Hinweis

Hinweis
Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmen
des Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besseren
Durchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter das
eingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, die
Texterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichen
Dateien mit Fehlern behaftet.
Alle mehr als 700 Protokolle (Anfang 2007) können auf der Seite
http://www.chids.de/veranstaltungen/uebungen_experimentalvortrag.html
eingesehen und heruntergeladen werden.
Zudem stehen auf der Seite www.chids.de weitere Versuche, Lernzirkel und
Staatsexamensarbeiten bereit.
Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007
Protokoll zum Experimentalvortrag
A
Il-
SS 1996
Barbara Scharf
Chemie in der Schule: www.chids.de
Gliederung des Vortrags:
Aminosäuren - Peptide - Proteine
1. Aminosäuren
- Struktur - Löslichkeit - Reaktionen -
2. Peptidbindung
- Peptidsynthese-
3. Proteine
- Struktur - Eigenschaften - Reaktionen
Versuche:
I . Löslichkeit von Tyrosin
2. Reaktion von Glycin mit Ninhydrin
3. Peptid- Sythese im Carbonat- Puffer
a) Synthese eines Oligopeptids aus Methionin- Einheiten
b) Biuret- Reaktion des Peptids
c) Hydrolyse des Peptids und Nachweis der Produkte
d) Chromatographie der Hydrolyseprodukte
4. Geschwindigkeit und Produkte der BOC- Abspaltung
5. Tyndall- Effekt einer Eiklarlösung
6. Xanthoprotein- Reaktion
7. PAULY'sche Probe
8. Ringprobe nach HOPKINS/ COLE
o
Chemie in der Schule: www.chids.de
1. Aminosäuren
Eine biochemisch besonders wichtige Gruppe substituierter Carbonsäuren sind
die Aminosäuren, die Bausteine der Eiweiße. Alle natürlich vorkommenden
Aminosäuren enthalten in u- Ste1hmg eine NH2- Gruppe als zweite funktionelle
Gruppe. Sie lassen sich durch folgende allgemeine Formel darstellen:
10 /Q-H
H
"C
/
"
I
IN-C-H
H'"
I
R
In den Aminosäuren finden intramolekulare Protonenübergänge statt:
10 /Q-H
"
/
H
C
"
I
IN-C-H
H'" RI
-
10,
-----.
./-~
/~e
H "c
I I
H-N-C-H
~ I
I
H R
Zwitterionform
Im festen Zustand liegen alle Aminosäuren in der Zwitterionform vor. Deshalb
haben sie alle relativ hohe Schmelztemperaturen (Salzähnlichkeit!). Der pHWert, bei dem die Aminosäuren in wässriger Lösung außschließlich in dieser
Zwitterionform vorliegen, wird als isoelektrischer Punkt (IEP) bezeichnet.
Aufgrund der hier aufgehobenen Hydrophilie der Amino- und Carboxylgruppe
haben die Aminosäuren dort ein Löslichkeitsminimum.
Einen wichtigen Beweis für das Vorliegen des Zwitterions im festen Zustand
liefern RAMAN- und IR- spektroskopische Untersuchungen, aus denen das
Fehlen der typischen NH r und COOH- Absorptionen hervorgeht.
Es gibt zwanzig proteinogene Aminosäuren (Aminosäuren, aus denen die
natürlichen Proteine aufgebaut sind) , die sich aufgrund ihrer Reste in fünf
Gruppen einteilen lassen:
1
Chemie in der Schule: www.chids.de
1. Aminosäuren mit aliphatischem, ungeladenem Rest
caae
I
H3N-C-H
I
H
(f)
Caa
(f)
e
I
H3N-C-H
I
CH3
Glycin
(f)
e
caa e
I
H3N-C-H
(f)
I
CH2
I
CH
H3C"'" 'CH3
H-t-C H3
I
C H2
I
C H3
Leuein
Isoleuein
I
H3N-C-H
I
CH
" ....CH3
H3C
Alanin
caa
(f)
I
H3N-C-H
caae
Valin
caa e
I H
(f) C/
H N/ ' CH
2,
I 2
H2CCH2
Prolln
2. Aminosäuren mit polarem, ungeladenem Rest
caae
I
H3N-C-H
I
C H2
I
aH
(f)
Serin
Caae
I
H3N-C-H
I
CH2
I
CH2
I
S
I
C H3
(f)
Methionin
caa e
I
H3N-C-H
I
H-c-aH
I
CH3
Caa e
I
H3N-C-H
I
CH2
I
SH
Threonin
Cystein
(f)
(f)
caa e
I
H3N-C-H
I
CH2
I
H2N
/C~
a
Asparagin
(f)
caa e
I
H3N-C-H
I
CH2
I
CH2
I
C
H2N/ ~a
(f)
Glutamin
2
Chemie in der Schule: www.chids.de
3. Aminosäuren mit aromatischem Rest
OH
Phenylalanin
Tyrosin
Tryptophan
4. Aminosäuren mit positiv geladenem Rest (basische Aminosäuren)
coo?
@ I
H3N-C-H
I
C H2
I
C-NH
:eH
11
HC-N@
H
Arginin
Lysin
Histidin
5. Aminosäuren mit negativ geladenem Rest (saure Aminosäuren)
COOe
I
H3N-C-H
I
CH2
I
CH2
I
tt>
COOe
Aspartat
Glutamat
3
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die isoelektrischen Punkte sowie die Löslichkeit der Aminosäuren in Wasser sind
in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:
Aminosäure
Glvcin
Alanin
Valin
Leuein
Isoleuein
Prolin
Serin
Treonin
Cystein
Methionin
IEP
Löslichkeit in
H 2 0 , [gJ/IOO ml
(T= 25°C)
24,99 5,97
16,65 6,01
8,85 5,96
2,43 5,98
4,12 6,02
16,23 6,30
5,00 5,68
20,50 6,16
5,02
3,50 5,74
Löslichkeit in
820' [gJ/lOO ml
(T= 25°C)
2,98
3,60
2,96
0,045
1,14
Aminosäure
Asparagin
Glutamin
Phenylalanin
Tyrosin
Tryptophan
Lysin
Arginin
Histidin
Asparaginsäure
Glutaminsäure
0,43
0,50
0,86
IEP
5,41
5,65
5,48
5,66
5,89
9,82
10,76
7,59
2,77
3,24
Tabelle 1
Alle Aminosäuren (außer Glycin mit einem Wasserstoffatom als Rest R) haben
am u- Kohlenstoffatom ein chirales Zentrum und können sowohl in der D- als
auch in der L- Konfiguration vorkommen und sind damit optisch aktiv
(nachstehend dargestellt am Beispiel des Alanins) :
ccce
\
H-C-NH3
I Et>
CH3
L- Alanin
H
D- Alanin
H
4
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die in der Natur vorkommenden Aminosäuren liegen in der Regel in der
L-Konfiguration vor.
Wie man aus Tabelle 1 entnehmen kann, ist das Löslichkeitsverhalten der
Aminosäuren in reinem Wasser sehr unterschiedlich. Während sich bei
Raumtemperatur Glycin mit 24,99 g/ 100 ml H2 0 sehr gut in Wasser löst, so ist
Tyrosin mit nur 0,045 g/ 100 ml H20 relativ schwerlöslich. Die Löslichkeit von
Aminosäuren ist allerdings stark pH- abhängig. So löst sich die Aminosäure
Tyrosin zwar sehr schlecht in reinem Wasser, ist aber in verdünnten Säuren und
Laugen gut löslich.
Versuch: Löslichkeit l'on Tyrosin
0,15 g Tyrosin werden in ca. 40 ml Wasser suspendiert. Unter Rühren wird Natronlauge
(c(NaOH)= 1 mol/I) zugetropfl:. Nach Zugabe von ca. 2 ml Lauge hat sich die Aminosäure
vollständig gelöst. Die Lösung wird mit einigen Tropfen Phenolphthalein versetzt und
anschließend mit Salzsäure(c(HCI)= 1 mol/l) versetzt.
Kurz nach Erreichen des Äquivalenzpunktes fällt die Aminosäure wieder aus. Wird Salzsäure
im Überschuß zugegeben, so geht diese wieder in Lösung.
Dieser Effekt beruht auf der Deprotonierung der NB}+- Gruppe, bzw. wird ab
pH 9 auch die OH- Gruppe des Phenolrestes deprotoniert,- es ensteht ein Anion.
Unter Säurezugabe findet wieder Protonierung statt, wobei die Aminosäure am
IEP als Zwitterion ausfällt. Bei weiterer Säurezugabe findet die Protonierung der
Carbonsäuregruppe statt, das entstehende Kation geht in Lösung.
COOH
t±l I
H3N-C-H
I
Q
OH
COOH
I
H2N-C-H
I
-
+OH-/-H20
+H+
COoe
I
H3N-C-H
I
(j)
Q Q
..
+OH-/-H20
OH
OH
+H+
COoe
I
H2N-C-H
I
COoe
I
H2N-C- H
I
Q Q
-
+OH-/-H20
+H+
OH
IQl e
5
Chemie in der Schule: www.chids.de
Ein Nachweis für Aminosäuren ist deren charakteristische Reaktion mit
Ninhydrin.
Versuch: Reaktion der Aminosäure Glvcin mit Ninhvdrin
Eine Spatelspitze Glycin wird in Wasser gelöst und mit einer wässrigen Ninhydrin- Lösung
versetzt. Beim Erhitzen färbt sich die Lösung blau- violett.
Hierbei reagieren zwei Moleküle Ninhydrin mit einem Molekül Aminosäure unter
Abspaltung von CO 2 und Aldehyd zu einem violetten Farbstoffinolekül.
+
C02
+
Das vorstehender Reaktionsschema, das man in einer Vielzahl von Lehrbüchern
findet, gibt allerdings keinen Aufschluß über den Reaktionsmechanismus.
6
Chemie in der Schule: www.chids.de
Das oben formulierte Ninhydrinhydrat liegt in wässriger Lösung im
Gleichgewicht mit freiem Ninhydrin vor:
/0'
/0'
11
O::C,~--H
~ I
c'C'oJ
'I
11
I
\0/
H
O::C
/0'
8
I
,
-
/0'
11
-
~
~
'C/ ~
,
C \O~H
11
\0/
I +.
O::CI C
11
- H2C)
-+H2C) -
'C=~
~
H
11
\0/
Am positiv polarisierten Kohlenstoffstom der mittleren Ketogruppe erfolgt der
Angriff der Aminosäure über das freie Elektronenpaar des Stickstoffs der
Aminogruppe. Ein Angriff an den anderen bei den Ketogruppen des Ninhydrins
erfolgt nicht, da diese durch den Elektronendruck des Aromaten nicht
ausreichend positiv polarisiert sind. Es ergibt sich folgendes Reaktionsschema:
7
Chemie in der Schule: www.chids.de
Reaktionsmechanismus der Ninhvdrinprobe
'Q'
:~---[,\
-
,
,
/ ':' = N \ / M
~--..c
C
P
/ 1,
~1
cI' :·,
. : H ~ )~ '~() i
H
.~ '---" ", ,,?.. =
( :',
f{
l
. CO;
'~ """' ---" .'
H
I
{ .\ :d lrt\lnd....··rr. 31,
. s ..:: tll lr· ~ a.~C .1
.,
~l\/ ,.;) i;
/'J
~\../ 'l l
~ ~//
"
H
;:
, R--C/
~
,
lj
j
H
// ~"
'c- . ·. " ~... ~}=:~ (/ ii
'
I!
u ' \~
"
,'",,,
..\ 1...
~
,
,':-..~ /'-~
' Em ol)
-. ~ :"
I
't j'
,
"
.~ \.:,
'C- \ = C/
i
.. 11-=
;~ c//
i
10 !
'-~
·
\. ~
iI
C
~
,
:1
C-_.,,/~
'c '=' ~; - . . //
~~/
'I
, I,) ,
,0 /
"c'--''-.../
rv
,0,.
(Dikctumnatuon r
Farbst eif der ~ mh \in n p r or.: )
I hlauvioleuer
KET = Keto-Enol- Taurorncn e
GBS = Geschw mdigkcusbcsu nuncnder Schr itt
Chemie in der Schule: www.chids.de
2. Peptide
Durch Reaktion von Aminosäuren untereinander entstehen Peptide. Diese
Reaktion kann man, zumindest formal, folgendermaßen formulieren:
------
H ,. . .0. . . . .
R2
I ,,- I
~O/
H2N-C- C- N-C-C
+ H2Ü
I
I I
'OH
R1
H H
Die resultierende Bindung wird als Peptidbindung bezeichnet. Die vorstehend
formulierte Reaktion läuft allerdings nicht spontan ab. Sie ist endergonisch und
damit liegt das Gleichgewicht vollständig auf der Seite der Edukte.
Die Verschiebung des Gleichgewichts auf die Seite der Produkte erreicht man,
wenn man bei geeigneten Reaktionsbedingungen von den aktivierten
Aminosäuren ausgeht. Die Aktivierung besteht in der Verknüpfung einer
Abgangsgruppe mit dem Acylkohlenstoffatom der Carboxykomponente der
Aminosäuren. In der Peptidsynthese finden u.a. folgende Derivate Verwendung:
Acylchloride:
/0
-C:.-',
SOCI2
~
OH
/0
-C:.-',
Acylazide:
~H.t/NaN02/H+
~
OH
/0
-C:.-'
,
CI
/0
-C:.-',
N3
/0
-C:.-',
Aktive Ester:
O-R
Die Aminolyse der reaktiven Carboxylderivate verläuft dann gemäß dem folgenen
Schema:
+
-
~
+
HX
9
Chemie in der Schule: www.chids.de
Im Versuch soll ein Peptid aus Methionin- Einheiten synthetisiert werden. Im
synthetisierten Produkt wird anhand einer Farbreaktion die Peptidbindung
nachgewiesen. Die Hydrolyse des Reaktionsproduktes liefert wieder die freien
Aminosäuren, die chromatographisch untersucht werden.
Versuch: Peptid- Synthese im Carbonatpuffer
1. Peptidsynthese
2 g Methionin- methylester- hydrochlorid und 2 g Glycin werden in 40 ml Carbonatpuffer
(pH= 9,5) gelöst und 40 mg Papain (katalysierendes Enzym) zugegeben. Die Reaktion erfolgt
in ca. 60 Minuten im Wasserbad (T= 40°C). Nach bereits 15 Minuten beginnt sich die zunächst
klare Lösung zu trüben und ein weißer, gelatinöser Niederschlag fällt aus.
Das Reaktionsprodukt wird abfiltriert und so lange mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat keine
positive Ninhydrin- Reaktion mehr zeigt (ca. 5x mit je 20 ml H20) .
2. Biuret- Reaktion des Peptids
Mit einem Teil des in 1. erhaltenen Niederschlages wird die Biuret- Reaktion durchgefuhrt.
Dazu löst man eine Spatelspitze des Peptids in ca. 3ml NaOH
(c(NaOH)= 2 mol/I) und gibt einige Tropfen Kupfersulfat- Lösung
(w(CuS04)= 0,1) hinzu. Die eventuell etwas trübe Lösung zeigt bald die blau- violette
Färbung des Kupfer- Peptid- Komplexes.
3. Hydrolyse des Peptids
Ein Teil des Reaktionsproduktes aus 1. wird mit 5 ml HClkonz unter Erwärmen ca. 5 Minuten
hydrolysiert. Man filtriert vom ungelösten Niederschlag ab, neutraliert durch Zugabe von
NaOH- Plätzchen und fuhrt die Ninhydrin- Probe durch .
Die Lösung verfärbt sich bald violett , was auf Anwesenheit freier Aminosäuren schließen läßt.
4. Chromatographische Untersuchung der Hydrolyseprodukte
Es werden 2 DC-Chromatogramme angefertigt. Dazu löst man je eine Spatel spitze der
Aminosäuren Methionin- methylester- hydrochlorid, Glycin und D-/L-Methionin in
Isopropanol (w=0,2) und stellt ferner eine Mischung der drei Aminosäure- Lösungen her. Die
unter 3. gewonnen Hydrolyse- Produkte werden direkt aufgetragen (Darstellung der
Chromatogramme s.u.).
Als Fließmittel dient eine Mischung aus Isopropanol, Ameisensäure und Wasser im Verhältniss
40 : 2 : 10.
Dauer: 60 - 70 min.
10
Chemie in der Schule: www.chids.de
\ 'ersuchsführung : Peptid -Synthese im Carbonatpuffer
:
Carbonat - Puffer pH
=9,5
L -M€t h i o ni n-m ethy : e ste~
I
i
i
:
!
Peptid - Synthese
I
I
j
i
.
G :YCIn
D
I
I
I
.
apam
8iuret - Reakt ion
L .
Niede rschlag
Niederschlag
abfiltrieren und
waschen
Niederschlag
hydrolysieren
Ninhydrin - Reaktio n
Filtrat
Filtrieren
Chemie in der Schule: www.chids.de
;111
\ 'Iechanismus der papainkatalvsierten Peptidsynthese
Tetraedische Zwischenform (2)
syn thetisierte Peptidbindung (1)
:s
!
H
G
r>.
I
\
f
\
i(3) (2)\
(4)
,
L" "
~
. .
.. 1/1)
-"c.-.1G
t.
\
Papain
Aminosäureester (4)
Aminokomponente
Hi s
A
'>
\ h N1
HN -:.r
NH2
!
HCR
I
X
/C~
~O i
Chemie in der Schule: www.chids.de
Thioester (3)
·
.
,
.
.
,
- ':
.. ....
;~ ~.
": ~~
.,. ' .. .
~
'-.
'...
.'""f\-'';;;'
,
~:.~'"
.-:..:.:....
'
..
..
"
'
10.'. '
, , (-
-
1
r...-_
2
_
.
3
4
5
._ _
Darstellung der Chromatogramme
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
L- Methionin- methylester- hydroch lorid
Glycin
D,L- Methionin
Mischung (1) - (3)
Hydrolysat (4 Tropfen)
Hydrolysat (8 Tropfen)
Chemie in der Schule: www.chids.de
6
Die Bildung der Peptidbindung erfolgt nach dem vorstehenden Mechanismus.
Das Vorliegen der COHN- Gruppe wird durch die Biuret- Probe nachgewiesen.
Hierbei wird zunächst durch die zugegebene Natronlauge am Stickstoff der
Peptidbindung das Proton abgespalten. Das Peptid koordiniert über die freien
Elektronenpaare der Stickstoffatome der Peptidbindung an den
Koordinationsstellen des Cu(II)- Ions. Es entsteht ein verzerrt oktaedrischer
Komplex, bei dem zwei Moleküle des Peptids die Koordinationsstellen entlang
der x - und y- Achse besetzen. Die beiden Stellen entlang der z- Achse sind durch
H20- Moleküle besetzt.
/
HN,
RHC
/
C=O
:NH
2
O=C
'CHR
+ [Cu(H20)6]2+ +
20H-
/
HN,
/
C=O
RHC
;NH
F\/
H- C, e
0-- / N
--------
~
--C
R
I
~C"' ~
\
C~O
I
~ N <,H / H
C--
2+
cu~
H H~
O~C
\
I
R
_/C~O
N
8'c_H
/ 'R
Der entstehende Komplex ist blau- violett gefärbt.
14
Chemie in der Schule: www.chids.de
Nun ist erwiesen, das aus den eingesetzten Aminosäuren ein Peptid entstanden
ist. Hydrolysiert man dieses Peptid, erhält man wieder die freien Aminosäuren.
Wie im Versuch beschrieben, zeigt das filtrierte und neutralisierte Hydrolysat
eine positive Ninhydrin- Reaktion. Da diese Reaktion allerdings keinen
Aufschluß darüber gibt aus welchen Aminosäuren dieses besteht, wird eine Probe
des Hydrolysats chromatographiert. Der nachstehenden Darstellung der
Chromatogramme kann man entnehmen, daß dieses aus Methionin, Glycin und
einer weiteren Komponente besteht, die anhand der aufgetragenen
Vergleichssubstanzen nicht identifiziert werden kann. Hierbei handelt es sich um
nicht hydrolysierte Oligopeptide. Das synthetisierte Peptid besteht nur aus
Methionin- Einheiten. Glycin wird nachweislich nicht eingebaut. Man hat
festgestellt, daß die Anwesenheit von Glycin die Fällung der Oligopeptide
begünstigt. Die Tatsache, daß es trotzdem im Hydrolysat enthalten ist und damit
auch im Chromatogramm erscheint liegt daran, daß es am Peptid adsorbiert und
nicht gut ausgewaschen werden kann.
Darstellung der Chromatogramme
1. Methionin- methylster- hydrochlorid
2. Glycin
3. D-/ L- Methionin
4. Gemisch aus 1 - 3
5. Hydrolysat (4 Tropfen)
6. Hydrolysat (6 Tropfen)
15/ 1
Chemie in der Schule: www.chids.de
Peptidsynthese
Die Natur synthetisiert Proteine (Peptide mit großer Anzahl verknüpfter
Aminosäuren) durch schrittweisen Aufbau. Diesen Weg verfolgt der Chemiker im
allgemeinen auch im Labor. Die Bildung eines Dipeptids ohne funktionelle
Gruppen in den Seitenketten durch Kondensation zweier Aminosäuren unter
Eliminierung von Wasser läßt sich wie bereits erwähnt formal nach folgendem
Schema darstellen:
+
---
H 0
R2
I "
I
~O
H2N-C-C- N-C-C
+
I
I I
'OH
R1
H H
H2Ü
Es ist klar, daß diese Umwandlung nicht eindeutig verlaufen würde, selbst wenn
sie chemisch durchführbar wäre, was in der abgebildeten vereinfachten Form
nicht der Fall ist. Hier kann zwischen den Aminogruppen und den
Carboxylgruppen nicht unterschieden werden, das Produkt würde gemeinsam mit
den Dipeptiden Cl), (2) und (4) und den Polykondensationsprodukten aller vier
möglichen Dipeptide entstehen:
Die kontrollierte Synthese von (3) würde die Blockienmg (=Schutz) der
Aminogruppe (=Carboxylkomponente) an einem Reaktionspartner und der
Carboxylgruppe (=Aminokomponente) am anderen Partner, die nachfolgende
Kondensation (=Kupplullg) und anschließend die Entfernung der Schutzgruppen
vom Zwischenprodukt (=Deblockierung) erfordem- ein Miniumum von vier
getrennten Reaktionen! Die weitere Umsetzung von (3) zum Tripeptid würde
außerdem voraussetzen, daß PI ohne Angriff auf P 2 abgespalten werden kann,
d.h. PI und P 2 sollten orthogonal sein. Dies würde für die Synthese des Tripeptids
aus den freien Aminosäuren mindestens acht seperate Reaktionen bedeuten.
15 /'2..
Chemie in der Schule: www.chids.de
Schema zur Darstellung eines Dipeptides
OH
H
OH
H
i
H
OH
ii
iii
OH
H
i Blockierung
ii Kupplung
iii doppelte Deblockierung
Schema zur Darstellung eines Tripeptides
H
OH
P1
i
p3
ii
OH
H
iii
P ,)
iv
H
OH
i Blockierung
ii selektive Deblockierung
iii Kupplung
iv doppelte Deblockierung
16
Chemie in der Schule: www.chids.de
Eine Erschwerung ergibt sich ferner dadurch, daß funktionelle Seitenketten der
Aminosäuren bei den Reaktionen, die zur Bildung der Peptidbindung zur
Verfügung stehen, in gewissem Maße stören und für gewöhnlich eine
Blockierung erfordern, die zumindest zu einer der für den Schutz der a-Funktion
gewählten Methoden orthogonal ist, was die Auswahl begrenzt und die ZaW der
Arbeitsgänge erhöht.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß bei der Peptidsynthese von den
aktivierten Aminosäuren ausgegangen werden muß, erhöht sich die Anzahl der
Schritte nochmals (nachstehend als Schema für die Synthese eines Dipeptids):
H
OH
H
i
OH
i
OH
ii
X
H
iii
iv
H
OH
Blockierung
ii Aktivierung
iii
Kupplung
iv doppelte Deblockierung
Die Auswahl der zur Blockierung der Amino- bzw. Carboxylgruppe der
Aminosäuren einführbaren Schutzgruppen erfordert eine gute Kombinationsgabe
des Chemikers. Die nachstehend aufgeführten Schutzgruppen unterscheiden sich
in Einführbarkeit und Abspaltbarkeit.
17
Chemie in der Schule: www.chids.de
Schutzgruppen
1.) u- Carboxylschutzgruppen
Methyl- und Ethylester
Benzylester
r-Butylester
Phenylester
2.) u- Aminoschutzgruppen
Benzyloxycarbonyl (Z)- Blockierung
<>CH2-0-~-NHo
CH3
t- Butyloxycarbonyl (Boc)- Blockierung
I
11
CH3-C-O-C-NH·Y.W
I
CH3
2-(4-Biphenylyl)-isopropoxycarbonyl
(Bpoc)- Blockierung
9- Fluorenylmethoxycarbonyl
(Fmoc)- Blockierung
0
Me
0
I
11
C-O-C-NHI
Me
H
~
CH2-0-C-NH-
18
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die Anforderungen an eine temporäre Schutzgruppe sind leichte Einfuhrbarkeit,
geringes Reaktionsverm ögen und gute Abspaltbarkeit, wobei sich der
abgespaltene Rest gut vom Reaktionsgemisch abtrennen lassen sollte.
Anband eines Versuches soll die Abspaltbarkeit der Aminoschutzgruppe
tert- Butyloxycarbonyl (BOC- Schutzgruppe) demonstriert werden. Die
Einführung dieser Schutzgruppe erfolgt z.B. mit Di- tert- butyldicarbonat. Als
Ausgangssubstanz für den Versuch dient BOC- Glycin. Dessen Synthese läßt sich
im Labor nachvollziehen, nicht aber dessen Isolierung, da BOC- Glycin sehr
schlecht kristallisiert. Daher wird das käufliche Präparat verwendet.
Die BOC- Schutzgruppe ist stabil gegen Basen wird aber unter Einwirkung von
starken Säuren abgespalten. Bei der BOC- Abspaltung handelt es sich um eine
sehr zuverlässig funktionierende und schnelle Reaktion der organischen Chemie.
Der schnelle Reaktionsverlauf kann optisch verfolgt werden, da bei der
Umsetzung gasförmige Produkte entstehen.
Versuch: Geschwindigkeit und Produkte der BOC- Abspaltung
1. Herstellung der Lösungen
a) Abspaltungsreagenz: 980 mg (10mmol) H 2S0 4 konz werden mit Eisessig zu 10 ml
Lösung aufgefullt. ~ c(H 2S0 4)= 1 mol/l
b) BOC- Glycin- Lsg :
1,75 g BOC- Glycin (10 mmol) werden in 8,15 ml Eisessig
gelöst. Man erhält 10 ml Lösung mit c(BOC-Glycin) = 1 molll
c) Ca(OH)2- Lsg :
Man suspendiert 74,1 mg Ca(OH)2 in 100 ml H20 und filtriert
durch einen Papierfilter
2. BOC- Abspaltung
Im 50 ml 2- Halskolben werden 3 ml Abspaltungsreagenz vorgelegt. Nach Zugabe von 3 ml
BOC- Glycin- Lösung wird der Kolben verschlossen und der Magnetrührer eingeschaltet (evtl.
etwas erwärmen).Das entstehende Gas wird in die Calciumhydroxid- Lösung eingeleitet, aus
der bald farbloses Calciumcarbonat ausfällt.
Die Geschwindigkeit der Reaktion hängt von den Konzentrationen sowie von der Temperatur
ab. Bei den oben angegebenen Mengen enstehen bei 25°C pro Minute ca. 80 ml Gas .
Während das Reaktionsprodukt eine positive Ninhydrin- Reaktion zeigt, findet mit BOC Glycin keine Bildung des Ninhydrin- Farbstoffes statt , da die Aminogruppe geschützt ist.
19
Chemie in der Schule: www.chids.de
Mechanismus der BOC-Abspaltung
CH3
1 H
H3C - C - 0 "
/
I
'C-NI
C H3
"CH;r-COOH
8
CH3
I -:-..
H
H3C-C-0
(
I
'C-N
C H3 11
CH;r-COOH
.......01
H
$
C H3
-
1
CH3-... / o-c-c H3
c"
I
11
CH3
,0/
1-
H+
+ CH3COOH
1
+ H+
$
H3N,
CHz-COOH
CH3C0 0 8
20
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die BOC- Gruppe läßt sich mit starken Säuren sehr schnell abspalten, weil das
intermediär enstehende tertiäre Carbemium- Ion durch induktive Effekte
stabilisiert ist
(~
MARKOWNIKOW-Regel bei der Addition an 2-
Methylpropen). Dieses Kation reagiert jedoch sofort weiter und kann entweder
durch Abspaltung eines Protons
eines Nucleophils wie H20
(~2-
Methlypropen) oder durch Anlagerung
(~tert- Butanol)
oder Essigsäure
(~
Essigsäure- tert-
butylester) eine ungeladene Verbindung bilden. Die Carbaminsäurefunktion, die
am N- Terminus zurückbleibt ist im sauren Milieu instabil und zerfällt sofort .
Dabei wird CO 2 freigesetzt, welches aus der Lösung entweicht, so daß die freie
Aminofunktion zurückbleibt. Die überschüssige Säure protoniert die
Aminofunktion. Die Ammoniumsalzbildung schützt vor einer Weiterreaktion mit
anderen Produkten (C02 oder Alken) .
In der Praxis führt man die BOC- Abspaltung mit Trifluoressigsäure/
Methansulfonsäure in Dichlormethan als Lösungsmittel durch . Diese
Substanzen sind für den Schulversuch (lmd dieser Versuch ist ein Schulversuch)
allerdings weniger geeignet.
21
Chemie in der Schule: www.chids.de
3. Proteine
Durch Kondensation von Aminosäuren erhält man Peptide. Bei einer Anzahl von
bis zu 10 verknüpften Aminosäuren bezeichnet man diese als Oligopeptide, bis zu
100 Einheiten als Polypeptide und ab 100 verknüpften Aminosäureeinheiten
spricht man von Proteinen. Die Struktur der Proteine ist sehr komplex. Man
unterscheidet vier Struktureinheiten, die einander über- bzw untergeordnet sind.
Primärstruktur
Als Primärstruktur der Proteine bezeichnet man die Aminosäuresequenz.
Hierunter versteht man die Abfolge der verknüpften Aminosäuren im Protein.
Bei der Schreibweise ist darauf zu achten, daß die N- terminale Aminosäure
immer links steht. Die Abfolge Ala - Tyr - Val - Leu entspricht damit folgenem
Peptid:
H 0
1
11
H H 0
1
I
11
H H 0
I
I
11
H H
I
I
H2N-C-C -N-C -C-N-C-C-N-C-COOH
I
I
I
I
C~
C~
CH
C~
/ ,
I
H3C
CH3
CH
H3C"'" 'CH3
OH
Alanin
Tyrosin
Valin
Leuein
Sekundärstruktur
Betrachten wir zunächst die Peptidbindung:
22
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die relativ kurze C-N- Bindung in der Peptidbindung (132 pm) im Gegensatz zur
"normalen" C-N -
0'-
Bindung (147 pm) zeigt, das ihr in gewissem Maße
Doppelbindungscharakter zukommt:
Mesomerie der Peptidbindung
Die tatsächliche Elektronenanordnung liegt zwischen den formulierten
Grenzstrukturen. Der partielle Doppelbindungscharakter hat Konsequenzen für
die Struktur. Die freie Drehbarkeit ist aufgehoben, es ergeben sich mit der cisund trans- Form zwei in einer Ebene liegende Konformationen der Peptidbindung:
R
R
CH
CH
I
-:
I
"C-N/
'<,
Ii HI
o
trans- Form
cis- Form
In natürlichen Proteinen liegen die Peptidketten überwiegend in der trans- Form
vor.
Die Peptidketten im Protein liegen nicht als gestreckte Makromoleküle vor. Die
räumliche Anordnung der Polypeptidketten wird als Sekundärstruktur bezeichnet.
Durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Sauerstoff der C=O- Gruppe
und dem Wasserstoff der -NH- Gruppe der Peptidbindungen erfolgt eine Faltung
des Peptidrückgrates. Hierbei unterscheidet man zwischen intramolekularen (sich
innerhalb eines Peptidstranges ausbildende) und intermolekularen ( sich
zwischen zwei Peptidsträngen ausbildende) Wasserstoffbrücken, aus den zwei
mögliche Sekundärstrukturen resultieren.
23
Chemie in der Schule: www.chids.de
Aus den intramolekularen Wasserstoftbrücken ergibt sich die Faltung des
Peptidrückgrates zur u- Helix, die rechts- oder linksgewunden sein kann .
Jede Windung besteht aus 3,66 Aminosäuren. Die Wasserstoffbrücken zwischen
den Peptidbindungen liegen fast parallel zu Achse der Helix.
Sekundärstruktur
o- HeHl.
:24
Chemie in der Schule: www.chids.de
Aus den intermolekular ausgebildeten Wasserstoftbrücken entsteht das
ß- Faltblatt. Die Ketten können parallel (N- terminale Aminosäuren aller Ketten
liegen an einem Ende) oder antiparallel (gegenläufige Richtung der Ketten)
angeordnet sein. Durch diese Faltung des Peptidrückgrats wird die Kette
gestaucht, wobei die Seitenketten der Aminosäuren senkrecht von der Faltfläche
wegstehen. Die Peptidstränge die in dieser Struktur vorliegen sind tatsächlich
kürzer, als die berechnete Länge im gestreckten Molekül.
Sekundärstruktu r
ß- Faltblatt
Die Sekundärstruktur stellt die engergieärmste und damit stabilste
Raumanordnung der Peptidkette dar, da sie die maximale Anzahl H- Brücken
enthält.
25
Chemie in der Schule: www.chids.de
Tertiärstmktur
Als Tertiärstruktur bezeichnet man die spezifische räumliche Anordnung der
helicalen bzw zickzack- gefalteten Peptidketten.
Für die se räumliche Anordnung sind die Bindungen zwischen den Seitenketten
des Makromoleküls verantwortlich .
Mögliche Bind ungsarten im Protein :
CH.
/
CH,
, ,:. ...
-,
~~: '. .
CH~
/
.
'. ~
CH,
.
CHi 01,
\. /
eH
a Atombindung (Schwefelbrücke)
b Ionenbindung
Chemie in der Schule: www.chids.de
c Wasserstoffbrücken
d H vdr cohobc Bind ufi g:= n
26
Quartärstruktur
Oft wiederholen sich Proteinmoleküle mit gleicher Tertiärstruktur in einer
bestimmten Weise. Sie können durch anders strukturierte Abschnitte
unterbrochen werden. Diese komplexen Proteineinheiten bilden die
Quartätstruktur. Erst in diesem Zustand erreichen die meisten Proteine ihre volle
biologische Wirksamkeit. Die Proteinuntereinheiten, die Protorneren, werden
durch Nebenvalenzen zusammengehalten, wobe i Proteinkomplexe aus
identi schen aber auch verschiedenen Protomeren zusammengesetzt sein können .
Das Hämoglobin A beispielsweise besteht aus vier Peptidketten. von denen
j eweils zwei identisch sind (a l und
ß:J
B- Ket ten
2-
Ketten
Löslichkeitsverhaltell von Proteinen
W ie jede einzelne Aminosäure, hat jedes Protein einen isoelektrischen Punkt, bei
dem es LTJ Wasser ein Löslichkeitsminimum aufweist. Da am IEP die
elektrostatischen Anziehungskräfte des Zwitterions zum tragen kommen, wird die
Zusammenlagerung zu größeren Aggregaten begünstigt. Als Folge kann das
Protein ausfallen. Im sauren und basischen erhöht sich die Löslichkeit aufgrund
der Abstoßung gleichgeladener Ionen.
27
Chemie in der Schule: www.chids.de
Im Hinblick auf die komplexen Struktureinheiten der Proteinmoleküle muß man
daran zweifeln, daß sich Proteine in Wasser tatsächlich lösen. Eine echte Lösung
ist "optisch leer", liegt eine Substanz kolloidal in Lösung vor, so zeigt diese den
TYNDALL- Effekt.
Versuch: Tvndall- Effekt einer Eiklar- Lösung
Herstellen der Eiklar- Lösung:
Vier Hühnereiweiß werden mit 400 ml 0,9 %- iger NaCI- Lösung geschüttelt. Anschließend
wird durch Glaswolle filtriert .
Die Eiklarlösung (die man noch nach Belieben verdünnen kann) wird in einer Küvette in einen
Strahlengang eingebracht. Das Licht wird an den kolloidal verteilten Teilchen gebrochen. Man
kann den Lichtstrahl durch die Lösung hindurch verfolgen. Zum Vergleich befullt man die
Küvette mit 0,9%- iger NaCL- Lösung. Diese Lösung ist (annähernd) optisch leer.
Anmerkung: Es ist praktisch unmöglich, eine optisch total leere Lösung zu erhalten, da feine
Staubpartikel, die sich immer in der Raumluft und damit auch in der Lösung befinden, das
Licht ebenfalls brechen. Der Unterschied zwischen den beiden Lösungen ist allerdings
eindeutig erkennbar.
28
Chemie in der Schule: www.chids.de
Farbreaktionen mit Proteinen
Reaktion
Ausführung
reagierende
Bestandteile
Färbung
BIURET
stark alkalische Probe mit
-CO-NH-
violett
Tyrosin
rot-
verd. CUS04- Lsg versetzen
MILLONSCHE
mit Hg(N0 3) 2 versetzen und
brauner
aufkochen
NS
PAULYSCHE
sodaalkalische Probe mit
Tyrosin
rot,
Diazobenzolsulfonsäure
Histidin
rot-gelb
nach W-
versetzen
Zusatz
HOPKINS-
Probe mit Glyoxylsäure-Lsg
COLE
mischen und mit H2S04 konz
Tryptophan
violetter
Ring
unterschichten
SAKAGUCHI
Probe mit alkalischer u-
Arginin
rot
Naphthol-Lsg und
Hypobromit versetzen
XANTHO-
Probe mit HN0 3 konz versetzen Tyrosin
PROTEIN
Phenylalanin
gelb;
nach OHZusatz
orange
29
Chemie in der Schule: www.chids.de
Die vorstehende Tabelle zeigt eine Auswahl an Farbreaktionen mit Proteinen.
Es fällt auf, daß die aufgeführten Reagenzien eigentlich nicht mit dem "Protein"
reagieren, sondern in der Regel mit einem oder mehreren bestimmten Resten der
proteinogenen Aminosäuren. Eine Ausnahme bildet die Biuret- Reaktion, hier ist
der "reagierende Bestandteil" die Peptidgruppe selbst.
Nachstehend werden drei der genannten Farbreaktionen näher beschrieben.
Xanthoprotein- Reaktion
Versuch: Xanthoprotein- Reaktion einer Eiklar- Lösung
3 ml einer Eiklar- Lösung werden mit HN03 konz versetzt. Der weiße Niederschlag färbt sich
beim Erwärmen gelb .
Durch Säurezugabe denaturiert das Protein und fällt als weißer, flockiger
Niederschlag aus. Die Gelbfärbung des Niederschlags nach Erhitzen ist auf die
Bildung gelber Nitro- Derivate der aromatischen Aminosäuebausteine des
Proteins zurückzuführen.
+
Phenylalanin
30
Chemie in der Schule: www.chids.de
PA ULY'sche Probe
Versuch: PA ULY'sche Probe - Nachweis von Histidin im Eiklar
Lösung 1: 0,5 g Sulfanilsäure werden in 5 ml HClkonz gelöst und mit H 20 auf 100 ml
aufgefullt
Lösung 2: 1 g NaNOi 100 ml H 20
Lösung 3: 10 g Na2C03 /100 ml HzO
Eine EiklarIösung wird mit einer 1:1 Mischung aus Lösung 1 + 2 versetzt. Es wird soviel Soda
zugetropft, bis die Lösung leicht alkalisch reagiert. Die Lösung färbt sich aufgrund der
Reaktion der Diazobenzolsulfonsäure mit einem Histidin- Rest im Protein zu einem
Azofarbstoff orange- rot .
1. Bildung des Nitrosylkations
G3
N=O'
-
/'
2. Diazotierung
(f)
<,
+ -N=O/
------------
3. Kupplung
N)R
11
HC,
N
H
31
Chemie in der Schule: www.chids.de
Ringreaktion nach HOPKINS/ eOLE
Versuch: Ringreaktion- Nachweis von Tryptophan im Eiklar
Zu einer Eiklar- Lösung gibt man etwas Eisessig und eine Spur Cu(II)- Ionen (einen Glasstab
kurz in eine Kupfersulfat- Lösung und danach in die Probe tauchen). Die Lösung wird mit
H 2S04 unterschichtet. An der Phasengrenze bildet sich ein violetter Ring .
Eisessig enthält in geringen Mengen Glyoxylsäure, die mit Indolderivaten einen
violetten Farbstoff bildet:
R
~.
~NÄH
+
R
0-'H
~NÄ6-0H
-----
0:-.
',;C-COOH
H/
H
H
R
600H
fr-0
HÄ"NÄ/
H
~
W
N
H
Leukoverbindung
-CO~
R
H N1
R
c~ Q H
c---gf
I //
0..... .
Thermische cis- Eliminierung
~
~~
--~)l~~
H
H
32
Chemie in der Schule: www.chids.de
R
R
~I
+VI
+ HS04- + H30+
~NÄCH2
H
R
[Cu 2+J
.Oxidation
H
R
h-----0
~NÄCH)(N~
~I
H
W
~
I
N
H
H
<±>
R
R
R
)
cu
@
H
~lcH
R
H
R
CCiCH
H
R
H
violetter Farbstoff
33
Chemie in der Schule: www.chids.de
Literatur
Bukatsch, F. und Glöckner, W Experimentelle Schulchemie. Aulis, Köln 1977.
(Band 8)
Christen, H. -R. und Vögtle, F. Gnmdlagen der organischen Chemie. SalleSauerländer, Frankfurt 1989
Devenyi, T und Gergely, J. Analytische Methoden zu Untersuchung von
Aminosäuren, Peptiden und Proteinen. Akademische Verlagsgesellschaft
Frankfurt 1968
Flörke und Wolff. Organische Chemie und Biochemie. Dümmler, Bonn 1984
Hafner, L. Einführung in die Organische Chemie. Schroedel.
Jakubke, H.D. und Jeschkeit, H. Aminosäuren- Peptide - Proteine. Akademie
Verlag Berlin 1969
JUSI, Mund Hradetzky, A. Chemische Schulexperinlente. Volk und Wissen,
Berlin 1987. (Band 4)
Karlson, P. Kurzes Lehrbuch der Biochemie. Thieme, Stuttgart 1980 (11. Aufl.)
Konat, R. K. "Der BOC- Versuch". PdNCh 44, Heft 7,19 (1995)
Latzel, G (Hrsg). "Aminosäuren und Peptide- spezielle Anwendungen"
(Themenheft). PdNCh 45, Heft 3 (1996)
Lehninger, Nelson, Cax.Prinzipien der Biochemie. Spektr. d. Wiss.
Heidelber 1994
Lutz, B. und Müller, V "Cyclodextrin und Papain- Modellreaktionen zur Wirkung
von Enzymen". PdNCh 40, Heft 2,21 ff(1991)
Pi/hafer, W Biochemische Grundversuche. Aulis, Köln. (3. Aufl)
Stapf. H. Chemische Schulversuche. Deutsch, Frankfurt. (Teil 3)
Stryer, L. Biochemie. Spektr. d. Wiss. Heidelberg 1990
34
Chemie in der Schule: www.chids.de