, beide arbeiten mit NDV-modifizierten Tumorzellen und unterstützen die intrakutanen Applikationen mit IL-2, bzw. IFN-a. Pomer beobachtete 7 OR bei 23 Patienten, zusätzlich 7 "stable diseases" [95], Atzpodien behandelte 72 Patienten ohne nachweisbare Metastasen und kam zu dem Ergebnis, daß die ASI das krankheitsfreie Überleben bei NZK-Patienten eindeutig günstig beeinflußt. Die Aufnahme nicht-metastasierter Fälle begründet sich außer in der praktisch-urologischen Erfahrung vor allem in den Arbeiten Hannas [33; 34] und Schirrmachers [38; 123; 160], die feststellen, daß eine Immuntherapie grundsätzlich umso erfolgversprechender ist, je kleiner die zu bewältigende zurückbleibende Tumorzellast im Körper ist. Für das NZK folgern sie daraus: - 38 1. Die Nephrektomie ist nicht nur zur Gewinnung von Tumorzellen, sondern auch zur Verkleinerung der Tumorlast unerläßlich. 2. Die vielfach nachgewiesene Mikrometastasierung gebietet es, besonders Patienten mit lokal begrenzten, aber vermutetem mikrometastasierten NZK als Zielgruppe der ASI zu definieren. 3. Die chirurgische Therapie von Makrometastasen, besonders solitärer in Leber und Lunge und die anschließende ASI mit Tumormaterial aus den resezierten Metastasen erscheint als rationale Intervention. Alle Autoren, die sich mit der ASI allgemein und speziell mit der des NZK beschäftigt haben, stimmen in einem grundlegenden Ergebnis überein: Die ASI ist, abgesehen von leichten Hautrötungen und vorübergehender leichter Temperaturerhöhung, praktisch nebenwirkungsfrei und ist zudem dem Patienten als Verstärkung eines körpereigenen Therapieverfahrens leicht vermittelbar. Die im Vergleich zu anderen Therapien (z.B. IL-2, IFN) niedrigen Behandlungskosten sind ein weiteres Argument dafür, daß bei einem Nachweis ähnlicher Wirksamkeit in größeren Studien die ASI sicherlich als Routinealternative in der postoperativen Behandlung des NZK anzusehen ist. - 39 - 2 Methoden und Materialien 2.1 2.1.1 Klinische Studie, Vorphase Planung des Studienkonzeptes Schon seit einigen Jahren wurden in der AG von Professor Falkenberg der Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie an der Ruhruniversität Bochum Studien zur aktiven spezifischen Immunisierung von Patientinnen und Patienten mit fortgeschrittenem NZK durchgeführt. So wurde 1984 in Zusammenarbeit mit der Urologischen Universitätsklinik Bochum im Marienhospital Herne (Direktor: Professor Dr. Senge) eine Phase-II-Studie zur Tumorimmunisierung begonnen [32]. Trotz eher ernüchternder Ergebnisse dieser ersten Versuche wurde 1989 auch wegen der sich häufenden ermutigenden Berichte in der internationalen Fachliteratur eine neue Studie mit stark modifizierter Methodik begonnen. Grundlage dieser Methodik war zunächst das von Schirrmacher et al. nach umfangreichen Tiermodellstudien [116; 121; 124] vorgeschlagene und von PD. Dr. Pomer et al. [95; 96] für Humanstudien modifizierte Protokoll der Tumoraufarbeitung zu Vakzinierungszwecken [120]. Die Grundpfeiler dieser Methode sind die unmittelbare Aufarbeitung autologer Tumorzellen (meist Operationspräparat), die Inkubation mit dem seit langem als antineoplastischen Agens [15] beschriebenen hier als Adjuvans verwendeten NDV und die streng intrakutane Applikation des zuvor mittels Bestrahlung inaktivierten Impfstoffs. Beteiligt sind neben der Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie an der Ruhruniversität Bochum und der Urologischen Klinik des Marienhospitals in Herne seit 1991 auch die Urologische Universitätsklinik Münster. Ferner haben die Radiologische Abteilung des Marienhospitals (verantwortlich für die Bestrahlung der Zellen) und das Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Ruhruniversität Bochum (Durchführung der Sterilkontrollen der hergestellten Vakzine) bei der Durchführung mitgearbeitet. Zusammen mit der Ethikkommission der Ruhruniversität Bochum wurde die Immunisierung von zunächst 40 Patientinnen und Patienten mit NZK geplant. - 40 2.1.2 Ein- und Ausschlußkriterien der Studie Als Einschlußkriterien bezüglich der Patientendaten wurden definiert: % histologisch gesichertes NZK % Stadium pT2 ab 4 cm Durchmesser, alle pT3 und pT4, alle N- und MStadien Als Ausschlußkriterien wurden festgelegt: % Tumorstadium pT1 oder pT2 kleiner 4 cm Durchmesser % Karnowski-Index kleiner 604 % Keimnachweis in den Sterilkontrollen der jeweiligen Vakzine % Maligner Zweittumor % Schwangerschaft % Alter unter 18 Jahren % Fehlende Bereitschaft des Patienten zur Zusammenarbeit % Hormon-, Zytostatika- oder Radiotherapie in den letzten 6 Monaten (ausgenommen hormonelle Kontrazeptiva) % Fehlende schriftliche Einwilligung Den Abbruch der Therapie wurde gefordert bei: % Schweren lokalen Nebenwirkungen der Injektionen wie Allergien oder Ulzerationen % Systemischen Nebenwirkungen stärkerer Art (obgleich solche bisher nie beobachtet wurden) % Rückzug der Einwilligung durch den Patienten % Eindeutig belegter Tumorprogression unter der Therapie 2.1.3 Patienten Zwischen Februar 1990 und Dezember 1994 konnten 39 Patienten, die mit fortgeschrittenen NZK in den Kliniken von Herne oder Münster aufgenommen wurden und auch sonst alle Einschlußkriterien für die Teilnahme an der Studie erfüllten, für die Studie rekrutiert werden. Sobald die Tumoraufarbeitung erfolgreich war, d.h. die für eine Immunisierungstherapie erforderlichen Zellmengen ohne bakterielle Verunreinigungen gewonnen werden konnten, wurden die Patientinnen und Patienten umfassend über das Konzept der Studie und auch über deren experimentellen Charakter, sowie über möglicherweise zu erwartende 4Klinisch-onkologischer Index, der Tumorpatienten von 100% (ohne Symptome) bis 0% (Patient ist tot) einteilt; Unter 60% benötigt der Patient ständig Unterstützung und medizinische Versorgung. - 41 Nebenwirkungen aufgeklärt. Eine schriftliche Einwilligung zur Durchführung einer aktiven spezifischen Immuntherapie war anschließend abzugeben5 Die Tabelle zeigt relevante präoperative Daten der behandelten Patienten: Patient Geschlecht Alter W.R. w 65 E.F. w 53 R.L. m 33 H.H. w 65 A.F. w 61 C.H. m 54 H.M. w 65 H.K. w 57 W.H. m 57 A.H. w 63 G.F. m 72 F.S. m 46 U.M. m 52 M.B. w 59 W.S. m 77 H.S. m 51 M.M. m 62 W.M. m 55 K.O. m 62 K.S. m 65 K.W. m 65 H.D. w 55 K.L. m 55 K.S. m 55 M.D. w 61 A.G. w 37 W.S. m 60 B.H. m 62 H.F. m 50 M.M. w 62 B.H. m 57 W.C. m 73 G.E. w 68 B.B. w 56 H.S. w 72 V.S. w 66 E.W. w 63 E.B. m 67 F-W. V. m 51 OP-Dat. TNMG-Status Fa-Nr. 05.02.1990 pT2, N0, M0 (M1), G2 1 22.02.1990 pT3, N0, M0, G3 2 13.03.1990 pT3, N0, M0, G3 3 27.03.1990 pT2, Nx, M0, G2 4 21.05.1990 pT2, Nx, M0, G2 5 03.07.1990 pT4, N2, M1, G3 6 27.07.1990 pT3, N0, M1, G2-3 7 19.10.1990 pT3, Nx, Mx, G2 8 27.11.1990 pT2, Nx, Mx, G1 9 08.02.1991 pT2, Nx, Mx, G1 10 26.04.1991 pT3b, N1, Mx, G2 11 29.08.1991 pT3, Nx, Mx, G2 12 18.10.1991 pT4, N2, M1, G3 13 11.11.1991 pTx, Nx, Mx, G1 14 18.11.1991 pT3, Nx, Mx, G1 15 10.12.1991 pT2, Nx, M1, G2 16 23.12.1992 pT3, N2, M1, G1 17 10.01.1992 pT3, Nx, Mx, G2 18 13.01.1992 pT3, Nx, M1, G2 19 27.01.1992 pT3a, Nx, Mx, G2 20 30.01.1992 pT4, Nx, M1, G3 21 10.02.1992 pT3, N+, M+, G2 22 18.02.1992 pT3, N0, Mx, G2 23 09.03.1992 pT2, Nx, Mx, G2 24 10.04.1992 pT3, N0, Mx, G3 25 24.04.1992 Paragangliom 26 17.06.1992 pT3, Nx, Mx, G2 27 22.06.1992 pT3, Nx, M1, G2 28 24.06.1992 pT3b, Nx, M1, G3 29 29.07.1992 pT2, Nx, Mx, G2 30 02.09.1992 pT3, Nx. Mx, G231 08.10.1992 pT3, Nx, Mx, G1 32 17.05.1993 pT3, Nx, M0, G2 33 24.08.1993 pT3a, Nx, Mx, G2 38 23.09.1993 pT3a, Nx, M0, G2 43 05.10.1993 pT2, N0, M0, G2 44 04.11.1993 pT2, N0, M0, G1 45 08.11.1993 pT3b, N0, M0, G2 47 07.12.1993 pT3a, N0, M0, G2 50 TAB.7: ERSTE STUDIENPHASE, PATIENTENDATEN 5Als Formular vorgelegt, in dem die Grundsätze der Therapie noch einmal verständlich dargelegt wurden - 42 2.1.4 Kontrollgruppe Es wurde aus dem Patientengut der Urologischen Klinik des Marienhospital in Herne nach der "matched-pairs-Technik" retrospektiv eine Kontrollgruppe zusammengestellt. Es handelte sich dabei um Patienten, die im Zeitraum zwischen 1990 und 1992 nephrektomiert wurden und bei denen histologisch ein NZK gesichert werden konnte. In keinem der Fälle wurde Tumormaterial postoperativ für eine mögliche ASI aufgearbeitet, andere adjuvante postoperative Therapien werden später erwähnt und entsprechend bewertet. Es wurde versucht, zu jedem einzelnen unserer Patienten möglichst einen "Symptomzwilling" zu finden, der vor allem in den Merkmalen Alter, Geschlecht, Tumorstadium, -größe und -grading, sowie im OP-Datum möglichst weitgehend mit den entsprechenden ASI-Patienten übereinstimmen mußte. 2.2 2.2.1 Klinische Studie: Die autologe Tumorvakzine Nephrektomie und Transport Zu Anfang der Studie wurde im Anschluß an die wie üblich durchgeführte Nephrektomie das komplette Operationspräparat noch im Operationssaal unter sterilen Bedingungen vom Fett freipräpariert. Unter Aufsicht des Operateurs wurde dann der Tumor aufgesucht, er wurde samt Restniere durch Längsinzision genau in der Mitte geteilt. Der eine Teil wurde dem zuständigen Pathologen zur Begutachtung vorgelegt, der zweite Teil wurde zur Vakzineherstellung aufgearbeitet. Das Resektionspräparat wurde zum Transport grob zerteilt und in ein steriles, antibiotikahaltiges Transportmedium überführt (s.u.) und auf Eis in einem Isolierbehälter ins Labor der AG von Professor Falkenberg in die Ruhruniversität Bochum gebracht, wo die unverzügliche Weiterverarbeitung in einer sterilen Werkbank erfolgte. - 43 2.2.2 2.2.2.1 Tumoraufarbeitung Präparation und Dissoziation Zunächst wurden die Tumorteile freipräpariert, zerkleinert und in Medium gewaschen. Für spätere Experimente (s. Experimente, Immunfluoreszenz) mußten sodann je zwei Tumorstückchen aus Tumormitte und Tumorrand mit Tissuetek fixiert, in durch flüssigen Stickstoff gekühltem Isopentan schockgefroren und bei -80°C gelagert werden. Die restlichen Tumorstücke wurden dann mit einem passenden sterilen Stößel vorsichtig durch ein feines steriles Drahtnetz gequetscht und zur weiteren Dissoziation in eine 37°C warme Enzymlösung aufgenommen. Diese enthielt Kollagenase, Hyaluronidase und DNase (s. Dissoziationsmedium), die Suspension wurde unter ständigem Schütteln etwa 30 min. lang im Wasserbad inkubiert. Dies dient dem Herauslösen der Tumorzellen aus dem bindegewebigen Verband und verhindert ein Verklumpen durch DNA zugrundegegangener Zellen. 2.2.2.2 Reinigung des Pellets Um verunreinigende Anteile wie Binde- und Fettgewebspartikel zu entfernen erfolgte nach der Dissoziation eine Filtration durch sterile 50-mesh-Drahtnetze, die zur besseren Fettabsorption mit Glaswolle gefüllt waren. Sodann wurde die Suspension 10 min lang bei 4°C und 400g in der Heraeus-Kryofuge zentrifugiert. Nach dem Abdekantieren wurde das Zellsediment (Pellet) mit einem Puffer aufgenommen und mit Medium 199 gewaschen. Durch ammoniumhaltige Lysepuffer wurden während der Einwirkdauer von 1-2 min osmotisch relativ selektiv Erythrozyten lysiert, während andere Zellen intakt bleiben. Nach erneuter Zentrifugation konnte die Resuspension in Lysepuffer je nach Aussehen der Suspension noch mehrfach wiederholt werden. Beim folgenden Zentrifugieren bleiben die Erythrozytenreste dann weitgehend in der Lösung zurück und wurden beim Abdekantieren entfernt. 2.2.2.3 Bestimmung von Zahl und Vitalität der Tumorzellen Die Zellzahl wird mit Hilfe der Neugebauer-Zählkammer bestimmt, nach der Zählung wurden die Portionen durch entsprechendes Verdünnen auf die u.g. Zellzahlen eingestellt. Durch Einsatz des Farbstoffes Trypanblau kann eine Unterscheidung zwischen vitalen und abgestorbenen Zellen erfolgen, da er nur die Zellmembranen toter Zellen - 44 passieren kann und die betreffenden Zellen blau färbt. Die wie oben ermittelte Anzahl toter Zellen wird von der Gesamtzellzahl abgezogen (ein Anteil lebender Zellen von mindestens 70% wurde vereinbart). 2.2.2.4 Einfrieren der Zellen in Kryotubes Lebende Zellen können beim Einfrieren durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle teils irreparabel geschädigt werden. Um dies zu verhindern wird den fertigen Vakzinierungsportionen ein Einfriermedium zugesetzt, welches das "Gefrierschutzmittel" DMSO enthält. Letzteres ist bei Raumtemperatur allerdings zytotoxisch, sodaß die Zellsuspension nach Zusatz des Einfriermediums möglichst rasch abgekühlt werden muß. Das nach der Zellzählung und erneuter Zentrifugation erhaltene Zellpellet wird so in Kryotubes abgefüllt, daß sich in den für die Immunisierung vorgesehenen Proben mindestens 1,5 x 107 Zellen pro Milliliter (Z/ml) befinden und in den Kontrollproben mindestens 1,5 x 106 Z/ml. Einfriermedium wird im Volumenverhältnis 1:1 zugesetzt, dann werden die Kryotubes umgehend mit Zellstoff umwickelt und in einem Styroporbehälter bei -80°C gelagert. Nach dem Einfrieren am nächsten Tag wird die Zellprobe in flüssigen Stickstoff überführt und hier bei -196°C bis zur Anwendung gelagert. 2.2.3 Sterilkontrollen Zur Gewährleistung der Keimfreiheit wurden im Anschluß an die Tumoraufarbeitung unmittelbar vor dem Einfrieren Sterilkontrollen der Einzelzellsuspensionen durchgeführt. Gleichermaßen wurden die Transportmedien kontrolliert. Dazu wurden einige Tropfen jeder Lösung auf Nährböden ausgestrichen oder in Bouillons eingebracht und jeweils aerob und anaerob 7 Tage lang bebrütet. Es wurden verwandt (Standardkontrolle im Institut für Mikrobiologie, Prof. Opferkuch): Aerob, Nährböden: Blutagar Mc Conkey Sabouraud Aerob, Bouillons: Soja Sabouraud Anaerob, Nährb.: BHI - 45 Anaerob, Bouillon: BHI Die beimpften BHI-Platten und -Bouillons wurden in einen Anaerobiertopf gestellt, in dem mittels einer mit 35 ml Wasser getränkten Anaerocultplatte nach Verschluß ein mikroanaerobes Millieu erzeugt wurde. Die Bebrütung, bei Keimbefall auch die weitere Differenzierung, erfolgte dann im Untersuchungsamt Bochum, welches die Kontrollen auch schriftlich befundete. 2.3 2.3.1 Klinische Studie, Immunisierung Vorbereitung der Vakzine zur Applikation Beim Auftauvorgang sind die Zellen genauso durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle gefährdet wie bei Einfrieren. Daher wurden die Einfrierröhrchen zum schonenden Auftauen in einem 37°C-warmen Wasserbad geschwenkt, bis die Suspension gerade antaute. Sodann wurde sie in 50 ml DNase-haltiges Medium (s.u.) aufgenommen und unter leichtem Schütteln 20 min lang im Wasserbad gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4°C und 400 x g und Vitalbestimmung wurde der Ansatz noch einmal mit Medium 199 gewaschen. Das nach erneuter Zentrifugation erhaltene Zellsediment mit den 1,5 x 107 Zellen wurde mit 32 HAU NDV, suspendiert in 1 ml Medium 199, resuspendiert und 60 min lang bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Das NDV, Stamm Ulster, wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Schirrmacher, Heidelberg, zur Verfügung gestellt. Es hat sich in umfangreichen Studien dieser Gruppe als gutes Adjuvans bei der aktiven spezifischen Immunisierung erwiesen. Danach wurden die Zellen wieder gewaschen und zentrifugiert. Das Sediment wurde in 0,5 ml Medium 199 aufgenommen und in ein steriles BorosilikatGlasröhrchen (Kimble, 5x50 mm) gefüllt Desweiteren wurden als Immunisierungskontrollen (s.u.) folgende Proben ebenfalls in sterile KimbleRöhrchen abgefüllt: % ca.1,5 x 106 Tumorzellen, aufgenommen in 0,5 ml Medium 199 % 32 HAU NDV, aufgenommen in 0,5 ml NaCl % 32 HAU NDV, aufgenommen in 0,4 ml NaCl % 0,5 ml NaCl - 46 Außerdem wurden noch 3 Portionen mit je 75 000 Cetus-Einheiten6 rIL-2 bereitgestellt (s. Kap. Immunisierungen). Die fünf o.g. Immunisierungsproben wurden verpackt und in einem Isolierbehälter auf Eis so umgehend wie möglich zur jeweiligen strahlentherapeutischen Einrichtung transportiert. Hier mußten folgende Voraussetzungen gegeben sein: % Linearbeschleuniger zur Bestrahlung mit einer Gesamtdosis von mindestens 100 Gray % Offizielle Genehmigung auch Zellen zu bestrahlen Die Bestrahlung dauerte etwa 20 Minuten, wobei die 5x50mm großen Borosilikatröhrchen mit den Proben in ein spezielles Phantom eingespannt wurden. Bei einer Gesamtdosis von 100 Gray werden die vitalen Tumorzellen durch Induktion von DNA-Strangbrüchen sicher irreversibel geschädigt und teilungsunfähig gemacht. 2.3.2 Immunisierungen Die eigentliche Vakzine mit den NDV-modifizierten Tumorzellen wurde mit der ersten Portion rIL-2 versetzt, dieses sollte als Chemotaxis- und Wachstumsfaktor für Lymphozyten die lokale und systemische Immunreaktion verstärken. Die weiteren rIL-2-Portionen wurden dem Ansatz mit 0,4 ml NaCl/NDV beigegeben bzw. ohne Zusatz als rIL-2-Kontrolle verwandt. Die Kontrollen dienten zur Differenzierung des Effektes der einzelnen Komponenten der Vakzine auf die DTH-Reaktion. Dann erfolgte die eigentliche Immunisierung des Patienten, ein Arzt der Klinik applizierte die Lösungen streng intrakutan nach vorgeschriebenem und schriftlich dokumentiertem Schema: % Die erste Immunisierung wurde jeweils am rechten Oberschenkel des Patienten bei ausreichendem Abstand (3-4cm) der Injektionen vorgenommmen % Die zweite Immunisierung wurde am rechten Arm, die dritte am linken Arm vorgenommen % Die Injektionsstellen mußten zur sicheren späteren Identifikation mit einem geeigneten Stift markiert und sorgfältig in einem Immunisierungsprotokoll dokumentiert werden 6Cetus-Einheiten sind die vom europäischen Haupthersteller von rIl-2, der Firma Euro-Cetus, benutzten Meßeinheiten und entsprechen je 6 I.E., sodaß 75 000 Cetus-Einh. 450 000 I.E. entsprechen. - 47 % Zur Überprüfung der allgemeinen Reagibilität der verzögerten Immunreaktion wurde bei jeder Immunisierung an einem Unterarm eine Abrufreaktion mit dem Multitest Merieux durchgeführt Die Applikationsorte wurden 72 Stunden und 7 Tage nach der Immunisierung kontrolliert, die DTH in mm gemessen und im Immunisierungsprotokoll dokumentiert. So wurde bei allen drei Immunisierungsterminen, die ca. 4, 8 und 24 Wochen nach der Operation anberaumt wurden, verfahren. Wegen des zeitlichen Aufwandes für den Patienten sollte nach Möglichkeit versucht werden, den 3. Immunisierungstermin mit dem 1. stationären Nachsorgeaufenthalt zu koppeln. 2.4 2.4.1 Klinische Studie, Nachsorge Routine-Follow-up Die Patienten wurden zunächst routinemäßig, wie in der Tumornachsorge beim NZK nach Nephrektomie allgemein üblich, ca. 3 und 6 Monate nach OP, sowie dann in etwa halbjährigen Abständen zu stationären Nachsorgeaufenthalten in die behandelnde urologische Klinik einbestellt. Hier wurden in aller Regel neben dem allgemeinen klinischen Status die üblichen Laborparameter erhoben, sowie ein Abdomensonogramm, Thoraxröntgenaufnahmen in zwei Ebenen, eine Computertomographie des Abdomens, eine Skelettszintigraphie und ein Ausscheidungsurogramm angefertigt. Beim geringsten Verdacht auf eine zerebrale Beteiligung (Hirnmetastasierung) wurde außerdem eine Computertomographie des Schädels durchgeführt. 2.4.2 Hausärztliche Nachsorge Regelmäßig wurden die betreuenden Hausärzte bzw. niedergelassenen Urologen kontaktiert, um 1. Die außerhalb der Klinik erhobenen, gleichwohl die NZK-Nachsorge betreffenden Befunde erfassen zu können 2. Im Todesfall die erforderlichen Daten erheben und dokumentieren zu können 3. Mit dem viel näher mit dem Patienten befaßten persönlichen Arzt auch Fragen der allgemeinen Befindlichkeit und der Persönlichkeit des Patienten, sowie die den psychoonkologischen Bereich berührenden Pro- - 48 bleme (Stellenwert der ASI-Therapie für den Patienten, Haltung gegenüber einer neuen Therapieform) zu diskutieren 2.4.3 Dokumentation Zur Dokumentation und späteren genaueren immunologisch-experimentellen Auswertung der Studienergebnisse wurde von jedem Patienten: % Eine eigene ASI-Akte mit allen Befunden und Protokollen angelegt % Tumorstückchen wie beschrieben entnommen und bei -80°C gelagert % Vor der Operation und bei jedem Immunisierungstermin Venenblut entnommen und das gewonnene Serum bei -20°C gelagert % Gegebenenfalls nicht zur Vakzinierung verwendete Tumorzellen nicht verworfen, sondern in flüssigem Stickstoff gelagert. 2.4.4 Statistik Die Statistik wurde mit dem Programm SPSS Version 8.0, der Firma SPSS Inc.; 233 Street, Wacker Drive, 11th floor, Chicago, IL 60606-6307, USA, 1998 angefertigt. Für den Vergleich von den Überlebenszeiten wurde die Überlebensanalyse nach Kaplan-Meier verwendet, die gleichzeitig die gleichzeitig die Betrachtung der Daten auf statistische Signifikanzen zuläßt. Als statistischer Test wurde der log rank Test verwendet, da dieser alle Zeitpunkte in diesem Test gleich gewichtet und er in der Überlebensanalyse als einer der üblichen Teststandards gelten kann. Als Alternativen stehen auch noch der Tarone-Ware Test (Ein Test zum Vergleich der Gleichheit von Überlebensverteilungen. Die Zeitpunkte werden mit der Quadratwurzel der Anzahl der zu jedem Zeitpunkt gefährdeten Fälle gewichtet) oder dem Breslow-Test (ein Test, der die Gleichheit der Überlebensverteilungen vergleicht. Die Zeitpunkte werden mit der Anzahl der gefährdeten Fälle zu jedem Zeitpunkt gewichtet), zur Verfügung, diesbezüglich wurden ebenfalls die Signifikanzen errechnet. - 49 2.5 2.5.1 Klinische Studie: Material Chemikalien EDTA DMSO DNase Glucose 10% HBSS Humanserumalbumin 20% Hyaluronidase Isopentan KHCO3 Kollagenase IV Medium 199 Nanopur-Wasser NaCl 0,9% NH4Cl Penicillin rIL-2 "Proleukin" Streptomycin Tissuetek Trypanblau 2.5.2 (Riedel-de-Haen) (Merck) (Sigma) (Fresenius) (Gibco) (Blutspendedienst DRK) (Sigma) (Merck) (Riedel-de-Haen) (Sigma) (Gibco) (Uni Bochum) (Fresenius) (Riedel-de-Haen) (Sigma) (Eurocetus) (Sigma) (Miles Inc.) (Sigma) Verbrauchsmaterial Aluminiumfolie Anaerocult-Platten BHI-Nährboden u. -Bouillon Blut-Nährboden Drahtnetz, 50 mesh Einfrierröhrchen "Kryotubes", 2 ml Einmalhandschuhe, steril Einmalskalpelle Einmelhandschuhe, unsteril Glasröhrchen aus Borosilikat "Kimble-Tubes" 5 x 50 mm (Melitta) (Merck) (Oxoid) (Oxoid) (Dürener Metalltuch) (Greiner) (Beiersdorf, Hartmann) (Braun) (Hartmann) (Kimble) - 50 McConkey-Nährboden Multitest Merieux Petrischalen, eckig Petrischalen, rund Sabouraud-Nährboden u. -Bouillon Soya-Bouillon Sterilfilter Zentrifugenröhrchen, 12 ml Zentrifugenröhrchen, 50 ml 2.5.3 (Merck) (Merieux) (Greiner) (Greiner) (Oxoid) (Oxoid) (Schleicher und Schuell) (Greiner) (Greiner) Geräte Anaerobiertöpfe Arbeitsplatz, Laminar Air Flow Bechergläser Brutschränke Gefrierschrank, -20°C Gefrierschrank, -85°C Instrumentenkasten Telecobaltgerät Co 60 Messer, zweischneidig Mikroskop Pasteur-Pipetten Pinzetten Pipetten, graduiert Scheren Stickstoffbehälter Transportflaschen Waage Wasserbad Zählkammer Neugebauer Zentrifuge "Kryofuge" (Merck, Oxoid) (Biohazard, Gelaire Flow Laboratories) (Schott) (Heraeus, Forma Scientific) (Liebherr) (Forma Scientific) (Martin) (Siemens) (Martin) (Olympus) (Assistent) (Martin) (Schott) (Martin) (Messer Griesheim) (Gibco, Seromed) (Mettler AE 100) (MGW Lauda) (Superior) (Heraeus) - 51 2.5.4 Gebrauchslösungen Medium 199 Pulver zum Ansatz von 1l Medium Entionisiertes Wasser (Nanopur) 350 mg NaHCO3 5958 mg HEPES (= 25 mmol) Das Medium 199-Pulver wird samt NaHCO3 und Hepes im Nanopur-Wasser gelöst, sodaß 1000 ml Lösung vorliegen. In dieser wird dann ein pH-Wert von 7,2 eingestellt, das fertige Medium wird sterilfiltriert (Poren 0,2µm) und im Kühlschrank gelagert. Enzymlösungen Die Mg-Konzentration in den Enzymlösungen wird auf 4,2 mM eingestellt, da Desoxiribonuklease gerade bei dieser Mg-Konzentration optimal katalytisch aktiv ist. Dissoziationsmedium 70 ml Medium 199 30,2 mg Kollagenase IV bei 460 U/ml und 27,13 mg bei 512 U/ml lt. Hersteller 34,8 mg Hyaluronidase bei 720 U/ml und 39,5 mg bei 635 U/ml lt. Hersteller 14,8 mg DNase I 6 mg Mg-Ionen pro 35 ml fertiger Gebrauchslösung (3g MgCl2 in 500 ml Nanopur-Wasser aufnehmen, sterilfiltrieren und im Kühlschrank lagern). Die in pulverisierter Form vorliegenden Enzyme werden in 10 ml Medium 199 aufgenommen, sterilfiltriert und zu einer Lösung aus 60 ml Medium 199 und 2 ml MgCl2 gegeben. Die hergestellte Gebrauchslösung wird auf zwei Tubes verteilt und kann bis zum Gebrauch, höchstens aber für ca. 12 Stunden, im Gefrierschrank (20°C) aufbewahrt werden. Auftaumedium 70 ml Medium 199 14,8 mg DNase 12 mg Mg-Ionen Das Medium wird wie oben beschrieben bereitet, steril in zwei Portionen zu je 35 ml abgefüllt und bei -20°C gelagert (höchstens ca. 12h). - 52 Lysepuffer 8,29 g NH4Cl 37 mg DiNaEDTA 1 g KHCO3 Die Ingredienzien werden mit Nanopur-Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und, nach Einstellung des pH-Werten auf 7,3, sterilfiltriert. Lagerung im Kühlschrank. Einfriermedium 81 ml Medium 199 4 ml Humanalbumin 15 ml DMSO Albumin und DMSO werden wegen der Ausfällungsgefahr einzeln mit etwas Medium 199 aufgenommen und sterilfiltriert. Beides wird vorsichtig dem restlichen Medium 199 zugegeben, die gebrauchsfertige Lösung muß lichtgeschützt im Gefrierschrank bei -20°C gelagert werden. Transportmedium Penicillin, 10 000 U/ml Streptomycin, 10 000 U/ml gewünschte Menge Medium 199, pro Transport 500 ml Aufnahme von Penicillin und Streptomycin in der gewünschten Menge Medium 199, Sterilfiltration, Lagerung im Kühlschrank. Virussuspension Die Viren werden unter sterilen Bedingungen als Portionen zu je 32 HAU (was etwa 107 Viruspartikeln entspricht) in je 0,1 ml NaCl bzw. Medium 199 aufgenommen, in Kryotubes gefüllt und im Gefrierschrank bei -85°C gelagert. Nach dem Auftauen werden sie wie oben angegeben je nach Erfordernis mit Medium 199 oder mit NaCl weiterverdünnt. Interleukin-2-Lösung 1 mg rIL-2-Lyophilisat (= 18 Mio. I.E.) 10 ml Glukose 20% 2 ml Humanserumalbumin 20% 8 ml Nanopur-Wasser Das Lyophilisat wird in Glukose aufgenommen und vorsichtig mit Albumin und Nanopur-Wasser gemischt, um ein Aufschäumen zu verhindern. Die rIL-2-Lösung - 53 wird in 40 Portionen (also 450 000 I.E. entsprechend 75 000 Cetus-Einheiten pro Portion) zu je 0,5 ml aufgeteilt und im Gefrierschrank bei -85°C gelagert. 2.6 2.6.1 Experimente I, Elektronenmikroskopie Herkunft der Präparate Bevor an ausgewählten Tumorzellsuspensionen (es wurden nur die Patientenvakzinen verwandt, die aus verschiedenen Gründen nicht zur Immunisierung verwendet werden konnten) elektronenmikroskopisch die Wirkung der NDV-Inkubation und Modifikation beobachtet und dokumentiert werden konnte, wurden diese selbstverständlich "ganz normal", d.h. wie oben beschrieben bereitgestellt. Am Untersuchungstag wurde die betreffende Suspension aufgetaut, die Zellen mit DNase inkubiert und gewaschen. Nach der 10-minütigen Zentrifugation bei 400 x g wurde etwa die Hälfte der Zellen mit 0,5 ml der NDV-Suspension (entspricht 16 HAU) 10, bzw. 30 min lang im Wasserbad inkubiert, die andere Hälfte wurde ohne Virus auch im Wasserbad inkubiert. Im Anschluß daran erfolgte die sofortige Fixierung beider Ansätze in 3%igem Glutaraldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2 für mindestens 24h. 2.6.2 Herstellung der Präparate für das Rasterelektronenmikroskop Für die Betrachtung der Präparate mit einem Rasterelektronenmikroskop müssen die Präparate zum einen Elektronenbeschuß aushalten, weswegen sie zur besserern Oberflächenleitfähigkeit mit einer Goldschicht belegt werden, und sie müssen zum anderen hochvakuumbeständig sein. Man trocknet die Präparate um Trocknungsartefakte zu vermeiden am "kritischen Punkt", d.h. bei denjenigen Druck- und Temperaturverhältnissen, an denen die Phasengrenze zwischen flüssigem und festem Zustand verschwindet und die Oberflächenspannungen gleich Null sind. Durch vorsichtige Druck- und Temperaturabsenkung kann man nun eine Trocknung ohne Zellschädigung erreichen. Durchführung: 1. Filtration der Zellsuspensionen durch COSTAR Nuclepore-Filter, Porengröße 5µm 2. Die im Filter zurückgehaltenen Zellen werden mit dem ausgestanzten Filterstück in Glutaraldehyd aufgenommen 3. Die mit Glutaraldehyd fixierten Präparate werden 24h lang gewässert - 54 4. Dann werden die Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (Methanol 30%, 50%, 70%, 90% und 100% für jeweils 3h) 4. Das Methanol wird schrittweise durch Fréon 11 ersetzt (Fréon 11 30%, 50%, 70%, 90% und 100% für jeweils 3h) 5. Trocknung am "kritischen Punkt" mit Hilfe einer temperaturgeregelten Überdruckkammer. 6. Mit Hilfe eines Auflichtmikroskops werden geeignete Abschnitte des Präparats ausgewählt und auf Stiftprobentellern fixiert 7. Anschließend werden die Präparate in einer Vakuumkammer bei einem Unterdruck von 0,2 - 0,55 Torr und einer Stromstärke von 25 mA mit einer monomolekularen Goldschicht belegt. 2.6.3 2.6.3.1 Material Chemikalien und Gebrauchslösungen Fixationsmittel 17 ml Glutaraldehyd 3% und 100 ml Phosphatpuffer Phosphatpuffer 6,8 g KH2PO4 auf 500 ml A dest., zum Gebrauch hiervon 20 ml 17,99 g Na2HPO4 auf 500 ml A dest., zum Gebrauch hiervon 80 ml pH-Einstellung auf 7,4 Fréon 11, Glutaraldehyd 3%, KH2PO4, Methanol, und Na2HPO4, wurden im pathologischen Institut gestellt und sind dort in höchstmöglicher Reinheit von den üblichen Herstellern bezogen worden. 2.6.3.2 Geräte Druckkammer "critical point dryer" Nuclepore-Filter Rasterelektronenmikroskop Vakuumkammer E3000 (Polaron) (COSTAR) ISI SS 40.5-1 (Leitz) Sputter Coater 500 (Emscope) - 55 Experimente II, Immunfluoreszenz 2.6.4 Herstellen von Gefrierschnitten Zunächst wurden Gefrierschnitte von denjenigen Tumorstückchen angefertigt, die zur Dokumentation an den Operationspräparaten entnommen und eingefroren worden waren. Es wurden Semidünnschnitte von 7 µm Dicke im Kryotom bei -15°C hergestellt und diese sofort auf mit Ethanol gereinigte Objektträger überführt. Nach ca. 24-stündiger Lufttrocknung konnten die Präparate weiterverarbeitet werden, wobei zur Identifizierung der Strukturen zunächst eine Färbung mit Methylenblau und eine lichtmikroskopische Durchmusterung erfolgte. Die Aufbewahrung erfolgte im Kühlschrank. 2.6.5 Herstellen von Zellzentrifugaten Die Gefrierschnitte erwiesen sich als für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zu heterogen und zu verunreinigt. Als dann verschiedene in der AG von Professor Falkenberg hergestellte MAK auf ihre mögliche NZK-Spezifität getestet werden sollten, wurden hierzu auch Zellzentrifugate der entsprechenden Tumorzellsuspensionen verwandt. Hierzu wurden durch Verdünnung gewonnene Chargen von ca. 10 000 Zellen auf 200 µl Flüssigkeit in die Vorrichtung geladen, ein selbstgefertigtes gelochtes Filterpapier auf die gereinigten Objektträger gebracht und 5 Minuten lang bei 600 U/min zentrifugiert. Nach 24-stündiger Lufttrocknung konnten die Präparate bis zur Weiterverwendung bei -80°C aufbewahrt werden. 2.6.6 Gewinnung von Lymphozytensuspensionen Beim Nachweis von Tumorzellen mit MAK muß man sie vor allem gegen die in aller Regel sowohl in den Suspensionen als auch in Gewebeschnitten vorhandenen Lymphozyten abgrenzen können. Deswegen wurden als Kontrollen u.a. aus menschlichem Venenblut gewonnene Lymphozytensuspensionen eingesetzt. Durchführung: 1. Je 5 ml Vollblut werden vorsichtig auf 5 ml Separationsmedium (Ficoll) geschichtet und 20 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert 2. Von der oberen Plasmaschicht so viel wie möglich absaugen und verwerfen. Mit einer neuen Pasteurpipette die Lymphozyten abnehmen - 56 3. Die Lymphozytenfraktionen in Reagenzgläser geben, 5 ml PBS-G. zugeben und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugieren 4. Nach Dekomplementierung (30 min im Wasserbad bei 56°C) kann die Suspension als Zellzentrifugat bereitet werden. 2.6.7 Immunfluoreszenz Es sollten in den Seren der Patienten Antikörper gegen tumorspezifische Antigene nachgewiesen und deren Titer im Laufe der Immunisierungsbehandlung verfolgt werden. Da die Nachweissysteme gegen menschliche Ig gerichtet waren und sich in den Präparaten antigen-unabhängig [22] gebundene menschliche Ig bereits befinden, mußten diese zunächst aus dem Nachweis genommen, also "abgedeckt" werden. Um dies zu erreichen, wurden nach der Methode von Nielsen et al. [87] die Gefrierschnittpräparate in einem ersten Schritt mit monomeren Fragmenten (Fab) eines Anti-humanen Anti-Immunglobulin-Antikörpers (Im vorliegenden Fall von der Ziege) inkubiert, um die endogenen unspezifischen Immunglobuline in den Schnitten zu blockieren und damit die unspezifische Floureszenz ("Hintergrundrauschen") nach Möglichkeit zu unterdrücken. Dann erfolgte die Fluoreszenzmarkierung, wobei als Positivkontrollen ANA-positive menschliche Seren, also Seren, die mit ihrem nachgewiesenen Anteil anti-nukleärer Antikörper die Zellkerne spezifisch anfärben mußten und als Negativkontrolle PBS-Proben beutzt wurden. Durchführung: 1. Markierung der Präparate auf den Objektträgern (Diamantstift) 2. Abdecken der unspezifischen gewebsständigen Ak mit Fab-Fragmenten eines anti-humanen Ig; es wurden jeweils 50 µl einer für jedes Präparat individuell zu bestimmenden Verdünnung des Ig mit PBS-G. aufgetragen und 30 min lang bei 37°C inkubiert 3. Waschen in Waschpuffer 3 x 1 min lang, dann Überschichtung mit 50 µl Aliquots der verschiedenen Verdünnungen der Patientenseren und der Kontrollsubstanzen; erneute Inkubation von 30 min Dauer 4. Waschen, dann Überschichtung mit 50 µl verschiedener Verdünnungen eines FITC-markierten ZaHuIg ; erneute Inkubation von 30 min Dauer 5. Erneutes Waschen in Waschpuffer für 3 x 1 min, dann Eindecken der Präparate mit Eindeckpuffer, Deckgläschen und Eukitt - 57 Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ist ein Derivat des Fluoreszeins, das sich in alkalischem Millieu leicht kovalent an Proteine bindet. Antikörper werden dadurch zu Detektoren; ohne ihre immunologische Funktion zu verlieren. Das Absorptionsmaximum liegt bei 490-495 nm, es emittiert ein charakteristisches grünes Licht einer Wellenlänge von 517 nm. 2.6.8 2.6.8.1 Material Chemikalien Eukitt Glycerin KH2PO4 Na2HPO4 Rinderserumalbumin, rein Fab-Z!HuIg Z!HuIg, FITC-markiert 2.6.8.2 (Langenbrinck) (Roth) (Riedel de Haen) (Merck) (Serva) (Ag Falkenberg) (Nordic) Puffer PBS, 20-fach konzentrierte Stammlösung 180 g NaCl 5,34 g KH2PO4, wasserfrei 28,66 g Na2HPO4 x 2 H2O in 1000 ml A. bidest. PBS-G durch 1:20-Verdünnung, pH-Einstellung auf 7,2 Waschpuffer PBS-G und 0,1% Rinderserumalbumin Eindeckpuffer PBS-G und 10% Glycerin - 58 2.6.8.3 Geräte Mikroskop "Bh 2" mit Fluoreszenz-Auflichtilluminator Fotokamera C-35 AD Kryotom "2700 Frigocut" Objektträger, Deckgläser Zellzentrifuge "Zytospin" (Olympus) (Olympus) (Reichert-Jung) (Langenbrinck) (Shandon) - 59 - 3 Ergebnisse 3.1 3.1.1 Klinische Studie: Weiterentwicklung der Methodik Interdisziplinäre Zusammenarbeit Die Tumoraufarbeitung nach der bisher in der AG angewendeten Methodik war von methodischen Problemen begleitet, die sukzessive gelöst werden mußten. Ein Hauptproblem bestand darin, daß an der Aufarbeitung jeweils mindestens fünf verschiedene unabhängige Stellen (Immunologie, Mikrobiologie, Pathologie, Radiologie und Urologie) beteiligt sind, die zeitlich und konzeptionell zusammenarbeiten mußten, sodaß eine enge interdisziplinäre Zusammenarbeit notwendig war. An erster Stelle ist hier die Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie, Prof. Opferkuch, zu nennen. Die zweite sicherlich bedeutendere Zusammenarbeit ergab sich mit dem Institut für Pathologie, Professor Morgenroth, zuständig für die pathologische Begutachtung der Präparate aus dem Marienhospital Herne. Professor Morgenroth und seine Mitarbeiter erklärten sich auf unsere Initiative hin bereit, die Tumoren gemeinsam mit uns anzunehmen und zu verwerten. Dies sah in der Praxis so aus, daß ein entsprechend instruierter Assistent aus dem pathologischen Institut an unserer Werkbank unter sterilen Bedingungen die makroskopische Begutachtung vornahm und die für die histologische Untersuchung notwendigen Proben unter sterilen Kautelen entnahm. Der gesamte Resttumor konnte danach von uns nach der oben beschriebenen Methode weiter aufgearbeitet werden. In neuester Zeit ergab sich eine dritte wichtige Zusammenarbeit mit dem strahlentherapeutischen Institut der Universität Essen, das über ein Gerät zur Bestrahlung von Blutproben verfügt und das die entsprechenden Arbeiten ermöglichte. - 60 3.1.2 Methodische Vereinfachung Die von Pomer [96] übernommene und von Hinkel [42] weiterentwickelte und beschriebene Methodik der Aufarbeitung mußte unter folgenden Gesichtspunkten erneut weiter modifiziert werden: " " " Die Aufarbeitung der einzelnen Tumoren dauerte sehr lange, sodaß bei ständig zunehmendem Tumoraufkommen eine schnellere Abwicklung des technischen Ablaufs wünschenswert erschien Die mechanische Zerkleinerung zerstörte sehr viele Zellen, was zu starken Schwankungen in der Ausbeute an Zellen aus dem Tumormaterial führte Es mußten im Anschluß an die mechanische Zerkleinerung immer große Mengen von Zellfragmenten in der Suspension in Kauf genommen werden, deren Antigenität völlig unberechenbar erschien. So entwickelte sich folgende modifizierte Arbeitsmethode, die den technischen Problemen Rechnung trug und die Erfordernisse einer interdisziplinären Zusammenarbeit miteinbezog: " " " " " " " Entnahme und Transport des Gewebes wie oben beschrieben Begutachtung des Tumors durch einen in die sterile Arbeitsweise in der Gewebekultur eingewiesenen Pathologen unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Air-Flow-Werkbank, sorgfältige "Sterilitätsassistenz" durch Mitarbeiter unserer AG, Gewebeentnahme, ggf. Schnellschnittdiagnose Präparation, Zerkleinerung und Waschen des Gewebes wie beschrieben, ebenso wie die Probenentnahme zur Dokumentation Schonende enzymatische Dissoziation über Nacht bei 37°C unter vorsichtigem Rühren Filtration der Suspension, Zentrifugation und weitere Zellpräparation wie beschrieben Anlegen einer Zellkultur mit ca. 10 000 Tumorzellen pro Gewebekulturflasche Einfrieren, Lagerung, Auftauen der Zellen und Bereitung der späteren Vakzinierungsproben wie oben beschrieben - 61 3.1.3 Zellkulturen Von der 32. Aufarbeitung an nahmen wir regelmäßig einen kleinen Teil der gewonnenen Tumorzellen (etwa je 10 000 Zellen in einer Gewebekulturflasche) in Zellkultur. Zu dieser Maßnahme führten uns sowohl technische als auch theoretisch-immunologische Überlegungen. Es gelang nicht, aus jeder Tumoraufarbeitung eine ausreichende Anzahl an Zellen zu gewinnen, insbesondere dann, wenn das in der Regel viel kleinere Volumen einer Metastase aufzuarbeiten war. In einigen Fällen waren aus nicht immer zu eruierenden Gründen über 90% der Zellen abgestorben. Da lebende Zellen immunogener sind als abgestorbene [97] wären hierbei die Erfolgsmöglichkeiten einer folgenden Immunisierung beeinträchtigt worden. In beiden Fällen erhofften wir uns durch geeignete Zellkulturen eine Reserve, sodaß die betreffenden Patienten trotzdem erfolgversprechend immunsiert werden könnten. Theoretisch unterstützte uns die Überlegung, daß es ja gerade die Zellfraktion ist, die wir in der Kultur expandieren, die zur Proliferation und damit auch potentiell zur Metastasenbildung befähigt ist. Das heißt, daß wir unter Umständen in der Zellkultur ein viel spezifischeres Antigengemisch herstellen können. Manche Autoren führten die ASI-Behandlungen bis zu zwei Jahre lang monatlich durch, ein Option, die sich mit in Zellkultur expandierten Zellen ebenfalls eröffnete. Die Zellen wurden hierzu in 25-ml-Kulturflaschen (Falkon) überführt und mit RPMI-Medium mit 15% FCS (Fetal calf serum) expandiert. Anfangs wurden Streptomycin, Getamicin und Penicillin zugesetzt. Die adhärent wachsenden Zellen wurden alle zwei Tage mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in neue Kulturflaschen umgesetzt. Die Inkubation fand im Brutschrank bei 37°C in einem mit 5% CO2 versetzten Raumluftgemisch statt. - 62 3.2 Klinische Studie:Patientenergebnisse 3.2.1 3.2.1.1 Patienten ASI-Therapiegruppe Zwischen Februar 1990 und Dezember 1993 konnte das Tumormaterial von 39 NZK-Patienten der Urologischen Kliniken Herne (20 Patienten) und Münster (19 Patienten) aufgearbeitet werden. Von diesen Patienten konnten 30 in die Studie aufgenommen werden (77%), Tabelle 1 zeigt die Gründe für das Herausfallen der übrigen Patienten Gründe gegen die Auswertung Anzahl Reduzierter AZ, Progredienz bis zum Tode, bevor die Immunisie- 4 (+1) Pat. rungen erfolgen konnten (bzw.Abbruch) Unbrauchbares Vakzine-Material 2Pat. Histologisch kein NZK (malignes Paragangliom), 1Pat. Immunisierungen trotzdem erfolgt, Bericht siehe unten Widerruf der Einwilligung durch den Patienten 1Pat. TAB.8: NICHT-AUSGEWERTETE PATIENTEN Zwei dieser Patienten sind gleichwohl immunisiert worden, ein Pat. (FA17 M.M.) hätte laut Studienprotokoll wegen schlechten Allgemeinzustandes und Tumorprogredienz eigentlich nicht vakziniert werden dürfen, sodaß er aus der Auswertung genommen werden mußte, der Fall einer weiteren Pat. (Paragangliom) wird noch dargestellt. Von den 30 übrigen Patienten waren 9 primär metastasiert (30%), sie wurden weitgehend als separate Gruppe ausgewertet und den entsprechenden Patienten der Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das durchschnittliche Alter der Patienten betrug 59,2 Jahre, wir behandelten 14 Frauen und 16 Männer, das entspricht einem Verhältnis von 1:1,14, was angesichts der Tatsache, daß sowieso zunehmend Frauen vom NZK betroffen sind und sich das alte 1:2-Verhältnis in ein 1:1,5-Verhältnis umwandelt [62], eine vertretbare statistische Abweichung darstellt. - 63 Bezüglich der präoperativen Stadien wurden die Patienten in zwei Auswertungseinheiten eingeteilt, die der Pat. mit fortgeschrittenen, d.h. primär metastasierten oder in Nachbarorgane eingebrochenen (T4) NZK, und die der nach OP klinisch tumorfreien, d.h. primär metastasenfreien Pat.. Wegen der eindeutigen prognostischen Unterschiede werden die in den beiden Gruppen erhaltenen Ergebnisse gesondert interpretiert. Die Verteilung der präoperativen Prognosekriterien zeigen die folgenden Tabellen: Metastasenfreie Patienten, T2/3, N0(x), M0(x) 21 Patienten (70%) T-Stadien N-/M-Stadien Anzahl Prozent T2 T3a T3b N0(x)/M0(x) N0(x)/M0(x) N0(x)/M0(x) 8 8 5 27% 27% 17% Grade: G1 1Pat., G2 18 Pat., G3 2 Pat. Primär metastasierte Patienten, Alle T, N+ u./o. M+ 9 Patienten (30%) T-Stadien N-/M-Stadien Anzahl Prozent T2 T3 T4 N+/M+ N+/M+ alle N/M 1 6 2 3% 20% 7% Grade: G2 5 Pat., G3 4Pat. TAB.9: TNM-UND G-STADIEN ASI-GRUPPE Es sind alle 30 Patienten immunisiert worden (100%), darunter 23 dreimal oder öfter (76,6%), die anderen zweimal (5 Pat., 16,6%) oder einmal (2 Pat., 6,6%). Bei den 7 nicht komplett durchimmunisierten Patienten lag der Grund dafür in 4 Fällen (13,33%) bei einer quantitativ insuffizienten Vakzine, bei 3 Patienten mußte die Therapie gemäß den Abbruchkriterien wegen Tumorprogredienz abgebrochen werden. Ein Beobachtungszeitraum von mindestens 15 Monaten, meist aber von über 2 Jahren, und bis zu 61 Monaten nach OP, in denen regelmäßige Follow-upUntersuchungen und hausärztliche Einschätzungen stattfanden, konnte den Auswertungen zugrundegelegt werden. - 64 3.2.1.2 Kontrollgruppe Mit Hilfe der Matched-Pairs-Technik (Korrelation von Alter, Geschlecht, TNMStadium und OP-Datum) wurde aus dem Patientengut des Marienhospital Herne eine Kontrollgruppe von 30 Patienten aus den Jahren 1990-1992 zusammengestellt. Das Durchschnittsalter dieser Gruppe lag bei 62,6 Jahren, die Verteilung von Frauen zu Männern bei 1:1,73. Es fanden sich im angegebenen Zeitraum nur 7 primär metastasierte Patienten, die nephrektomiert worden waren, ein weiterer Grund dafür, die Patienten mit metastasierten Fällen von den anderen zu trennen und gesondert zu vergleichen und zu bewerten. Metastasenfreie Patienten, T2/3, N0(x), M0(x) 23 Patienten (77%) T-Stadien N-/M-Stadien Anzahl Prozent T2 T3a T3b N0(x)/M0(x) N0(x)/M0(x) N0(x)/M0(x) 10 5 8 30% 17% 27% Grade: G1 5 Pat., G2 16 Pat., G3 2 Pat. Primär metastasierte Patienten, Alle T, N+ u./o. M+ 7 Patienten (23%) T-Stadien N-/M-Stadien Anzahl Prozent T2 T3 T4 N+/M+ N+/M+ alle N/M 3 4 0 10% 13% 0% Grade: G2 5 Pat., G3 2 Pat. TAB.10: TNM-UND G-STADIEN KONTROLLGRUPPE Auch diese Patienten sind regelmäßig zur Nachuntersuchung gebeten worden, zusammen mit den Informationen der Hausärzte konnte ein Beobachtungszeitraum zwischen 32 und 60 Monate nach OP den Auswertungen zugrundegelegt werden. - 65 3.2.2 3.2.2.1 Immunisierungen Durchführung Sofern die Patienten nicht hospitalisiert waren, wurden sie mit festem Termin in die Ambulanz bestellt. Der eigens dafür konzipierte Aufklärungs- und Einwilligungsbogen mußte analog der Aufklärung über einen medizinischen Eingriff jedweder Art noch einmal durchgesprochen und vom Patienten unterschrieben werden. Dann wurde die Vakzine gemäß dem anzulegenden Protokoll (hierzu standen ebenfalls in der AG entworfene Formulare zur Verfügung) streng intrakutan appliziert, was durch die entstehende intradermale Quaddel recht gut zu kontrollieren ist. Nach 3 und nach 7 Tagen wurden die Injektionsstellen begutachtet und die getasteten Durchmesser der Induration an den Einstichstellen dokumentiert. 3.2.2.2 Probleme Die bei der Durchführung der Studie aufgetretenen auftretenden Probleme hängen vor allem mit der Verschiedenheit der Menschen zusammen, mit denen die Studie durchgeführt wurde. Patienten: Für jede Immunisierung mußten drei Temine wahrgenommen werden: Die Immunisierung selbst, der Ablesetermin nach zwei Tagen und der zweite Ablesetermin nach einer Woche. Dies ist schon für Patienten, die in der Nähe der Klinik wohnen, mit Schwierigkeiten verbunden und führt häufig zu Unregelmäßigkeiten, gerade bei den Ableseterminen. Der in die Studie eingebundene Arzt, der die Immunisierungen durchführt, ist selbst im Klinikalltag eingebunden. Dies kann bei nicht exakter Planung letztlich zu nicht studiengemäßen Immunisierungen oder -häufiger- zu Vernachlässigungen in der Dokumentation führen, was die wissenschaftliche Auswertung der Studienergebnisse ungemein erschwert. Außerdem muß man feststellen, daß die erhobenen Befunde und dokumentierten Hautreaktionen umso weniger reproduzierbar und objektivierbar waren, je mehr verschiedene Personen an den Immunisierungen beteiligt waren. - 66 3.2.2.3 Nebenwirkungen Wie auch in der Literatur immer wieder betont wird, treten bei der ASI keine ernsten Nebenwirkungen auf. Auch in unserer Studiengruppe konnten allenfalls leichte lokale Erscheinungen an den Einstichstelle eindeutig auf die Vakzinierung zurückgeführt werden. So beobachteten wir hier in einigen Fällen Hautrötungen, Juckreiz und eine leichte Druckschmerzhaftgkeit der betreffenden Stellen. Zu Ulzerationen der Haut ist es bei den Patienten, die in der vorliegenden Studie mit ASI behandelt wurden, nie gekommen. Alle Symptome haben sich spätestens innerhalb von 14 Tagen vollständig zurückgebildet, kein Patient berichtete von einer ernsthaften Beeinträchtigung zu irgendeinem Behandlungszeitpunkt. Die noch seltener beobachteten systemischen Nebenwirkungen wie eine leichte Temperaturerhöhung, Abgeschlagenheit, Müdigkeit, Kopfschmerzen und eine allgemeine Antriebslosigkeit konnten in keinem der Fälle eindeutig mit der Vakzinierung in Verbindung gebracht werden (bei zeitlicher Koinzidenz zu grippeartigen Erkrankungen) und waren zudem ebenfalls nur sehr leicht beeinträchtigend und in kurzer Zeit vollständig reversibel. 3.2.3 Prognosekategorien Die beiden Patientengruppen wurden unter Berücksichtigung von anatomischer Ausbreitung (T-Stadium), histologischem Differenzierungsgrad (G-Stadium) und Einbruch ins venöse System („a“ mit oder „b“ ohne Veneneinbruch) noch weiter in Prognosekategorien aufgeteilt. Hierbei wurden bei den nicht-metastasierten Patienten 5 Kategorien gebildet, wobei die T-Stadien 2 und 3a wegen ähnlicher Prognosedaten zusammengefaßt wurden; außerdem wurde aus praktischen Erwägungen das T-Stadium 3b in nur zwei Kategorien unterteilt, ausgehend von der Tatsache, daß ein theoretisch mögliches Stadium T3b/G1 bei den Patienten dieser Studie nie beobachtet wurde. - 67 Das untenstehende Diagramm veranschaulicht die Verteilung der Patienten auf die einzelnen Prognosekategorien 70% ASI, n=21 14 60% Kontr., n=23 50% 40% 9 30% 7 20% 5 5 10% 1 1 1 1 0% T2/3a, G1 T2/3a, G2 T2/3a, G3 T3b, G1/2 T3b, G3 Abb.6: Prognosekategorien I In der Kontrollgruppe sind gegenüber der ASI-Gruppe also die ungünstigen Prognoseparameter etwas häufiger anzutreffen, die sehr günstigen allerdings auch, sodaß sich insgesamt ein recht ausgeglichenes Bild ergibt. Die primär metastasierten Patienten werden, Vorschlägen in der neueren Literatur entsprechend [20], anhand des Metastasierungsmusters in eine günstigere (Metastasen in regionalen Lymphknoten u./o. homolateraler Nebenniere u./o. Lunge) Kategorie A und eine ungünstigere (Metastasen in entfernten Lymphknoten u./o. anderen Organen) Prognosekategorie B eingeteilt. Folgende Metastasenorte kamen in den beiden Gruppen vor: Kategorie Patient Metastasen Besonderheiten A G.F. hiläre u. aortale LK noduläre Strukturen im Rö-Tx A H.M. Lunge reduzierter AZ A M.D. hiläre/aortale LK, Lunge Aufarbeit. Metastasenmaterial B C.H. LK, kontralat. Niere 2. Rezidiv-OP, Enukleation B U.M. LK, Milz, Pankreas, etc. T4, palliative Rezidiv-OP B K.O. Beide Nieren, Nebenniere - 68 B H.S. Leber, (multipel) Knochen B H.D. Knochen, Lunge, LK B B.H. Knochen (multipel) Später Metastasenexstirpation TAB.11: METASTASEN ASI-GRUPPE, N=9 Kategorie Patient Metastasen Besonderheiten A W.W.. hiläre u. aortale LK A A.W. homolat. Nebenniere A G.P. LK, homolat. Nebenniere B B.A. Lunge, Scapula B H.B. Lunge, Rippe B A.S. Humerus B M.G. Nebennieren, Rippe Enukleation Zusätzliches Tumorleiden TAB.12: METASTASEN KONTROLLGRUPPE, N=7 Die Zuordnung zu den Kategorien ist im Vergleich der beiden Gruppen im folgenden Diagramm dargestellt. Auf die Besonderheiten einzelner Fälle wird an anderer Stelle noch eingegangen. 70% 60% 6 50% 4 40% 30% ASI, n=9 3 Kontr., n=7 3 20% 10% 0% Kat. A Abb.7: Prognosekategorien II Kat. B - 69 Hierbei ergibt sich eine deutlich ungünstigere Ausgangsposition für die ASIGruppe, auf die später noch ausführlich eingegangen wird. 3.2.4 3.2.4.1 Auswertung bei den primär metastasenfreien Patienten Rezidive des NZK In der ASI-Gruppe registrierten wir 4 Patienten(19%) mit Rezidiven nach 6, 18, 18 und 28 Monaten, drei dieser Patienten verstarben bereits während des Beobachtungszeitraums. In der Kontrollgruppe traten 8 Rezidive (35%) (nach 4, 4, 7, 13, 16, 19, 24 und 24 Monaten) auf. 6 dieser Patienten mit Rezidiven verstarben im entsprechenden Zeitraum. Über die relevanten Daten (einschließlich krankheitsfreiem Intervall und Überlebenszeit) bezüglich der Rezidive informieren die nachfolgenden Tabellen: Patient präop. T/G Metastasierungsorte KFI/ÜZ R.L. pT3a, G2 Lokalrezidiv 18 Mo./61+Mo. R.S. pT3a, G2 Lunge 18 Mo./28 Mo. F.S. pT3b, G2 lokal, Leber, Lunge, Hirn 6 Mo./10 Mo. K.-H. L. pT3b, G2 Leber Lunge, Hirn 28 Mo./30 Mo. TAB.13: REZIDIVE ASI-GRUPPE Patient präop. T/G Metastasierungsorte KFI/ÜZ H.E. pT2, G1 Hirn 16 Mo./29Mo. A.M. pT2, G2 Leber 19 Mo./40+ Mo. K.-H.B. pT2, G3 Lunge, Hirn 24 Mo./36 Mo. K.P. pT3a, G2 Hirn 16Mo./18 Mo. H.W. pT3b, G2 Hirn, Pleura 13 Mo./17 Mo. J.S. pT3b, G2 Hirn, Lunge, Knochen 24 Mo./37 Mo. M.G. pT3b, G2 Leber, Lunge, Cava 4 Mo./47+Mo. I.S. pT3b, G3 Lokal, Lunge 7 Mo./15 Mo. TAB.14: REZIDIVE KONTROLLGRUPPE - 70 In beiden Gruppen waren in sämtlichen Todesfällen die Folgen der Tumorprogredienz (meist kardiorespiratorisches Versagen infolge erhöhten Hirndrucks, einmal Tumorkachexie, Dyspnoe und Sekundärinfektionen) ausschlaggebend für die Todesursache. 3.2.4.2 Krankheitsverlauf mit und ohne ASI Das folgende Diagramm zeigt die Kaplan-Meier-Kurven für das krankheitsfreie Intervall bei den primär metastasenfreien Patienten. 100 90 80 70 % 60 50 40 ASI, n=21 30 Kontr., n=23 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Monate KFI Abb.8: KFI metastasenfreie Pat. Man sieht also recht deutlich die Schere, die sich zwischen den Gruppen auftut und die sich seit der letzten Untersuchung von A. Hinkel [42] jetzt noch etwas deutlicher herausgebildet hat. So leben nach der jetzt durchschnittlich über 3-jährigen Beobachtungszeit noch 81% der Patienten der ASI-Gruppe krankheitsfrei gegenüber nur 65% der Patienten der Kontrollgruppe. Bezüglich der Überlebenszeiten der Patienten mit Rezidiv ergeben sich nach unseren Beobachtungen trotz des tendenziell späteren Rezidivierungszeitpunkts keine bedeutsamen Unterschiede. So lebt von den 4 Rezidivpatienten bis dato noch einer (25%), die durchschnittliche Überlebenszeit der übrigen Patienten betrug 23 Monate (10 Mo. -30 Mo.). Von den 8 Rezidivpatienten der Kontrollgruppe leben - 71 noch zwei (25%), die durchschnittlich Überlebenszeit lag bei 25 Monaten. Hier schlägt vor allem der Fall F.S. zu Buche , der später noch näher erläutert wird. 3.2.4.3 Statistik Krankheitsfreiheit bei den Nicht-Metastasierten Fällen ASI-Gruppe KFI Kumul. KFI Standardabweich. Ereignisse 6,00 Monate 0,9524 0,0465 1. Rezidiv 18,00 Monate 2. Rezidiv 18,00 Monate 0,8571 0,0764 3. Rezidiv 28,00 Monate 0,8095 0,0857 4. Rezidiv 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. 50,00 Monate 4 Rez. TAB.15: STATISTIK; KFI/ASI Anzahl der Fälle: 21 Überlebende: 17 (80,95%) Anzahl der Ereignisse: 4 - 72 Mittelwert des krankheitsfreien Intervalls (bis 50 begrenzt): 43,81 Monate (bei Standardabweichung 2,88; 95% Konfidenzintervall zwischen 38,16 und 49,46). Kontrollgruppe Überlebenszeit Kumul. Überleben Standardabweich. Ereignisse 4,00 Monate 0,9583 0,0408 1. Rezidiv 7,00 Monate 0,9167 0,0564 2. Rezidiv 13,00 Monate 0,8750 0,0675 3. Rezidiv 16,00 Monate 4. Rezidiv 16,00 Monate 0,7917 0,0829 5. Rezidiv 19,00 Monate 0,7500 0,0884 6. Rezidiv 24,00 Monate 24,00 Monate 7. Rezidiv 0,6667 0,0962 8.Rezidiv 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. 50,00 Monate 8 Rez. TAB.16: STATISTIK; KFI/KONTROLLGRUPPE Anzahl der Fälle: 24 Überlebende: 16 (66,67%) Anzahl der Ereignisse: 8 - 73 Mittelwert des krankheitsfreien Intervalls (bis 50 begrenzt): 38,46 Monate (bei Standardabweichung 3,43; 95% Konfidenzintervall zwischen 31,74 und 45,17). Die Signifikanz der Abweichungen unter den beiden Gruppen wurde nach dem Log Rank Test berechnet und beträgt p=0,2684. Die Unterschiede sind aufgrund der kleinen Fallzahlen statistisch nicht signifikant. 3.2.4.4 Metastasierungsmuster und Zusatztherapien In der Beurteilung des Metastasierungsmusters geht es vor allem darum zu untersuchen, inwieweit sich Unterschiede bezüglich der Entwicklung prognostisch eher günstiger Metastasierungsmuster (Lokalrezidiv, Lungenmetastasen), bzw. eher ungünstiger Muster (Hirn- und Knochenmetastasen) ergeben haben. In der ASI-Gruppe finden sich 2/4 (50%) Lokalrezidive, 3/4 (75%) Lungenmetastasierungen und 2/4 (50%) Hirnmetastasen. Alle Patienten hatten initial zunächst entweder ein Lokal- oder ein Lungenrezidiv, Knochenmetastasen sind nicht aufgetreten. In der Kontrollgruppe kam es zu der Entwicklung von 1/8 (12,5%) Lokalrezidiv, 4/8 (50%) Lungenmetastasen, 5/8 (62,5%) Hirnmetastasen und 1/8 (12,5%) Knochenmetastase. 4/8 (50%) der Patienten hatten initial direkt Hirnmetastasen (3/4), bzw. Lebermetastasen (1/4), ohne ein Lokalrezidiv oder Lungenmetastasen zu entwickeln. Es kann anhand dieser Daten festgestellt werden, daß die Patienten der ASI-Gruppe grundsätzlich trotz Rezidivs zu leicht günstigeren Metastasierungsmustern neigen, die dann zusätzlich therapeutische Interventionsmöglichkeiten erlauben. Das Lokalrezidiv kann noch einmal chirurgisch revidiert und entfernt werden, ebenso wie solitäre Lungenmetastasen. Multiple Lungenmetastasierung läßt dann immer noch die Option der adjuvanten Immuntherapie mit Il-2, IFN-a offen, die hier erfahrungsgemäß ihre besten Ergebnisse aufweist. Die Patienten der Kontrollgruppe weisen vor allem etwas häufiger und schneller Hirnmetastasen auf, bei denen nach der derzeitigen Lehrmeinung außer Palliativmaßnahmen keine rationale therapeutische Intervention mehr sinnvoll ist. Zu adjuvanten Therapiemaßnahmen kam es in der ASI-Gruppe in zwei Fällen, Pat. R.L. erhielt zunächst eine Vinblastin-Therapie (5 Stöße 10/91-1/92), dann entschloß man sich zur erneuten chirurgischen Intervention bei gleichzeitiger Whipple-OP. Der Patient ist 6/95 bei langsamer Progredienz des Krankheitsgeschehens bei guter - 74 Gesundheit. Pat. R.S. erhielt nach Resektion von Lungenmetastasen in 10/93, bei der nicht alle Metastasen entfernt werden konnten, eine Il-2/IFN-a/EndoxanTherapie, die bei zwischenzeitlichem stable disease die Progredienz noch ca. 6 Monate hinauszögern konnte. In der Kontrollgruppe wird bei Pat. I.S. eine IFN/Vinblastin-Therapie bei Lokalrezidiv und Lungenfiliae eingesetzt, sie verstarb 8 Monate nach Beginn der Progredienz. Pat. M.G. erhält seit der Diagnose einer pulmonalen Metastasierung 5/92 alle 14 Tage Stöße einer Vinblastin-Therapie, verträgt sie gut und erfreut sich bei stabilem Krankheitsgeschehen 6/95 guter Gesundheit. 3.2.4.5 Prognose und Rezidiv Trotz der teils sehr kleinen Patientenzahlen wird hier versucht, eine Korrelation zwischen der Zuordnung zu den Prognosekategorien (s.o.) und der Rezidivhäufigkeit aufzuzeigen. Die folgende Diagramm veranschaulicht die Beziehungen. Die absoluten Patientenzahlen und Relationen beschreibt die darunterstehende Erläuterung. 100% 90% 80% 70% 60% ASI 50% Kontr. 40% 30% 20% 10% 0% T2/3a, G1 T2/3a, G2 T2/3a, G3 T3b, G1/2 Abb.9: Prognose und Rezidiv In der Kategorie T2/3a, G1 hat ein Patient (1/5) der Kontrollgruppe ein Rezidiv erlitten und keiner der ASI-Patienten. Sowohl 2 Patienten der ASI-, als auch der - 75 Kontrollgruppe waren in der Kategorie T2/3a, G2 betroffen, was in der Kontrollgruppe aber prozentual stärker ins Gewicht fällt. In die Kategorie T2/3a, G3 konnte aus beiden Parteien je ein Patient eingeordnet werden, nur in der Kontrollgruppe war er von einem Rezidiv betroffen. In der Kategorie T3b, G1/2 waren aus der ASIGruppe 2 (2/5) Patienten von einem Rezidiv betroffen, während dies in der Kontrollgruppe bei 4 (4/7) Patienten der Fall war. Der einzige Patient aus der Kontrollgruppe mit T3b, G3 hat ein Rezidiv entwickelt, ist aber hierbei mit keinem Pat. der ASI-Gruppe vergleichbar und deshalb in der Grafik nicht aufgeführt. Trotz der geringen Fallzahlen ist die Tendenz deutlich erkennbar: in jeder einzelnen Prognosekategorie ist der Anteil der Patienten mit Rezidiv bei den immunisierten Patienten niedriger als bei den nicht-immunisierten Patienten. 3.2.5 Auswertung bei den primär metastasierten Patienten 3.2.5.1 Überlebenszeit mit und ohne ASI % In dem folgenden Diagramm sind die Kaplan-Meier-Überlebenskurven der beiden Gruppen der primär metastasierten Patienten dargestellt: 120 100 80 60 40 ASI, n=9 Kontr., n=7 20 0 0 10 20 30 40 50 60 ÜZ in Monaten Abb.10: Überlebenszeit prim. metastasierte Pat. Von den drei überlebenden Patienten kann in einem Fall (G.F.) bei 48 Mo. Remission von einer definitiven Heilung ausgegangen werden, zwei Patienten (H.D. und M.D.) befinden sich derzeit ohne Anzeichen einer Progredienz nachgewiesener Metastasen im stable disease, eine davon (M.D.) allerdings bei zwischenzeitlichem Progreß des Krankheitsgeschehens unter der ASI. Todesursachen in der ASIGruppe waren in vier Fällen die Folgen der Tumorprogredienz (In je zwei Fällen - 76 Hirndruck bei Hirnmetastasen und Tumorkachexie bei multipler Metastasierung), ein Patient (B.H.) verstarb bei langsam progredientem Tumorgeschehen an seinem zweiten Herzinfarkt auf dem Boden einer bekannten koronaren Herzerkrankung. In der Kontrollgruppe ergibt sich ein ähnliches Bild: alle Patienten bis auf einen verstarben an den Folgen ihres fortgeschrittenen Tumorleidens, ein Patient (W.W.) verstarb bei gleichwohl progredientem Tumorleiden an einem Herzinfarkt. 3.2.5.2 Statistik Überlebensanalyse bei den metastasierten Fällen. ASI-Gruppe Überlebenszeit Kumul. Überleben Standardabweich. Ereignisse 12,00 Monate 0,8889 0,1048 1. Pat. verstorb. 13,00 Monate 0,7778 0,1386 2. Pat. verstorb. 16,00 Monate 0,6667 0,1571 3. Pat. verstorb. 25,00 Monate 0,5556 0,1656 4. Pat. verstorb. 30,00 Monate 0,4444 0,1656 5. Pat. verstorb. 33,00 Monate 0,3333 0,1571 6. Pat. verstorb. 60,00 Monate 6 Pat. verstorb. 60,00 Monate 6 Pat. verstorb. 60,00 Monate 6 Pat. verstorb. TAB.17: STATISTIK; ÜZ/ASI Anzahl der Fälle: 9 Überlebende: 3 (33,33%) Anzahl der Ereignisse: 6 Mittelwert Überlebenszeit (bis 60 begrenzt): 34,33 Monate (bei Standardabweichung 6,45; 95% Konfidenzintervall zwischen 21,68 und 46,98). Kontrollgruppe Überlebenszeit Kumul. Überleben Standardabweich. Ereignisse 2,00 Monate 0,8571 0,1323 1. Pat. verstorb. 8,00 Monate 0,7143 0,1707 2. Pat. verstorb. 20,00 Monate 3. Pat. verstorb. - 77 20,00 Monate 0,4286 0,1870 4. Pat. verstorb. 22,00 Monate 0,2857 0,1707 5. Pat. verstorb. 33,00 Monate 0,1429 0,1323 6. Pat. verstorb. 44,00 Monate 0,0 0,0 7. Pat. verstorb. TAB.18: STATISTIK; ÜZ/KONTROLLGRUPPE Anzahl der Fälle: 7 Überlebende: 0 Anzahl der Ereignisse: 7 Mittelwert Überlebenszeit (bis 60 begrenzt): 21,29 Monate (bei Standardabweichung 5,36; 95% Konfidenzintervall zwischen 4,60 und 35,40). Die Signifikanz der Abweichungen unter den beiden Gruppen wurde nach dem Log Rank Test berechnet und beträgt p=0,1675. Die Unterschiede sind statistisch nicht signifikant. 3.2.5.3 Krankheitsverlauf unter ASI Um den Krankheitsverlauf unter irgendeiner postoperativen Therapie eines metastasierenden Tumorleidens beurteilen, sowie quantifizieren und damit vergleichen zu können, ist es notwendig, geeignete Parameter herauszuarbeiten und zu dokumentieren. Diesbezüglich hat sich neben der vor allem aus Patientensicht entscheidenden Überlebenszeit (ÜZ) in der medizinischen Forschung vor allem die schon beschriebene "objektive Ansprechrate (OR)" einer Therapie beim Tumorleiden des Patienten als Parameter bewährt. Diese setzt sich zusammen aus dem Anteil der Patienten mit kompletter Remission (CR), der Patienten mit partieller Remission (PR) und der Patienten mit stabilem Krankheitsgeschehen (SD) bei zuvor diagnostiziertem Progreß. Ferner spielt die Dauer der erzielten Remissionen eine ebenso große Rolle. Die Dauer der Remissionen bezieht sich in dieser Studie auf die Zeit zwischen der Operation, nach der das Resektat zu einer Vakzine aufgearbeitet wurde, und dem letzten dokumentierten Follow-up-Datum, an dem ein unveränderter Krankheitsstand, d.h. keine Progredienz befundet wurde. Bei durchschnittlich halbjährlichen Abständen in den Nachuntersuchungen ist die tatsächliche Remissionsdauer damit in der Regel etwas länger als bewertet. Wurde schon in der ersten postoperativen - 78 Nachsorgeuntersuchung ein Progreß nicht ausgeschlossen, mußte von einem fortschreitenden Krankheitsgeschehen von Beginn (Zeitpunkt der OP) an ausgegangen werden. Danach wurde eine (11%) komplette Remission (Pat. G.F.) bei einem Patienten mit lymphogen metastasiertem NZK im Stadium T3b erzielt. Bei diesem Patienten (OPDatum 26.4.1991) wurden computertomographisch im Bauchraum mehrere Lymphknotenmetastasen beschrieben, die operativ nicht entfernt werden konnten. In den Staging-Untersuchungen hatten diese sich vollständig zurückgebildet und konnten bis Mai 1995 nicht mehr nachgewiesen werden. Auch im Aufnahmebefund gefundene "fragliche feinnoduläre Strukturen" im Röntgenbild des Thorax wurden später nicht mehr beschrieben. Die Remissionsdauer beträgt bis 5/95 48 Monate. Des weiteren wurden drei (33%) partielle Remissionen von 12, 12 und 13 Monaten Dauer beobachtet, eine Patientin davon befindet sich trotz zwischenzeitlicher Progression nach IL-2/IFN-Therapie im Stadium des stable disease. Es handelt sich hierbei im ersten Fall (Pat. K.O., OP 13.1.1992) um zwischenzeitliche Remissionen von R1-(nicht tumorfrei) resezierter kontralateraler Metastase samt Nebennierenmetastase. Beim zweiten Patienten (Pat. B.H., OP Niere 22.6.1992, OP Knochenmetastase 13.7.1992) konnte histologisch eine Remission in entfernten Lymphknotenmetastasen (supraclaviculär) nachgewiesen werden. Die dritte Patientin (Pat H.D., OP 10.2.1992) litt zum OP-Zeitpunkt schon unter einem weit fortgeschrittenen Krankheitsgeschehen mit Knochen-, Lungen- und Lymphknotenmetastasen. So wird bei ihr radiologischerseits der Nachweis einer 4 cm großen osteolytischen Metastase im proximalen linken Radius erbracht, zudem werden Metastasen in der Lunge und in den Lymphknoten des Leberhilus diagnostiziert. Der Verdacht auf weitere Knochenmetastasen in Scapula und Trochanter major links wurde darüberhinaus geäußert. Nach ASI und der späteren Resektion einer Radiusmetastase waren zwölf Monate post-OP nur noch die Lungenherde bei hier fraglicher Progredienz (zuvor Röntgenbild, dann Computertomographie des Thorax zur Diagnose) nachzuweisen (siehe Einzelfälle und Diskussion). Zwei Patienten (22%) befanden sich einige Zeit in einem stabilen Zustand ohne nachweisbare Progredienz der Metastasen. Eine Patientin (Pat. M.D., OP Niere 10.4.1992, OP Lungenmetastasen 10.8.1992) zeigte zwar nach 5 Mo. offensichtlich neu aufgetretene Lungenmetastasen. Nach Abschluß der ASI konnte jedoch keine sichere Progredienz beobachtet werden. Bis - 79 dato (6/95) ist das Krankheitsbild ohne weitere Therapie (eine Immuntherapie wurde nicht toleriert und daher sofort wieder abgebrochen) als stabil zu bezeichnen (36 Mo.). Der zweite Patient (Pat.C.H., OP 3.7.1990) wurde bereits am zweiten (kontralateralen) Rezidiv operiert, der verbliebene Tumorrest (Tumorstadium T4, R1-Resektion) bleibt nach ASI 12 Monate ohne Progredienz (eine mögliche Remission ist wegen fehlender, z.B. kenspintomographischer Verlaufskontrolle nicht sicher zu belegen, siehe Einzelfälle). Bei drei Patienten (33%) war das Krankheitsgeschehen postoperativ von vorneherein auch unter der ASI progredient, zwei davon hatten allerdings auch extrem schlechte präoperative Prognoseparameter (einmal Metastasen-OP ein Jahr nach Tumornephrektomie bei nachgewiesenem riesigen T4-Lokalrezidiv und zum zweiten reduzierter Allgemeinzustand bei massiver Tumorfolgesymptomatik, wie Fieber, Gewichtsverlust, etc.). 3.2.5.4 Krankheitsverlauf ohne ASI Es ist in der Onkologie allgemein bekannt, daß die chirurgische Entfernung eines Primärtumors auch ohne adjuvante Therapie präoperativ nachgewiesene Metastasen in ihrem Wachstum hemmen kann. In Einzelfällen ist es sogar schon zu Spontanremissionen gekommen. In unserem Kontrollkollektiv ist es in einem Fall (14%) während des Beobachtungszeitraums von 44 Monaten zu keiner weiteren Progredienz des Grundleidens (präop. multiple Lymphknotenmetastasen) gekommen. Der zum Zeitpunkt der OP bereits 83-jährige Patient verstarb an den Folgen eines Herzinfarktes. Bei allen anderen Patienten war das Krankheitsgeschehen mehr oder weniger rasch progredient, drei davon erhielten adjuvante Zusatztherapien (Radiatio und/oder Chemotherapie). 3.2.5.5 Zusatztherapien in der ASI-Gruppe Vier Patienten erhielten nach Abschluß der ASI bei nachfolgender Progredienz des Tumorgeschehens adjuvante Radio- und/oder Chemotherapien. Eine Patientin (Pat. H.D.) erhielt nach einer zwischenzeitlichen fraglichen Progredienz von Lungenmetastasen eine Kombination von Il-2/IFN subkutan und befindet sich damit - 80 nach 2 Intensivzyklen und 12-monatiger Erhaltungstherapie seit 8 Monaten ganz ohne Therapie weiterhin in Vollremission. Die Zusatztherapien bei den übrigen Patienten bleiben ohne meßbaren Remissionserfolg: ein Patient (Pat. B.H.) erhielt eine Radiatio nach Lymphknotenresektion, zwei weitere Patienten (Pat. C.H. u. H.M.) wurden zunächst mit Vinblastin/IFN, später dann mit Vinblastin/Clinovir behandelt. 3.2.6 DTH als Parameter Die Auswertung der DTH könnte bezüglich ihres Wertes sowohl als prognostischer Parameter, als auch als differentialtherapeutischer Parameter erfolgen. Vorausgeschickt sei, daß in dieser Studie die Auswertung der lokalen Immunisierungsreaktion leider sehr unter der mangelnden Dokumentation durch die immunisierenden Ärzte leidet. So konnten bei 30 immunisierten Patienten gerade einmal 7 (23,3%!) komplette und 13 weitere inkomplette Immunisierungsprotokolle ausgewertet werden (von denen allerdings wiederum 4 praktisch unbrauchbar waren, da nur einer von mehreren Terminen protokolliert vorliegt). Die Ergebnisse zeigen die folgenden Tabellen. Erläuternd sei gesagt, daß nicht alle tatsächlich durchgeführten, sondern nur die ordnungsgemäß dokumentierten Immunisierungen aufgeführt sind. In der ersten Tabelle ist die Auswertungseinheit der nicht-metastasierten Patienten dargestellt, die mittleren Spalten zeigen die DTH auf die Tumorzellproben, jeweils in Millimetern des Durchmessers der tastbaren Induration angegeben in chronologischer Reihenfolge. Wie anhand der untenstehenden Tabelle belegt werden kann, konnte keine Korrelation zwischen dem Krankheitsverlauf nach Immunisierung und der Hautreaktion vom verzögerten Typ auf die Injektionen festgestellt werden. Weder zeigt sich bei den Patienten mit schlechtem Krankheitsverlauf ein im Vergleich zu den anderen niedrigeres Reaktionsniveau, noch kann offenbar aus der sukzessiven Verringerung der Reaktion auf eine ungünstigere Prognose geschlossen werden, da man diese auch mit wenigen Ausnahmen bei Patienten mit sehr gutem Verlauf beobachtet. - 81 Name 107Z/ml 106Z/ml Verlauf F.S. 10 - 7,5 4-3 schnell (6Mo) progredient M.B. 9-5 1-1 krankheitsfrei W.M. 25 - 10 - 7 0 - 0 - 4,5 krankheitsfrei K.-H. L. 25 - 10 - 10 0 (4) - 0 - 0 nach 28 Mo. progredient K.S. 10 - 5 3-0 krankheitsfrei M.M. 42 - 17 11 - 0 krankheitsfrei W.C. 4-- 0-- krankheitsfrei B.B. 10 - 4 4-2 krankheitsfrei H.S. 8 - 10 - 8 5-8-4 krankheitsfrei V.S. 9-7 2-2 krankheitsfrei E.W. 12 - 8 9-5 krankheitsfrei E.B. 5-- 0-- krankheitsfrei F.-W V. 8 - 12 - 15 0-2-2 krankheitsfrei TAB.19: DTH NICHT-METASTASIERTE PAT. Diese Beurteilung ist allerdings vorbehaltlich, da erstens nicht alle Immunisierungsprotokolle exakt geführt wurden und da zweitens verschiedene Ärzte diese Untersuchung übernommen haben, was die Interpretierbarkeit erschwert. Zum Zweiten sehen wir die Auswertungseinheit der primär metastasierten Patienten Name 107Z/ml 106Z/ml Verlauf F.G. 3-4-5 0-2-4 krankheitsfrei seit 48 Mo. U.M. 11 - 10 - 10 1-1-0 Von Beginn progredient H.S. 11 - 5 0-1 Progredienz nach ca. 4 Mo. K.O. 10 - 6 - 2 0 (4) - 0 - 0 Progredienz nach ca. 12 Mo. H.D. 11 - - 2,5 - - Ohne Therapie in Remission M.D. 5-- 1-- Derzeit keine Progredienz TAB.20: DTH METASTASIERTE PAT. Hier kann zwar ein Anstieg der DTH bei den einzigen auswertbaren Patienten in Remission und ein Abfall der DTH bei den Patienten mit progredientem Krankheitsbild konstatiert werden, doch muß dieses Ergebnis aus den o.g. Grüden ebenso vorsichtig bewertet werden. - 82 3.2.7 Einzelfalldarstellungen Von den 9 Patienten mit primär metastasiertem NZK werden im folgenden die 6 günstigeren Verläufe in chronologischer Reihenfolge in Form von Falldarstellungen beschrieben. Die Zeitangaben beziehen sich auf das OP-Datum. Die 3 übrigen Patienten überlebten die OP 12, 13 und 25 Monate, bei zwei von ihnen wurde die Immunisierungstherapie wegen Tumorprogreß gemäß Protokoll abgebrochen. Bei einem der Patienten (U.M., m, 52 Jahre) handelte es sich bei dem aufgearbeiteten Präparat um exstipierte Halslymphknotenmetastasen bei Zustand nach Nephrektomie ein Jahr zuvor (T3b, N2, M1, G1) und nachgewiesenem Lokalrezidiv (T4, N2, M1, G3). Die zweite Patientin (H.M., w, 65 Jahre) wurde im Tumorstadium pT3a, N0, M1, G2-3 in reduziertem Allgemeinzustand bei Tumorkachexie nephrektomiert. Sie erhielt nach Abbruch der Immunisierungen wegen Metastasenprogredienz eine kombinierte Vinblastin/IFN-Therapie. Der dritte Patient (H.S., m, 51 Jahre) im Tumorstadium pT2, Nx, M1, G2, hepatische und ossäre Metastasierung, erhielt nach dem Abbruch der ASI (szintigraphische Zunahme der Knochenherde) eine Il-2/IFN-Therapie. Fall 1, (C.H., m, 54 Jahre, Tumorstadium T4, N2, M1, G3) 1/86 Tumornephrektomie links 7/89 Teilresektion der rechten Niere wegen kontralateraler Metastase 7/90 Tumorenukleation rechts wegen zweier im Durchmesser je 5 cm großen Rezidivmetastasen AZ gut, kompensierte Niereninsuffizienz, starke BSG-Beschleunigung Histologie: Resektionsränder nicht tumorfrei, Infiltration der Thoraxwand 8/90 ASI aus dem Material der Enukleation, 3 Immunisierungen 11/90 Staging ohne Hinweise auf Rezidiv oder Metastasen 3/91 Staging ohne Hinweise auf Rezidiv oder Metastasen 8/91 Etwa 3 cm großes Rezidiv (nicht ganz eindeutig), IFN-VinblastinTherapie 12/91 Unverändert inhomogene, für einen Rezidivtumor sprechende Struktur der rechten Restniere bei sonst stabilem Krankheitsgeschehen 6/92 Lokalrezidiv in unveränderter Größe, kein Tumorprogreß - 83 2/93 Lokalrezidiv 11 x 11 cm groß, hepatische Filialisierung, Pat. in gutem AZ, bei leichter Leukozytose und komp. Niereninsuffizienz 25.4.1993 Schnelle Progrdienz des Lokalrezidivs und der Metastasierung, finale Tumorkachexie, Exitus Fall 2, (G.F., m, 72 Jahre, Tumorstadium T3b, N1, Mx, G2) 4/90 Makrohämaturien, Diagnose eines lymphogen metastasierten NZK (paracavale/paraaortale LK-Metastasen infradiaphragmal), Durchführung einer arteriellen Tumorembolisation 4/91 Erneute Makrohämaturien, Rezidiv von etwa 13 cm Größe, weiterhin LK-Metastasen, Lungenmetastasen nicht auszuschließen Durchführung einer Tumornephrektomie rechts, laut histologischem Befund mit Tumorthrombus in der V. cava, Resektionsränder waren tumorfrei, LKMetastasen waren nicht entfernt worden 6/91 ASI aus dem aufgearbeiteten Tumormaterial, 3 Immunisierungen 1/92 Kontrollstaging ohne Hinweis auf ein Rezidiv oder Metastasen, insbesondere kein Nachweis vergrößerter LK im Abdominalbereich 7/92, 2/93, 8/93, 4/94und 2/95 Jeweils Kontrollstaginguntersuchungen (Abdomen-und Thorax-CT. Knochenszintigraphien) ohne Nachweis eines Rezidives oder einer Fernmetastasierung, klinische Beschwerdefreiheit, seit 2/93 Verdacht auf ein Prostatakarzinom 6/95 Fernmündlich Zustand unverändert gut Fall 3 (K.O., m, 62 Jahre, Tumorstadium T3a, Nx, M1, G2) 1/92 Tumornephrektomie, Tumor mit 10 cm Durchmesser, Metastasen in derselben Niere und in der gleichseitigen Nebenniere (bei OP entfernt) sowie in der kontralateralen Niere und Nebenniere (bei OP nicht entfernt, histologisch mittels PE gesichert) 2/92 ASI aus Tumor- und Metastasenmaterial, 3 Immunisierungen 8/92, 2/93 Stabiles Krankheitsgeschehen, Remission der Nebennierenrindenmetastase rechts, keine Veränderungen im Bereich der rechten Niere 3/93 Gang- und Standunsicherheiten führen zur Diagnose einer Kleinhirnmetastase rechts bei unverändertem lokalen Status - 84 8.5.1993 Wegen des ungünstigen Sitzes der Metastase rasche Entwicklung eines Hydrozephalus mit Hirndrucksymptomatik - nur noch symptomatische Therapie, Exitus Fall 4 (H.D., w, 55 Jahre, Tumorstadium T3b, N+, M+, G2) 2/92 Abklärung einer schmerzhaften tumorösen Vorwölbung im Bereich des linken Ellenbogens, Diagnose eines metastasierenden NZK (10 cm Durchmesser, mit Cavazapfen), Tumornephrektomie rechts Metastasenverdacht neben linkem Radius in Scapula, Trochanter major links, Lunge und Leberhilus-LK 3/92 Postoperativ Lungenembolie, später Resektion der ossären Metastase im linken Radius 3/92 ASI aus Tumormaterial (eine Immunisierung) 9/92 Unauffälliges Kontrollstaging mit unverändertem Lungenbefund (Metastasenverdächtige Rundherde im Rö-Thorax) und ohne Nachweis anderer Metastasen oder eines Rezidivs 4/93 Kontrollstaging mit Nachweis von 4-8 meist unter 1 cm großen Lungenrundherden im CT des Thorax, ansonsten kein Hinweis auf Metastasen oder Rezidiv 5/93 Der Befund wird als Progreß aufgefaßt, Einleitung einer IFN-Inhalationstherapie, bei fehlender klinischer Toleranz Umsetzen auuf eine kombinierte subkutane IFN/Il-2-Injektionstherapie 7/93 Rückbildung der pulmonalen Metastasen bereits nach dem ersten Therapiezyklus 9/93 Kontrollstaging (einschließlich Thorax-CT) ohne Hinweis auf Rezidiv oder Metastasen, komplette Remission nach zwei Zyklen IFN/Il-2 4/94, 10/94, 2/95 Kontrollstagings unter IFN/Il-2-Erhaltungstherapie (bis 9/94) und nach Absetzen derselben ergenben weiterhin keinen Hinweis auf ein Rezidiv oder Metastasen 5/95 Fernmündlich klinisch guter Zustand Fall 5 (M.D., w, 61 Jahre, Tumorstadium T3b, N1, Mx, G3) 4/92 Zufallsdiagnose eines linksseitigen Nierentumors, sonographisch und computertomographischer Nachweis von paraaortalen LK-Metastasen, Tumornephrektomie links - 85 Das zur Immunisierung aufgearbeitete Tumormaterial muß wegen positiver Sterilproben (Kontamination von Transportmedium und Vakzine) verworfen werden 8/92 Lungenoberlappenresektion links wegen solitärer Metastase (histologisch passend zum NZK) 9/92 ASI aus dem Metastasenmaterial, 3 Immunisierungen 1/93 Wahrscheinlich (jetzt CT gegenüber 9/92 Rö-Thorax) neu aufgetretene bis 2 cm große pulmonale Rundherde 3/93 Abschluß der Immunisierung 5/93 Versuch einer IFN/Il-2-Therapie, von der Pat. extrem schlecht toleriert, so daß der Abbruch der Therapie erfolgte. Die Pat. lehnte im Verlauf auch eine niedriger dosierte IFN/Il-2-Therapie ab In den Staging-Untersuchungen trotzdem keine Progredienz nachweisbar 9/93, 1/94, 5/94, 9/94 und 1/95, die jeweils durchgeführten StagingUntersuchungen erbrachten keinen Hinweis auf ein Lokalrezidiv oder auf ein Fortschreiten der pulmonalen Metastasierung, im Gegenteil erschienen die Lungenrundherde zuletzt kaum noch nachweisbar zu sein (Im RöThorax 1/95) 4/95 Fernmündlich klinisch in gutem AZ Fall 6 (B.H., m, 62 Jahre, Tumorstadium T3b, Nx, M1, G2) 5/92 Rechtsseitige Schulterschmerzen führen zum Nachweis einer Osteolyse und zur PE aus dem entsprechenden Bereich. Die weitere Diagnostik führt zum Nachweis eines ossär metastasierten NZK 6/92 Tumornephrektomie links wegen Fernmetastasierung ohne Adrenalektomie, Veneneinbruch, Resektionsränder tumorfrei 7/92 Scapulateilresektion rechts 7/92 ASI mit aufgearbeitetem Tumormaterial (3 Immunisierungen) 12/92 und 6/93 Staginguntersuchungen ohne Anhalt für Rezidiv oder Metastasierung 8/93 Im Thorax-CT, durchgeführt wegen persistierender Schulterschmerzen, zeigte sich eine tumoröse Raumforderung rechts infraklavikulär. Die Histologie nach Resektion ergab eine LK-Metastase mit nekrotischen Anteilen von NZK-Gewebe, dicht lymphozytär infiltriert. Der Befund wird als Immunisierungsfolge gedeutet 9/93 Nachbestrahlung der rechten Schulterregion mit insg. 40 Gy - 86 1/94 Im Staging (Abdomen-CT) Verdacht auf eine Nebennierenmetastase links 7/94 Staging, Größenzunahme der Nebennierenmetastase, zudem Nachweis beginnender multipler Metastasierung (pulmonal und ossär) 10/94 Palliative Bestrahlung einer Metastase im 8. Brustwirbelkörper wegen starker Schmerzsymptomatik, ansonsten keine wesentliche Progredienz des Geschehens 12/94 Stationäre Aufnahme wegen starker Knochenschmerzen 4.12.1994 Exitus durch Herzinfarkt bei bekannter koronarer Herzkrankheit und Zustand nach einem Herzinfarkt 3.2.8 Anekdotische Darstellung eines Sonderfalls: Versagen der ASI bei einer Patientin mit malignem Paragangliom Patientin A. G.-L., Alter: 37 Jahre 3/92 Linksseitiger Flankenschmerz führt zur Diagnose eines großen, zystischen Nierentumors 4/92 Tumornephrektomie links, präoperativ Nachweis von paraaortalen LKMetastasen sowie von pulmonalen metastasenverdächtigen Rundherden Veneneinbruch, komplizierter OP-Verlauf, in dessen Folge eine Milzexstirpation erfolgen muß Mittels diverser Spezialuntersuchungen erfolgt die histologische Einordnung als malignes Paragangliom, am ehesten vom Nebennierengewebe ausgehend 5/92 Entschluß zum Versuch der ASI, auch mangels therapeutischer Alternativen (1 Immunisierung) 6/92 Multiple hepatische und pulmonale Metastasierung, Abbruch der ASI, Beginn einer Polychemotherapie 7/92 Exitus im Rahmen einer sekundären Pneumonie bei Panzytopenie, Lungenödem und akutem Nierenversagen Die Paragangliome sind extrem seltene Tumoren, die von den Paraganglien (Katecholamin-sezernierende Zellen besonders in der Nebenniere und dem Grenzstrang) ausgehen. Etwa 10% der Paragangliome sind maligne, Metastasierungen sind jedoch im allgemeinen selten. Die Symptomatik wird vom endokrinen Verhalten, von der Größe und von der Lokalisation des Tumors bestimmt. - 87 - Die Therapie der Wahl ist die möglichst komplette chirurgische Resektion des Tumors, Paragangliome gelten als ausgesprochen strahlen- und chemosensibel. Dennoch sollte vor allem bei nachgewiesener Metastasierung eine Chemo- und/oder Radiotherapie versucht werden, weil immer wieder von Wirksamkeit in Einzelfällen berichtet wird. Die von uns nach einiger Diskussion mit allen Beteiligten probeweise durchgeführte Immunisierung mit einer Vakzine aus autologen Tumorzellen hat keinerlei nachweisbare Wirkung gezeigt, wobei der Krankheitsverlauf allerdings auch auf einen Tumorprozeß von außergewöhnlich aggressiver maligner Potenz hinweist, der sich sicherlich von vorneherein therapeutischen Maßnahmen gegenüber weitgehend resistent präsentierte. 3.3 3.3.1 Experimenteller Teil. Ergebnisse Immunfluoreszenz Gefrierschnitte Nach jeder Aufarbeitung waren Tumorstückchen zur Dokumentation abgenommen und eingefroren worden, von denen in den vorliegenen Experimenten zunächst Gefrierschnitte von 7µm Dicke verwendet wurden. Als Kontrollen dienten ebensolche Gefrierschnitte von normalem menschlichen Nierengewebe, das freundlicherweise von anderen Mitarbeitern der AG Falkenberg zur Verfügung gestellt wurde. Trotz sorgfältigster Technik und Blockade der unspezifischen endogenen Antikörper mit passenden Fab-Fragmenten, wie beschrieben, gelang es nicht, das "Hintergrundrauschen" ausreichend zu unterdrücken. Die mittels Immunfluoreszenz nachweisbaren Reaktionen auf den Gewebeschnitten konnten in keinem Fall wie vorgegeben einer spezifischen Antigen-Antikörperreaktion zugeordnet werden, sodaß diese Technik in der Folge rasch wieder verlassen werden mußte. 3.3.2 Zellzentrifugate Insgesamt sieben verschiedene in der AG Falkenberg hergestellte murine monoklonale Antikörper gegen Antigene der menschlichen Niere und des Nierenkarzinoms wurden an Zellzentrifugaten verschiedener NZK (hierzu wurden "übriggebliebene" - 88 nicht zu Immunisierungen verwendete Vakzinezellen genutzt) sowie an Lymphozytensuspensionen ausgetestet. Ziel der Untersuchungen war es, die Tumoren antigenisch näher zu charakterisieren und somit vielleicht ein Detektorsystem zu entwic??keln, das in der Lage ist, Tumorzellen von anderen zellulären Bestandteilen im Tumor (v.a. Lymphozyten) sicher zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt hätte auch dieses System zur möglichen Quantifizierung einer Ak-Reaktion gegen Tumorzellen aus den verschiedenen Seren der behandelten ASI-Patienten dienen sollen. Eine entsprechende Quantifizierung war von Breul [11] beschrieben worden. Er hatte Antigene des Nierenzellkarzinoms fluoreszenzmikroskopisch dargestellt und eine Quantifizierung von Antikörpern im Serum der entsprechenden Patienten über den reziproken Wert der Belichtungszeit vom Präparat angefertigter Fotografien versucht. Alle eingesetzten MAK zeigten eine ihrer Spezifität entsprechende Reaktivität an gleichzeitig ausgetesteten Gefrierschnitten normalen humanen Nierenparenchyms. Die Beurteilung der Intensität der Fluoreszenz erfolgte zunächst nach subjektiver Einschätzung am Mikroskop im Vergleich zu den Kontrollen (Negativkontrollen: PBS statt Zweit-AK; Positivkontrollen mit ANA-positiven humanen Seren) in fünf Kategorien: = keine Fluoreszenz Negativkontrollen (+) = sehr schwache Fluoreszenz + = schwache Fluoreszenz ++ = mittlere bis starke Fluoreszenz +++ = sehr starke Fluoreszenz Positivkontrollen - 89 Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle MAK Verdünnung Lymphozyten Tumorzellen PM I 8 A1 1:50 - ++ PM I 26 D1 1:50 + (+) PM II 20 E7 1:50 (+) ++ PM II 43 A3 1:70 (+) + PM II 48 C1 1:70 + ++ PM II 63 E9 1:50 + + NICA II 37 G10 1:70 - ++ TAB.21: ERGEBNISSE FLUORESZENZMIKROSKOPIE Die beiden MAK PM I 8 A1 und NICA II 37 G10 zeigten also hinreichende Spezifität bei der Differenzierung von Tumorzellen und Lymphozyten und könnten zur Detetektion eingesetzt werden. Bei der Belichtung darauffolgend angefertigter Fotografien stellte sich schnell heraus, daß der reziproke Wert der Belichtungszeit nicht zur Quantifizierung der Antikörperreaktion verwendet werden konnte: das zu erwartende Ergebnis auch in den Kontrollexperimenten stimmte äußerst selten mit dem festgestellten Ergebnis überein und selbst dasselbe Präparat konnte, zu verschiedenen Zeiten gemessen, vollkommen verschiedene Belichtungszeiten aufweisen. Auf den Versuch einer Quantifizierung der Antikörperreaktion gegen autologes NZK-Gewebe in den Seren behandelter Patienten mußte daraufhin verzichtet werden. 3.4 3.4.1 Experimenteller Teil: Elektronenmikroskopie Präparate Die Herstellung der Suspensionen NDV-modifizierter Tumorzellen erfolgte analog der Vorschrift zur Herstellung von Patientenvakzinen. Es wurden verschiedene im Rahmen dieser Studie gewonnene Tumorzellsuspensionen dazu verwendet, die aus den unterschiedlichsten Gründen (z.B. Abbruch der ASI-Therapie) nicht zur Vakzinierung verwendet worden waren. Diese Maßnahmen sollten die Repräsentanz der festgestellten Ergebnisse sicherstellen. - 90 Um die Dynamik in der Adsorption der Viruspartikel an die Tumorzellen untersuchen zu können, wurde der Inkubationsprozeß zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durch Fixierung der Zellen unterbrochen: nach 10 min und nach 30 min. Nach 10 min finden sich laut Meiselmann et al. [76] elektronenmikroskopisch verschiedene Phasen der Virusadsorption bei den von ihnen untersuchten menschlichen Zelltypen; nach 30 min gilt die Aufnahme der Viruspartikel in die Zelle als abgeschlossen. In enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Prof. Morgenroth) wurden die Präparate in einem institutsüblichen Standardverfahren für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet. Das Mikroskopieren, die fotografische Dokumentation und die Interpretation der gefundenen Strukturen erfolgte gemeinsam mit Prof. Morgenroth, durch dessen außerordentlich reiche elektronenmikroskopische Erfahrung die berichteten Ergebnisse fachlich fundiert und objektiviert dargestellt werden können. 3.4.2 Ergebnisse Die Abbildungen dokumentieren die Virusadsorption: Abb.11: Inkubationszeit 10 Minuten I - 91 - Abb.12: Inkubationszeit 10 Minuten II Abb.13: Inkubationszeit 10 Minuten III - 92 - Abb.14: Inkubationszeit 30 Minuten I - 93 - Abb.15: Inkubationszeit 30 Minuten II Abb.16: Inkubationszeit 30 Minuten III - 94 Auf den Abbildungen 11-13 ist zunächst eine Tumorzelle zu sehen, die eine glatte Oberfläche zeigt. Nur durch plattenförmige Auflagerungen des Nährmediums wirkt diese leicht unregelmäßig. Nach 10 min Inkubation finden sich im wesentlichen diese Zellen, bei näherem Hinsehen zeigen sich Zellausläufer verschiedener Länge, die in Kontakt treten mit einer Ansammlung sphärischer Partikel mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 0,4 µm, bei denen es sich zweifellos um die Viruspartikel (durch Umhüllung mit Medium verschieden groß wirkend) handelt. Die Größe der Viruspartikel entspricht der erwarteten Größe, die auch in verschiedenen elektronenmikroskopischen Studien über das NDV [76; 83; 109] festgestellt wurden. In der Studie von Meiselman et al. [76], die sich besonders mit dem Mechanismus der Penetration der Viren in Zellen befaßt, wird beschrieben, daß die Virusaufnahme in die meisten menschlichen Zellen durch eine Art Phagozytosemechanismus erfolgt. Daß dies auch für Tumorzellen gilt, kann hier deutlich demonstriert werden. Die Abbildungen 14-16 zeigen die virusmodifizierten Tumorzellen nach einer Inkubationszeit von 30 min. Deutlich ist die veränderte Oberfläche der Zellen zu erkennen, neben sphärischen Ausläufern mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 0,4 µm sieht man nun auch mehr längliche Strukturen mit bis zu 0,5 µm Länge. Auch andere Autoren beschreiben neben den sphärischen Viruspartikeln pleomorphe, mehr längliche Viruspartikel mit eben diesen Ausmaßen [113]. Legende zu den weißen Maßstabbalken: Abb.11: 1µm Abb.12: 1µm Abb.13: 1µm Abb.14: 1µm Abb.15: 500nm Abb.16: 200nm - 95 - 4 Diskussion Der vorliegenden Arbeit liegt eine Phase-II-Studie zugrunde mit 30 Patienten, die an fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom erkrankt waren und die nach Nephrektomie mit autologen Tumorzellpräparaten immunisiert wurden. In der folgenden Diskussion wird zunächst die Durchfürbarkeit der von Schirrmacher [124] und Pomer [96] beschriebenen Methode und deren Weiterentwicklung erörtert. Dann wird die Wirksamkeit der Therapie bei den behandelten NZK-Patienten beschrieben und dabei auch Einzelfälle dargestellt. Schließlich werden die Ergebnisse ergänzender fluoreszenz- und rasterelektronenmikroskopischer Experimente besprochen. 4.1 Klinische Studie: Weiterentwicklung der Methodik Die Aktive Spezifische Immunisierung (ASI) ist eine Therapieform, bei der für jeden Patienten eine Vakzine aus autologen Tumorzellen hergestellt werden muß. Für eine solche Therapie müssen höchste Anforderungen an die Methode der Aufarbeitung gestellt werden, vor allem was die Charakterisierung und Qualitätskontrolle dieser naturgemäß immer unterschiedlichen individuellen Präparate anbelangt. In kleinen Schritten wurde die Methodik so modifiziert, daß zuverlässig und standardisiert Einzelzellsuspensionen aus NZK-Gewebe gewonnen werden können (siehe auch [42]). Die logistische Zusammenarbeit der einzelnen an der Vakzineherstellung und Anwendung Beteiligten mußte zeitlich und konzeptionell koordiniert werden. Sodann wurde die Methodik labortechnisch, wie unten beschrieben, soweit vereinfacht und gestrafft, daß die Aufarbeitung sowohl schneller, als auch mit einer höheren Zellausbeute vonstatten ging. - 96 4.1.1 Entnahme und Transport In allen Fällen wurde versucht, die Aufarbeitung von der Entnahme des Operationspräparates bis zum Einfrieren der fertigen Zellportionen so schnell wie möglich durchzuführen. In der Regel dauerte es 6-8 Std. von der Tumorentnahme im Operationssaal bis zum Einfrieren der fertigen Tumorzellsuspensionen. Bei längerer Dauer von Transport und Aufarbeitung ist zu befürchten, daß der Anteil vitaler Zellen in der Suspension abnimmt, was wegen der allgemein geringeren Immunogenität abgestorbener gegenüber lebenden Zellen [97] unerwünscht ist. Die Präparate wurden daher aus dem Marienhospital Herne durch Institutsmitarbeiter und aus der Uniklinik Münster mit dem Fahrdienst des Deutschen Roten Kreuzes ins Labor transportiert. 4.1.2 Pathologische Diagnostik Es erfolgte eine Begutachtung des gesamten Resektates durch einen eingewiesenen Pathologen unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Air-Flow-Werkbank. Nach Musterung und makroskopischer Beurteilung erfolgte die Entnahme von zur pathologischen Diagnostik geeigneten Gewebeproben und ggf. eine Schnellschnittdiagnose. Es muß dazu ständig ein pathologisches Instrumentarium als sterilisiertes Set zur Verfügung stehen. Aus dem organisatorischen Aufwand erwachsen Vorteile für die Beteiligten: " " " " Der Pathologe sieht nicht, wie bisher, nur die Hälfte des Präparates, was ihm im Einzelfall das genaue „Staging“ erschwert, sondern kann selbst am vollständigen Präparat seine Diagnostik lege artis durchführen Für Mitarbeiter, die im OP das Tumorpräparat teilen, löst dies das Problem, als Nicht-Pathologe im Einzelfall über eine recht willkürliche Teilung des Präparates entscheiden zu müssen Da der Pathologe in aller Regel nur einen Teil des Tumor-Resektates zur histologischen Begutachtung entnimmt, steht für die Aufarbeitung eine größere Tumormenge zur Verfügung; Präparationen, die nicht ausreichend Material ergeben, konnten dadurch fast vollständig vermieden werden In Einzelfällen unklarer makroskopischer Aspekte (z.B. in Fällen von Phäochromozytomen und Lipomen) können durch eine Schnellschnittdiagnose unnötige Aufarbeitungen vermieden werden - 97 " 4.1.3 Weitergehende Zusammenarbeit könnte z.B. auf dem Gebiet der immunhistochemischen Frühdiagnostik erfolgen (denkbar wäre z.B. der Nachweis epithelialer Marker im Knochenmark der Patienten als frühzeitiger Hinweis auf Mikrometastasierung [93; 104; 129; 130]) Zellvereinzelung Für die Aufarbeitung von Tumormaterial zu einer Einzelzellsuspension ist die Einrichtung eines Zelllabors mit sterilen Arbeitsplätzen notwendig. Die von Pomer [96] übernommene und von Hinkel [42] weiterentwickelte Methodik der Aufarbeitung mußte wie unten beschrieben modifiziert werden: Für die Aufarbeitung von Tumorgewebe mit dem Ziel der Gewinnung von Einzelzellsuspensionen sind verschiedene Methoden beschrieben. Diese umfassen im wesentlichen rein mechanische oder rein enzymatische sowie kombinierte Ansätze. Die in der AG etablierte Aufarbeitungsmethode ist auf die besonders fragilen (und damit gegenüber aggressiven mechanischen Verfahren besonders empfindlichen) Zellen des häufigsten NZK-Typs (Hellzelliges NZK, s.o.) zugeschnitten. Eine maximale Ausbeute vitaler Zellen konnte so gesichert werden. Nach Präparation und grober Zerkleinerung des Tumorgewebes mit dem Skalpell erfolgt das Abspülen des Gewebes mit sterilem Medium zur Entfernung der Blutreste sowie der Antibiotikazusätze. Ein weiterer mechanischer Zerkleinerungsschritt, das Ausquetschen der Tumorstückchen durch ein sterilisiertes Metallsieb, wurde in der Anfangsphase der Studie von den Aufarbeitenden praktiziert, bot aber letztlich bei großem Arbeitsaufwand keine Vorteile bezüglich Ausbeute und Vitalität der Tumorzellen. Statt einer enzymatischen Kurzdissoziation von 30 min. wurde jetzt eine schonende enzymatische Langzeitdissoziation über Nacht bei 37°C unter vorsichtigem Schütteln angeschlossen. Das Rühren der Gewebestücke-Suspension auf einem Magnetrührer hatte sich als unbrauchbar erwiesen, da sich nach der Behandlung mittels Trypanblau-Färbung keine vitalen Zellen mehr nachweisen ließen. Offenbar wurden die enzymatisch vereinzelten Zellen vom Rührmagneten zerquetscht. Die verwendeten Enzyme sind bei 37°C nur einige Stunden lang katalytisch aktiv, sie sollten daher erst unmittelbar vor der Dissoziation in Medium 199 aufge- - 98 nommen und sterilfiltriert werden; längere Inkubationszeiten von Enzymlösung und Tumorgewebesuspension über 8-10 Std. hinaus sind aus dem selben Grund nicht sinnvoll. Vor dem Einfrieren der Tumorzellen wird ein Aliquot der Lösung entnommen, diese Zellen wurden in FCS-haltigem Medium kultiviert. Schon nach wenigen Tagen hat man damit eine expandierte Fraktion in-vitro vermehrter Tumorzellen zur Verfügung, die z.B. für die Herstellung weiterer Vakzineportionen genutzt werden kann. Die Zellen werden hierzu in 25-ml-Kulturflaschen (Falcon) überführt und mit RPMI-Medium mit 15% FCS (Fetal calf serum) kultiviert. Die adhärierten Zellen werden alle zwei Tage mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in neue Kulturflaschen umgesetzt. Die Inkubation findet im Brutschrank bei 37°C in einer 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre statt. Das Einfrieren der Zellen, die Lagerung, das Auftauen und die Bereitung der späteren Vakzinierungssuspensionen erfolgt wie beschrieben. Die Gewinnung von Tumorzellen durch in-vitro Kultivierung hat durchaus widersprüchliche Aspekte: einerseits werden in der Kulturflasche eben Zellen jener Zellklone einer durch vielfache Mutationen heterogenen Tumorzellsuspension angereichert, die (noch) proliferationsfähig sind. Es gibt gute Gründe anzunehmen, daß sich aus diesen “Wachstumsfraktionen“ die Tumorzellen rekrutieren, die potentiell zur Metastasierung in vivo fähig sind [104]. Eine ASI ist am besten gegen frühe Metastasenstadien wirksam [44]. Es könnte also theoretisch eine bessere Spezifität in bezug auf die Oberflächenantigene bei den durch Kultivierung gewonnenen Tumorzelllinien angenommen werden. Andererseits kann es durch die in-vitro Proliferation zur Einschränkung und/oder zur Veränderung der Antigenität der Tumorzelloberfläche kommen. Zur Proliferation fähige Tumorzellen können beispielsweise Antigene verlieren [117]. Das Antigenspektrum des dann vorliegenden Tumorzellgemisches wird dann mit zunehmender Expansionsrate immer dem des ursprünglichen Gemisches entsprechen. Von Hanna und Schirrmacher wurde die Notwendigkeit des kontrollierten Einfrierens der Zellsuspensionen für die Konservierung ihrer Immunogenität betont [94]. Da keine Vorrichtung zum temperatur- und zeitkontrollierten Einfrieren zur Verfügung stand, wurden in der vorliegenden Arbeit die Zellen nach der in der AG Falkenberg etablierten Methode eingefroren, die sich für Hybridomzellen bewährt hat. - 99 - 4.1.4 Herstellung der Vakzine Das Auftauen der Zellen sollte rasch erfolgen, da das DMSO-haltige Einfriermedium zelltoxisch ist. Die Aufnahme in 50 ml DNAse-haltigem Medium gewährleistet neben der Verdünnung des Einfriermediums (1:50) den enzymatischen Abbau freier DNA-Fragmente. Letztere entstehen beim Zelluntergang und erschweren die weiteren Arbeitschritte, da sie mit ihren freien Enden („sticky ends“) Zellen zum Verklumpen bringen. Die Augmentation der Immunogenität der Vakzine erfolgte in der vorliegenden Studie mit NDV, Strain Ulster. NDV wurde von Schirrmacher als immunmodulatorisch aktiv beschrieben, ohne dabei humanpathogene Risiken zu bergen [114]. Die Inkubation der Tumorzellen mit den Viruspartikeln (1x107 Tumorzellen mit 32 HAU NDV) erfolgte nach dem Auftauen. Nach der Inkubation sind Viruspartikel an der Oberfläche der Tumorzellen elektronenoptisch nachweisbar. Die Virusantigene wirken auf verschiedenen Tumorzellen als kostimulatorische Antigene neben den tumorspezifischen und führen darüber hinaus über eine unspezifische Freisetzung von Zytokinen und Schockmediatoren (z.B. IFN, TNF) zu einer Verstärkung der Induktion einer CTL-abhängigen Immunantwort [68; 120; 161]. Um zu verhindern, daß aus den applizierten Tumorzellen am Injektionsort Tumoren anwachsen, müssen sie wirksam inaktiviert werden. Gleichzeitig betonen Hanna und Schirrmacher die deutlich höhere Immunogenität vitaler Zellen gegenüber abgetöteten Zellen oder Membranfragmenten [35; 122; 125]. Die Fähigkeit der Tumorzellen zur Antigenpräsentation über MHC-I-Peptidkomplexe ist offenbar eng mit der Integrität der Zellen verbunden. Für die Zellen des NZK sind außer dem Antigen, das als Target des MAK G250 beschrieben wurde, bislang keine weiteren tumorspezifischen Antigene sicher identifiziert worden. Es muß jedoch davon ausgegangen werden, daß weitere solcher Antigene existieren, denn ohne sie ist eine effektive Immunabwehr, die experimentell bereits nachgewiesen werden konnte, nicht denkbar. In der vorliegenden Studie wurden die Zellen mittels eines Linearbeschleunigers mit einer Dosis von 100 Gy bestrahlt. Für die Bestrahlungsdauer von ca. 20 min wurden die 5x50 mm großen Borosilikatröhrchen mit den Präparaten in ein spezi- - 100 elles Phantom eingespannt. Die Tumorzellen werden dadurch inaktiviert, können aber bis zum Zelltod in Kultur noch einige wenige Teilungen vollziehen. Die Bestrahlung mit so hohen Dosen in relativ kurzer Zeit stellt für den Linearbeschleuniger eine hohe Belastung dar, so daß, auch angesichts von Terminproblemen bei größeren Fallzahlen, im praktischen Klinikalltag die Zellen in Zukunft zunehmend mit Gammastrahlern (z.B. Kobaltquellen) bestrahlt werden sollen. 4.1.5 Qualitätssicherung Qualitätskontrollen wurden bei verschiedenen Arbeitsschritten der Vakzineherstellung implementiert: So wurde zweimal, direkt nach der Zellvereinzelung und unmittelbar vor der Applikation, der Anteil an intakten vitalen Zellen in der Suspension mikroskopisch in der Zählkammer bestimmt. Analog der Arbeiten von Schirrmacher [33] wurden nur Präparate mit mehr als 50% Tumorzellen und mehr als 70% vitalen Zellen verwendet. Die erfolgte Virusadsorption wurde in ausgewählten Proben (s.u.) direkt mittels Elektronenmikroskopie kontrolliert. Hierzu wurden in Analogie zur Vakzine bereitete Tumorzellsuspensionen sowohl mit, als auch ohne Inkubation mit den Viruspräparaten elektronenoptisch mit einem erfahrenen Pathologen durchgemustert und verglichen. Die Virusadsorption und die resultierende Oberflächenveränderung der Tumorzellen konnte so demonstriert werden. Der Ausschluß mikrobieller Kontamination wurde umfassend sichergestellt. Der Transport der Gewebestücke erfolgte in sterilisierten Glasflaschen mit antibiotikahaltigem Medium (Penicillin/Streptomycin). Nach steriler Überführung der Tumorstücke in die Flaschen erfolgte der Transport auf Eis gekühlt. Die verwendete Antibiotikakombination und -dosis hat sich als wirksam zur Verhütung von bakteriellen Kontaminationen während der Weiterverarbeitung erwiesen, lediglich in zwei Fällen wurde im Verlauf der Aufarbeitung Keimwachstum festgestellt. Zu Beginn und am Ende einer jeden Aufarbeitung erfolgten Sterilkontrollen. Sowohl die Transportlösungen, als auch die fertigen Vakzinesuspensionen wurden nach einem Standardschema des hiesigen mikrobiologischen Institutes auf verschiedenen Nährböden ausgestrichen. Nur vollständig sterile Präparate wurden zur - 101 Immunisierung verwendet. Die nach der Kontamination zweier Vakzinen angestellte Überlegung, diese unter spezifischem Antibiotikaschutz dennoch einzusetzen, wurde nach ausgiebiger Diskussion mit den Mikrobiologen verworfen. Die erfolgte Inaktivierung der Tumorzellen in der Vakzine durch Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen unmittelbar vor der Applikation wurde anfangs durch Wachstumstests nachgewiesen. Hierbei wurden routinemäßig bereitete Vakzine bestrahlt und ein kleiner Teil der Tumorzellen entnommen. Dieser wurde in Standardnährlösungen überführt und bei 37°C bebrütet. In keinem Fall ließ sich eine Weitervermehrung der Zellen demonstrieren. Die Stabilität des Impfstoffes unter den verschiedenen Lagerungsbedingungen ergibt sich aus den Vitalbestimmungen unmittelbar vor Applikation. Hierbei sei erwähnt, daß bei der Bereitstellung von Eis zur Kühlung beim Transport darauf zu achten ist, daß es sich um gefrorenes Wasser und nicht, wie häufig üblich, um gefrorene Kochsalzlösung handelt. Bei Letzterer liegt der Gefrierpunkt unter 0°C, was für die Zellen die Gefahr des Einfrierens und damit der Schädigung durch intrazelluläre Eiskristallbildung in sich birgt. Wünschenswert wäre darüber hinaus eine Methode zur Befreiung der Tumorzellen von kontaminierenden Lymphozyten, sodaß der Einsatz reiner Tumorzellsuspensionen möglich wird (z.B. MAK-gekoppelte Magnet-Beads nach Schirrmacher et al.). Dies scheint auch durch Kultivierung der Tumorzellen in speziellen Medien möglich zu sein. - 102 Die Qualitätssicherung in der Dokumentation könnte noch erhöht werden, so daß nach den Erfahrungen dieser Studie vorzuschlagen wäre: "& Die Aufnahme des Operationsprotokolls in die Routinedokumentation "& Das Anfordern der radiologischen Originalbefunde in allen Zweifelsfällen, ggf. mit Bildern mit der Möglichkeit einer unabhängigen Nachbefundung "& Die Möglichkeit einer Referenzhistologie in allen Zweifelsfällen "& Die schriftliche Dokumentation, auch z.B. von mit Hausärzten geführten Telefonaten 4.2 4.2.1 Klinische Studie: Diskussion der Patientenergebnisse Immunisierung und Adjuvantien Es wurde eine dreimalige Vakzinierung mit autologen Tumorzellen angestrebt, die Injektionen erfolgten intrakutan, wobei eine Quaddel auf Hautniveau entstehen mußte. Nur in der Epidermis befinden sich die Langerhans’schen Zellen, die als äußerst effektive antigen-präsentierende Zellen (APC) fungieren. Einer der grundlegenden physiologischen Mechanismen, mit denen Menschen sich mit Antigenen aus ihrer Umwelt auseinandersetzen, sollte hierbei genutzt werden. Im Tierversuch hatten sich nach vielfachen Studien Injektionen in die Bauchhöhle als optimal bezüglich der immunologischen Reagibilität erwiesen. Gerade in der Restimulation bereits sensibilisierter Tiere hatten sich hier optimale Ergebnisse erzielen lassen. Die intraperitoneale Applikation von Tumorzellen beim Menschen ist jedoch wegen der vielfältigen Risiken (Infektion, Fibrose u.a.) abzulehnen. Die in verschiedenen Untersuchungen z.B. [128] bei der aktiven spezifischen Immuntherapie beobachtete Immunantwort vom verzögerten Typ (DTH- oder Typ-4Reaktion) konnte auch in der vorliegenden Studie regelmäßig nachgewiesen werden. Hautindurationen waren 24, bzw. 72 Stunden nach Applikation sicht- und tastbar. Eine Korrelation zwischen Ausprägung der Reaktion und dem krankheitsfreien Intervall, die von verschiedenen Autoren beschrieben wurde [72; 73], konnte in der vorliegenden Studie nicht demonstriert werden. Als Adjuvantien zur Verstärkung der Immunreaktion gegenüber der autologen Tumorzellvakzine wurden in der vorliegenden Studie das NDV und geringe Dosen - 103 an rekombinantem IL-2 eingesetzt. Seit langem ist bekannt, daß verschiedene Viren, speziell auch das NDV, in der Lage sind, unter bestimmten Umständen auf Tumorerkrankungen einen günstigen Einfuß zu nehmen. Lange galt das NDV selbst als antineoplastisch wirksam [15], neuere Studien konnten diese Wirkungen als adjuvante Immunstimulation interpretieren. Beispielsweise wies Schirrmacher eine Veränderung der Tumorzelloberfläche durch Exposition von NDV-Antigenen nach [115; 120], ein Ergebnis, das unter anderem durch die elektronenmikroskopischen Experimente der vorliegenden Studie bestätigt werden konnte. Es konnte auch gezeigt werden, daß NDV die Freisetzung von Zytokinen und anderen Mediatoren (TNF, ACTH u.a.) induziert [127]. Das Virus bindet über Hämagglutinin-Neuraminidase an die Zelle und kann mit ihr mittels eines Fusionsproteins verschmelzen. Nach Genomreplikation erscheinen Virushüll-Antigene an der Tumozelloberfläche. Durch das Einbringen neuer Oberflächenantigene in die Tumorzellmembran wird deren Antigenität ganz offensichtlich erhöht, was mittels des Nachweises einer deutlich gesteigerten tumorspezifischen T-Zell-Antwort nachgewiesen werden konnte [114; 161]. IL-2 stimuliert nicht-antigenspezifisch die Proliferation und Entwicklung von spezifisch geprägten Efektor-T-Zellen [88]. Zudem steigert es die Zytotoxizität sowohl von Effektor-T-Zellen, als auch von NK-Zellen [36; 69]. Auch bei der aktiven spezifischen Immuntherapie werden Zytokine wie das IL-2 zur Verstärkung der Immunantwort auf eine Vakzine eingesetzt. In der vorliegenden Studie wurde die Vakzine mit einer geringen, nicht systemisch wirksamen Dosis IL-2 (450.000 i.E.) versetzt. IL-2 ist auch in dieser Dosierung bei intrakutaner Applikation in der Lage, eine gesteigerte Entzündungsreaktion hervorzurufen. Ganz optimal ist die für die IL-2-Wirkung gewählte adjuvante Applikationsform allerdings nicht. Der Abbau von IL-2 durch renale und intrahepatische Clearance sowie durch Gewebsenzyme geschieht so rasch, daß die Halbwertzeit des IL-2 in bezug auf die adjuvante Immunstimulation bei der Vakzine-Applikation auf höchstens 30 Minuten begrenzt ist. Notwendig für die Generierung einer effektiven Antitumorantwort durch T-Lymphozyten wäre, daß IL-2 in ausreichenden Mengen für die gesamte Dauer des Kontaktes von T-Zellen mit den Tumorzellen vor Ort zur Verfügung steht [162]. - 104 Für die Dauer bis zur Ausbildung einer Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ, müßte IL-2 eigentlich über einige Tage kontinuierlich ausgeschüttet werden. Eine Möglichkeit liegt in der Verwendung von Liposomen als „drug delivery system“. Liposomen sind Vesikel, in denen eine wäßrige Lösung ganzheitlich von einer Lipiddoppelmembran umschlossen ist. Ihre Anwendung mit IL-2 als Inhalt in der Tumorimmunologie wurde unter anderem von Reimer 1994 beschrieben [101]. Auch sie ging davon aus, daß das zusammen mit den abgetöteten Tumorzellen applizierte IL-2 infolge seiner kurzen Halbwertzeit nur eine geringe Wirkung erzielt. Sie koppelte Liposomen chemisch an Tumorzellen und wies nach, daß das Zytokin am Ort der Injektion als Depot verbleibt, aus dem es, als Folge des langsameren Abbaus der Liposomen, über einen längeren Zeitraum in geringen Dosen freigesetzt wird. Daß diese Zytokin-Depots in Verbindung mit bestrahlten autologen Tumorzellen eine effektive Vakzine bilden, demonstrierten Krup et al. bereits im Maus-Modell [61]. 4.2.2 Therapieergebnisse primär metastasenfreier Patienten Die in dieser Arbeit durchgeführte Studie wurde als Phase-II-Studie ausgelegt, d.h. es erfolgte keine Randomisierung in eine Therapiegruppe und eine Kontrollgruppe. Erst retrospektiv wurde die Kontrollgruppe wie beschrieben aus dem Krankengut der Urologischen Klinik des Marienhospitals Herne gebildet, wobei mit Hilfe der "Match-pairs-Technik" eine Gruppe von nichtvakzinierten NZK-Patienten zusammengestellt wurde. Die Patienten mit präoperativ nicht metastasierten Tumoren wurden in fünf Prognosegruppen eingeteilt. Legte man bei diesen Patienten die Robson-Klassifikation (s.o.) zugrunde, so ergibt sich folgende Situation: Diese rein nach der anatomischen Ausbreitung erfolgte Einteilung hat verschiedenen Autoren zufolge [6; 20] die nach wie vor größte klinische Relevanz. Die Zehnjahresüberlebensrate im Stadium I geben die verschiedenen Autoren mit 50-60 % an, im Stadium II mit 25-30 %. Im Stadium III soll die Dreijahresüberlebensrate um 30 % liegen. Formuliert man für die Patienten daraus eine vergleichende Gesamtprognose, so ergibt sich eine Zehnjahresüberlebensrate zwischen 25 und 30 %. - 105 Im Auswertungszeitraum traten in der ASI-Gruppe vier Rezidive und in der Kontrollgruppe acht Rezidive auf. Von den ASI-Patienten mit Rezidiv waren drei zum Auswertungszeitpunkt bereits an ihrem Tumorleiden verstorben, ein Patient hatte bereits 43 Monate mit einem langsam progredienten Lokalrezidiv überlebt. Von den acht Patienten der Kontrollgruppe, die zum Auswertungszeitpunkt ein Rezidiv erlitten hatten, hatten zwei Patienten 21 bzw. 43 Monate den Progreß ihres Tumorleidens überlebt. Die übrigen sechs waren infolge der Tumorprogredienz verstorben. Der Vergleich der im Ergebnisteil vorgestellten Kaplan-Meier-Kurven für das Krankheitsfreie Intervall bei den primär metastasenfreien Patienten läßt eine Tendenz zugunsten der mit ASI behandelten Patienten erkennen. Von Beginn des Untersuchungszeitraumes an zeigte sich in der nichtbehandelten Gruppe schnellere Progredienz, abzulesen an den früheren und häufigeren Rezidiven in dieser Patientengruppe. Das festgestellte tendenziell bessere Behandlungsergebnis bei den ASI-Patienten deutete sich schon in den Vorauswertungen durch A. Hinkel [42] an, in der vorliegenden Endauswertung zeigt sich der Vorteil der behandelten Gruppe deutlicher, jedoch weiterhin nicht mit statistischer Signifikanz. Nach der durchschnittlich über dreijährigen Beobachtungszeit in beiden Patientengruppen überlebten bis dato noch 81 % der Patienten aus der ASI-Gruppe krankheitsfrei, wohingegen dieser Anteil in der Kontrollgruppe bei 65 % der Patienten liegt. Nicht wesentlich beeinflußbar durch die aktive Immunisierung erscheinen die Überlebenszeiten der Patienten, die ein Rezidiv erlitten. So betrug die durchschnittliche Überlebenszeit der an einem Rezidiv verstorbenen ASI-Patienten 23 Monate und die in der Vergleichsgruppe 25 Monate. In Studien ähnlichen Designs werden diese Ergebnisse im wesentlichen bestätigt [53; 102]. Um eine bessere Vergleichbarkeit und Aussagekraft zu gewährleisten, umfaßte die weitere Auswertung zwei weitere Zusatzkategorien: die Unterschiede im Metastasierungsmuster der Patienten mit Rezidiv und die Auswertung der Ergebnisse bezüglich der oben erwähnten Prognosegruppen. Es konnte festgestellt werden, daß die Patienten der ASI-Gruppe trotz Rezidivs prognostisch günstigere Metastasierungsmuster entwickelten (Lokalrezidiv, solitäre Lungenmetastasen), wohingegen bei den Patienten der Kontrollgruppe häufiger und früher die prognostisch ungünstigeren Hirn- und Knochenmetastasen auftraten. - 106 Die klinische Bedeutung dieser Auswertungskategorie ergibt sich aus den therapeutischen Optionen: So stehen bei den Patienten der günstigeren Metastasierungsgruppe immer noch sekundäre therapeutische Maßnahmen von Relevanz zur Verfügung (Exstirpation eines Lokalrezidivs oder Chemotherapie der Lungenmetastasen), mit deren Hilfe eine weitere Lebenszeitverlängerung und/oder eine Verbesserung der Lebensqualität erreicht werden kann. Zum zweiten sind die Auswirkungen von Hirnmetastasen (Krampfanfälle, Wesensveränderungen, Lähmungen etc.) und von Knochenmetastasen (pathologische Frakturen, therapierefraktäre Schmerzsyndrome) in der Regel für den Patienten mit weitaus einschneidenderen Folgen für die Lebensqualität verbunden. Das Ergebnis der Zusatzauswertung in bezug auf die Prognosekategorien bestätigt den (statistisch nicht signifikanten) Trend: In jeder einzelnen Prognosekategorie ist der Anteil der Patienten mit Rezidiv bei den immunisierten Patienten deutlich niedriger als bei den nicht immunisierten Patienten. Bei den Patienten mit präoperativ ungünstigeren Prognosevorzeichen ist diese Tendenz noch deutlicher zu erkennen. Diese Ergebnisse können durch neuere klinische Phase-II-Studien ähnlichen Designs bestätigt werden; so finden Kirchner et al. [53] bei 208 Patienten mit lokal fortgeschrittenen, primär metastasenfreien Tumoren eine Steigerung des Krankheitsfreien Intervalls bei den mit ASI nachbehandelten Patienten gegenüber den Patienten einer Kontrollgruppe. Repmann et al. [102] finden bei 116 Patienten bei den mittleren Prognosegruppen (Robson II u. III) sogar statistisch signifikante Vorteile zugunsten der Therapiegruppe. 4.2.3 Therapieergebnisse bei den Patienten mit primär metastasierten Tumoren Wie oben beschrieben ist bei den Patienten der mittels ASI-behandelten Gruppe eine ungünstigere Ausgangsposition festzustellen. Diese betrifft sowohl das Staging, als auch das Metastasierungsmuster der betreffenden Tumore. Trotzdem ergibt sich am Ende des Beobachtungszeitraumes ein etwas besseres Ergebnis für die mit ASI therapierten Patienten im Vergleich zu den nichttherapierten Patienten. Einem Patienten aus der Kontrollgruppe, der mit 44 Monaten am längsten überlebt hat, stehen drei Patienten aus der ASI-Gruppe gegenüber, die nach 50 Monaten Beobachtungszeit weiterhin am Leben sind. Auch die in den klinischen Studien der - 107 Fachliteratur untersuchten Fallzahlen sind in bezug auf diese Patientengruppe so klein, daß die Autoren allenfalls von ermutigenden Tendenzen berichten, wie in dieser Studie aber ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede fanden [102]. In diesem Zusammenhang sei bei aller Vorsicht in bezug auf die Interpretation der Ergebnisse vor allem der Patient G.F. anekdotisch erwähnt, bei dem sich computertomographisch mehrfach nachgewiesene Lymphknotenmetastasen unter der Therapie zurückgebildet haben. Radiologische Lehrbücher weisen der Computertomographie eine Sicherheit von etwa 95 % im Nachweis intraabdominaler Lymphknotenmetastasen zu, mit mehrmaligen Untersuchungen erhöht sich die Zuverlässigkeit dieses Nachweises weiter. Wegen der vermeintlich ungünstigen Prognose wurde beim Patienten zunächst eine Tumorembolisation und dann später erst die Nephrektomie durchgeführt. Der zunächst geäußerte Verdacht auf eine pulmonale Metastasierung ("feinnoduläre Strukturen" im Röntgenbild des Thorax) konnte später nicht bestätigt werden. Hier wäre auch denkbar, daß sich kleinste Lungenmetastasen unter der Therapie zurückgebildet haben könnten. Bei dem Patienten kann angesichts von 48 Monaten Remissionsdauer mittlerweile von einer definitiven Heilung ausgegangen werden. Der Effekt einer dreimaligen Immunisierung bei sehr fortgeschrittenem Tumorleiden scheint angesichts der nach Operation noch verbleibenden makroskopischen Tumorreste allerdings insgesamt gering zu sein. Kontinuierlich durchgeführte Vakzinierungen, wie sie beispielsweise technisch durch In-vitro-Vermehrung der Tumorzellen möglich wären, könnten vielleicht eine Verbesserung der Immunstimulation auch bei größeren systemischen Tumorzellmassen erreichen. Die Patienten mit metastasiertem NZK wurden in eine günstigere und eine ungünstigere Prognosegruppe eingeteilt [20]. Beim Verhältnis von 3:3 in der günstigeren und 4:6 in der ungünstigeren Prognosegruppe findet sich hier ein Ungleichgewicht zuungunsten der ASI-Gruppe. Dieses resultiert unter anderem aus der Tatsache, daß im betreffenden Zeitraum in der urologischen Universitätsklinik Herne nur wenige Patienten mit fortgeschrittenen NZK nephrektomiert wurden. Da es sich aber hierbei um tendenziell negativere präoperative Voraussetzungen für die Therapiegruppe handelte, wurden in der vorliegenden Studie die Gruppen verglichen. - 108 Zum Schluß seien aus der Immunisierungsgruppe der Patienten mit metastasiertem NZK zwei weitere Patienten erwähnt, die trotz infauster Prognose (Knochenmetastasierung) einen relativ günstigen Krankheitsverlauf zeigten. Bei der Patientin H.D. zeigte sich nach stabilem Krankheitsverlauf 14 Monate postoperativ eine pulmonale Filialisierung. Unter der eingeleiteten IL-2/IFNKombinationstherapie kam es zu deren Regression und im weiteren Verlauf zur kompletten Remission. Es ist durchaus möglich, daß das prompte Ansprechen der Patientin auf die Zytokin-Therapie durch die vorausgegangene Immunstimulation mittels ASI mitbedingt sein könnte. Neuere Studien von Atzpodien und Kirchner stützen diese Annahme [53]. Der zweite Patient (B.H.) befand sich nach initialer Entfernung einer Knochenmetastase und Tumornephrektomie in gutem Allgemeinzustand. 15 Monate nach Vakzinierung konnte in einem chirurgisch entfernten Lymphknoten nur nekrotisches, lymphozytär infiltriertes Tumorgewebe nachgewiesen werden. Dieses histologische Bild wurde als Immunisierungsfolge gedeutet. 4.2.4 Stellenwert der Immuntherapien in der Therapie des NZK Das NZK ist ein Tumor mit sehr schlechter Prognose. Die allgemein akzeptierte Standardtherapie bei Patienten ohne nachgewiesene Metastasen ist die radikale Tumornephrektomie mit kurativer Zielsetzung [20; 166]. Bei den Patienten mit primär metastasiertem Tumorleiden existiert kein einheitliches Therapiekonzept. Fortschritte konnten bei der Identifikation von Risikofaktoren erzielt werden, wohingegen sichere Marker, die bei lokalisierten Tumoren nach Nephrektomie zwischen hohem und niedrigem Risiko in bezug auf Rezidiv oder Metastasierung differenzieren, weiter fehlen [27]. Die früher angewendeten postoperativen adjuvanten Verfahren (Chemotherapie, Radiotherapie und Hormontherapie) werden nach enttäuschenden Ergebnissen kaum noch angewandt [6; 45]. Die hohe Spontanremissionsrate des NZK und die Hauptmetastasenlokalisation in immunologisch aktiven Organen legten schon lange die Vermutung nahe, daß dem Immunsystem eine besondere Rolle bei der Abwehr des NZK zukommt [50]. - 109 Sowohl spezifische als auch unspezifische Immuntherapien wurden seitdem experimentell zur postoperativen adjuvanten Therapie des NZK eingesetzt. Am umfassendsten ist in der Literatur die kombinierte IL-2/IFN!-Therapie beschrieben worden, sie schließt sich als postoperative adjuvante Therapie an eine Nephrektomie zur Reduktion der Tumorzellmasse an und kann gegebenenfalls noch mit einem Chemotherapeutikum (z.B. Vinblastin) kombiniert werden. Es wird in diesen Verfahren von Remissionsraten zwischen 30 % [2] und 48 % [4] berichtet. Die Dauer der Remission ist sehr unterschiedlich, und die Gründe für ein NichtAnsprechen sind Gegenstand der Diskussion [63]. Ein weiteres postoperatives Therapieverfahren ist die Infusion von IL-2 mit invitro-expandierten TIL (mit IL-2), in denen eine Lymphzellpopulation mit relativer Spezifität in bezug auf die Antigene des infiltrierten Tumorgewebes zu vermuten ist. Die Studien berichten für das NZK von Remissionsraten um 20 % [37], beim Melanom teils von deutlich besseren Ergebnissen [51; 92]. Weitere interessante Entwicklungen bei den Immuntherapien wurden durch die Charakterisierung NZK-spezifischer Antigene (G250) und durch die Gentechnik ermöglicht. Letztere erreicht beim NZK durch Transfektion von Tumorzellen mit Zytokin-Genen eine Vestärkung der Immunogenität der betreffenden Zellen [47]. Die gentransfizierte Tumorzelle gleicht einer Effektorzelle des Immunsystems und lockt durch die Zytokinproduktion körpereigene Effektorzellen an. Das Konzept wird allerdings durch die notwendige Inaktivierung der transfizierten Zellen geschwächt. Die Charakterisierung tumorspezifischer bzw. tumorassoziierter Antigene (v.a.G250) ermöglicht die Entwicklung spezifischer MAK und insbesondere auch chimärer bispezifischer MAK mit weitreichenden diagnostischen und therapeutischen Implikationen. Neben Studien zu wichtigen histochemischen Nachweismethoden [137; 139; 140] konnten auch solche zu ersten (Phase I/II) immun- und radioimmuntherapeutischen Anwendungen beim humanen NZK vorgelegt werden [23; 138]. Die Ergebnisse werden noch sehr vorsichtig beurteilt. 4.2.5 Stellenwert der ASI in der Therapie des NZK Ausgehend von den umfangreichen Studien von Tallberg und Tykkä seit 1971 [146; 147] haben verschiedene Autoren die Möglichkeit der aktiven spezifischen Immunisierung als postoperative adjuvante Therapie bei Patienten mit Nieren- - 110 zellkarzinom systematisch untersucht. In verschiedenen Tiermodellen wurde die Methodik der Aufarbeitung und die Wahl des geeigneten Adjuvans optimiert [33; 124]. So lehnten sich die dargestellten Versuche an die von Schirrmacher am Mausmodell entwickelte Methodik der Tumoraufarbeitung zur aktiven spezifischen Immunisierung an. In theoretisch-immunologischen Studien konnten zytotoxische T-Lymphozyten als Träger dieser Immunität nachgewiesen werden [38; 123; 160; 161]. In jüngster Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen um Schirrmacher weitere Aspekte der pleiotropen immunstimulierenden Eigenschaften virusmodifizierter Tumorzellen charakterisieren [115]. Sie beschreiben zwei der sechs viralen Gene (HN und F), die mit ihren Produkten die Tumorzelloberfläche dergestalt modifizieren, daß neue Adhäsionsmoleküle für die Interaktion mit Lymphozyten eingeführt werden. Nach Optimierung der von Schirrmacher übernommenen Methodik zur Tumoraufarbeitung für die Anwendung am menschlichen Nierenzellkarzinom wurde die ASI in der vorliegenden Phase-II-Studie zur adjuvanten Therapie nach Nephrektomie angewandt [42]. Trotz der niedrigen Fallzahlen und der Probleme bezüglich der statistischen Interpretation ist sowohl bei den Patienten mit primär nicht metastasiertem Tumorleiden, als auch bei den Patienten mit metastasiertem NZK festzustellen, daß die im Rahmen der Studie gewonnenen Daten für eine Wirksamkeit der Therapie sprechen. So konnte sich die Rezidivhäufigkeit bei den lokalisierten Tumoren senken lassen. Dies ließ sich nicht nur anhand der Gesamtfallzahlen feststellen, sondern trifft auch für jede einzelne der präoperativen Prognosegruppen zu. Für die Patienten mit primär metastasiertem NZK lassen sich die Zahlen mit entsprechenden Daten anderer Studien vergleichen. Mit einer kompletten und drei partiellen Remissionen konnte somit eine objektive Ansprechrate von 44 % erzielt werden. Dieses Ergebnis ist damit etwa mit Ergebnissen der Studien mit IL-2/IFN! zu vergleichen [4; 37; 165]. Die Dauer der Remission ist wegen der allgemeinen Inkonstanz der Angaben hierbei nicht berücksichtigt. Von kompletten Remissionen über einen längeren Zeitraum kann jedoch kaum berichtet werden. Auch bezüglich des Metastasierungsmusters ist ein Vorteil der ASI-Gruppe dahingehend festzustellen, daß eine Progredienz des Tumorgeschehens unter ASI für den Patienten prognostisch günstiger erfolgt. Kombinationstherapien mit verschiedenen - 111 immuntherapeutischen Ansätzen (ASI und IFN!/IFN$) werden in jüngster Zeit auf ihren Vorteil gegenüber Monotherapien untersucht. Schwaab et al. fanden in einer Phase-II-Studie keine klaren klinischen Unterschiede, aber Hinweise für bedeutsame immunmodulatorische Effekte [133]. Zudem kann die ASI möglicherweise die Wirksamkeit nachfolgender postoperativer Immuntherapien bzw. kombinierter Chemoimmuntherapien verstärken [52]. Die statistischen Ergebnisse dokumentieren lediglich tendenzielle Unterschiede der Therapieergebnisse zwischen den behandelten und den nicht-behandelten Patienten in beiden Therapiegruppen. Statistisch signifikante Unterschiede ließen sich angesichts der geringen Patientenzahlen erwartungsgemäß nicht ermitteln. Eine Weiterentwicklung der aktiven spezifischen Immuntherapien ist in mehreren Bereichen denkbar. So kann zum einen eine weiter optimierte Aufarbeitungsmethode durch eine weitere Erhöhung von Vakzinequalität und Zellausbeute dazu führen, daß hochwertigere Vakzinierungen in regelmäßigen Abständen möglich werden. Zum zweiten könnte die Zytokin-Wirkung des eingesetzten Interleukin-2 entscheidend verbessert werden, wenn man durch Depotformulierungen die Wirkung prolongiert. Chemotaxis und die Aktivierung von Lymphozyten am Ort der Vakzinierung könnten somit verstärkt werden. Versuche zu einer solchen Verlängerung der Zytokinwirkung am Vakzinierungsort selbst wurden bereits erfolgreich durchgeführt [61; 101]. Weitere Entwicklungsmöglichkeiten ergeben sich durch die Untersuchung besser validierbarer Prognosekriterien des NZK. So sollte es beispielsweise u.a. anhand immunologischer Kriterien auch möglich sein, die Ansprechbarkeit eines konkreten Tumors auf Immuntherapie zu prognostizieren und eine Indikation somit differenzierter stellen zu können. Das Vorhandensein des tumorassoziierten Antigens G250 ist ein Beispiel für einen solchen Prognosemarker [140]. Zellen menschlicher Tumoren, die ja meist über Jahre hinweg gewachsen sind, unterscheiden sich von denen im Tiermodell verwendeten insbesondere durch ihre phäno- und genotypische Inhomogenität. Das bedeutet, daß das Spektrum an tumorspezifischen und tumorassoziierten Antigenen auf Zellen desselben Tumors durchaus verschieden sein kann. Aufgrund dieser Überlegungen behält die ASI, die sich im Idealfall ja der körpereigenen Immunantwort auf ein konkretes Antigengemisch zur Induktion einer zytotoxischen Reaktion bedient, auch theoretisch ihre Berechtigung neben hochspezifischen Immuntherapien mit MAK. - 112 4.3 4.3.1 Experimente Immunfluoreszenz Als Ergebnis der Immunfluoreszenzexperimente ist festzuhalten, daß in der Arbeitsgruppe Falkenberg 2 monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen, die in der Lage sind, Zellen der untersuchten NZK von Lymphozyten zu differenzieren. Die immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen haben sich als nicht geeignet erwiesen, eine Antikörperreaktion gegen autologes Tumorgewebe im entsprechenden Patientenserum nachzuweisen. Die unspezifische Fluoreszenz (u.a. Debridement) überwiegt die spezifische in diesen Versuchen bei weitem. Die einzige Möglichkeit diesbezüglich ergäbe sich durch die Untersuchung von gereinigten Suspensionen expandierter Zellen. Ein spezifischerer Nachweis sowohl von Tumorzellen, als auch einer Immunreaktion im Organismus gelingt nach der Charakterisierung tumorspezifischer oder tumorassoziierter Antigene (z.B. G250) mittels MAK. So zeigen die Arbeitsgruppen um Steffens, daß mit Jod-131-markierten MAK G250 eine exzellente Visualisation von Tumorläsionen in der Immunszintigraphie möglich wird [138; 140]. Nach in-vitro- Studien und tierexperimentellen Untersuchungen [70; 159] werden bereits Berichte über einen therapeutischen Einsatz dieser MAK-vermittelten (Radio-) Immuntherapie veröffentlicht [23]. 4.3.2 Elektronenmikroskopie In der elektronenmikroskopischen Studie konnte eine Adsorption der Viruspartikel an die Tumorzellen nachgewiesen werden. In verschiedenen Phasen dieses Adsorptionsmechanismus werden Annäherung, Kontaktaufnahme, Adsorption und Internalisation der Viruspartikel demonstriert. Im Anschluß an die Virusadsorption und -aufnahme präsentieren sich die Tumorzellen im elektronenmikroskopischen Bild mit veränderter Oberfläche. Auch Schirrmacher wies eine Veränderung der Tumorzelloberfläche durch Exposition von NDV-Antigenen nach [120], ein Ergebnis, daß unter anderem durch die elektronenmikroskopischen Experimente der Arbeiten von Liebrich et al. bestätigt - 113 werden konnte [65]. Analog zu den vorliegenden Ergebnissen beschreibt er Viruspartikel sowohl an der Oberfläche der verwendeten epithelialen Zellen (eines Kolorektalen Karzinoms), als auch an Membranfragmenten und in Aggregaten zwischen den Zellen. Es werden zwei der sechs viralen Gene (HN und F) beschrieben, die mit ihren Produkten die Tumorzelloberfläche dergestalt modifizieren, daß neue Adhäsionsmoleküle für die Interaktion mit Lymphozyten eingeführt werden [115]. Die Virusantigene wirken auf verschiedenen Tumorzellen als kostimulatorische Antigene neben den tumorspezifischen und führen darüber hinaus über eine unspezifische Freisetzung von Zytokinen und Schockmediatoren (z.B. IFN!, TNF) zu einer Verstärkung der Induktion einer CTL-abhängigen Immunantwort [68; 120; 161]. Daß es sich bei diesen Oberflächenausläufern um nukleinsäurehaltige komplette Viruspartikel handelt, konnte Liebrich transmissionselektronenmikroskopisch nachweisen [65]. - 114 LITERATURVERZEICHNIS 1. Ahlert T, Bastert G, Kaul S, Schirrmacher V (1989): Induktion antitumoraler Immunantwort beim Ovarialkarzinom mit virusmodifizierten autologen Tumorzellen. Archives of Gynecology and Obstetrics 245:631-632. 2. Altwein JE, Rübben H (1993): Tumoren/Nierenparenchym. In: Urologie, 4 Ed., Enke, ed. Enke-Verlag, Stuttgart, pp. 172-189. 3. Atzpodien J, Hänninen EL, Kirchner H, Poliwoda H (1995): Multiinstitutional Home-Therapy Trial of Recombinant Human Il-2 and IFN-alpha-2 in Progressive RCC. J Clin.Oncol. 13 No.2:497-501. 4. Atzpodien J, Kirchner H, Poliwoda H (1993a): European Studies of Il-2 in Metastatic Renal Cell Carcinoma. Semin.Oncol. 20 No. 6 Suppl. 9:22-26. 5. Atzpodien J, Kirchner H, Poliwoda H (1993b): Expansion of Peripheral Blood NKCells Correlates with Clinical Outcome in Cancer Patients Receiving rIl-2 and IFN alpha-2. Tumor Biology 14:354-359. 6. Avisrror MU (1992): Renal Cell Carcinoma and other Tumours. In: Oxford Textbook of Clinical Nephrology, 3 Ed., S Cameron, AM Davison, JP Grünfeld, D Kerr, E Ritz, eds. Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, pp. 2237-2253. 7. Baron D (1990): MAK und Mediatoren- Immunologische Tumortherapie. Naturwissenschaften 77:405-411. 8. Beverly PCL, Lowenthal RM, Tyrell DAJ (1972): Immune Responses in Mice to Tumour Challenge after Immunisation with NDV-Infected or X-Irradiated Tumour Cells or Cell Fractions. xxx x:212-223. 9. Bloom HJ (1973): Hormone induced and spontaneous regression of metastatic renal cancer. Cancer 32:1006 10. Bohle W, Schlag P, Liebrich W, Hohenberger P, Manasterski M, Moller P, Schirrmacher V (1990): Postoperative active specific immunization in colorectal cancer patients with virus-modified autologous tumor-cell vaccine. First clinical results with tumor-cell vaccines modified with live but avirulent Newcastle disease virus. Cancer. 66:1517-1523. - 115 11. Breul J (1986): Nachweis und Quantitative Bestimmung von Antikörpern gegen Strukturen des Nierenzellkarzinoms in Seren von Tumorpatienten. Dissertation Uni Bochum/Medizinische Fakultät 12. Bukowski RM, Goodman P, Crawford ED, Sergi JS, Redman BG, Whitehead RP (1990): Phase II trial of high-dose intermittent interleukin-2 in metastatic renal cell carcinoma: a Southwest Oncology Group study. J.Natl.Cancer.Inst. 82:143-146. 13. Burnet FM (1970): The Concept of Immunological Surveillance. Progr.exp.Tumor Res. 13:1-27. 14. Carpinto GA, Osband ME, Krane RJ (1984): An Immunodiagnostic Assay to Detect Metastatic RCC based on Phenotypic Analysis of Tumor Antigenspecific Adherent Lymphocytes. J.Urol. 131:227 15. Cassel WA, Garrett RE (1965): Newcastle Disease Virus as an Antineoplastic Agent. Cancer 18:863-868. 16. Cassel WA, Murray DR, Phillips HS (1983): A phase II study on the postsurgical management of Stage II malignant melanoma with a Newcastle disease virus oncolysate. Cancer. 52:856-860. 17. Cetto GL, Franceschi T, Turrina G, Chiarion Sileni V, Capelli MC, Bellini A, Paccagnella A, Bassetto MA, Molino AM, de Sandre G (1988): Recombinant alpha-interferon and vinblastine in metastatic renal cell carcinoma: efficacy of low doses. Semin.Surg.Oncol. 4:184-190. 18. Chiou RK (1991): The impact of tumor size on the efficacy of monoclonal antibody- targeted radiotherapy: studies using a nude mouse model with human renal cell carcinoma xenografts. J Urol 146:232-237. 19. Chiou RK, Vessella RL, Limas C, Shafer RB, Elson MK, Arfman EW, Lange PH (1988): Monoclonal antibody-targeted radiotherapy of renal cell carcinoma using a nude mouse model. Cancer. 61:1766-1775. 20. De Kernion J, Belldegrun A (1992): Malignant Renal Tumors. In: Campbell's Urology, PC Walsh, AB Retik, TA Stamey, ED Vaughan, eds. W.B.Saunders Company, Philadelphia, pp. 1062-1093. - 116 21. De Kernion J, Ramming KP, Smith RB (1978): The Natural History of Metastatic renal cell carcinoma. J.Urol. 148: 22. Ditzel H, Erb K, Nielsen B, Borup Christensen P, Jensenius JC (1990): A method for blocking antigen-independent binding of human IgM to frozen tissue sections when screening human hybridoma antibodies. J.Immunol.Methods. 133:245-251. 23. Divgi CR, Bander NH, Scott AM, O´Donoghue JA, Sgouros G, Welt S, Finn RD, Morrissey F, Capitelli P, Williams JM, Deland D, Nakhre A, Oosterwijk E, Gulec S, Graham MC, Larson SM, Old Lj (1998): Phase I/II radioimmunotherapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody G250 in metastatic renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research 4:27292739. 24. Fossa SD (1988): Is interferon with or without vinblastine the "treatment of choice" in metastatic renal cell carcinoma? The Norwegian Radium Hospital's experience 1983-1986. Semin.Surg.Oncol. 4:178-183. 25. Fowler JEJ (1986): Failure of immunotherapy for metastatic renal cell carcinoma. J.Urol. 135:22-25. 26. Freedman RS, Bowen JM, Herson JH, Wharton JT, Edwards CL, Rutledge FN (1983): Immunotherapy for vulvar carcinoma with virus-modified homologous extracts. Obstet.Gynecol. 62:707-714. 27. Godley PA EM (1998): Renal cell carcinoma. Curr Opin Oncol 10:261-265. 28. Gorer PA (1938): The Antigenetic Basis of Tumour Transplantation. J Path.Bact. 47:231 29. Greiner JW, Hand PH, Schlom J (1984): Enhanced Expression of TAA on Human Breast and Colon TumorCells after recombinant alpha-Interferon treatment. Cancer Res. 44:3208 30. Griffin T, Rybak E, Giordano L (1989): Monoclonal Antibodies as New Antitumor Agents. In: Monoclonal Antibodies: Production and Application, I Alan R.Liss, ed. pp. 335-358. 31. Gross L (1943): Intradermal Immunization of C3H-Mice against a Sarcoma that originates in an Animal of the same Line. Cancer Res. 3:326 - 117 32. Grothey A (1988): Versuche zur aktiven Immuntherapie des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms. Dissertation Uni Bochum/Medizinische Fakultät, 33. Hanna MG, Brandhorst JS, Peters LC (1979): Active specific immunotherapy of residual micrometastasis. cancer immunol.immunother. 7:165-173. 34. Hanna MG, Hoover HC, Peters LC (1987): Fundamental and Applied Aspects of Successful Active Specific Immunotherapy of Cancer. Cancer Biotherapy,Principles and Practice Raven Press,New York:195-221. 35. Hanna MG, Peters LC, Brandhorst JS, Pollack VA (1980): Postoperative spezifische Immuntherapie von Rest-Mikrometastasen: Ergebnisse eines experimentellen Modells. S.M 2:67-75. 36. Hefeneider SA, Conlon PJ, Henney CS, Gillis S (1983): In Vivo Il-2 Administration augments the Generation of Alloreactive Cytolytic TLymphocytes and Resident Natural Killer Cells. J Immunol. 130:222 37. Heicappell R, Ackermann R (1990): Rationale for immunotherapy of renal cell carcinoma. Urol.Res. 18:357-372. 38. Heicappell R, Schirrmacher V, von Hoegen P, Ahlert T, Appelhans B (1986): Prevention of metastatic spread by postoperative immunotherapy with virally modified autologous tumor cells. I. Parameters for optimal therapeutic effects. Int.J.Cancer. 37:569-577. 39. Hellsten S, Johnsen J, Berge T, Linell F (1990): Clinically unrecognized renal cell carcinoma. Diagnostic and pathological aspects. Eur.Urol. 18 Suppl 2:2-3. 40. Hersey P, Edwards A, D'Alessandro G, MacDonald M (1986): Phase II study of vaccinia melanoma cell lysates (VMCL) as adjuvant to surgical treatment of stage II melanoma. II. Effects on cell mediated cytotoxicity and leucocyte dependent antibody activity: immunological effects of VMCL in melanoma patients. Cancer.Immunol.Immunother. 22:221-231. 41. Hersey P, Edwards A, Milton G (1987): Evidence that Treatment with VMCL may improve Survival of Patients with Stage-II-Melanoma. cancer immunol.immunother. 25:257-265. - 118 42. Hinkel A (1995): Aktive spezifische Immuntherapie mit Newcastle-Disease-Virus (NDV)-modifizierten Tumorzellen als postoperative Therapie bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (NZK). 43. Hollinshead A, Stewart TH, Takita H, Dalbow M, Concannon J (1987): Adjuvant specific active lung cancer immunotherapy trials. Tumor- associated antigens. Cancer. 60:1249-1262. 44. Hoover HCJ, Surdyke MG, Dangel RB, Peters LC, Hanna MGJ (1985): Prospectively randomized trial of adjuvant active-specific immunotherapy for human colorectal cancer. Cancer. 55:1236-1243. 45. Hrushesky WJ, Murphy GP (1977): Current Status of the Therapy of Advanced Renal Carcinoma. J Surg.Oncol. 9:277 46. Itoh K, Balch CM (1993): Therapeutic Applications of Interleukin-2. Marcel Dekker, New York, pp. 39-48. 47. Jaffee EM. (1999): Immunotherapy of cancer. Ann N Y Acad Sci 886:67-72. 48. Jolles P, Paraf A (1973): Mechanisms of Adjuvant Activity. In: Molacular Biology, Biochemistry and Biophysics, 13 Ed., Kleinzeller et al., ed. Springer, Berlin, pp. 81 49. Kabat EA, Bezer AE (1958): The Effect of Variation in Molecular Weight on the Antigenicity of Dextran in Man. Archs Biochem.Biophys. 78:306 50. Katz SE, Strapira He (1982): Spontaneous Regression of Genitourinary Cancer-an Update. J.Urol. 128:1-4. 51. Kawakami Y, Rosenberg SA (1998): Identification of new melanoma epitopes on melanosomal proteins recognized by tumor infiltrating T lymphocytes restricted by HLA-A1, -A2, and A3-alleles. J.Immunol. 161:6985-6992. 52. Kirchner H (1982): Interferons as Antitumor Agents. J Cancer Res.clin.Oncol. 103:1 53. Kirchner H, Anton P, Atzpodien J (1995): Adjuvant treatment of locally advanced renal cancer with autologous virus-modified tumor vaccines. World J Urol 13:171-173. - 119 54. Kjaer M (1976): Prognostic Value of Tumor-directed Cell-mediated Hypersensitivity detected by Means of the Leucocyte Migration Technique in Patients with Renal Carcinoma. Eur.J.Cancer. 12:889 55. Klein G, Sjögren HO, Hellström KE (1960): Demonstation of Resistance against Methyl-cholanthrene-induced Sarcomas in the Primary Authochtonous Host. Cancer Res. 20:1561 56. Klein J (1991): Immunologie. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 57. Klippel KF, Jacobi GH, Schulte-Wissermann H (1981): Aktive Immuntherapie beim metastasierenden Hypernephrom. Aktuelle Urologie 12:161-165. 58. Kochevar J (1990): Blockage of autonomous growth of ACHN cells by anti-renal cell carcinoma monoclonal antibody 5F4. Cancer.Res. 50:2968-2972. 59. Kovacs G, Szucs S, de Riese W, Baumgartel H (1987): Specific chromosome aberration in human renal cell carcinoma. Int.J.Cancer. 40:171-178. 60. Krech RH, Fonatsch C, Peters B, Löhrs U (1989): Morphologie und Wachstumsfraktion von Nierenzellkarzinomen des Menschen in Korrelation zu zytogenetischen Daten. Verh.Dtsch.Ges.Pathol. 73:409-414. 61. Krup OC, Kroll I, Bose G, Falkenberg FW (1999): Cytokine depot formulations as adjuvants for tumor vaccines. Liposome-encapsulated Il-2 as a depot formulation. J Immunother 22:525-538. 62. La Vecchia C, Levi F, Lucchini F, Negri E (1992): Descriptive Epidemiology of Kidney Cancer in Europe. Journal of Nephrology 5 No. 1:37-43. 63. Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC (1998): Patterns of relapse and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy. Cancer J Sci Am. 4:86-93. 64. Lehner B, Schlag P, Liebrich W, Schirrmacher V (1990): Postoperative active specific immunization in curatively resected colorectal cancer patients with a virus-modified autologous tumor cell vaccine. Cancer.Immunol.Immunother. 32:173-178. - 120 65. Liebrich W, Schlag P, Manasterski M, Lehner B, Stohr M, Moller P, Schirrmacher V (1991): In vitro and clinical characterisation of a Newcastle disease virusmodified autologous tumour cell vaccine for treatment of colorectal cancer patients. Eur.J.Cancer. 27:703-710. 66. Ljungberg B, Roos G (1990): Value of DNA analysis for treatment of renal cell carcinoma. Eur.Urol. 18 Suppl 2:31-32. 67. Loh A, Sgouros G, O´Donoghue JA, Deland D, Puri D, Capitelli P, Humm JL, Larson SM, Old LJ, Divgi CR (1998): Pharmacokinetic model of iodine131-G250 antibody in renal cell carcinoma. Journal of Nuclear Medicine 39:484-489. 68. Lorence RM, Rood PA, Kelley KW (1988): Newcastle disease virus as an antineoplastic agent: induction of tumor necrosis factor-alpha and augmentation of its cytotoxicity. J.Natl.Cancer.Inst. 80:1305-1312. 69. Lotze MT, Chang AE, Rosenberg SA (1986): High dose rIl-2 in the Treatment of Patients with Disseminated Cancer. J.Am.Med.Assoc. 256:3117-3124. 70. Luiten RM, Coney LR, Fleuren GJ, Warnaar SO, Litvinov SV (1996): Generation of chimeric bispecific G250/anti-CD3 monoclonal antibody, a tool to combat renal cell carcinoma. Br.J Cancer 74:735-744. 71. Maloney KE, Norman RW, Lee CL, Millard OH, Welch JP (1991): Cytogenetic abnormalities associated with renal cell carcinoma. J Urol 146:692-696. 72. McCune CS, deKernion J, Huben RP, Pontes JE (1984): Specific Immunotherapy vs. Megace for Metastatic Renal Cell Carcinoma. A Prospective Randomized Trial. J.Urol. part 2:178A, abstract 300. 73. McCune CS, O'Donnell RW, Marquis DM, Sahasrabudhe DM (1990): Renal cell carcinoma treated by vaccines for active specific immunotherapy: correlation of survival with skin testing by autologous tumor cells. Cancer.Immunol.Immunother. 32:62-66. 74. McCune CS, Patterson WB, Henshaw EC (1979): Active specific immunotherapy with tumor cells and Corynebacterium parvum: a phase I study. Cancer. 43:1619-1623. - 121 75. McCune CS, Schapira DV, Henshaw EC (1981): Specific immunotherapy of advanced renal carcinoma: evidence for the polyclonality of metastases. Cancer. 47:1984-1987. 76. Meiselman N, Kohn A, Danon D (1967): Electron Microscopic Study of Penetration of NDV into Cells.. Journal of Cell Science 2:71-76. 77. Minasian LM, Motzer RJ, Gluck L, Mazumdar M, Vlamis V, Krown SE (1993): Interferon alfa-2a in advanced renal cell carcinoma: treatment results and survival in 159 patients with long-term follow-up. J Clin.Oncol. 11:13681375. 78. Morrison SL, Schlom J (1990): Recombinant Chimeric Monoclonal Antibodies. Oncology. 3-18. 79. Mostofi FK (1981): Histological Typing of Kidney Tumours. International Histological Classification of Tumours No. 25 WHO Geneva: 80. Murphy GP, Mostofi FK (1965): The Significance of Cytoplasmic Granularity in the Prognosis of Renal Carcinoma. J Urol 48-54. 81. Murray DR, Cassel WA, Moore ME (1977): Viral Oncolysate in The Management of Malignant Melanoma. Cancer 40:680-686. 82. Muss HB (1988): Interferon therapy of Semin.Surg.Oncol. 4:199-203. metastatic renal cell cancer. 83. Nagy E, Huber P, Krell.P.J., Derbyshire JB (1991): Sythesis of NDV-like Envelopes in insect-cells. Journal of General Virology 72:753-756. 84. Nakano E, Fujioka H, Sonoda T (1984): Autologous MLC in Patients with Renal Cell Carcinoma. J.Urol. 131:48 85. Namba M, Miyoshi T, Kanamori T, Ogawa S (1982): Combined effects of 5-FU and Interferon on Proliferation of Human Neoplastic Cells in Culture. J Cancer Res 73:819-824. 86. Neidhart JA, Murphy SG, Hennick LA, Wise HA (1980): Active specific immunotherapy of stage IV renal carcinoma with aggregated tumor antigen adjuvant. Cancer. 46:1128-1134. - 122 87. Nielsen B, Borup Christensen P, Erb K, Jensenius JC, Husby S (1987): A method for the blocking of endogenous immunoglobulin on frozen tissue sections in the screening of human hybridoma antibody in culture supernatants. Hybridoma. 6:103-109. 88. O'Garra A (1989): Interleukins and the immune system 2. Lancet. 1:1003-1005. 89. Oettgen HF, Hellström KE (1989): Principles of Immunology. Cancer Medicine 1029 90. Oosterwijk E, Ruiter DJ, Hoedemaeker PJ, Pauwels EKJ, Jonas U, Zwartendijk J, w, Warnaar SO (1986): Monoclonal antibody G 250 recognizes a determinant present in renal.cell carcinoma and absent from normal kidney. Int.J Cancer 38:489-494. 91. Oosterwijk E, Warnaar SO, Zwartendijk J, van der Velde EA, Fleuren GJ, Cornelisse CJ (1988): Relationship between DNA ploidy, antigen expression and survival in renal cell carcinoma. Int.J.Cancer. 42:703-708. 92. Panelli MC, Bettinotti MP, Lally K, Ohnmacht GA, Li Y, Robbins P, Riker A, Rosenberg SA, Marincola SM (2000): A tumor-infiltrating lymphocyte from a melanoma metastasis with decreased expression of melanoma differentiation antigens recognizes MAGE-12. J.Immunol. 164:4382-4392. 93. Pantel K, Izbicki JR, Angstwurm M, Braun S, Passlick B, Karg O, Thetter O, Riethmuller G (1993): Immunocytological detection of bone marrow micrometastasis in operable non-small cell lung cancer. Cancer Res. 53:1027-1031. 94. Peters LC, Hanna MGJ (1980): Active specific immunotherapy of established micrometastasis: effect of cryopreservation procedures on tumor cell immunogenicity in guinea pigs. J.Natl.Cancer.Inst. 64:1521-1525. 95. Pomer S., Thiele R, Schirrmacher V, Staehler G (1991): Sequential treatment of patients with advanced renal cell carcinoma with autologous tumor vaccine and subcutaneous administration of recombinant interleukin-2 and interferon alpha 2b. World J Urol 9:223-227. 96. Pomer S., Thiele R, Staehler G (1989): Die Behandlung des fortgeschrittenen NZK mittels kombinierter Vakzinierung mit modifiziertem autologen - 123 Tumormaterial und Il-2; Methodencharakterisierung und vorläufige Ergebnisse. Aktuelle Onkologie 57:28-37. 97. Prager MD, Baechtel FS (1973): Methods for Modification of Cancer Cell to Enhance their Antigenicity. In: Methods in Cancer Research, 9 Ed., Academic Press, ed. New York, pp. 339 98. Prager MD, Baechtel FS, Greene C (1981): Specific Immunotherapy of Human Metastatic Renal Cell Carcinoma. Clinical Investigations abstract:163 99. Quesada JR, Gutterman JU (1986): Clinical Toxicity of Interferons in Cancer Patients. J Clin.Oncol. 4:234-243. 100. Rauschmeier HA (1988): Immunotherapy Semin.Surg.Oncol. 4:169-173. of metastatic renal cancer. 101. Reimer M (1996): Herstellung von IL-2 enthaltenden Liposomen und deren Koppelung an B-16 Tumorzellen. 102. Repmann R, Wagner, Richter A (1997): Adjuvant therapy of renal cell carcinoma with active-specific-immunotherapy (ASI) using autologous tumor vaccine . Anticancer Res 17:2879-2882. 103. Reuter VE (1990): Antigen Expression in Renal Cell Carcinoma. Eur Urol 18 (suppl.2):4-5. 104. Riethmuller G, Schlimok G, Pantel K, Angstwurm M, Izbicki J, Karg O, Stade BG, Johnson JP (1992): Metastasis formation in human solid tumors: phenotypic characteristics of early metastatic cells. Behring.Inst.Mitt. 204-209. 105. Roitt IMeal (1992): Encyclopedia of Immunology. Academic press, 106. Roos G, Ljungberg B (1990): DNA content in renal cell carcinoma and its clinical significance. Eur.Urol. 18 Suppl 2:29-30. 107. Rosenberg SA (1990): Adoptive Immuntherapie von Krebs. Wissenschaft Juli:56-64. Spektrum der 108. Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, Chang AE, Ettinghausen SE, Matory YL, Skibber JM, Shiloni E, Vetto JT, et al (1985): Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells - 124 and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N.Engl.J.Med. 313:1485-1492. 109. Rott R (1965): Untersuchungen über die Feinstruktur des infektiösen Partikels der Newcastle-Disease. Zentralblatt der Veterinärmedizin 12:74-116. 110. Russel SJ (1990): Lymphokine Gene Therapy for Cancer. Immunol.Today. 11, No.6:196-200. 111. Sarna G, Figlin R, De Kernion J (1987): Interferon in Renal Cell Carcinoma. Cancer 59:610-612. 112. Scharfe T, Becht E, Hohenfellner R (1986): active immunotherapy of stage 4 renal cell cancer using autologous tumor cells. World J Urol 3:245-248. 113. Schemera B, Toro H, Herbst W, Kaleta EF (1987): Konjunktivitis und Störungen des Allgemeinbefindens beim Menschen durch Infektion mit dem Virus der Newcastle-Krankheit. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 94:383-384. 114. Schild H, von Hoegen P, Schirrmacher V (1989): Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. II. Augmented tumor-specific T cell response as a result of CD4+ and CD8+ immune T cell cooperation. Cancer.Immunol.Immunother. 28:22-28. 115. Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, Ahlert T, Gerhards R, Ertel C (1999): Human tumor cell modification by virus infection: an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle disease virus. Gene Ther 6:63-73. 116. Schirrmacher V (1979): Tumor metastases and cell-mediated immunity in a model system in DBA/2 mice. V. Transfer of protective immunity with H-2 identical immune T cells from B10.D2 mice. Int.J.Cancer. 24:80-86. 117. Schirrmacher V (1990): Krebsimpfung mit Tumorzellen. Wissenschaft Januar:38-50. Spektrum der 118. Schirrmacher V (1991): Immunologie. Thieme, pp. 185-203. 119. Schirrmacher V (1992): Immunity and metastasis: in situ activation of protective T cells by virus modified cancer vaccines. Cancer.Surv. 13:129-154. - 125 120. Schirrmacher V, Ahlert T, Heicappell R, Appelhans B, von Hoegen P (1986): Successful Application of non-Oncogenic Virusses for Antimetastatic Cancer Immunotherapy. Cancer Rev. 5:19-49. 121. Schirrmacher V, Bosslet K, Shantz G, Clauer K, Hubsch D (1979): Tumor metastases and cell-mediated immunity in a model system in DBA/2 mice. IV. Antigenic differences between a metastasizing variant and the parental tumor line revealed by cytotoxic T lymphocytes. Int.J.Cancer. 23:245-252. 122. Schirrmacher V, Griesbach A, Zangemeister U (1994): Gamma-Irradiated Viable Tumor Cells as Whole-Cell Vaccines can stimulate in Situ Syngeneic Antitumor Cytotoxic T-Lymphocytes and Delayed-Type Hypersensitivity whereas Tumor Cell Lysates elicit only Delayed-Type Hypersensitivity Reactivity. Vaccine Research 3:31-48. 123. Schirrmacher V, Heicappell R (1987): Prevention of Metastatic Spread by Postoperative Immunotherapy with Virally Modified Autologous Tumour Cells. II. Establishment of Specific Systemic Antitumour Immunity. Clin.Exp.Metastasis. 5:147-156. 124. Schirrmacher V, Shantz G, Clauer K, Komitowski D, Zimmermann HP, Lohmann Matthes ML (1979): Tumor metastases and cell-mediated immunity in a model system in DBA/2 mice. I. Tumor invasiveness in vitro and metastasis formation in vivo. Int.J.Cancer. 23:233-244. 125. Schirrmacher V, von Hoegen P (1993): Importance of Tumor Cell Membrane Integrity and Viability for Cytotoxic T-Lymphocyte Activation by Cancer Vaccines. Vaccine Research 2:183-196. 126. Schirrmacher V, von Hoegen P, Griesbach A, Schild HJ, Zangemeister Wittke U (1991): Specific eradication of micrometastases by transfer of tumourimmune T cells from major-histocompatibility-complex congenic mice. Cancer.Immunol.Immunother. 32:373-381. 127. Schirrmacher V, von Hoegen P, Schlag P, Ahlert T, Bastert G (1989): Cancer Metastasis. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 157-170. 128. Schlag P, Manasterski M, Gerneth T, Hohenberger P, Dueck M, Herfarth C, Liebrich W, Schirrmacher V (1992): Active specific immunotherapy with Newcastle-disease-virus- modified autologous tumor cells following - 126 resection of liver metastases in colorectal cancer. First evaluation of clinical response of a phase II-trial. Cancer.Immunol.Immunother. 35:325-330. 129. Schlimok G, Funke I, Holzmann B, Gottlinger G, Schmidt G, Hauser H, Swierkot S, Warnecke HH, Schneider B, Koprowski H, et al (1987): Micrometastatic cancer cells in bone marrow: in vitro detection with anti-cytokeratin and in vivo labeling with anti-17-1A monoclonal antibodies. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84:8672-8676. 130. Schlimok G, Funke I, Pantel K, Strobel F, Lindemann F, Witte J, Riethmuller G (1991): Micrometastatic tumour cells in bone marrow of patients with gastric cancer: methodological aspects of detection and prognostic significance. Eur.J Cancer 27:1461-1465. 131. Schreiber H (1989): Fundamental Immunology. Raven press Ltd., New York, pp. 923-955. 132. Schumacher K (1989): New immunologic methods in cancer therapy. Versicherungsmedizin. 41:42-48. 133. Schwaab T, Heaney JA, Schned AR, Harris RD, Cole BF, Noelle RJ, Phillips DM, Stempowsky L, Ernstoff MS (2000): A randomized phase-II-trial comparing two different sequence combinations of autologous vaccine and human recombinant interferon gamma and human recombinant interferon alpha2B therapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: clinical outcome and analysis of immunological parameters. J Urol 163:1322-1327. 134. Shawler DL, Bartholomew RM, Smith LM, Dillman RO (1985): Human immune response to multiple injections of murine monoclonal IgG. J.Immunol. 135:1530-1535. 135. Singh M, Kralovec J, Mezei M, Ghose T (1989): Inhibition of Renal Cancer by Methotrexate Linked to a Monoclonal Antibody. J.Urol. 141:428-431. 136. Skinner DG, Colvin RB, Vermillion CD, Pfister RC, Leadbetter WF (1971): Diagnosis and Management of Renal Cell Carcinoma. Cancer 28:11651177. 137. Steffens MG, Boermann OC, Oosterwijk-Wakka JC, Oosterhoff GO, Witjes JA, Koenders EB, Oyen WJ, Buijs WC, Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk - 127 E (1997): Targeting of renal cell carcinoma with iodine-131-labeled chimeric monoclonal antibody G250. J.Clin.Oncol. 15:1529-1537. 138. Steffens MG, Boermann OC, Oyen WJ, Kniest PH, Witjes JA, Oosterhoff GO, van Leenders GJ, Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk E, Oosterwijk E (1999): Intratumoral distribution of two consecutive injections of chimeric antibody G250 in primary renal cell carcinoma: implications for fractioned dose radioimmunotherappy. Cancer.Res. 59:1615-1619. 139. Steffens MG, Oosterwijk-Wakka JC, Zegwaart-Hagemeier NE, Boermann OC, Debruyne FM, Corstens FH, Oosterwijk E (1999): immunohistochemical analysis of tumor antigen saturation following injection of monoclonal antibody G250. Anticancer research 19 (2A):1197-1200. 140. Steffens MG, Oosterwijk E, Zegwaart-Hagemeier NE, van´t Hoff MA, Debruyne FM, Corstens FH, Boermann OC (1998): Immunohistochemical analysis of intratumoral heterogeneity of [131I]cG250 antibody uptake in primary renal cell carcinomas. Br.J.Cancer. 78:1208-1213. 141. Steplewski Z, Chang TH, Koprowski H (1981): Release of Monoclonal Antibodydefined Antigens by Human Carcinoma Cells. Cancer Res. 41:2723 142. Storkel S, Thoenes W, Jacobi GH, Engelmann U, Lippold R (1990): Prognostic parameters of renal cell carcinoma. Eur.Urol. 18 Suppl 2:36-37. 143. Swanson D, Quesada JR (1988): Interferon Therapy for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Semin.Surg.Oncol. 4:174-177. 144. Tallberg T, Kalima T, Dabek J (1987): Postoperative ASI with Supportive Biomodulating Measures in Patients Suffering from Malignant Gastric Cancer. TumorDiagnostik und Therapie 8:49-53. 145. Tallberg T, Kalima T, Halttunen P, Tykka H, Mahlberg K, Matous B, Sundell B (1986): Postoperative active specific immunotherapy with supportive measures in patients suffering from recurrent metastasized melanoma: case reports of six patients. J.Surg.Oncol. 33:115-119. 146. Tallberg T, Tykka H (1986): Specific Active Immunotherapy in Advanced Renal Cell Carcinoma: A Clinical Longterm Follow-Up Study. World J Urol 3:234-244. - 128 147. Tallberg T, Tykka H, Mahlberg K, Halttunen P, Lehtonen T, Kalima T, Sarna S (1985): Active specific immunotherapy with supportive measures in the treatment of palliatively nephrectomized, renal adenocarcinoma patients. A thirteen-year follow-up study. Eur.Urol. 11:233-243. 148. Tallberg T, Tykkä H (1986): specific active immunotherapy in advanced renal cell carcinoma: A clinical longterm follow-up study. World J Urol 3:234-244. 149. Teyssier JR, Ferre D (1990): Chromosomal Changes in Renal Cell Carcinoma. Cancer.Genet.Cytogenet. 45:197-205. 150. Thoenes W, Rumpelt HJ, Storkel S (1990): Classification of renal cell carcinoma/tumors and their relationship to the nephron-collecting tubules system. Klin.Wochenschr. 68:1102-1111. 151. Thoenes W, Storkel S, Rumpelt HJ (1986): Histopathology and classification of renal cell tumors (adenomas, oncocytomas and carcinomas). The basic cytological and histopathological elements and their use for diagnostics. Pathol.Res.Pract. 181:125-143. 152. Thoenes W, Storkel S, Rumpelt HJ, Jacobi GH (1986): Renal cell carcinoma-a classification based on cytomorphological criteria. Zentralbl.Allg.Pathol. 132:503-513. 153. Topalian SL, Rosenberg SA (1990): Tumor-Infiltrating Lymphocytes. Oncology. 19-41. 154. Topalian SL, Solomon D, Avis FP, Chang AE, Freerksen DL, Linehan WM, Lotze MT, Robertson CN, Seipp CA, Simon P, et al (1988): Immunotherapy of patients with advanced cancer using tumor- infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2: a pilot study. J.Clin.Oncol. 6:839-853. 155. Tykka H, Oravisto KJ, Lehtonen T, Sarna S, Tallberg T (1978): Active specific immunotherapy of advanced renal-cell carcinoma. Eur.Urol. 4:250-258. 156. Tykkä H, Hjelt L, Tallberg T (1974): Disappearance of Lung-Metastases during Immunotherapy in five Patients Suffering from Renal Carcinoma. Scand J Resp Dis 89 (suppl.):123-134. - 129 157. Urba WJ, Steis RG, Longo DL, Kopp WC, Maluish AE, Marcon L, Nelson DL, Stevenson HC, Clark JW (1990): Immunomodulatory properties and toxicity of interleukin 2 in patients with cancer. Cancer.Res. 50:185-192. 158. van der Hout AH, Kok K, van den Berg A, Oosterhuis JW, Carritt B, Buys CH (1988): Direct molecular analysis of a deletion of 3p in tumors from patients with sporadic renal cell carcinoma. Cancer.Genet.Cytogenet. 32:281-285. 159. van Dijk J, Warnaar SO, van Eendenburg JD, Thienpont M, Braakman E, Boot JH, Fleuren GJ, Bolhuis RL (1989): Induction of tumor-cell lysis by bi-specific monoclonal antibodies recognizing renal-cell carcinoma and CD3 antigen. Int.J Cancer 43:344-349. 160. von Hoegen P, Heicappell R, Griesbach A, Altevogt P, Schirrmacher V (1989): Prevention of metastatic spread by postoperative immunotherapy with virally modified autologous tumor cells. III. Postoperative activation of tumor-specific CTLP from mice with metastases requires stimulation with the specific antigen plus additional signals. Invasion.Metastasis. 9:117-133. 161. von Hoegen P, Weber E, Schirrmacher V (1988): Modification of tumor cells by a low dose of Newcastle disease virus. Augmentation of the tumor-specific T cell response in the absence of an anti-viral response. Eur.J.Immunol. 18:1159-1166. 162. Waldmann TA (1993): The IL-2/IL-2 receptor system: A target for rational immune intervention. Immunol.Today. 14:264-270. 163. Weaver DJ, Michalski K, Miles J (1988): Cytogenetic analysis in renal cell carcinoma: correlation with tumor aggressiveness. Cancer.Res. 48:28872889. 164. Wei#müller J, König HJ, Schrott KM (1990): Vindesin und Ifosfamid mit und ohne IFN-alpha 2b in der Behandlung des progredient metastasierenden NZK. Aktuelle Onkologie 57:23 165. Williams RD (1990): Immunotherapy of advanced renal cancer. Eur.Urol. 18 Suppl 2:46-47. 166. Wolchok JD MR (2000): Management of renal cell carcinoma. (Huntingt). 14:29-34. Oncology - 130 167. Wunderlich M, Schiessel R, Rainer H, Rauhs R, Kovats E, Schemper M, Dittrich C, Micksche M, Sedlacek HH (1985): Effect of adjuvant chemo- or immunotherapy on the prognosis of colorectal cancer operated for cure. Br.J.Surg. 72 Suppl:107-110. 168. Zangemeister Wittke U, Kyewski B, Schirrmacher V (1989): Recruitment and activation of tumor-specific immune T cells in situ. CD8+ cells predominate the secondary response in sponge matrices and exert both delayed-type hypersensitivity-like and cytotoxic T lymphocyte activity. J.Immunol. 143:379-385. 169. Zangemeister U, Thiede K, Schirrmacher V (1989): Recruitment and activation of tumor-specific immune T cells in situ: functional studies using a sponge matrix model. Int.J.Cancer. 43:310-316. Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Opferkuch für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. Ganz besonders danke ich Herr Prof. Dr. F.W. Falkenberg, nicht alleine für die Überlassung des Themas, sondern auch für die ständige Diskussionsbereitschaft und für die freundliche, engagierte und versierte Betreuung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. Senge und Herrn Prof. Dr. Hertle danke ich für die klinische Unterstützung und Begleitung meiner Arbeit. Herrn Dr. J. Alefelder danke ich herzlich für seinen wirklich unermüdlichen Einsatz, neben ihm danke ich Herrn Priv.-Doz. Dr. de Riese und Herrn Dr. Brinkmann für die Arbeit mit den Patienten. Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Morgenroth und seiner Mitarbeiterin Frau A. Koch vom Institut für Pathologie der RUB, die entscheidend zum Gelingen der elektronenmikroskopischen Experimente beigetragen haben. Ein besonderes Dankeschön gilt meinem Studienkollegen und Vorreiter in dieser Studie, Herrn Dr. A. Hinkel, der wichtige methodische Vorarbeit geleistet hat und mit dem ich Teile der Studie gemeinsam erarbeitet habe. Herrn Dr. O. Krup danke ich herzlich für die kritische Durchsicht des Manuskripts und für viele wertvolle Hinweise, darüber hinaus gilt mein Dank allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Falkenberg für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung. Herrn Dr. S. Pickelmann möchte ich ganz besonders herzlich danken für die ständige `Online-Hilfe´ in allen Fragen zur Abfassung wissenschaftlicher Texte, unverzichtbar war mir seine Hilfe insbesondere bei der Statistik und der Literaturverwaltung. Meinem Bruder Severin Laumann danke ich für die Hilfe beim Layout und seinen Schwiegereltern für die Überlassung des multimedialen Büros. Meinen Eltern danke ich für die Korrektur des Manuskripts. Der letzte aber innigste Dank gilt meiner Frau Annette Laumann, die mich nicht nur immer wieder neu motiviert und unterstützt hat, sondern die auch selbst viel Zeit investierte, indem sie mich zu bestimmten Zeiten immer wieder meiner väterlichen Pflichten entband. Curriculum vitae Name: Dominik Thomas Heinrich Laumann Geburtsdatum: 8. Dezember 1966 Geburtsort: Kenzingen/Breisgau Eltern: Agnes Maria Laumann, geb. Bohne, Lehrerin Klemens August Laumann, Oberstudienrat Konfession: Römisch-Katholisch Familienstand: verheiratet seit dem 19.6.1992 mit Annette Laumann, geb. Pielhau, drei Kinder Grundschule: 1972 - 1976 Gymnasium: 1976 - 1985 Zivildienst: 1985 - 1987 Alten- und Krankenpflege im Dietrich-BonhoefferAltenzentrum, Lüdenscheid Studium: 1987 - 1992 Studium der Humanmedizin an der Ruhruniversität Bochum, Physikum, 1. Abschnitt ärztliche Prüfung 1991/92 Auslandsjahr an der Université Louis-Pasteur-France in Straßburg/Frankreich 1992 - 1994 Fortsetzung des Studiums an der Universität zu Köln, 2.Abschnitt ärztliche Prüfung 1994 Praktisches Jahr im Krankenhaus Merheim und im Hôpital La Chaux de Fonds, Schweiz, Wahlfach Neurologie, 3. Abschnitt ärztliche Prüfung Grundschule Langeoog und Albert-SchweitzerGrundschule Lüdenscheid Bergstadt-Gymnasium Lüdenscheid, abgeschlossen mit dem Abitur 6/85 Approbation: Dezember 1994, Vollapprobation 12/1996 Ärztl. Tätigkeit: 1995/96 Arzt im Praktikum der Neurologischen Abteilung des Krankenhauses Köln-Merheim Weiterbildungsassistent im Fach Psychiatrie in der Evangel. Nervenklinik Stiftung Tannenhof Remscheid Weiterbildungsassistent im Fach Psychiatrie in den Rheinischen Kliniken Köln 1996/97 seit 1997 Ich versichere hiermit, daß die Arbeit selbständig und ohne unerlaubte Hilfe durchgeführt, verfaßt und in dieser oder ähnlicher Form noch bei keiner anderen Abteilung oder entsprechenden Einrichtung einer Hochschule eingereicht worden ist. Köln, 03.06.00 _____________________________________
