Eine rechnerische Methode zur quantitativen

Breuer, Ise, Döllefeld u. Breuer: Rechnerische Methode zur Bestimmung von Prolin und Citrullin
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KURZMITTEILUNG
Eine rechnerische Methode zur quantitativen Bestimmung
von Prolin und Citrullin bei der automatischen Aminosäurenanalyse
Von J. BREUER, H. ISE, E. DÖLLEFELD und H. BREUER
Aits der Abteilung für Klinische Chemie und Biochemie der Chirurgischen Universitätsklinik und Poliklinik Bonn
(Direktor: Prof. Dr. A. Gütgemann)
(Eingegangen am 2. Mai 1966)
1951 beschrieben MOORE und STEIN (1) ein säulenchromatographisches Verfahren zur Auftrennung von
Aminosäuren an lonenaustauscherharzen („Dowex 50").
Mit Hilfe dieser Methode lassen sich jedoch nicht alle im
Serum und Urin vorkommenden Aminosäuren vollständig voneinander trennen; dadurch kann ihre quantitative Bestimmung auf Schwierigkeiten stoßen. So
werden z. B. Prolin und Citrullin bei der automatischen
Aminosäurenanalyse (Aminosäureanalysator der Fa.
Technicon GmbH, Frankfurt/Main) unter Verwendung
von sulfoniertem Polystyrol (Chromobeadharz A der
Fa. Technicon) als Austauscherharz und der Gradientenelution (steigender pH-Wert von 2,87—10,0) mit Hilfe
der Varigrad-Technik (2,3) nicht voneinander getrennt.
Da andererseits eine Änderung des Elutionsschemas
wegen der zu erwartenden Schwierigkeiten bei der chromatographischen Trennung der übrigen Aminosäuren
nicht zweckmäßig erschien, wurde der Versuch unternommen, Prolin und Citrullin durch ein rechnerisches Verfahren quantitativ zu bestimmen; hierbei erwies es sich
von Vorteil, daß die beiden Aminosäuren mit Ninhydrin
verschiedene Absorptionskurven ergeben. Citrullin
weist bei 570 m/i ein Maximum und bei 455
ein
Minimum auf; im Gegensatz dazu zeigt die Absorptionskurve von Prolin mit Ninhydrin von 600—400 m/j
einen Anstieg ohne ausgeprägtes Maximum. Da bei
der automatischen Aminosäurenanalyse die Extinktionen
sowohl bei 440 m/j als auch bei 570 m/j aufgezeichnet
werden, erlaubt das verschiedene Verhalten der beiden
Aminosäuren bei der Ninhydrin-Reaktion eine rechnerische Ermittlung ihrer Konzentrationen.
Als Maß für die Konzentration einer Aminosäure dient
die Fläche des Extinktionsgipfels der entsprechenden
Aminosäure bei der jeweiligen Wellenlänge. Nach einem
von PICKELS (4) angegebenen Verfahren kann die
Fläche numerisch ermittelt werden. Dabei werden zur
Berechnung der Fläche (a) die Höhe der Kurve abgelesen und (b) die Punkte über der halben Höhe =— als
Maß für die Halb wertsbreite — abgezählt; durch Multiplikation der beiden Parameter (Höhe · Halbwertsbreite)
ergibt sich ein Maß für die Fläche und damit für die
Konzentration der Aminosäure.
Die Berechnung der Konzentrationen von Prolin und
Citrullin wird in folgender Weise vorgenommen, wobei
Norleucin als innerer Standard dient.
Z. klin. Chem. / 4. Jahrg. 1966 / Heft 5
Erläuterung der Symbole
FP,440
FC44
' ° 570
"~
FC570
KC'440 ·
[P]
[C]
=
=
Höhe · Halbwertsbreite von Prolin bei 440
Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Citrullin bei 440
Höhe · Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe· Halbwertsbreite von Prolin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe· Halbwertsbreite von Citrullin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Prolin u. Citrullin bei 440
Höhe · Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Prolin u. Citrullin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Norleucin bei 570
Höhe · Halbwertsbreite von Prolin bei 440
eingesetzte Menge Prolin (mg)
Höhe · Halbwertsbreite von Citrullin bei 440
eingesetzte Menge Citrullin (mg)
Höhe · Halbwertsbreite von Prolin bei 570
eingesetzte Menge Prolin (mg)
Höhe · Halbwertsbreite von Citrullin bei 570
eingesetzte Menge Citrullin (mg)
Konzentration von Prolin (mg/Probe)
Konzentration von Citrullin (mg/Probe)
Bestimmung der Eichfaktoren
In Einzelanalysen wurden bekannte Mengen Prolin und Citrullin
chromatographiert und die Extinktionen der beiden Aminosäuren
mit Ninhydrin bei 440
und 570
ermittelt. Für die einzelnen
Eichfaktoren ergaben sich nach Bestimmung von Höhe · Halbwertsbreite folgende Werte:
10,93mg-1;
KP570 = 1,62mg-1
440
KC570= 25,80 mg
7,19mg
KC'440
Aufstellung der Gleichungen
In Versuchen mit Proliri und Citrullin wurde festgestellt, daß die
Fläche (Höhe · Halbwertsbreite), die durch ein Gemisch der beiden
Aminosäuren gebildet wird, sich additiv aus den Flächen (Höhe
mal Halbwertsbreite) der einzelnen Aminosäuren zusammensetzt.
Daraus ergeben sich folgende Gleichungen:
W
FP570+FC'570
(2)
Da weiterhin die Flächen (Höhe · Halbwertsbreite) den Konzentrationen der einzelnen Aminosäuren proportional sind, gilt:
FP440 = [P] · KP440
r/~i . £ *
440 ^ lA-d
•"^^-'440
FP570 = [P] · KP570
FC670=[C]'KCB70
0)
.
(A\
v /
W
(<Q
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Buchbesprechungen
Die Gleichungen (/) und (2) können unter Verwendung der
Gleichungen (5) bis (6) wie folgt umgeformt werden:
F140 =[P]-KC 4 4 0 +[q-KC 4 1 0
F670 =[P].KP 5 7 0 +[C]-KC 5 7 0
'
(7)
(8)
Aus den Gleichungen (7) und (S) ergibt sich für [P] und [CJ:
[PJ:
)
'
KC440 -
670
5:
— FS70 · KC
440
KP
· KC440
graphischer Trennung Prolin und Citrullin auf rechnerischem Wege mit genügender Genauigkeit quantitativ
bestimmt werden können. — Das hier angegebene Verfahren läßt sich in analoger Weise auch zur quantitativen
Bestimmung anderer, chromatographisch nicht trennbarer Substanzpaare anwenden.
Tab. 1.
670
^570 " *
— KCß70 · KP,440
(10)
Formeln zur Berechnung von Prolin und
Citrullin
Setzt man in die Gleichungen (9) und (10) die Eichfaktoren für Prolin und Citrullin bei 440 und 570
ein,
so erhält man folgende Formeln zur Berechnung der
Konzentrationen von Prolin und Citrullin:
[P] (mg/Probe) = (F440 - 25,80 - F570 - 7,19) - 0,0037
[C] (mg/Probe) = (F570 - 10,93 - F440 · 1,62) - 0,0037
(//)
(12)
Anwendung der Formeln
Um festzustellen, ob mit Hilfe der Formeln (11) und (12)
brauchbare Ergebnisse erzielt werden können, wurden
die in Tabelle l angegebenen Versuche durchgeführt.
Daraus geht hervor, daß trotz fehlender chromato-
Rechnerische Bestimmung der Wiederfindung von Prolin und
Citrullin nach Chromatographie bekannter Mengen der beiden
Aminosäuren unter Verwendung der im Text angegebenen Formeln
Die Chromatographie der Aminosäuren erfolgte mit dem Aminosäurcanalysator (Fa.
Technicon, Frankfurt/Main) unter Verwendung von Chromöbeadharz A; Dauer des
Ohromatogramms 10,5 Stdn.; Durchflußgeschwindigkeit 0,95 m//Min.
Eingesetzte
Höhe· Halbwertsbreite
Aminosäure in &
F
Prolin
Citrullin
440
FSTO
23,0
23,0
23,0
23,0
23,0
23,0
23,0
23,0
34,5
34,5
35,0
35,0
35,0
35,0
35,0
35,0
52,6
52,6
35,0
35,0
0,48
0,52
0,53
0,49
0,49
0,51
0,60
0,64
0,63
0,65
0,95
0,97
1,00
0,93
0,95
1,00
1,38
1,42
1,00
0,98
Wiederfindung
in o/
/o
Prolin
Citrullin
92
106
105
97
95
97
94
102
98
101
100
100
105
98
102
107
98
99
103
102
Literatur
1. MOORE, S. und W. H. STEIN, J. biol. Chemistry 190, 663 (1951).
— 2. PETERSON, E. A. und H. A. SOBER, Analytic. Chem. 31, 857
(1959). — 3. PIEZ, K. A. und L. MORRIS, Analyt. Biochem. (New
York) /, 187 (1960). —4. PICKELS, D. W., zit. nach G. BRAUNITZER,
Angew. Chem. Ausg. A 72, 485 (1960).
Professor Dr. H. Breuer
Chirurgische Universitätsklinik
. 53 Bonn-Venusberg
BUCHBESPRECHUNGEN
Agonie. Physiologisch-chemische Untersuchungen bei gewaltsamen Todesarten. Von W. LAVES und S. BERG, unter Mitarbeit
von M. ASANO. (Bd. 2 der Reihe Arbeitsmetboden der medizinischen
und naturwissenschaftlichen Kriminalistik. Hrsg. von E. WEINIG und
S. BERG). 176 S., 59 Abb., 24 Tab., DM 80,—.
Max-Schmidt-Römhild-Verlag, Lübeck (1965).
Bekanntlich hat der gerichtliche Mediziner bei Anwendung der
herkömmlichen morphologischen Untersuchungsmethoden sehr
oft große Schwierigkeiten, wenn es gilt, die „letzte Todesursache" zuverlässig festzustellen. Für die rechtliche Würdigung
des Anteiles fremden Verschuldens an Todesfällen ist aber eine
genaue Überprüfung der Ursachenkette, die zum Todesgeschehen
geführt hat, nötig. Das entscheidende Verdienst der Verfasser ist
es, die bisherigen Kenntnisse über die agonalen StoffwechselVorgänge kritisch auf ihre Anwendungsmöglichkeit in der gerichtlich-medizinischen Diagnostik geprüft zu haben. Die Verfasser sind besonders dazu berufen, weil sie selbst maßgeblich
dabei beteiligt waren. — Die Monographie ist so angelegt, daß
einerseits der Nichtfachmann in die aktuelle Fragestellung eingeführt wird; andererseits wird der gerichtlich-medizinisch inter-"
essierte Arzt, der mit den biochemischen Untersuchungsmethoden
nicht so vertraut ist, die Möglichkeit haben, in den einzelnen
Kapiteln sich über die physiologisch-chemische Bedeutung der
verwandten Systeme, über die gängigen Bestimmungsmethoden
und über ihren Beweiswert zu unterrichten. — Die Grundkonzeption geht von der Feststellung aus, daß in der Agonie die
morphologisch faßbaren Veränderungen immer dürftiger Werden,
während die chemischen Veränderungen im Blut an Intensität
zunehmen. Dabei wird zwischen Todesfällen ohne Agonie
(schlagartiger Tod bei „überdimensionalen Gewalteinwirkungen",
z. B. Flugzeugabstürze), der kurzen Agonie (Tod nach traumatischphysikalischer oder toxischer Einwirkung, u. a. auch plötzlicher
Tod, Herzinfarkt), der protrahierten Agonie (verschiedene chronische Erkrankungen) und der durch Reanimation verlängerten
Agonie unterschieden (LAVES). Die Aussichten für eine Abgrenzung der agonalen Veränderungen gegenüber postmortalen Veränderungen sind bei frühen Obduktionen (bis 48 Stunden nach
dem Tode) am günstigsten. Die rechtliche Bedeutung einer
genauen Feststellung der vorliegenden Agonieform wird deutlich
gemacht. Für den in den Reanimationszentren tätigen Arzt sind
diese Ausführungen besonders wichtig; für den Sachverständigen
kommt es hier darauf an, die Frage nach dem Todeszeitpunkt so
genau wie möglich abzugrenzen. Die Verfasser selbst betonen,
daß mit der vorliegenden Mitteilung nur ein erster Schritt in
dieser Richtung getan ist und wollen ihre Monographie nur als
Anregung aufgefaßt wissen, sich mit dem Problem der „Chemie
der Agonie" näher zu beschäftigen. Es wird dabei nicht übersehen, daß die erhaltenen Befunde nur ein Teil in der Beweiskette
sind, und daß Umstände und Sektionsbefund sorgfältig mitberücksichtigt werden müssen. Die Fülle der zusammengetragenen
Ergebnisse stehen einem Referieren von Einzelheiten entgegen;
einige Beispiele jedoch seien wegen ihrer Wichtigkeit angeführt.
Besonders aussichtsreich erscheint die spektrophotometrische
Untersuchung des Blutserums nach LAVES, mit der das Auftreten
von Nucleotiden (AMP, ADP, ATP) erfaßt werden kann. Nach
Z. klin. Chem. / 4. Jahrg. 1966 / Heft 5