Frage der Substrataktivierung in Isocitrat-Lyase - ETH E

Diss. ETH Nr. 9539
Zur
Frage
der
bzw.
Substrataktivierung
in
den
von
Isocitrat-Lyase,
1,4-Dihydroxy-2-naphthoat-Synthetase
Reaktionen
katalysierten
ABHANDLUNG
zur
Erlangung
Doktors der
des Titeis eines
Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
von
IVOHUBACEK
dipl. chem. ETH
geboren
von
am
23. Juli 1958
Usti nad Labern / CSFR
Angenommen auf Antrag
Prof. Dr. D.
Prof. Dr. W.
Arigoni,
von
Referent
Simon, Korreferent
Zürich
1991
Sf
215
ZUSAMMENFASSUNG
A) Isocitrat-Lyase ist ein Enzym, das im Glyoxylatcyclus die
versible
Ueberfuhrung
Bernsteinsäure
fensichtliche
in
(2) und Glyoxylsäure (3) katalysiert. Um die nicht
of¬
Substrataktivierung
erklären,
zu
gestellt, das die Bildung
eines
Aktivierugsschritt
der
wurde
1) Durch Synthese
enzymgebundenen
Citronensäure
markierten
Bernsteinsäuren
annimmt.
Arbeiten
Zur
durchgeführt:
und 180-monomarkierten
spezifisch
indizierten
13C- und 180-
mono¬
(103)
und (104) anderseits erhielt man zu¬
Verfügung stehenden 180-mehrfach indi¬
zur
Bernsteinsäure
auf¬
Isocitrylamids als
und der 180-mehrfach
(125)
einerseits und der
mit der bereits
sammen
zierten
(115)
spezifisch 13C-
von
und
(111)
Schema
ein
Spaltungsreaktion
Ueberprüfung dieses Postulats wurden folgende
Citronensäuren
re¬
(1)
vor
Isocitronensäure
(2R,3S)
von
(142)
die
Durchführung
zur
der
geplanten
Untersuchungen geeigneten Spezies.
2) Nachdem
man
sich durch ein
Kontrollexperiment davon über¬
zeugt hat, dass bei der Ueberfuhrung
Isocitronensäure
Austausch
die
mit dem
Sauerstoffe
Lösungsmittel
eingehen, wurden zwei Sätze
wurden
der
von
bestehend
Dehydrogenase
steinsäure
und
in
aus
oder
111
Gemischen
Equilibrierung
von
Glyoxylsäure (3)
aus
Isocitrat
keinen
Substratmolekülen
Im ersten
und
Lyase
Reaktionssequenz
Im
den
(2R.3S)
und 125, bzw. 115 mit einer
Aconitase,
Glykolsäure überführt.
bzw. 142 und
in
Carboxylgruppe
mit anderen
irreversiblen
einer
Citronensäure
Experimenten durchgeführt:
Gemische der Citronensäuren
Proteinlösung
von
tertiären
zweiten
Satz
Bernsteinsäuren
mit der Isocitrat
in
Lactat
Bern¬
erfolgte eine
103 und 104,
Lyase.
In beiden Versuchsserien wurde ein intermolekularer 180-Transfer
beobachtet.
Obwohl
in
säurespezies
doppelt
relativen
(180- und13C-)
Anteilen
5.5
spektrometrisch
nachgewiesen wurden, entsprachen
die
aufgrung
Postulats
des
Mechanismus
Beobachtung
müsste
von
ausgeschlossen
Eggerer
rend der untersuchten
erwarteten
et al.
[64],
die
2.0
nicht
werden.
Bernstein¬
markierte
bis
von
und
der
%
Mengen
den
postulierte
Zusammen
festgestellt
massen-
mit
der
haben, dass wäh¬
Reaktion kein messbarer Sauerstoffaustausch mit
216
dem
Lösungsmittel stattfindet legen
dass
nahe,
die
Lyase
doch
als
Erkenntnisse die Vermutung
unsere
kovalent
Partner
gebundener
der
an
Sauerstoffübertragung beteiligt ist. Ein entsprechender Mechanismus¬
vorschlag wurde im Rahmen der vorliegeden Arbeit diskutiert.
0
HOOC^^\ COOH
H
XOOH
3
HO
HO
COOH
HOOCV-(^s^,COOH
HOOC,
13c
B)
«
=
Das
CO«H
125
H-tOC,
XOOH
103
=
HO
HOOC^^X^COOH
115
111
c
C««H
H»«C^X^C<t»H
C»«H
*COOH
104
142
1-b
Enzym
1,4-Dihydroxy-2-naphthoat-Synthetase
Ueberfuhrung des mono-Coenzym A Derivats (4) der
o-Succinoylbenzoesäue (160) in 1,4-Dihydroxy-2-naphthoesäure (5)
katalysiert
mit der
eine Reaktion in der Biosynthese der K-Vitamine. Zur
möglichen
Rolle
des
Lactols
184
als
Ueberprüfung
eigentliches
Substrat
der
der
Kondensationsreaktion wurden folgende Arbeiten durchgeführt:
1) In einer achtstufigen Synthese wurde spezifisch
tischen
Carboxylgruppe 180-monomarkierte
(160)
hergestellt
und
mit
einem
in
der
aroma¬
o-Succinoylbenzoesäure
zellfreien
Extrakt
aus
E.
coli
umgesetzt. Das gebildete Produkt wurde in das Derivat 217 überführt.
Die
13C-NMR-spektroskopische Analyse zeigte
einen
50
%igen Verlust
217
180 und eine temperaturabhängige Verteilung der zweiten Hälfte des
von
zwischen
Isotopen
Produkts. Dabei
den
betrug
Befunde schlössen den
1-
die
und
4-ständigen
180-Menge
Hydroxylgruppen
in der 4-Position 3
-
des
9 %. Diese
in Betracht gezogenen Mechanismus
ursprünglich
aus.
Cgr- ^
COOH
COSCoA
OH
184
160
COOH
ofy
COOH
SCoA
OH
324
325
313
C-1^
2) Durch eine fünfstufige Synthese nach Inouye [119] wurde eine
in
der
aromatischen
cinoylbenzoesäure
Carboxylgruppe spezifisch 13C-indizierte
hergestellt
diskutierte
Möglichkeit
welche
gefundene 1sO-Verteilung
unseres
die
einer
o-Suc¬
(160). Sie erlaubte die in der Arbeit
Catboxylatwanderung
rationalisiert
zu
überprüfen,
hätte.
Aufgrund
Resultats müsste dieser Reaktionsweg ausgeschlossen werden.
218
Durch
3)
modifiziertes
Synthetase
Enzym
325,
synthetisiert
von
erhalten,
untersucht werden
führte nicht
deren
des
Herstellung
Substrat
mit
konnte:
der
als
Auch
313 brachte keine
Derivates
A
die
erwarteten
Untersuchung
positiven Resultate.
perimentellen Befunden Rechnung trägt.
wurde ein
der
313 mit dem
Produkte 324, oder
Broom
inhibitiven
der
4) Aufgrund der Resultate in den Punkten 3)
thetischer Reaktionsmechanismus entworfen
von
nach
Vergleichspräparate
die
313
Substratspezifität
Die Inkubation
Bildung eines der
zur
Methylester
wurden.
Coenzym
-
[125]
Wirkung
5) wurde ein hypo¬
und diskutiert, der den
ex¬
219
SUMMARY
A) Isocitrate-Iyase is
catalyses
the
succinic
does
reversible
require any cofactors.
Substrate activation
formation
the
which
glyoxylic acid cycle
(2R.3S)
of
isocitric
(1) into
acid
(2) and glyoxylic acid (3). For its catalytic activity the lyase
not
before
enzyme of the
an
conversion
of
an
breaking
explain the
To
reaction scheme
a
bonded
enzyme
activating step
the
as
In connection with
occurs.
of
proposed that includes the
was
isocitrylamid
bond
of the C-C
mode
unevident
proposed mechanism the following work
studies of
carried out:
was
1) By synthesis of the specifically 130- and 18C-monolabeled
citric acids
(115)
on
the
(103) and (104)
on
the other hand
multiply 180-labeled
already existing
Substrate and
multiply 180-labeled
the
product species
citric
acid
specifically 13C- and 180-monolabeled
hand and of the
succinic acids
with
and
(111) and (125)
one
for the
planned
obtained, together
we
acid
succinic
mechanistic
(142)
investigati¬
ons.
2) Incubation of
with
mixture
a
aconitase showed
that
the
during
tric acid neither loss of 180
between the
of the
nor
following
work
and 125
carried
was
or
111
out:
(111)
of
mixtures
were
and
citric
(125)
into
oxygen
isoci¬
exchange
this knowledge the
With
occur.
First,
and 115
acids
intermolecular
an
tertiary carboxylic groups
cies 111
citric
conversion
the
of
ineubated with
citric acid
spe¬
Solution
con¬
a
taining aconitase, isocitrate lyase and lactate dehydrogenase. Addition
of
the
dehydrogenase
redueed to
ensured
the
that
glyoxylic acid
resulting
is
glycolic acid thus making the reaction sequence irreversible.
In
the second set mixtures of the
products succinic acid 103 and 104
or
103
acid
and
isocitrate
142
lyase.
and
Mass
revealed in both sets of
to
2.0
to
from the
incorrect.
that
no
glyoxylic
of
spectroscopy
experiments
These
results
(3)
an
equilibrated
were
the
labeled
succinic
internal 180 transfer
with
acid
amounting
those
predicted
postulated mechanism, which in consequence turned
out to be
5.5 %.
Together with
the
detectable oxygen
catalytic
reaction,
covalent
enzyme
our
incompatible
are
results of
exchange
in
et
the
may
180
be
[64] which show
al.
with the solvent
observations
participation
Eggerer
with
explained
exchange.
mechanistic postuiate is discussed in the text.
during the
occurs
An
in
terms
of
appropriate
220
O
HOOC,
.X,
XOOH
H'
"COOH
3
HO
HO
CMH
HO
COOH
HOOCNv<^<v^COOH
HOOC^M^COOH
125
115
111
HOOC
HHCv^v
C««H
HtOC^^COOH
COOH
142
104
B)
CO»H
The
enzyme
1,4-dihydroxy-2-naphthoat synthetase
catalyses the conversion of the mono-coenzyme A derivative (4)
of
o-
succinoylbenzoic
as
a
acid
(160)
into
1,4-dihydroxy-2-naphthoic
acid
step in vitamine K biosynthesis. In connection with the investigation of
the
possible role of the lactol 184
following
work
1)A sample
acid
four
(160)
different
containig
both
an
activated
specifically 180-monolabeled
of
prepared
was
as
intermediate
the
carried out:
was
in
temperatures
o-succinoylbenzoic
eight step synthesis and ineubated
an
with
a
cell
free
extract
from
the
o-succinoylbenzoic aeid-coenzyme A-Iigase
1,4-dihydroxy-2-naphthoat-synthetase. The resulting product
analysed by 13C-NMR
as
the derivative 217. The
analysis
E
and
215
at
coli
the
was
showed that
50 % of the 180 label
is lost in the reaction and the residual label is
distributed between the
hydroxyl
is
dependent
during
on
groups at C-1
the temperature
formation
of
quantitative data
is
proposed mechanism.
215
not
of the
oxygen
compatible
is
and C-4 in
incubation. While
migrating
with
the
into
simple
a
ratio which
proving that
position
4,
the
version
of
the
221
2) A sample of specifically 13C-labeled
(160)
a
was
prepared
Substrate of the
by 13C-NMR failed
course
in five
steps according
enzymatic
to
to
Inouye [119] and used
reaction. Analysis of the
reveal
migration
a
acid
o-succinoylbenzoic
of the
as
resulting product
thioestergroup
in
the
of the reaction.
c02ÜCOSCoA
COOH
COSCoA
184
COOCH3
,0 CH3
160
217
COOH
Ofy'
COOH
SCoA
324
313
C-1^
3)
In separate incubation
313 is neither
a
Substrate
nor
experiment
an
4) The results of this work
it
was
inhibitor of the
are
shown that
Compound
synthtase.
integrated in
which is discussed at the end of the present report.
a
reaction
scheme