Charakterisierung der Tollwutvakzinen "Rabipur

Aus dem Institut für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der
Jusrus-Liebig-Universität Giessen
Betreuer: Prof. Dr. H.-J. Thiel
Charakterisierung der Tollwutvakzinen "Rabipur" und "Rabivac"
und der enthaltenen Virusstämme
FluryLEP und PM 1503
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Dr. med. vet.
beim Fachbereich Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Giessen
Eingereicht von
Claudia Carolina Lopez Yomayuza
Tierärztin aus Bogota, Kolumbien
Giessen 2009
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
12
TABELLENVERZEICHNIS
14
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
15
1. EINLEITUNG
1.1 Literaturübersicht
1.1.1 Der Erreger
1.1.1a Taxonomie
1.1.1b Epidemiologie
1.1.1c Struktur und Morphologie des Erregers
1.1.ld Replikation
1.1.2 Pathogenese
1.1.2a Übertragung
1.1.2b Inkubationszeit
1.1.2c Virale Infektion und Ausbreitung
1.1.2d Pathologie
1.1.2e Immunologie
1.1.2ea Allgemeine Einführung
1.1.2eb Immunantwort gegen Tollwutvirus
1.1.2ec Zielproteine der antiviralen Immunantwort
1.1.2ed Die Immunantwort nach Impfung gegen Tollwut
1.1.3 Klinische Symptomatik
1.1.4 Diagnose
1.1.5 Therapie
1.1.6 Prophylaxe
1.1.6a Präexpositionelle Immunisierung
1.1.6b Postexpositionelle Prophylaxe (PEP)
1.1.7 .Impfstoffe zur Anwendung beim Menschen
1.1.7a Qualitätskontrolle bei Impfstoffen
1.1.7b Nebenwirkungen
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1.2 Zielsetzung der Arbeit
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2. MATERIAL UND METHODEN
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2.1 Material
2.1.1 Biologisches Material
2.1.1a Versuchstiere
2.1.1b Zellkulruren
2.1.1c Viren
2.1.2 Vakzinen
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INHALTSVERZEICHNIS
2.1.3 Medien und Platten
2.1.3a Medien für Zellkultur
2.1.3b Medien und Platten für die Kultivierung von Bakterien
2.1.4 Zusätze für Medien und Agarplatten
2.1.5 Chemikalien und Reagenzien
2.1.6 Puffer und Lösungen
2.1.6a Häufig verwendete Puffer
2.1.6b Puffer für RT-PCR
2.1.6c Puffer für Sequenzierung
2.1.6d Puffer für SDS-PAGE
2.1.6da Eindimensionale Gelelektrophorese (1-D SDS-PAGE)
2.1.6db Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-D SDS-PAGE)
2.1.6e Puffer für Protein-Transfer auf Membran
2.1.6ea Semi-Dry Transfer
2.1.6eb Nasstransfer
2.1.6f Lösungen für Protein-Färbung
2.1.6fa Coomassie-Färbung
2.1.6fb Silberfärbung
2.1.6g Puffer für die Reinigung der rekombinanten Proteine
2.1.6h Puffer für Kopplung von monoklonalen Antikörpern an
Sepharose G
2.1.6i Puffer für die Reinigung der Antikörper
2.1.6J Puffer für die Biotinylierung von polyklonalen Antikörpern
2.1.6k Puffer für ELISA
2.1.7 Antikörper
2.1.8 Fertige Reagenzien und Kits
2.1.9 Verbrauchsmaterialen
2.1.10 Geräte
2.2 Methoden
2.2.1 Molekularbiologische Methoden
2.2.1a Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
2.2.1aa RNS Isolierung aus Kulturzellen
2.2.1ab Reverse Transkription
2.2.1.ac Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.1b PCR-Analyse von Baculoviren
2.2.1ba DNS-Isolierung aus Virussuspensionen
2.2.1bb Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.1c Agarose-Gelelektrophorese
2.2.ld Herstellung rekombinanter Baculovirus-Transferplasmide
2.2.1e Mini-Präparation von Plasmid-DNS
2.2.lf Restriktionsenzym-Verdau
2.2.1g DNS-Sequenzierung
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1h Auswertung von Sequenzen
2.2.2 Zellbiologische Methoden
2.2.2a Kultivierung von Insektenzellen (SF-21)
2.2.2b Kryokonservierung von Zellen
2.2.2c Trypsinieren von Zellen
2.2.2d Bestimmung der Zellzahl
2.2.2e Transfektion von Insektenzellen
2.2.2f Plaque-Test
2.2.2g Virusvermehrung
2.2.2ga Vermehrung von rekombinanten Baculoviren
2.2.2gb Vermehrung und Reinigung von Tollwutviren
2.2.2h Titration von Tollwutviren
2.2.3 Proteinanalytische Methoden
2.2.3a Proteinbestimmung
"
2.2.3b SDS-PAGE
2.2.3ba Eindimensionale Gelelektrophorese (1-D SDS-PAGE)
2.2.3bb Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-D SDS-PAGE)
2.2.3c Färbung von Proteingelen
2.2.3ca Coomassie-Färbung
2.2.3cb Silberfärbung
2.2.3d Immunoblot
2.2.3e N-terminale Peptid-Sequenzierung
2.2.3f Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight
Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)
2.2.4 Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine
2.2.4a Expression des rekombinanten Glykoproteins (GP) und des
Nukleoproteins (NP) von Tollwutvirus
2.2.4b Reinigung der rekombinanten Proteine
2.2.4ba Affinitäts-Chromatographie
2.2.4bb Elektroelution nach SDS-PAGE
2.2.5 Herstellung von polyklonalen Antikörpern
2.2.6 Fluorescent antibody virus neutralisation test - FAVN-Test
2.2.7 Etablierung eines ELISAs
2.2.7a Reinigung von IgG
2.2.7b Biotinylierung der polyklonalen Antikörper
2.2.7c Durchführung des ELISAs
2.2.7ca Vorbereitung der Proben
2.2.7cb Ablauf des ELISAs
2.2.7d Berechnung der Standardkurve
.
2.2.8 Mikroskopie
2.2.8a Immunfluoreszenz-Mikroskopie
2.2.8aa Direkte Immunfluoreszenz
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.8ab Indirekte Immunfluoreszenz
2.2.8b Immunelektronenmikroskopie
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104
3. ERGEBNISSE
106
3.1 Charakterisierung der Tollwutvirusstämme FluryLEP und PM 1503
3.1.1 Analysen auf der Basis von Nukleinsäuresequenzen
3.1.2 Analysen auf der Basis von Aminosäuresequenzen
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3.2 Gewinnung und Charakterisierung von polyklonalen Seren
3.2.1 Herstellung von rekombinanten Baculoviren
3.2.2 Expression des Glyko-/Nukleoproteins der Tollwutvirusstämme
FluryLEP und PM 1503
3.2.3 Reinigung der rekombinanten Proteine
3.2.4 Herstellung und Charakterisierung polyklonaler Seren
3.2.4a Reaktivität der Seren im Immunoblot
3.2.4b Reaktivität der Seren in der Immunfluoreszenz
3.2.4c Virusneutralisation mit Hilfe der anti-G-Seren
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3.3 Etablierung eines ELISAs
3.3.1 Standardisierung des ELISAs
3.3.2 Qualitätsparameter des ELISAs
3.3.2a Nachweisempfindlichkeit
3.3.2b Reproduzierbarkeit des ELISAs
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3.4. Biochemische Charakterisierung der Impfstoffe „Rabipur" und
„Rabivac"
3.4.1 Quantifizierung des Nukleo-/Glykoproteins in den
Viruskonzentraten und in den Vakzinen „Rabipur" und „Rabivac"
mittels ELISA
3.4.2 Identifizierung von Nukleo-/Glykoprotein mittels
Immunelektronenmikroskopie
3.4.3 Nachweis der Proteine in den Vakzinen „Rabipur" und „Rabivac"
3.4.3a Identifizierung viraler Proteine mittels Immunoblot
3.4.3b Identifizierung von Proteinen mittels N-terminaler PeptidSequenzierung
3.4.3c Identifizierung nicht viraler Proteine mittels Immunoblot
3.4.3d Identifizierung von Proteinen mittels MALDI-TOF MS
3.4.3e Zusammenfassung der Identifizierung von Proteinen in den
Viruskonzentraten der Tollwutvirusstämme FluryLEP und PM 1503
sowie in den entsprechenden Vakzinen „Rabipur" und „Rabivac"
3.5 Gewinnung von Tollwutviruskonzentraten und deren
Charakterisierung
3.5.1 Vermehrung von Tollwutviren
3.5.2 Reinigung von Tollwutviren
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INHALTSVERZEICHNIS
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3.5.3 Charakterisierung der Tollwutviruskonzentrate FL- bzw. FL*
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3.5.3a Elektronenmikroskopische Charakterisierung der FL" bzw. FL* 151
3.5.3b Charakterisierung der FL" bzw. FL* mittels 2-D SDS-PAGE
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4. DISKUSSION
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4.1 Molekulare Charakterisierung der Tollwutvirusstämme FluryLEP und
PM 1503
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4.2 Biochemische Charakterisierung der Tollwutimpfstoffe „Rabipur" und
„Rabivac"
4.2.1 Integrität von Tollwutviruspartikeln
4.2.1a Direkte Untersuchung der Integrität von Tollwutviruspartikeln
4.2.1b Indirekte Untersuchung der Integrität von
Tollwutviruspartikeln
.
4.2.2 Charakterisierung der Proteome von Vakzinen
4.2.2a Identifizierung viraler Proteine
4.2.2b Identifizierung nicht viraler Proteine
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5. ZUSAMMENFASSUNG
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6. SUMMARY
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7. RESUMEN
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8. LITERATURVERZEICHNIS
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