Charakterisierung von Interleukin-10 und Interleukin-12

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Pneumologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Charakterisierung von
Interleukin-10 und Interleukin-12
produzierenden Monozyten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2007
von Tibor Zoltán Veres
geboren in Budapest
Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters
Erster Gutachter: PD. Dr. Gernot Zissel
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Nikolaus Freudenberg
Jahr der Promotion: 2007
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ........................................................................................................................................1
1.1
DAS TH1-TH2-MODELL .....................................................................................................................1
1.1.1
Interleukin 10 (IL-10) ............................................................................................................. 3
1.1.2
Interleukin-12 (IL-12)............................................................................................................. 4
1.1.3
In vitro Modell der Differenzierung von naiven T-Lymphozyten in Effektorzellen, nach dem
TH1/TH2-Modell.................................................................................................................................... 5
1.2
ANTIGENPRÄSENTIERENDE ZELLEN ...................................................................................................5
1.2.1
Monozyten.............................................................................................................................. 5
1.2.2
Dendritische Zellen................................................................................................................. 8
1.3
FRAGESTELLUNG ............................................................................................................................11
2
MATERIAL UND METHODEN.........................................................................................................12
2.1
MATERIAL ......................................................................................................................................12
2.1.1
Geräte .................................................................................................................................. 12
2.1.2
Verbrauchsmaterialien ......................................................................................................... 12
2.1.3
Reagenzien ........................................................................................................................... 13
2.1.4
Medien und Lösungen........................................................................................................... 13
2.1.5
Zytokine................................................................................................................................ 14
2.1.6
Antikörper ............................................................................................................................ 14
2.1.7
ELISA-Kits ........................................................................................................................... 15
2.1.8
Probanden............................................................................................................................ 15
2.2
METHODEN.....................................................................................................................................16
2.2.1
Isolierung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation............................... 16
2.2.2
Kimura-Färbung .................................................................................................................. 16
2.2.3
Zellkultur und –Stimulation................................................................................................... 16
2.2.4
Gewinnung von IL-10 positive bzw. negative Monozyten und T-Lymphozyten mittels
Zellsortierung..................................................................................................................................... 17
2.2.5
Zellkultur zur Bestimmung der Stabilität der Zytokinproduktion per ELISA............................ 20
2.2.6
Analyse der Modulation der TH1/TH2 Immunatwort durch IL-10 produzierende Monozyten ... 20
2.2.7
Auswertung der Fuoreszenzdaten.......................................................................................... 23
2.2.8
Nachweiß von Zytokinen in den Zellüberstände mittels ELISA ............................................... 24
2.2.9
Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten........................................................... 24
2.2.10.
Statistische Auswertung.................................................................................................... 24
3
ERGEBNISSE......................................................................................................................................25
3.1
3.2
3.3
REINHEIT DER SORTIERTEN ZELLEN .................................................................................................25
STABILITÄT DER IL-10 UND IL-12P40 PRODUKTION DER MONOZYTEN NACH DER SORTIERUNG .........25
DER EINFLUSS DER SORTIERTEN MONOZYTENPOPULATIONEN AUF DIE AKTIVIERUNG VON TEFFEKTORZELLEN ...........................................................................................................................26
3.4
DER EINFLUSS DER SORTIERTEN MONOZYTENSPOPULATIONEN AUF DIE ENTWICKLUNG VON TH1BZW. TH2- LYMPHOZYTEN AUS NAIVEN T-HELFERZELLEN ................................................................27
3.4.1
Die Produktion von IFN-γ und IL-4 nach 5-tägiger Kulturdauer............................................ 27
3.4.2
Die Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 nach Expansion mit IL-2 und Aktivierung mit
PMA/Ca-Ionophor.............................................................................................................................. 28
3.5
DIE GENERIERUNG DENDRITISCHER ZELLEN AUS IL-10 POSITIVEN UND IL-10 NEGATIVEN
MONOZYTEN ..................................................................................................................................32
4
DISKUSSION.......................................................................................................................................33
4.1. DISKUSSION DER EINGESETZTEN METHODE ............................................................................................33
4.1
DIE STABILITÄT DER IL-10 UND IL-12 PRODUKTION DER SORTIERTEN
MONOZYTENSUBPOPULATIONEN .....................................................................................................36
4.2
DIE TH1/TH2-POLARISIERNEDE FÄHIGKEIT DER SORTIERTEN MONOZYTENSUBPOPULATIONEN...........36
4.2.1
Der Effekt der IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten auf die Aktivierung von TEffektorzellen ..................................................................................................................................... 37
4.2.2
Der Effekt der IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten auf die Aktivierung von naiven TLymphozyten und ihrer Differenzierung zu T-Effektorzellen ................................................................ 38
4.3
DIE FÄHIGKEIT DER MONOZYTEN ZU DENDRITISCHEN ZELLEN ZU DIFFERENZIEREN ..........................44
5
ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................................................45
6
LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................................46
7
ABBILDUNGSVERZEICHNIS...........................................................................................................55
8
LEBENSLAUF...................................................................................................................................567
9
DANKSAGUNG.................................................................................................................................578
Abkürzungsverzeichnis
APC
Antigen Presenting Cell (Antigenpräsentierende Zelle)
CD
Cluster of Differentiation
CFU
Colony Forming Unit
Cy5
Phycoerythrin-Cyanin-5
DC
Dendritic Cell (Dendritische Zelle)
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting (Durchflusszytometrie)
FCS
Fetal Calf Serum (Serum von Kälberföten)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FSC
Forward Scatter (Vorwärtsstreuung)
GM-CSF
Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor
HLA
Human Leukocyte Antigen
IFN
Interferon
IL
Interleukin
LPS
Lipopolysacharid
MHC
Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
PBS
Phosphate Buffered Saline (Kochsalzlösung mit Phosphatpuffer)
PE
Phycoerythrin
PMA
Phorbol 12-Mysirate 13-Acetate (Phorbolester)
SEB
Staphylococcus Enterotoxin B
SSC
Side Scatter (Seitwärtsstreuung)
TH
T-Helfer Lymphozyt
TNF
Tumornekrosefaktor
Selten verwendete Abkürzungen im Text erläutert
1
Einleitung
1 EINLEITUNG
1.1 Das TH1-TH2-Modell
Die T-Helfer-Lymphozyten, deren gemeinsames Merkmal die Expression des CD4
Oberflächenmoleküls ist, können sich im Verlauf ihrer Reifung zu verschiedenen Phänotypen
entwickeln, die sich durch die Bildung charakteristischer Zytokine unterscheiden. 1986 wurde
dieses Konzept erstmals von Mosmann et al.95 bei Mäusezellen beobachtet und konnte in der
Folge auch auf den Menschen übertragen werden. Initial wurde dieses Konzept für zwei
gegensätzliche Immunantworten TH1 und TH2 beschrieben. In der Folge wurde das Konzept
jedoch um TH0 und einer Immuntoleranz induzierenden Immunantwort THR erweitert.
TH1: TH1-Zellen sind definiert durch ihre auschließliche Produktion von Zytokinen wie IFN-γ,
und Lymphotoxin, die die zellvermittelte Immunreaktionen fördern. Sie induzieren Typ
IV-Reaktionen nach Coombs, aktivieren Makrophagen und zytotoxische T-Zellen.
TH2: Als TH2-typische Zytokine gelten IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Diese Botenstoffe fördern
die IgE-Bildung und aktivieren Eosinophile, Mastzellen und Basophile. Während der
Pathogenese von allergischen Erkrankungen spielen sie beispielsweise eine wichtige Rolle.
TH0: Es gibt T-Lymphozyten, die sowohl TH1- als auch TH2-typische Zytokine exprimieren. Sie
werden als TH0-Zellen gekennzeichnet.
THR: Regulatorische T-Zellen produzieren eine große Menge von TGF-β und/ oder IL-10.
Die Erfassung der TH1/TH2 Immunantwort erfolgt derzeit zumeist durch die Bestimmung der
Leitzytokine IFN-γ und IL-4. Diese zwei Zytokine befinden sich auf den entgegen gesetzten
Seiten des TH1-TH2 Spektrums, und werden in den meisten experimentellen Modellen als
Indikatoren für die TH1- bzw. TH2-Immunantwort verwendet. Da die Differenzierung
auf
Einzelzellebene erfolgt, bieten sich Meßverfahren an, die Zytokinmessung der beiden o.g.
Zytokine auf Einzelzellebene ermöglichen. Die intrazelluläre Zytokinmessung mittels
Durchflusszytometrie ist unter anderem ein solches Verfahren und wird besonders häufig zur
Bestimmung der Immunantwort eingesetzt.
Das TH1 und TH2 Muster der Zytokinproduktion betrifft nur aktivierte Effektorzellen, die
während einer Immunantwort entstehen. Wenn naive CD4+ Zellen von antigenpräsentierenden
Zellen (APC) zum ersten Mal aktiviert werden, produzieren sie hauptsächlich IL-2, proliferieren
und differenzieren in die verschiedenen Phänotypen. Wenn es später zu einem erneuten
Antigenkontakt kommt, werden sie aktivierte Lymphoblasten, die eine große Menge
unterschiedlicher Zytokine produzieren und erfüllen Effektorfunktionen durch Interaktionen mit
anderen Zellarten.11 Naive TH-Lymphozyten und Effektorzellen unterscheiden sich in der
2
Einleitung
Expression von verschiedenen Oberflächemolekülen. Das Oberflächemolekül CD45RA befindet
sich nur auf den naiven Zellen, die Gedächtniszellen sind dagegen CD45RO positiv.
Die Bedingungen, die zu einer Aktivierung von naiven T-Zellen bzw. zu der Reaktivierung von
T-Effektorzellen führen sind bei den zwei Zellarten unterschiedlich. Naive T-Zellen werden
aktiviert, wenn das Immunsystem mit einem bestimmten Antigen zum ersten Mal in Kontakt
kommt. Das Antigen wird in dem Kontext von MHC-II Molekülen von professionellen
antigenpresentierenden Zellen präsentiert, wobei weitere Signalen von kostimulatorischen
Molekülen benötigt werden. Ohne diese Signale kommt es zu einer antigenspezifischen
Toleranzindukzion statt der Aktivatierung.97
Die Aktivierung von T-Effektorzellen wird hauptsächlich von der MHC-II-TCR Interaktion
induziert. Wenn das Antigen der APC in einer hohen Konzentration zur Verfügung steht,
kommt es zu einer maximalen DNA-Synthese und Zytokinproduktion auch ohne
Kostimulation.112,88 Bei einer suboptimalen Signalübertragung durch den TCR (z. B. eine
limitierte Antigenkonzentration oder geringe Anzahl an APC) ist die Interaktion zwischen
akzessorischen Moleküle notwendig.126,17
Alle Faktoren, die eine polarisierte Differenzierung von T-Zellen induzieren, sind von
besonderem Interesse, weil sie den Ausgang der Immunantwort determinieren können. So
wurde unter anderem beschrieben, dass die Natur33,83 und die Menge22 des Antigens, die
kostimulatorischen Signale, die neben der MHC-II/TCR Interaktion anwesend sind,78 und
verschiedene Zytokine, die von der APC und von anderen Zellen produziert werden und die sich
in der Umgebung befinden eine wichtige Rolle bei der Festlegung des Typs der Immunantwort
spielen. Die Entstehung allergischer Erkrankungen führt man beispielsweise auf eine verstärkte
TH2-Immunantwort zurück. Durch die erhöhte Ausschüttung von Typ-2 Zytokinen wird
einerseits die Ausdifferenzierung von naiven T-Lymphozyten zu TH2-Zellen gefördert und so
die schädliche Immunreaktion weiter unterhalten, andererseits auch die Aktivierung und
Proliferation von TH1-Zellen unterdrückt. IL-12 gilt als das wichtigste Zytokin, dass die
Differenzierung von TH1-Zellen fördert. Es wird hauptsächlich von Monozyten, Makrophagen
und Dendritischen Zellen gebildet. Die Auslöser der IL-12 Produktion von Monozyten und
Dendritischen Zellen sind LPS,124 die Phagozytose selbst,115 und die Bindung von CD40L.19
Dieses kostimulatorische Molekül wird nach der Aktivierung durch den TCR auf T-Zellen
hochreguliert80 und spielt wahrscheinlich eine Hauptrolle während der Interaktion von T-Zellen
und DC. Ein anderes wichtiges Zytokin, dass die TH1/TH2 Differenzierung beeinflusst ist IL-10.
Dieses Zytokin soll möglicherweise TH2 induzierend sein, es wird jedoch hauptsächlich bei der
Generierung der THR-Immunantwort diskutiert. Im Folgenden werden die Zytokine IL-12 und
IL-10 genauer besprochen, da sie wesentliche Zytokine antigenpräsentierender Zellen sind und
hauptsächlich in dieser Arbeit untersucht wurden.
3
Einleitung
1.1.1 Interleukin 10 (IL-10)
Ursprünglich wurde IL-10 als ein Produkt von TH2-Lymphozyten entdeckt, das die
Zytokinsekretion von TH1-Zellen hemmt.44 Das 35 kD schwere Molekül besteht aus zwei
identischen Untereinheiten, die auch einzeln ihre volle biologische Wirksamkeit entfalten.44,93
Neben TH2-Zellen produzieren auch TH1 Lymphozyten,38 Monozyten,36 Makrophagen,
Keratinozyten42 und mit dem Epstein-Barr-Virus infizierte B-Lymphozyten15 IL-10. Dabei
erfolgt die IL-10 Ausschüttung im Vergleich zu anderen Zytokinen verzögert, das Maximum
wird erst nach 24 - 48 h erreicht.36
Monozyten bilden IL-10 nach Stimulation mit LPS,36 PGE27 und TNF-α.137 Dabei bewirkt die
intrazelluläre Signalübertragung über cAMP eine Steigerung der Transkription des IL-10
Genes.7 In der Einzelzellmessung zeigt sich, dass nur ein kleiner Teil der Monozyten IL-10
bildet.23,54 Die Zytokine IFN-γ,23 IL-4, IL-1337 und auch IL-10 selbst36 unterdrücken die IL-10
Produktion.
Bei Lymphozyten führt IL-10 zur Hemmung der TH1 Immunantwort und begünstigt TH2
Reaktionen, indem es die Proliferation, Aktivierung und Zytokinsynthese von TH1 und
natürlichen Killerzellen unterdrückt.94 Allerdings kann IL-10 auch die Zytokinproduktion von
TH2-Lymphozyten hemmen.38 Da sowohl proinflammatorische Zytokine des TH1 wie auch des
TH2 Typs die IL-10 Freisetzung erhöhen,30,65 stellt die Ausschüttung von IL-10 ein Mittel dar,
das eine anhaltende und überschießende Entzündung verhindern kann. Auch für IL-12 wurde
auf einen solchen Mechanismus negativer Rückkoppelung geschlossen, da IL-12 die IL-10
Produktion von T-Lymphozyten steigert.89
Wie andere TH2 Zytokine fördert auch IL-10 die Proliferation und Aktivierung von B-Zellen.111
In Monozyten und Makrophagen hemmt IL-10 die Produktion von Zytokinen, die
normalerweise bei Kontakt mit Bakterien freigesetzt werden, unter anderem IL-1β, IL-6, IL-8,
IL-10, IL-12, TNF-α und GM-CSF.36,45 Dass es sich hierbei nicht um eine unspezifische
Wirkung handelt, beweist die gleichzeitig vermehrte Bildung des antiinflammatorisch
wirkenden IL-1 Rezeptor-Antagonisten.4 Daneben vermindert IL-10 die Freisetzung von
zytotoxischen NO-Radikalen51 und die Antigenpräsentation über MHC-II.36 Die Expression der
kostimulatorischen CD80 und CD86 Moleküle, die der Aktivierung der T-Zellen dienen, wird
ebenfalls durch IL-10 gehemmt.40
In einem Mausmodell einer asthmaähnlichen Immunreaktion bilden IL-10 Knockout-Mäuse
mehr IFN-γ und IL-12, aber weniger IL-5 als die Wildtyp-Mäuse und entwickeln eine geringere
Entzündung in den Atemwegen.141 In einem anderen Modellversuch wurde dagegen eine
erhöhte Produktion von IL-4, IL-5 und IFN-γ und eine erhöhte Sterblichkeit bei den IL-10
knockout-Mäusen beobachtet.57
4
Einleitung
Die Bedeutung von IL-10 bei atopischen Erkrankungen des Menschen ist bislang nicht
ausreichend geklärt. Verschiedene Arbeitsgruppen beobachteten bei atopischer Dermatitis eine
normale119 oder gesteigerte101 IL-10 Produktion. Für das Asthma bronchiale wurden etwas
widersprüchliche wohl auch je nach Schweregrad differierende, teilweise erhöhte,108
unveränderte133 und erniedrigte9 IL-10 Werte beschrieben.
1.1.2 Interleukin-12 (IL-12)
1989 wurde erstmals eine neue Substanz beschrieben, die natürliche Killerzellen stimuliert.74
Dieses später Interleukin-12 genannte Zytokin ist ein Heterodimer, das aus zwei über
Disulfidbrücken verknüpften Untereinheiten mit 40 kD (p40, β-Kette) und 35 kD (p35, α-Kette)
Molekulargewicht besteht. Diese Untereinheiten werden von zwei verschiedenen58,105 und
unabhängig voneinander regulierten59 Genen kodiert. Dabei wird das p35 Molekül von vielen
Zellen konstitutiv exprimiert, aber nicht sezerniert.29 Die p40 Untereinheit wird hingegen im
Überschuß und fast immer zusammen mit dem bioaktiven Heterodimer sezerniert.29,49 Sie zeigt
wie die isolierte p35 Untereinheit keine biologische Aktivität.
Im menschlichen Organismus wird IL-12 hauptsächlich von Monozyten, Makrophagen,
dendritischen Zellen und B-Lymphozyten gebildet.29,131 Die Produktion von IL-12 in
Monozyten und Makrophagen wird entweder durch Antigene verschiedener Mikroorganismen29
oder durch Interaktion mit T-Lymphozyten über CD40/CD40-Ligand induziert118
IL-1027 und PGE2134 hemmen die Bildung von IL-12, die Zytokine TGF-β1, IL-4 und IL-13
können je nach Zeitpunkt ihrer Zugabe hemmenden oder fördernden Einfluss auf die IL-12
Produktion nehmen.28 Verglichen mit IL-10 ist die Hemmwirkung von IL-4 und IL-6 aber
geringer und abhängig davon, wie die IL-12 Produktion ausgelöst wurde.125
Die wohl wichtigste Wirkung von IL-12 ist die Regulation des Gleichgewichts zwischen TH1
und TH2-Zellen. Dabei fördert es einerseits die Entwicklung von TH1-Zellen,64 andererseits dient
es als Ko-Stimulans für die IFN-γ Freisetzung durch TH1-Zellen und natürlichen
Killerzellen.20,74 Da IFN-γ selbst die Bildung von IL-12 erhöht, entsteht so durch positive
Rückkopplung ein Mechanismus gegenseitiger Verstärkung.77,84 Mäuse, die kein IL-12 bilden
können, zeigen eine verminderte IFN-γ Produktion und Typ-1 Immunantwort.85 Ob gleichzeitig
auch vermehrt TH2 Zytokine produziert werden,61,85 oder nicht, hängt von den experimentellen
Bedingungen und dem verwendeten Mäusestamm ab.50,107 Bei Patienten mit Krankheiten des
atopischen Formenkreises wie allergischem Asthma133 oder atopischer Dermatitis75 wurde eine
verringerte Produktion von IL-12 und IFN-γ im peripheren Blut beobachtet.
5
Einleitung
1.1.3 In vitro Modell der Differenzierung von naiven T-Lymphozyten in
Effektorzellen, nach dem TH1/TH2-Modell
Zur Untersuchung der diversen Aspekte der T-Zell-Aktivierung wie z.B. der Typ der
antigenpräsentierenden Zelle oder das spezifische Mediatormilieu während der Entstehung einer
TH1- bzw. TH2-Immunantwort wurden unterschiedliche in vitro Modelle entwickelt. In dieser
Arbeit
wurde
der
Einfluss
von
verschiedenen Monozytensubpopulationen
auf
die
Differenzierung von TH1- bzw. TH2-Lymphozyten aus naiven T-Helferzellen untersucht. In
unserem Modell wurden die naiven T-Helferzellen mit der Hilfe eines Superantigens
(Staphylococcus Enterotoxin B, SEB) aktiviert. Nach der Aktivierung und der Expansion wurde
die Bildung typischer TH1- bzw. TH2-Zytokine gemessen (die detaillierte Beschreibung befindet
sich in dem Methodenteil). Außerdem wurde der Einfluss der IL-10 positiven und IL-10
negativen Monozyten auf die Aktivierung von TH1 bzw. TH2 Effektorlymphozyten. in diesem
System wurden die T-Effektorlymphozyten durch einen monoklonalen Antikörper gegen das
CD3 Molekül aktiviert.
1.2 Antigenpräsentierende Zellen
1.2.1 Monozyten
Monozyten sind weiße Blutzellen von 12-20 µm Durchmesser mit einem großen,
unsegmentierten und meist gelappten Kern. Im Blut zirkulieren sie durchschnittlich 3 Tage,139
bevor sie in verschiedene Organe wandern und dort zu unterschiedlichen spezialisierten
Phagozyten differenzieren. Sie entstehen über mehrere Zwischenstufen aus myeloischen
Vorläuferzellen im Knochenmark.66
Myeloide Zellen abstammen aus einem gemeinsamen Präkursor, der Colony Forming UnitGranulocyte-Monocyte (CFU-GM). Diese Zelle entspringt aus früheren Progenitorzellen, die
imstande sind, myeloische, megakariozytische und lymphoide Zellinien hervorzubringen. Die
Nachkommer des CFU-GMs können sich zu Monozyten, Granulozyten und Makrophagen
differenzieren. Myeloische Zellen erfüllen drei Hauptfunktionen:
•
Sie haben das Vermögen, mit der Hilfe verschiedener Adhäsionsmoleküle aus dem
peripheren Blut in entzündete, infizierte oder geschädigte Gewebe einzuwandern.
Einleitung
6
•
Sie können native oder opsonisierte Partikel (z. B. Bakterien, Pilze, Bruchstücke von
Zellen) phagozytieren. Diese werden in phagozytischen Vakuolen isoliert, die mit
preformierten Granula innerhalb der Zelle zu Phagosomen fusionieren. In diesen
Organellen werden die Partikel mit der Hilfe von Enzymen und Sauerstoffradikalen
degradiert. Die Fähigkeit myeloischer Zellen zur Phagozytose und intrazellulärem
"Killing" steht unter erheblicher Kontrolle und wird durch ihre Aktivierung
reguliert.
•
Die dritte Funktion umfasst die Ausschüttung des Inhalts der Granula (Exozytose).
Die exozytotischen Granula enthalten hydrolytische Enzyme, chemotaktische
Faktoren, Aktivatoren des Komplementsystems und der Fibrinolyse und Substanzen,
die die vaskuläre Permeabilität beeinflussen. Durch die Ausschüttung dieser
vielfältigen Moleküle wird die Entzündungsreaktion aufrechterhalten. Daneben
werden weitere myeloische Zellen an die Stelle rekrutiert. Außerdem werden andere
Komponenten der Reaktion des Organismus zu Infektion, Neoplasien und
Schädigungen moduliert.
Anhand spezifischer Oberflächenrezeptoren kann man Monozyten von anderen Blutzellen
abgrenzen und verschiedene Reifungsstadien unterscheiden. Gemeinsam ist allen Monozyten
der LPS-Rezeptor CD14.143,104 Außerdem zeigen sie eine starke Expression von HLA-DR
Molekülen und Fc-Rezeptoren (CD32, CD64). Die Zelloberfläche ist normalerweise mit einer
erheblichen Menge von Plasmaimmunoglobulinen übergezogen.
Monoyzten, bzw. CD14+ Zellen des peripheren Blutes selbst gelten auch als Vorläufer von
anderen, spezialisierten Zelltypen. In der Peripherie differenzieren sie zu professionellen
antigenpräsentierenden
Zellen:
Makrophagen
und
dendritischen
Zellen.26,142
Unter
pathologischen Bedingungen (z. B. Osteomyelosklerose) können sie sich zu Fibroblasten und
Osteoblasten differenzieren.79 Außerdem können sie in der Anwesenheit angiogenetischer
Faktoren zu Endothelzellen entwickeln.106 In der Abwesendheit von Aktivierungs- oder
Differenzierungssignalen kommt es zu einer spontanen Apoptose der Monozyten.60,46
(Abbildung 1).
7
Einleitung
Abbildung 1: Möglichkeiten der weiteren Differenzierung aus Monozyten.
Der aus der myeloischen Vorläuferzelle entstandene Monozyt kann unter den geeigneten Bedingungen zu Makrophage,
dendritische Zelle, Endothelzelle oder Fibroblast differenzieren. In der Abwesenheit von Differenzierungssignalen kommt
es zu einer Apoptose
1.2.1.1 Subpopulationen der Monozyten
Die vielfältigen Funktionen der Monozyten bedingt die Heterogenität der Monozytenpopulation.
Nach Dichte, Sedimentationsgeschwindigkeit oder Adhärenz fraktionierte Monozyten
unterscheiden sich zum Teil erheblich in der Expression von Oberflächenrezeptoren,100,116,136
ihrer Phagozytosefähigkeit,73,136 und dem Vermögen, die Immunglobulinproduktion von
B-Zellen zu verstärken.73
Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang die Produktion immunregulatorischer
Zytokine. Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Populationen zeigen sich bei
der Produktion von IL-1130, TNF-α136 und PGE2.55
Khansari et al. trennten Monozyten nach ihrer Dichte in mehrere Fraktionen und konnten
zeigen, dass eine dieser Fraktionen hauptsächlich das proinflammatorisch und pyrogen wirkende
Zytokin IL-1 bildet, während eine andere nur wenig IL-1, aber viel PGE2 produziert, welches
auf Immunzellen hemmend wirkt.72 Wang et al. untersuchten die Zytokinproduktion von
Monozyten nach deren Trennung in zwei Populationen mit großen und kleinen Zellen. Sie
beschrieben, dass die größeren Zellen im Vergleich zu den kleineren sowohl mehr IL-1 als auch
mehr PGE2 bilden.136
8
Einleitung
Mit CD16 konnte die Arbeitsgruppe um Ziegler-Heitbrock erstmals einen Oberflächenrezeptor
auf Monozyten identifizieren, der nur von einem Teil der Zellen exprimiert wird144 und eine
funktionell und phänotypisch abweichende Subpopulation charakterisiert.104 In Hinblick auf ihre
Zytokinproduktion unterscheiden sich die CD16 exprimierenden Monozyten von der
Hauptpopulation in der Produktion von IL-1, IL-6 oder TNF-α nicht, die IL-10 Bildung ist
allerdings stark vermindert.48
Grage-Griebenow et al.56 beschrieben 4 verschiedene Monozytensubpopulationen nach der
Expression der IgG-Rezeptoren CD64 (hochaffiner FcγRI) und CD16 (niedrigaffiner FcγRIII)
in
CD64–CD16– (plasmazytoide DC2-Vorläufer, CD14–CD4+),
CD64–CD16+ (myeloide DC1, CD14dim),
CD64+CD16+(typische Monozyten, CD14+)
CD64+CD16–(Makrophagen, CD14+)
Die unterschiedlichen Subpopulationen wurden jedoch bisher nicht auf ihre Zytokinproduktion
hin untersucht.
Wenn auch die bisherigen Untersuchungen zum Teil widersprüchliche Ergebnisse erbracht
haben, so lassen sich dennoch nicht alle beschriebenen Unterschiede auf zellschädigende
Isolationsvorgänge oder die unterschiedliche Reife der Zellen zurückführen, sondern deuten die
Existenz von funktionell verschiedenen monozytären Subpopulationen an.41,48
1.2.2 Dendritische Zellen
Die dendritische Zelle (DC) gilt heute als die wichtigste antigenpräsentierende Zelle des
Immunsystems. Dendritische Zellen spielen eine führende Rolle in der Initiierung und
Modulierung von Immunantworten gegen unterschiedliche Pathogene durch die Aktivierung
von naiven T-Helferzellen.122,121 DC befinden sich in Organen mit hoher FremdantigenExposition (Lunge63, Haut10, Darm96), wo sie als professionelle Antigen verarbeitende und
präsentierende Zellen ein weit verzweigtes Netzwerk darstellen. Der größte Teil der im
peripheren Blut vorkommenden DC ist myeloischer Herkunft, ein kleinerer Teil (die
plasmazytoiden DC) stammt jedoch von lymphoiden Vorläuferzellen ab.109 Nachdem die
Vorläuferzellen das Knochenmark verlassen haben, zirkulieren sie im peripheren Blut bevor sie
in die verschiedenen Organe einwandern. Diese eingewanderten Zellen können dort als unreife
CD1a-positive DC nachgewiesen werden.6 Ihre Aufgabe besteht zunächst darin, Antigene zu
sammeln. Während dieser Periode zeigen sie eine verminderte T-Zell-stimulierende Kapazität,
exprimieren nur wenige kostimulatorischen Moleküle, weisen jedoch eine ausgeprägte Fähigkeit
zur Endozytose und Antigenprozessierung auf. Nach der Antigenaufnahme wandern die DC
9
Einleitung
über die Lymphgefäße in die lokoregionalen Lymphknoten. Während dieser Migration
entwickeln sie den Phänotyp reifer CD83-positiver DC142. Die reifen DC zeigen eine
verminderte Phagozytosefähigkeit und eine erhöhte Expression von MHC-II Molekülen und
verschiedenen kostimulatorischen Molekülen wie DC-SIGN (DC-specific ICAM-3 grabbing
nonintegrin), CD40, CD80 und CD86, die die T-Zell-Aktivierung verstärken und die TH1/TH2Immunantwort modulieren. Die Migration und die Reifung wird von bestimmten Signalen
induziert, wie z. B. der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-1) durch das
entzündete Gewebe oder durch bakterielle Bestandteile (LPS). In der T-Zellregion der
Lymphknoten treffen die DC auf naive T-Lymphozyten und können die T-Zellen mit einem
zum Antigen komplementären T-Zellrezeptor aktivieren. Nach der Aktivierung differenzieren
die naiven T-Helferzellen in T-Effektorzellen. Anhand des Zytokinmusters, welches die
gereiften CD4-Zellen exprimieren, unterscheidet man eine TH1- oder TH2-Immunantwort. Die
Polarisierung der Immunantwort wird unter anderem auch durch die antigenpräsentierende Zelle
entschieden. Faktoren aus dem Gewebe wie z. B. IFN-γ, die während der Reifung von
dendritischen Zellen anwesend sind, fördern die Entwicklung von Typ I Effektor DC (DC1), die
viel IL-12 produzieren und eine TH1-Anwort fördern. Während zum Beispiel PGE2, Histamin
die Entwicklung von IL-12-defizienten DC2 fördert, was wiederum die Differenzierung von
TH2-Lymphozyten begünstigen.69,135 Daneben wird die Entwicklung unterschiedlicher
DC-Phänotypen auch von der Herkunft der Antigene beeinflusst. Antigene extrazellulärer
Pathogene führen zur Differenzierung von DC1, während Bestandteile von Viren und
intrazellulären Bakterien die Reifung von Typ 2 DC induzieren.33
1.2.2.1 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten
Mit der Hilfe eines geeigneten Zytokinmilieus ist es möglich, DC aus Monozyten oder CD34+
Progenitorzellen in vitro zu generieren. Nach einer 6-7-tägiger Kultivierung der Monozyten in
der Anwesendheit von IL-4 und GM-CSF differenzieren sie zu unreifen CD1a positiven DC.21
Nach eine weitere 1-2-tägiger Stimulation mit verschiedenen Pathogenbestandteilen wie LPS34,
bakterieller DNA, doppelsträngiger-RNA18 oder proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α,
IL-167 entwickeln sie den Phänotyp reifer CD83 positiver DC.
Exogenes Interleukin-10 wirkt auf die Generierung dendritischer Zellen aus CD14+Monozyten
hemmend.14 Monozyten, die mit IL-4 und GM-CSF in der Anwesendheit von IL-10 kultiviert
wurden, exprimierten kein CD1a und weniger MHC-II. Dagegen exprimierten sie eine erhöhte
Anzahl von CD14, CD16 und CD68, die eher für Makrophagen typisch sind.3 Außerdem nimmt
die Produktion von IL-12 ab, ein Zytokin das für die Entwicklung von IFN-γ produzierenden
TH1-Lymphozyten nötig ist.35 Diese Beobachtung zeigt, dass IL-10 das TH1/TH2-Gleichgewicht
10
Einleitung
durch die Hemmung der IL-12 Produktion der antigenpräsentierenden Zellen in TH2-Richtung
verschiebt.
IL-10 hat eine bedeutende Wirkung auf die weitere Differenzierung von unreifen DC. Die
Behandlung von DC während ihrer Reifungsperiode mit IL-10 hemmt die Expression von CD83
und kostimulatorischer Moleküle wie CD58 und CD86.120 Außerdem zeigen diese Zellen eine
verminderte T-Zell-stimulatorische Kapazität in der MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) und
eine antigenspezifische Toleranz. Die Antagonisierung der Wirkung des endogenen IL-10 mit
IL-10 neutralisierenden Antikörper führt zu gegensätzlichen Veränderungen: kostimulatorische
Moleküle und das MHC-II-Molekül werden stark hochreguliert. Außerdem nimmt die IL-12
Produktion zu.25,76 Diese Ergebnisse unterstützen die Rolle des autokrinen/parakrinen IL-10
Moleküls in der Regulation der Reifung von DC und in der Induktion der antigenspezifischen
Toleranz.
1.2.2.2 Die dendritische Zelle als neues Mittel der Immuntherapie
Der Einsatz von dendritischen Zellen wird derzeit als ein mögliches Therapieverfahren in der
Immuntherapie von Tumorerkrankungen und Allergien stark beforscht. Es ist möglich DC aus
Monozyten des peripheren Blutes in vitro zu generieren. Während der Reifungsperiode können
sie zum Beispiel mit Tumorantigenen aus einem Tumorlysat inkubiert werden. Die gereiften DC
werden dem Patienten zurückgegeben, damit sie Tumorantigene im Kontext von
MHC-Moleküle präsentieren und so eine spezifische Immunantwort gegen den Tumor
induzieren.
In Tumorpatienten konnte gezeigt werden, dass die Generierung von dendritischen Zellen im
näheren Tumorbereich in vivo gehemmt ist.123,99 Durch die ex vivo Generierung von
dendritischen Zellen und deren gezielte Applikation soll dieser Mangel behoben werden. Aber
auch bei Autoimmunerkrankung wird der Einsatz von dendritischen Zellen derzeit erprobt. Hier
gilt das Interesse vor allem den Toleranz vermittelnden dendritischen Zellen.140
11
Einleitung
1.3 Fragestellung
In den Vorarbeiten zu dieser Arbeit galt das Hauptaugenmerk der Zytokinproduktion durch
Monozyten, insbesondere von IL-10 und IL-12. Hierbei wurde nachgewiesen, dass IL-10 und
IL-12 von zwei getrennten Subpopulationen der Monozyten gebildet werden.53 Da IL-12 die
Entwicklung von TH1-Zellen fördert, IL-10 hingegen als TH2-Zytokin gilt, wurde die Existenz
von verschiedenen Monozytenpopulationen, M1 und M2, vergleichbar zur Differenzierung von
CD4-Zellen in TH1 und TH2, postuliert. Kapsenberg et al. hatten 1999 eine Aufteilung
antigenpräsentierender Zellen analog zu CD4-Lymphozyten bereits vermutet und für
dendritische Zellen belegt.71 Die Arbeitsgruppe von Modolell konnte zeigen, dass eine
vergleichbare Aufteilung für Makrophagen zu finden ist.98 Zudem konnte unsere Arbeitsgruppe
zeigen, dass bei Personen mit Allergien, die als TH2-Immunantwort beschrieben werden, die
IL-10 produzierende Monozytenpopulationen zunimmt, hingegen die IL-12 produzierende
Subpopulation abnimmt.53 Diese eigenen Ergebnisse belegen somit unter anderem die
Hypothese, dass Antigenpräsentierenden Zellen möglicherweise eine entscheidende Funktion in
der Lenkung der Immunantwort beikommt. Mit der Hilfe eines neu entwickelten
Zytokinsekretions-Assays und eines Hochgeschwindigkeitzellsorters sollte die Hauptaufgabe
dieser Arbeit sein, ein Verfahren zur Separation lebender IL-10 produzierender Monozyten zu
entwickeln und anschließend diese in ihrer Funktion näher zu charakterisieren. Im Konkreten
ergaben sich folgende Fragestellungen:
•
Etablierung eines Verfahrens zur Isolation lebender IL-10 produzierender Monozyten
•
Zeigt sich die dichotomische Expression von IL-10 und IL-12 auch nach der
Separierung der zwei Monozytensubpopulationen?
•
Gibt es einen Unterschied zwischen den zwei Monozytensubpopulationen bezüglich
ihres Einfluss auf die Reifung von TH1- bzw. TH2-Lymphozyten aus naiven
T-Helferzellen?
•
Unterscheiden sie sich in ihrer Fähigkeit zur Differenzierung zu Dendritischen Zellen?
12
Material und Methoden
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
2.1.1 Geräte
Analysenwaage Handy H 51-D
Sartorius, Göttingen, D
Computer Power Macintosh G3
Apple, Cork, IRL
Dispenser
Eppendorf, Hamburg, D
Durchflusszytometer FACScan
Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
LS Separationssäule
Miltenyi Biotec, D
Mikrobiologische Sicherheitswerkbank
Heraeus, Stuttgart, D
Mikroskop Axiolab
Carl Zeiss, Oberkochem, D
Monovetten (EDTA-Röhrchen)
Sarstedt, Nümbrecht, D
Neubauer-Zählkammer, verbessert
Brand, Wertheim/Main, D
Pipetten Pipetta 2 (10; 50; 200 und 1000 µ l) Ratiolab, Dreieich, D
Pipette Proline Electronic 100 µ l
Biohit, Helsinki, Finnland
Präzisionswaage Scaltec SBC52
Scaltec, Heiligenstadt, D
Software CellQuest 3.2.1
Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
Software SigmaStat Version 2.03
SPSS, Erkrath, D
Vacuum module atom 304
Biotron, E
Whirler REAX 2000
Heidolph, Kelheim, D
Begasungsbrutschrank
Heraeus, Stuttgart, D
VarioMACS Permanentmagnet
Miltenyi Biotec, D
Zellsorter MoFlo
Cytomation, Colorado, USA
Zentrifuge Centrifuge 5415 C
Eppendorf, Hamburg, D
Zentrifuge LaboFuge 400R
Heraeus, Stuttgart, D
Zentrifuge Rotixa/RP
Hettich, Tuttlingen, D
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
Dispenser-Tips (0,5; 5 und 12,5 ml)
Eppendorf, Hamburg, D
FACS-Röhrchen (0,6 ml)
Greiner Labortechnik, Frickenhausen, D
Kulturplatten Costar 48 Well Culture Cluster Corning Inc., Corning, NY, USA
Kulturplatten Costar 24 Well Culture Cluster Corning Inc., Corning, NY, USA
13
Material und Methoden
Pipettenspitzen
Ratiolab, Dreieich, D
Reagenzröhrchen (15 und 50 ml)
Greiner Labortechnik, Frickenhausen, D
Reagenzröhrchen Falcon 2052
Becton Dickinson Labware, NJ, USA
Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml)
Eppendorf, Hamburg, D
2.1.3 Reagenzien
Brefeldin A
Sigma, Deisenhofen, D
Bovines Serumalbumin
USB, Cleveland, USA
Ca-Ionophore
Sigma, Deisenhofen, D
EDTA
BioWhittaker, USA
Ethanol 99,9 %
Baker, Deventer, NL
Fetal Calf Serum (FCS)
Sigma, Deisenhofen, D
Ficoll Separating Solution
Biochrom, Berlin, D
Light Green SF Yellowish
Sigma, Deisenhofen, D
Lipopolysaccharid (LPS) von E. coli
Sigma, Deisenhofen, D
Natriumazid
Merck, Darmstadt, D
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt, D
PBS Dulbecco’s
Gibco Life Technologies, Paisley, GB
Penicillin/Streptomycin Seromed
Biochrom, Berlin, D
PMA
Sigma, Deisenhofen, D
RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin
Gibco Life Technologies, Paisley, GB
Saponin
Sigma, Deisenhofen, D
Toluidinblau
Merck, Darmstadt, D
2.1.4 Medien und Lösungen
2.1.4.1 Kulturmedium
Zur Herstellung des Zellkulturmediums wurde RPMI 1640 Medium (mit 2 mM Glutamin) mit
10 % FCS, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin versetzt.
2.1.4.2 MACS-Puffer
Die MACS-Puffer, die bei der Markierung IL-10 produzierender Monozyten und bei der
Separation naiver T-Helferzellen verwendet wurde, enthielt PBS mit 0.5% BSA und 2 mM
EDTA
Material und Methoden
14
2.1.4.3 Kimura-Färbelösung
Die Kimura-Lösung enthielt als Farbstoffe Toluidinblau und Light Green. Sie bestand aus 62 %
Toluidinblau-Lösung (500 µg/ml Toluidinblau, 0,9 % NaCl und 20 % Ethanol gelöst in Aqua
bidest), 5 % Light Green-Lösung, 3 % in PBS gesättigter Saponinlösung und 30 %
Phosphatpuffer pH 6,4. Nach Mischen wurde die Lösung durch einen 0,45 µm Filter filtriert.
2.1.5 Zytokine
Die humane rekombinante Zytokine GM-CSF, IL-2 und IL-4 von Strathmann Biotec wurden
verwendet. Die Zytokine wurden mit RPMI Medium aliquotiert und bei -70°C gelagert.
2.1.6 Antikörper
2.1.6.1 Fluoreszenzmarkierte Antikörper
Bei allen fluoreszenzmarkierten Antikörpern handelt es sich um monoklonale Antikörper vom
Isotyp IgG1. Sie wurden mit einer Lösung aus PBS, 2 % FCS und 0,1 % Natriumazid verdünnt.
Spezifität
Fluorochrom
Klon
keine (Negativkontrolle)
FITC
DAK-GO1
Dako, Glostrup, DK
keine (Negativkontrolle)
PE
DAK-GO1
Dako, Glostrup, DK
keine (Negativkontrolle)
Cy5
679.1Mc7
Immunotech, Marseille, F
Anti-CD1a
FITC
HI149
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD3
Cy5
HIT3a
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD4
FITC
SK3, SK4
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD14
Cy5
M5E2
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD45RA
FITC
OX-33
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD45RO
PE
UCHL1
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-CD83
PE
HB15E
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Anti-HLA-DR
PE
TÜ36
BD Fastimmune, San Diego, CA, USA
Anti-IFN-γ
FITC
25723.11
BD Fastimmune, San Diego, CA, USA
Anti-IL-2
FITC
5344.111
BD Fastimmune, San Diego, CA, USA
Anti-IL-4
PE
3010.211
BD Fastimmune, San Diego, CA, USA
Anti-IL-13
PE
JES10-5A2
BD Fastimmune, San Diego, CA, USA
Tabelle 1: Verwendete fluoreszenzmarkierte Antikörper
Hersteller
15
Material und Methoden
2.1.6.2 IL-10 Secretion Assay/Detection kit (PE)
Dieses Kit von Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, D) wurde für die Markierung IL-10
produzierender Monozyten verwendet. Das Kit besteht aus zwei Komponenten: das IL-10 Catch
Reagent und das IL-10 Detection Antibody (PE)
2.1.6.3 CD45RO MicroBeads
Für die Separation von naiven T-Helferzellen und T-Gedächtniszellen wurden paramagnetische
monoklonale anti-CD45RO Antikörper von Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, D)
verwendet.
2.1.7 ELISA-Kits
Für die Bestimmung der Konzentration von den Zytokinen IL-4, IFN-γ, IL-10 und IL-12 aus
den Zellkulturüberständen wurden fertige Kits von R&D Systems (Minneapolis, USA)
verwendet.
2.1.7.1 Anti-CD3
Zur Aktivierung der T-Effektorzellen wurde der anti-CD3 Antikörper (Klon OKT-3) von
BeckmanCoulter Immunotech (Marseille, F) verwendet.
2.1.8 Probanden
Für die Experimente wurde das periphere Blut von 11 gesunden Probanden verwendet.
16
Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen mittels
Dichtegradientenzentrifugation
Peripher venöses Blut aus einer 9 ml EDTA-Monovette wurde mit der gleichen Menge PBS
verdünnt und über Ficoll (Dichte 1.077 g/ml) geschichtet. Nach Zentrifugation bei 1000 x g und
4˚C für 20 Minuten wurde aus der Interphase die mononukleären Zellen entnommen. Die Zellen
wurden zweimal mit PBS / 1% FCS gewaschen (600 x g, 10 min, 4 ˚C) und das Zellsediment in
20 ml Medium resuspendiert. Es erfolgte zunächst die Zellzählung mittels Kimura-Färbung.
2.2.2 Kimura-Färbung
Die Zellfärbung diente zur Bestimmung der Zelldichte in der Suspension, um daraus die
Gesamtzahl der isolierten Zellen zu errechnen. Zur Färbung der Zellen wurden 10 µ l
Zellsuspension mit 90 µ l Kimuralösung vermischt und mindestens eine Minute stehengelassen.
Anschließend wurde die Zellzahl mit einer Zählkammer im Lichtmikroskop bestimmt, wobei 4
Großquadrate mit je 0.01 µ l Volumen ausgezählt wurden. Die durchschnittliche Anzahl der
Zellen je Großquadrat mit 105 multipliziert ergab die Anzahl der Zellen in einem Milliliter.
2.2.3 Zellkultur und –Stimulation
Für die Zellkultur wurden zuerst 24 Well-Platten verwendet wobei in die Kulturschalen jeweils
3x106 Zellen in 1 ml Kulturmedium (RPMI 1640 mit 10% FCS, 100 µg/ml Streptomycin und
100 U/ml Penicillin) gegeben wurden. Die Zellen wurden 36 h in einem Brutschrank bei 37 ˚C
und einer halbfeuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Vorversuche hatten ergeben, dass
die Kultivierung der Monozyten für 36 h zusammen mit Lymphozyten zu einer maximalen
Produktion des Zytokins IL-10 führt. Als stimulierendes Antigen wurde LPS von Escherichia
coli (Serotyp: 0111:B4) in einer Konzentration von 1 µg/ml für die letzten 12 h verwendet.
Material und Methoden
17
2.2.4 Gewinnung von IL-10 positive bzw. negative Monozyten und
T-Lymphozyten mittels Zellsortierung
2.2.4.1 Zellmarkierung
Die IL-10 produzierenden Monozyten wurden mit der Hilfe des MACS IL-10 Secretion
Assay/Detection Kits markiert. Dieser Kit besteht aus zwei Komponenten: dem IL-10 Catch
Reagent und dem IL-10 Detection Antibody (Abbildung 2). Das IL-10 Catch Reagent besteht
aus zwei Antikörpermolekülen, die an den Fc-Teilen verbunden sind. Der eine Antikörper ist ein
monoklonaler Maus IgG1-Antikörper gegen das IL-10 Molekül, der andere ist ein
Zelloberflächen-spezifischer
Maus
IgG2a-Antikörper.
Das
Konjugat
bindet
auf
der
Zelloberfläche, um die von der gegebenen Zelle sezernierte IL-10 Moleküle zu abfangen. Der
IL-10 Detection Antibody ist ein gegen das IL-10 Molekül gerichteter, PE-konjugierter
monoklonaler Maus IgG1 Antikörper. Von den zuvor gewonnenen und stimulierten PBMCs
wurden 5x107 Zellen in jeweils 50 ml MACS-Puffer gegeben und abzentrifugiert (300 x g, 10
min, 4°C). Dieser Waschschritt wurde noch einmal wiederholt. Anschließend wurden die Zellen
in kaltem Medium (80 µ l/107 Zellen) aufgenommen. Danach erfolgte die Inkubation mit IL-10
Catch Reagent (20 µ l/107 Zellen) für 10 Minuten auf Eis. Als nächster Schritt wurden die Zellen
in 37 ˚C warmen Medium (10 ml/107 Zellen) für 45 Minuten im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2)
inkubiert, wobei die Zellsuspension alle 5 Minuten gewendet wurde. Nach der Inkubation
wurden die Zellen mit kaltem MACS-Puffer (50 ml/5x107 Zellen) zweimal gewaschen (300 x g,
10 min, 4°C). Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wurden die Zellen wieder in kaltes
Medium (80 µ l/107 Zellen) aufgenommen und mit IL-10 Detection Antibody (PE), CD14-Cy5
und CD4-FITC (jeweils 20 µl/107 Zellen) FACS-Antikörper (1:25 verdünnt) für 10 Minuten
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit MACS-Puffer (50 ml /5x107 Zellen) gewaschen,
abzentrifugiert (300 x g, 10 min, 4°C) und in 2 ml PBS mit 2 % FCS aufgenommen.
Abbildung 2: Das IL-10 Secretion Assay/Detection Kit.
Das IL-10 Catch Reagent Antiörperkonjugat besteht aus einem anti-IL-10 IgG1-Molekül und aus einem
zellemebranspezifischen IgG2a-Molekül. Das IL-10 Detection Antibody ist ein PE-markiertes anti-IL-10 IgG1
Antikörpermolekül
18
Material und Methoden
2.2.4.2 Zellsortierung
Die Zellsortierung unterscheidet sich von der analytischen Durchflusszytometrie dadurch, dass
mit dieser Methode die Zellpopulationen anhand ihrer Fluoreszenzeigenschaften voneinander
physikalisch getrennt werden. Die sortierten Zellpopulationen enthalten lebende Zellen, die man
kultivieren und in weitere Experimente einsetzen kann. Die gewünschten Zellen wurden
voneinander mit der Hilfe eines MoFlo® Hochgeschwindigkeitzellsorters getrennt, mit dem
eine maximale Sortgeschwindigkeit von 70.000 Zellen/Sekunde erreicht werden kann.
Abbildung 3: Das Prinzip der Zellsortierung.
Die einzelnen Zellen werden anhand ihrer Fluoreszenzeigenschaften von einem elektrischen Feld so abgelenkt, damit sie in
die richtigen Auffangröhrchen geraten.
Im Laufe der Sortierung werden die Zellen im Einzelzellstrom durch eine Meßkammer geleitet,
wo sie von dem monokromatischen Licht eines Lasers bestrahlt werden (Abbildung 3). Die
Photodetektoren, mit denen die drei verschiedenen Fluoreszenzen und die Vorwärts- (FSC) und
die Seitwärtsstreuung (SSC) erfasst werden können, sind durch einen Computer mit zwei
elektrischen Platten verbunden, die mit einer Spannung von 3500 V den Einzelzellstrom
ablenken können. Auf dieser Stelle besteht der Zellstrom aus vereinzelten Flüssigkeittropfen,
wobei jeder Tropfen eine einzige Zelle enthält. Die gewünschten Zellpopulationen werden mit
Kulturmedium-enthaltenden Falcon-Rörchen aufgefangen. Vor der Sortierung muss es definiert
werden, nach welchen Kriterien (Fluoreszenzwerten) die Anlage die Zellen zu sortieren hat.
Hierzu erfolgt die Auswahl geeigneter Parameter und Regionen. In dem Moment, wenn eine
Zelle durch die Meßkammer hindurch fließt, erfolgt sofort eine erste Analyse ihrer
Fluoreszenzeigenschaften, so dass anhand ihrer Fluoreszenwerten das angeschlossene
19
Softwareprogramm das
Maß der
gewünschten Ablenkung
Material und Methoden
errechnet,
so dass
der
Flüssigkeittropfen, in dem sich die Zelle befindet, in das richtige Abfangröhrchen gelangt. Der
Sortierung folgt eine Reanalyse, um die Reinheit der Sortzellen zu bestimmen.
In unserem Versuchsaufbau erfolgte die Markierung der T-Helferzellen mittels FITC-markierter
anti-CD4-Antikörper, PE-markiert war der Antikörper gegen IL-10 und PC5-markiert war das
Monozyten definierende CD14-Molekül. Während der Einstellung des Gerätes wurde erstmal
eine Kompensation durchgeführt, um die gewünschten Zellpopulationen identifizieren zu
können.
Bei einer Mehrfachmarkierung muss man mit dem Phänomen der spektralen Überlappung
rechnen. Dies heißt, dass das Emissionslicht des jeweiligen Fluoreszeinmoleküls nicht nur mit
dem entsprechenden Photodetektor detektiert wird, ein Teil des Signals strahlt auch in die
anderen Detektoren. Dieses Problem lässt sich durch die Kompensation lösen: aus den einzelnen
Fluoreszenzwerten wird ein bestimmter Teil (der der Menge des ungewünschten
Fluoreszenzlichtes entspricht) vom Softwareprogramm subtrahiert.
Abbildung 4: Die Identifizierung von den gewünschten Zellpopulationen.
A: Auf dem FSC/SSC Dotplot sind die Monozyten von den Lymphozyten gut abgrenzbar. B: Mit dem Lymphozytengate
wurde die CD4 FITC positive Th-Zellpopulation ausgewählt. C: Mit Monozytengate wurden IL-10 PE-positive bzw.
-negative CD14 Cy5 positive Monozyten identifiziert.
Abbildung 4 veranschaulicht die Wahl der Sortregionen. Zuerst wurden die Monozyten von den
Lymphozyten auf dem FSC-SSC Dotplot abgegrenzt (Monozyten- und Lymphozytengate,
Abbildung 4/A). Die Lymphozyten bildeten unten eine gut abgrenzbare, homogene Population,
während für die Monozyten, die bezüglich ihrer Größe und Granularität weniger homogen sind,
war die Bestimmung einer größeren Region nötig. Mit dem Lymphozytengate wurde ein FITCPE Dotplot geöffnet, wobei die gut abgrenzbare CD4 (FITC) Positive T-Helferzellen als die
erste sortierende Zellpopulation ausgewählt wurden (Abbildung 4/B). Mit dem Monozytengate
wurde ein Cy5-PE Dotplot geöffnet, auf dem sich die IL-10 (PE) positive und –negative
Monozyten darstellten (Abbildung 4/C). Diese Zwei Populationen der Monozyten waren schwer
voneinander abgrenzbar, weil sie auf den Ränder einer zusammenhängenden Population lagen.
Bei der Auswahl der sortierenden Monozytenpopulationen sind wir dem Prinzip gefolgt, dass
20
Material und Methoden
die zwei Regionen möglichst weit voneinander eingestellt werden sollten, dennoch nah genug,
um eine ausreichende Menge der Zellen gewinnen zu können.
Der Sortierung folgte eine Reanalyse, wobei die Reinheit der Zellen bestimmt wurde. Bei
diesem Schritt wurde ein Teil der gerade sortierten Zellpopulationen mit dem FACS-Sorter mit
den vor der Sortierung eingestellten Gates und Regionen gemessen. Es wurde von dem Gerät
errechnet, wie viel Prozent der analysierten Zellen sich in den früher eingestellten Regionen
befinden (Reinheit, Abbildung 7).
Nach erfolgreicher Isolation der IL-10 positiven Monozyten erfolgte die Charakterisierung und
Überprüfung der Funktion mittels weiterer anschließender Experimente, wie im Folgenden
aufgelistet und beschrieben werden.
2.2.5 Zellkultur zur Bestimmung der Stabilität der Zytokinproduktion
per ELISA
Um die Stabilität der IL-10 und IL-12 Produktion der sortierten Monozyten zu bestimmen
wurden jeweils 2.5x105 Zellen in 500 µl Kulturmedium auf einer 48 Well-Platte für 48 Stunden
inkubiert. Von den Zellüberständen wurde die Menge von IL-10, IL-12p40 und IL-12p70
mittels ELISA bestimmt.
2.2.6 Analyse der Modulation der TH1/TH2 Immunatwort durch IL-10
produzierende Monozyten
2.2.6.1 Zellkulturen zur Untersuchung den Einfluss von IL-10 positiven bzw. negativen
Monozyten auf die Aktivierung von T-Effektorlymphozyten
24 Well-Kulturplatten wurden mit anti-CD3 Antikörper in einer Konzentration von 5 µg/ml (in
PBS) beschichtet (1 ml Antikörperlösung wurde in jedem Well gegeben und auf 4ºC für 24
Stunden immobilisiert; der Überstand wurde gleich vor der Fertigstellung der Zellkultur
abpipettiert).
Jeweils 106 CD4+ Lymphozyten wurden mit 5x105 IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten
in 1 ml Kulturmedium gegeben. Als Kontrolle wurden CD4+ Lymphozyten einmal ohne
anti-CD3 und einmal mit anti-CD3 aber ohne Monozyten kultiviert. Nach 24 Stunden wurden
die Zellüberstände für die weitere Analyse der Zytokinproduktion mittels ELISA bei –70°C
eingefroren.
21
Material und Methoden
2.2.6.2 Separation von naiven CD4-Lymphozyten von Gedächtniszellen
Für die Untersuchungen zur Differenzierung von TH1- und TH2-Lymphozyten nach dem
Kontakt mit den sortierten Monozyten wurden naive CD4+ T-Lymphozyten benötigt. Die
naiven T-Helferzellen wurden von den Gedächtniszellen mittels Immunomagnetischer
Separation (MACS, Magnetic Antibody Cell Sorting) getrennt. Die bereits sortierten CD4+
Lymphozyten wurden abzentrifugiert (300 x g, 10 min, 4°C) und in MACS-Puffer resuspendiert
(80 µl/107 Zellen). Danach erfolgte die Inkubation mit MACS CD45RO Microbeads
paramagnetischen Antikörpern bei 4°C für 15 Minuten. Nach einem Waschschritt mit MACSPuffer (2 ml/107 Zellen) wurde eine Zellkonzentration von 2x108/ml mit MACS-Puffer
eingestellt. Nun wurde diese Zellsuspension auf eine Eisenkügelchen-enthaltende Säule (MACS
LS Column) gegeben, die vorher im Magnetfeld gestellt wurde. Vom unteren Teil dieser Säule
ließen sich die naive TH-Zellen gesammelt, während die CD45RO positive Gedächtniszellen
blieben in der Säule. Zur Gewinnung dieser Zellpopulation wurde die Säule vom Magnetfeld
entfernt, mit 5 ml MACS-Puffer aufgefüllt und mit der Hilfe des beiliegenden Stempels
ausgespült. Die zwei Zellfraktionen wurden gezählt und jeweils ein Aliquot von 100 µl für eine
Reinheitsmessung wurde entnommen. Der Rest der Zellen wurde auf Eis gestellt. Die Reinheit
der gewonnenen Zellpopulationen wurde mit einer analytischen FACS-Messung bestimmt
(Abbildung 5).
Abbildung 5: Die Separation von Naiven CD4+ Lymphozyten von Gedächtniszellen.
A: Vor der Trennung besteht die Lymphoyztensuspension sowohl von CD45RO+ Gedächtniszellen und CD45RA+ naiven
Th-Zellen. B: Nach der Trennung werden nur die CD45RA+CD45RO- naïve Th-Zellen detektiert.
Material und Methoden
22
2.2.6.3 Zellkulturen zur Untersuchung den Einfluss von IL-10 positiven bzw. negativen
Monozyten auf die Entwicklung von TH1 bzw. TH2-Lymphozyten aus naiven
T-Helferzellen
Nach der FACS-Sortierung von den gewünschten Monozytenpopulationen und der
Aufreinigung von autologen naiven CD4+CD45RA+ Lymphozyten wurden die Zellen auf einer
48-Well Kulturplatte miteinander kultiviert. Jeweils 105 CD4+ CD45RA+ Lymphozyten wurden
mit 2.5x104 IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten in 500 µl Kulturmedium gegeben
(Verhältnis 4:1). Es wurde das Superantigen Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) in einer
Konzentration von 100 pg/ml verwendet. Als Kontrolle wurden CD4+ CD45RA+ Zellen einmal
allein, und einmal mit Monozyten, ohne Superantigen kultiviert. Ein zusätzlicher Ansatz mit 105
CD4+ CD45RO+ Gedächtniszellen mit SEB wurde ebenfalls angelegt. Nach 5 Tagen wurden
die Zellen in kalten PBS aufgenommen, einmal gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C) und auf eine
24-Well-Kulturplatte in jeweils 1 ml Kulturmedium verteilt und mit 20 U/ml IL-2 ruhen
gelassen. Die Zellüberstände wurden für die weitere Analyse der Zytokinproduktion mittels
ELISA bei –70°C eingefroren. Nach weiteren 5 Tage wurden die Zellen erneut aufgenommen
und wie folgt weiter verwendet.
Zwei Ansätze wurden für die intrazelluläre Zytokinmessung mit 10-8 M PMA und 10-6 M
Calcium-Ionophor für 6 h stimuliert. Um die Zytokine im Zellinneren anzureichern, wurde
Brefeldin A
in
einer
Konzentration
von
10 µg/ml
zugesetzt.
Brefeldin A
ist
ein
Stoffwechselprodukt des Pilzes Penicillium brefeldianum und blockiert den Transport
sekretorischer Proteine vom endoplasmatischen Retikulum durch den Golgi-Apparat.91 Nach
Ende des Kulturzeitraums wurde die entnommene Zellsuspension wie unten stehend weiter
aufgearbeitet.
Die Zellen der anderen 2 Wells wurden gewaschen und jeweils 106 Zellen wurden auf einer
neue 24 Well-Kulturplatte in 1 ml Kulturmedium gegeben. Die Zellen wurden mit 10-8 M PMA
und 10-6M Calcium-Ionophor für 24h stimuliert und anschließend wurden die Zellkultur
Überstände für die weitere Analyse der Zytokinproduktion mittels ELISA bei –70°C
eingefroren.
2.2.6.4 Nachweiß von intrazellulären Zytokinen
Der intrazelluläre Nachweis von Zytokinen erfolgte in Anlehnung an die von de Caestecker et
al32 beschriebene Methodik und beruht auf der Anfärbung intrazellulär angereicherter Zytokine
mit monoklonalen fluoreszenzmarkierten Antikörpern in fixierten und permeabilisierten Zellen.
23
Material und Methoden
Außerdem wurden auch bestimmte Oberflächenmoleküle mit monoklonalen Antikörpern
angefärbt.
Die Suspension wurde aus der Kulturschale entnommen und der Überstand abzentrifugiert
(500 x g, 5 min). Danach wurden die Zellen mit 1 ml PBS gewaschen und zur Fixation mit
200 µl 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10 min auf Eis inkubiert. Nach zwei weiteren
Waschschritten mit 1 ml PBS wurde das Zellpellet in 40 µl PBS resuspendiert und davon je 10
µl in ein FACS-Röhrchen gegeben. Die Zellen wurden mit je 10 µ l Antikörperlösung und 20 µ l
0,1 % Saponinlösung vermischt und bei Raumtemperatur 15 min im Dunkeln inkubiert. Saponin
bewirkt eine Permeabilisierung der Zellmembran und ermöglicht so den fluoreszenzmarkierten
Antikörpern in die Zellen einzudringen. Nach zweimaligem Waschen mit 0,1 % Saponinlösung
wurden die Zellen in 100 µ l PBS aufgenommen und die Expression der untersuchten Zytokine
wurde im analytischen Durchflusszytometer gemessen.
2.2.7 Auswertung der Fuoreszenzdaten
Die Fluoreszenz einer Zelle im Durchflusszytometer entspricht der Summe aus ihrer
Eigenfluoreszenz und der Fluoreszenz der an ihr gebundenen Antikörper-FluorochromKonjugate. Dabei setzt sich letztere aus spezifisch an das nachzuweisende Molekül und
unspezifisch gebundenen Antikörpern zusammen. Um die Summe aus Eigen- und
unspezifischer Fluoreszenz zu messen, wurde jede Probe in einem zusätzlichen Ansatz mit
Antikörpern ohne Affinität zu menschlichen Zellen markiert (IgG1-Negativkontrolle). Somit
ergibt sich für die Berechnung der spezifischen Fluoreszenzintensität folgende Formel:
spezifische mittlere Fluoreszenz = Fluoreszenz der markierten Probe – Fluoreszenz der IgG1Negativkontrolle
Da die Intensität der spezifischen Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten gemessen wurde, die
von der Verstärkung in den Photodetektoren und der Kompensation abhängig waren, wurde zum
Vergleich der Messungen untereinander die relative spezifische Fluoreszenz errechnet. Sie ist
ein Maß für die Intensität der spezifischen Fluoreszenz im Verhältnis zur Fluoreszenz der IgG1Negativkontrolle und errechnet sich wie folgt:
relative spezifische mittlere Fluoreszen z =
spezifische mittlere Fluoreszenz
Fluoresze nz der IgG1-Negativkontrolle
24
Material und Methoden
2.2.8 Nachweiß von Zytokinen in den Zellüberstände mittels ELISA
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ist ein Testverfahren um die Konzentration von
Proteinen aus Körperflüssigkeiten, wie z. B. Serum oder aus Zellkulturüberständen zu
bestimmen. Die Methode beruht auf der Bindung des nachzuweisenden Proteins (in unserem
Fall Zytokine wie IL-10, IL-12, IFN-γ und IL-4) an einen spezifischen Antikörper (erster
Antikörper), der an eine Plastikoberfläche gebunden ist. Es wird anschließend ein 2. gegen
diesem Stoff gerichteter Antikörper (zweiter Antikörper) zugegeben, der mit Biotin konjugiert
ist und an den Stoff bindet. Zur Detektion wird dann Streptavidin-Peroxidase (= Enzym) und
Substrat (TMB) zugegeben. Die Farbreaktion ermöglicht die Quantifikation der Konzentration
des nachzuweisenden Stoffes.
Die Messung erfolgt im Photometer und die Qualifizierung des Signals in der Probe erfolgt über
eine Standardkurve mit aufgereinigtem Protein.
2.2.9 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten
Um die Fähigkeit der sortierten Monozyten für weitere Differenzierung zu dendritischen Zellen
zu untersuchen wurden jeweils 1x105 Monozyten beider Populationen wurden auf einer 24
Well-Platte in der Anwesenheit von 500 U/ml GM-CSF und 250 U/ml IL-4 für 6 Tage
kultiviert. An dem 7. Tag wurde zu den Zellen LPS in einer Konzentration von 1 µg /ml
dazugegeben. Diese Methode für die in vitro Differenzierung von dendritischen Zellen wurde
zum ersten mal von Romani et al beschrieben.110
Nach der Kultur wurde die Expression von der Oberflächemolekülen CD1a, CD83, HLA-DR
und CD14 durchflusszytometrisch untersucht.
2.2.10. Statistische Auswertung
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEM) dargestellt. Die
Auswertung erfolgte mit Hilfe des T-Tests, wobei die Fehlerwahrscheinlichkeit von p < 0,05 als
statistisch signifikant betrachtet wurde.
25
Ergebnisse
3 ERGEBNISSE
3.1 Reinheit der sortierten Zellen
Um die Reinheit der sortierten Zellen zu bestimmen wurde nach der Sortierung für jeden Zelltyp
eine Reanalyse durchgeführt. Dazu wurde wie in Abbildung 6 gezeigt die Prozentzahl der
entsprechenden Zellen festgestellt, die sich innerhalb des vor der Sortierung möglichst optimal
eingestellten Gates befinden. Die Sort-Reanalyse zeigte eine durchschnittliche Reinheit von
89,27 ± 5,17 % für die CD4+ Zellen, 73,37 ± 4,44 % für die IL-10 positive und 77,26 ± 3,26 %
für die IL-10 negative Monozytensubpopulation. Nach der CD45RA-Isolation ergab sich eine
Reinheit von 92,42 ± 1,84 % für die naïven T-Helferzellen.
Abbildung 6: Die Reanalyse der Sortzellen für die Bestimmung der Reinheit.
A: CD4+ T-Helferzellen, B: IL-10 positive Monozyten, C: IL-10 negative Monozyten (Darstellung eines repräsentativen
Experiments von 9)
3.2 Stabilität der IL-10 und IL-12p40 Produktion der
Monozyten nach der Sortierung
In diesem Experiment wurde untersucht, ob sich die dichotome Bildung der Zytokine IL-10 und
IL-12 nach der Sortierung erhält. Nach 48-stündiger Kultur zeigte sich ein eindeutiger
Unterschied zwischen den beiden Monozytensubpopulationen bezüglich der IL-10 Bildung.:
Die Monoyzten der positiven Population bildeten mehr IL-10 (153,22 ± 47,99 pg/ml) als die
Zellen der Negativpopulation (58,22 ± 17,79 pg/ml). Diese Unterschied war auch statistisch
signifikant (p=0.02). Bei der IL-12 Produktion fanden wir nur einen mäßigen Unterschied
zwischen den zwei Populationen: Die IL-10 positive Monozyten produzierten mit 208,44 ±
88,11 pg/ml etwas mehr IL-12p40, als die Negativpopulation (177,22 ± 75,69 pg/ml), ohne
Ergebnisse
26
signifikante Unterschied. Die Produktion des aktiven Heterodimers, IL-12p70 war kaum zu
detektieren. (Abbildung 7).
Zytokinproduktion [pg/ml]
350
300
250
200
IL-10 pos
IL-10 neg
150
*
100
50
0
IL-10
IL-12p40
IL-12p70
Abbildung 7: Die Stabilität der IL-10, IL-12p40 und IL-12p70 Produktion der sortierten Monozyten.
Die Monozyten der IL-10 positiven und IL-10 negativen Population wurden für 48h inkubiert. Dargestellt sind die
Konzentration von IL-10, IL-12p40 und IL-12p70 in den Zellkulturüberständen (*:p<0,05 im Vergleich mit IL-10 pos,
n=9).
3.3 Der Einfluss der sortierten Monozytenpopulationen
auf die Aktivierung von T-Effektorzellen
In diesem Versuch wurden IL-10 positive bzw. negative Monozyten mit CD4+ T-Lymphozyten
in der Anwesendheit von anti-CD3 (gebunden auf dem Boden der Zellkulturschale) für 48
Stunden kultiviert. Die IFN-γ und IL-4 Produktion der stimulierten Lymphozyten wurde mittels
ELISA gemessen (Abbildung 8).
Bei den stimulierten Lymphozyten kam es zur Produktion von IFN-γ (139,5 ± 36,75 pg/ml) und
IL-4 (145,25 ± 14,69 pg/ml). Die Zugabe von Monozyten erhöhte leicht die Produktion von
IFN-γ. Dieser Effekt war bei den IL-10 negativen Monozyten mit 162,25 ± 31,01 pg/ml
deutlicher ausgeprägt, als bei den IL-10 positiven (142,75 ± 42,78 pg/ml), die Unterschiede
zeigten aber keinerlei Signifikanz. Dagegen wurde die lymphozytäre IL-4 Produktion von den
Monozyten signifikant reduziert. Dieses Phänomen war bei den IL-10 positiven Monozyten mit
40,75 ± 3,75 pg/ml stärker, als bei den Monozyten der Negativpopulation (50,5 ± 12,74 pg/ml),
obwohl dieser Unterschied auch keine Signifikanz erreichte. Insgesamt waren die Unterschiede
zwischen den einzelnen Versuchansätzen nur marginal.
Ergebnisse
27
A
B
250
IL-4 [pg/ml]
IFN-γ [pg/ml]
200
150
100
50
0
CD4-Zellen
CD4-Zellen, antiCD3
CD4-Zellen, anti- CD4-Zellen, antiCD3, IL-10
CD3, IL-10
positive Monos
negative Monos
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
CD4-Zellen
CD4-Zellen,
anti-CD3
*
CD4-Zellen,
CD4-Zellen,
anti-CD3, IL-10 anti-CD3, IL-10
positive Monos negative Monos
Abbildung 8: Der Einfluss der zwei Monozytensubpopulationen auf die Aktivierung von T-Effektorzellen.
IL-10 positive bzw. negative Monozyten wurden mit CD4+ Lymphozyten in der Anwesendheit von anti-CD3 für 48h
Kultiviert. Die Produktion von IFN-γ(A) und IL-4(B) wurde mittels ELISA bestimmt (*:p<0,05 im Vergleich mit
CD4-Zellen+anti-CD3, n=4).
3.4 Der Einfluss der sortierten Monozytenpopulationen
auf die Entwicklung von TH1- bzw. TH2- Lymphozyten
aus naiven T-Helferzellen
Um den Einfluss der sortierten Monozytensubpopulationen auf die Entwicklung von TH1- bzw.
TH2-Lymphozyten zu untersuchen, wurden Monozyten zusammen mit naiven T-Lymphozyten
kokultiviert. Nach 5-tägiger Kulturdauer wurde die lymphozytäre Produktion von IFN-γ und
IL-4 mittels ELISA gemessen. Nach Expansion mit IL-2 für weitere 5 Tage und darauf
folgender Aktivierung mit PMA/Ca-Ionophore wurde die Produktion von IFN-γ und IL-4
mittels ELISA, und die Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 durchflusszytometrisch
bestimmt.
3.4.1 Die Produktion von IFN-γ und IL-4 nach 5-tägiger Kulturdauer
Die 5-tägige Kultivierung der naiven T-Helferzellen allein oder mit Monozyten, ohne SEB
induzierte keine messbare IFN-γ Produktion (Abbildung 9/A). Die Zugabe von SEB, einem
oligoklonalen Aktivator der T-Helferzellen durch die antigenpräsentierende Zellen ergab eine
massive IFN-γ Produktion, wobei Lymphozyten, die zusammen mit IL-10 negativen Monozyten
kultiviert wurden, bildeten mit 129,67 ± 44,49 pg/ml mehr IFN-γ, als die mit der IL-10 positiven
Monozyten (90,67 ± 45,12 pg/ml), obwohl ein signifikanter Unterschied nicht feststellbar war.
SEB allein, ohne Monozyten als Stimulatorzellen konnte keine IFN-γ Produktion der naiven
T-Helferzellen induzieren. Als Kontrolle wurde ebenfalls die Zytokinproduktion der
T-Gedächsniszellen (CD45RO+) gemessen, wobei eine mäßige IFN-γ Produktion nach
Stimulation mit SEB beobachtet wurde (46 ± 40,15 pg/ml).
Ergebnisse
28
Die Produktion von IL-4 nach 5-tägiger Kulturdauer erwies sich als minimal und lag unter der
Nachweisgrenze des ELISA-Systems bei 22 pg/ml in allen untersuchten Ansätzen. Die höchsten
Werte wurden bei den T-Helferzellen und T-Gedächtniszellen (Kontrollansatz) gemessen, die in
der Abwesendheit von Monozyten mit SEB stimuliert wurden (Abbildung 9/B).
A
200
180
IFN-γ [pg/ml]
160
140
120
100
80
60
40
20
0
naive T-Zellen
naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10
positive Monos
negative Monos
naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10
positive Monos, SEB negative Monos, SEB
naive T-Zellen, SEB
T-Gedächtniszellen,
SEB
naive T-Zellen, SEB
T-Gedächtniszellen,
SEB
B
IL-4 [pg/ml]
40
20
0
naive T-Zellen
naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10
positive Monos
negative Monos
positive Monos, SEB negative Monos, SEB
Abbildung 9: Der Einfluss der zwei Monozytensubpopulationen auf die Differenzierung von naiven T-Helferzellen.
IL-10 positive bzw. negative Monozyten wurden allein, mit naiven CD4+ Lymphozyten und mit SEB und naiven CD4+
T-Helferzellen für5 Tage kultiviert. Die Produktion von IFN-γ(A) und IL-4(B) wurde mittels ELISA bestimmt (n=3).
3.4.2 Die Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 nach Expansion mit
IL-2 und Aktivierung mit PMA/Ca-Ionophor
3.4.2.1 Der Nachweis von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 mittels intrazellulärer
Zytokinmessung
Die Expansion der proliferierenden Lymphozyten mit IL-2 war dazu nötig, um eine für die
durchflusszytometrische Analyse detektierbare Zellmenge zu gewinnen. Eine analysierbare
Zellmenge wurde aber nur bei zwei von den 7 untersuchten Ansätzen erreicht, und zwar bei den
Ansätzen, bei denen die naive T-Zellen in der Anwesendheit von entweder IL-10 positiven oder
IL-10 negativen Monozyten, zusammen mit SEB kultiviert wurden. Bei den anderen Ansätzen
Ergebnisse
29
wurden nur sehr wenige Zellen detektiert, eine Aussage über die Zytokinproduktion mittels
Durchflusszytometrie war dadurch nicht möglich.
Bei der durchflusszytometrischen Bestimmung der IL-4 und IFN-γ Produktion war dem
TH1/TH2 Modell entsprechend eine Dichotomie bemerkbar: die aktivierten Zellen exprimierten
hauptsächlich nur eine der beiden untersuchten Zytokine (Abbildung 10).
1.5%
0.76%
4.56%
5.71%
A
B
Abbildung 10: Der Einfluss der zwei Monozytenpopulationen auf die Differenzierung der naiven T-Helferzellen.
CD45RA+ naive T-Helferzellen wurden mit IL-10 positiven (A) und IL-10 negativen (B) Monozyten für 5 Tage kokultiviert
bzw. Aktiviert. Die aktivierte T-Zellen wurden für weitere 5 Tage mit IL-2 expandiert. Anschließend wurden die Zellen mit
PMA/Ca-Ionophore restimuliert und die Produktion von IFN-γ und IL-4 wurde durchflusszytometrisch bestimmt.
Darstellung einer repräsentativen intrazellulären Zytokinmessung.
Bei der Mehrheit der Lymphozyten war die Produktion von IFN-γ nachweisbar. Es wurde nur
ein minimaler Unterschied zwischen den beiden Ansätzen bezüglich der Prozentzahl IFN-γ
produzierender Zellen beobachtet (Abbildung 11/A): aus den naiven T-Helferzellen, die mit den
IL-10 negativen Monozyten kokultiviert wurden, ließen sich mit 62,48 ± 12,95% mehr IFN-γ
produzierende Lymphozyten differenzieren, als aus den Lymphozyten, die mit den IL-10
positiven Monozyten kultiviert wurden (59,81 ± 62,48). Bemerkbare Unterschiede wurden bei
den RSMF- (relative spezifische mittlere fluoreszenz, s. Methoden) Werten gefunden
(Abbildung 11/B), wobei Lymphozyten, die mit den IL-10 positiven Monozyten kultiviert
wurden, produzierten mit 57.98 ± 15,93 weniger IFN-γ, als die mit IL-10 negativen Monozyten
kultivierten (73,32 ± 24,51), obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (n=9).
Die Anzahl IL-4 produzierender Lymphozyten war ungefähr nur ein Drittel der IFN-γ positiven
Zellen. Prozentual zeigte sich eine leichte, nicht signifikante Unterschied zwischen den zwei
Ansätzen: in der Anwesendheit IL-10 positiver Monozyten ergab sich mit 20,68 ± 9,78% eine
größere
Anteil
IL-4
produzierender
Lymphozyten,
als
bei
den
Monozyten
der
Ergebnisse
30
Negativpopulation (14,25 ± 9,42). Dieser Tendenz wurde von den RSMF-Werten der IL-4
Produktion nur wenig unterstützt (2,51 ± 0,29 bzw. 2,35 ± 0,66).
Die Produktion von IL-2 war ungefähr in der Hälfte der Lymphozyten nachweisbar: mit
52,91 ± 10,06% war die Anzahl IL-2 produzierender Lymphozyten bei der IL-10 positiven
Monozytenpopulation nur wenig erhöht im Vergleich mit den Lymphozyten, die mit den
IL-
10 negativen Monozyten kultiviert wurden (48,88 ± 9,98%). Bei den RSMF-Werten wurde die
selbe Tendenz beobachtet (5,68 ± 1,14 bzw. 4,62 ± 0,72).
Es wurde nur eine minimale IL-13 Produktion der Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie
detektiert. Der Anteil IL-13 positiver Zellen war dabei mit 1,85 ± 0,79% bei den mit IL-10
positiven Monozyten kokultivierten Lymphozyten etwas größer, als bei den mit IL-10 negativen
Monozyten kultivierten Lymphozyten (1,70 ± 0,71%). Tendenziell war die Unterschied der
RSMF-Werten gleich, aber genauso minimal (1,14 ± 0,06 bzw. 1,11 ± 0,07).
Die Unterschiede der einzelnen Ansätzen bezüglich der Produktion von IL-2 und IL-13 zeigten
auch keinerlei Signifikanz.
B
80
35
70
30
60
25
50
IL-10pos
40
IL-10neg
RSMF
Anteil der Lymphozyten [%]
A
20
IL-10pos
15
IL-10neg
30
10
20
5
10
0
0
IFN-γ
IL-4
IL-2
IL-13
IFN-γ
IL-4
IL-2
IL-13
Abbildung 11: Der Einfluss der zwei Monozytenpopulationen auf die lymphozytäre Bildung von IFN-γ, IL-4, IL-2 und
IL-13.
Dargestellt sind der Anteil der zytokinproduzierenden Lymphozyten(A) und die RSMF-Werte(B), (n=10).
3.4.2.1 Der Nachweis von IFN-γ und IL-4 mittels ELISA
In einem anderen Ansatz wurde die Konzentration von IFN-γ und IL-4 im Zellkulturüberstand
mittels ELISA gemessen (Abbildung 12, n=9). Lymphozyten, ohne SEB oder Monozyten
bildeten gar kein IFN-γ. Die Anwesendheit von Monozyten induzierte eine ganz minimale
IFN-γ Produktion. Durch die Zugabe von SEB erfolgte eine massive IFN-γ Ausschüttung der
Lymphozyten: T-Zellen mit der IL-10 negativen Monozytenpopulation bildeten mit 367,56 ±
88,91 pg/ml mehr IFN-γ, als die mit der Negativpopulation (344,33 ± 93,87 pg/ml). Der
Unterschied erwies sich aber als statistisch nicht signifikant.
Ergebnisse
31
Die IL-4 Produktion zeigte ein ähnliches Muster: naive T-Zellen allein, oder mit Monozyten,
aber ohne SEB produzierten nur sehr wenig IL-4. Die Zugabe von SEB induzierte eine starke
IL-4 Ausschüttung, wobei Lymphozyten, die mit IL-10 positiven Monozyten kokultiviert
wurden, produzierten mit 128,00 ± 50,91 pg/ml mehr IL-4, als die mit IL-10 negativen
Monozyten kokultivierte Lymphozyten (102,11 ± 33,34 pg/ml). Dieser Unterschied erreicht
aber ebenfalls keine statistische Signifikanz.
In der Abbildung 12 ist auch die Zytokinfreisetzung der Lymphozyten ohne Monozyten
dargestellt. Erwähnenswerte Zytokinproduktion wurde bei den ursprünglich naiven T-Zellen mit
SEB (128 ± 46,79 pg/ml IFN-γ und 62,56 ± 34,79 pg/ml IL-4) und bei den T-Effektorzellen mit
SEB (174,44 ± 76,57 pg/ml IFN-γ und 153,33 ± 92,96 pg/ml IL-4) beobachtet.
A
500
IFN-γ [pg/ml]
400
300
200
100
0
naive T-Zellen
naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10 naive T-Zellen, IL-10
positive Monos
negative Monos
positive Monos, SEB negative Monos, SEB
naive T-Zellen, SEB
T-Gedächtniszellen,
SEB
naive T-Zellen, SEB
T-Gedächtniszellen,
SEB
B
300
IL-4 [pg/ml]
250
200
150
100
50
0
naive T-Zellen
naive T-Zellen, IL-10
positive Monos
naive T-Zellen, IL-10
negative Monos
naive T-Zellen, IL-10
positive Monos, SEB
naive T-Zellen, IL-10
negative Monos, SEB
Abbildung 12: Der Einfluss der zwei Monozytenpopulationen auf die lymphozytäre Bildung von IFN-γ(A) und IL-4(B)
nach Expansion mit IL-2 und anschließend Stimulation mit PMA/Ca-Ionophore.
Dargestellt sind die Zytokinkonzentrationen im Zellüberstand (n=9)
Ergebnisse
32
3.5 Die Generierung dendritischer Zellen aus IL-10
positiven und IL-10 negativen Monozyten
In Diesem Versuch wurde untersucht, ob die sortierte Populationen der Monozyten in der Lage
sind, nach 6-tägiger Kultur mit IL-4 und GM-CSF und anschließend mit LPS für 24 h zu reifen
dendritischen Zellen zu differenzieren. Dazu wurde die Expression der Oberflächenmarker
CD1a und CD83 durchflusszytometrisch bestimmt (Abbildung 13).
Abbildung 13 zeigt das Messergebnis des einzigen Experiments, das vollständig durchgeführt
wurde. Die IL-10 negativen Monozyten differenzierten zu dendritschen Zellen, die entweder
CD1a, oder CD83, oder beides exprimierten. Bei den IL-10 positiven Monozyten war die
Menge der geernteten Zellen für eine durchflusszytometrische Analyse, die mit den
Messergebnissen der IL-10 negativen Zellen vergleichbar wäre, in der Regel nicht ausreichend.
A
B
Abbildung 13: Die Fähigkeit IL-10 positiver (A) und IL-10 negativer (B) Monozyten, zu dendritischen Zellen zu
differenzieren.
Monozyten wurden mit GM-CSF und IL-4 für 6 Tage kultiviert. Anschließend wurden sie mit LPS für 24h stimuliert. Die
Expression der Oberflächenmarker CD1a und CD83 wurde durchflusszytometrisch untersucht. Dargestellt sind Dot-Plots
eines Messergebnisses mit Prozentualangaben der Oberflächemarker exprimierenden Zellen.
33
4 DISKUSSION
Mit der Hilfe eines Zytokinsekretionsassays und eines Hochgeschwindigkeitzellsorters wurde in
unserer Arbeit zum ersten Mal versucht, verschiedene Subpopulationen der Monozyten anhand
ihrer Zytokinproduktion zu separieren. In dieser Arbeit wurden „lebende” Monozyten anhand
ihrer IL-10 Produktion separiert. Mithilfe eines IL-10 Detektionskits der Firma Miltenyi war es
möglich IL-10 produzierende Monozyten von nicht IL-10-produzierenden Monozyten mittels
fluoreszierender Farbstoffe zu trennen. Der Hauptteil dieser Arbeit bestand darin, dieses
Verfahren zu etablieren und eine Methode zu entwickeln die fluoreszenzmarkierten IL-10
produzierenden Monozyten zu sortieren. Zudem sollte gezeigt werden, inwieweit mit dieser
Methode tatsächlich IL-10 produzierende von IL-10 negativen Monozyten separiert werden
können. Hierzu wurde durch die Messung der Zytokinproduktion mittels ELISA untersucht, ob
die früher beobachtete dichotome Bildung der beiden antagonistisch wirkenden Zytokine IL-10
und IL-12 sich auch nach der Separation zeigt. In einem weiteren Schritt sollte geklärt werden,
ob sich die separierten Monozytenpopulationen neben ihrer Zytokinproduktion auch in ihren
funktionellen Eigenschaften unterscheiden. Es wurde untersucht, ob die MonozytenSubpopulationen
die
Entstehung
von
Th1-
bzw.
Th2-Lymphozyten unterschiedlich
beeinflussen. Zudem wurde getestet, inwieweit sich die IL-10 Produktion der Monozyten auf
ihre Fähigkeit auswirkt in einem geeigneten Zytokinmilieu zu dendritischen Zellen zu
differenzieren.
4.1. Diskussion der eingesetzten Methode
Die IL-10 Produktion der Monozyten wurde durch LPS-Stimulation induziert. LPS ist ein
Molekülkomplex der Zellwand gramnegativer Bakterien, der Monozyten aktivieren kann, in
dem es an deren Membranmolekül CD14 bindet. Die Bindung zum LPS-Rezeptor CD14 erfolgt
die Aktivierung der Monozyt und die Produktion einer ganzen Reihe pro- (TNF-α, IL-1, IL-6,
IL-12) und antiinflammatorischer Zytokine (IL-10, TGF-β) und Mediatoren (NO).
In Vorversuchen wurde analysiert, wie die maximale Anzahl IL-10 produzierender Zellen
erreicht wird. Die Vorergebnisse ergaben, dass nach einer 24-stündiger Kultur mit Lymphozyten
und anschließender 12-stündiger LPS-Stimulation ein sehr hoher Anteil IL-10 produzierender
Monozyten (ca. 30%) zu erzielen ist.90 Der zusätzliche Effekt der Kultur mit Lymphozyten ist
darauf zurückzuführen, dass die Monozyten mit den T-Lymphozyten einen direkten Zellkontakt
34
aufbauen. So wurde beschrieben, dass aktivierte T-Lymphozyten die monozytäre IL-10 und
TNF-α Produktion durch direkten Zellkontakt fördern,103 wobei TNF-α selbst wiederum die
IL-10 Produktion fördert. Obwohl die Lymphozyten in unserem Versuchsaufbau am Anfang
nicht aktiviert wurden, mag der T-Zellkontakt für die Induktion der monozytären IL-10
Produktion eine wichtige Rolle gespielt haben. Eine andere Erklärung für die erhöhte IL-10
Produktion der Monozyten nach 24 Kultur bietet die spontane Apoptose der Monozyten. In der
Abwesendheit von bestimmten Stimuli wird ein Teil der kultivierten Monozyten spontan
apoptotisch.43 Die Stimulation mit LPS hemmt die weitere Apoptose der Zellen.87 Apoptitische
Zellen, die während der 24-stündiger Kultivierung entstanden sind, waren in der Lage, die LPSinduzierte IL-10 Produktion der lebenden Monozyten weiter zu erhöhen.16 Dieser Effekt wird
auch durch direkten Zell-Zell Kontakt zwischen lebenden und apoptotischen Monozyten
vermittelt.
Für die niedrigere der Reinheit der beiden Monozytenpopulationen (73,37% für die IL-10
positive und 77,26% für die IL-10 negative Monozyten) im Vergleich mit der Reinheit der
CD4+ Lymphozyten (89,27%) gibt es mehrere Gründe. Zum einen ist festzustellen, dass es sich
bei der IL-10 Produktion nicht um einen klassischen Oberflächenmaker handelt, dessen
durchflusszytometrische Detektion einem ja/nein Muster gleicht. Vielmehr ergibt sich in der
FACS-Population eine IL-10 positive Zellwolke, die sich aus der Wolke der IL-10 negativen
Zellen heraus entwickelt. Bei der Sortierung der IL-10 positiven Zellen wird eine an sich
zusammenstehende Gesamtpopulation in der Mitte zerschnitten. Bei der Reanalyse verschieben
sich dann die Populationen durch die erneute Aktivierung mit dem Laserlicht. Die hier
angegebenen Werte sind Werte, die vor der Korrektur des Reanalysegates gemessen wurden.
Spätere Reanalysen kamen dann zu deutlich besseren Werten. Neben der Wahl des
Reanalysegates und der Einstellung der zu sortierenden Areale nehmen selbstverständlich auch
andere Faktoren Einfluss auf die Reinheit der zu sortierenden Zellen. Zum einen beeinflusst die
Geschwindigkeit des Sortiervorganges die Genauigkeit des Sortierens, aber auch individuelle,
probandenabhängige Faktoren spielen eine Rolle. So ist z.B. die Fluoreszenzintensität für IL-10
individuell verschieden. Die verschiedenen Populationen waren jedoch optisch gut zu trennen,
sodass die Einstellung der Sortierungsareale in der Regel eindeutig festzulegen war. Die
Ergebnisse der IL-10 Bestimmung (mittels ELISA) der sortierten IL-10 positiven und negativen
Zellen belegen, dass das Sortierungsprotokoll erfolgreich war. IL-10 positive Monozyten
produzierten auch tatsächlich signifikant mehr IL-10 als IL-10 negative Monozyten. Wir
schlussfolgern hieraus, dass die erstmals in dieser Arbeit eingesetzte und entwickelte Methode
zur Separierung IL-10 produzierender Monozyten erfolgreich ist. Trotzdem war eine eindeutige
IL-10 Produktion auch in der initial IL-10 negativen Subpopulation feststellbar. Dies mag
mehrere Gründe haben. Zum einen war, wie beschrieben, die Sortierreinheit nicht sehr hoch.
35
Zum anderen lag der Zeitpunkt des Kulturbeginnes recht spät bei ca. 18 Stunden nach der
initialen LPS-Stimulation. Trotzdem ist davon auszugehen, dass die hier gemessenen Werte das
Verhalten der sortierten Zellen auch in den anderen Versuchen widerspiegelt. Bei der erstmals
eingesetzten Methode handelt es sich eher um eine Anreicherung IL-10 produzierender Zellen,
denn um eine tatsächliche, eindeutige Isolation. Dies wird auch so vom Hersteller beschrieben.
Ursprünglich wurde das IL-10 Secretion Assay – Cell Enrichment and Detection Kit (PE) für die
Anreicherung IL-10 produzierender Lymphozyten entwickelt. Anhand der Arbeitsanweisung
sollten die IL-10 produzierende Zellen nach der Markierung mit dem IL-10 Detection Antibody
(PE) mit paramagnetischem anti-PE Antikörper weiter markiert werden. Anschließend wird eine
paramagnetische Zellseparation mit demselben Prinzip durchgeführt, wie es in dem
Methodenteil bei der Separation von naiven T-Helferzellen beschrieben wurde. Auf dieser
Weise kann man eine Maximale Reinheit von 30-40% der zytokinproduzierenden Zellen
erreichen. Um einen höheren Anteil IL-10 produzierender Zellen zu gewinnen wurden die
Zellen
statt
mit
der
paramagnetischen
Separation
mittels
durchflusszytometrischer
Zellsortierung aufgereinigt. Außerdem kann bei der hier beobachteten Zytokinproduktion die
schon früher erwähnte Apoptose der Monozyten auch eine wichtige Rolle gespielt haben. Die
Zellsortierung selbst ist ein großer mechanischer Stress für die Zellen. Dadurch ist es möglich,
dass die Sortierung Apoptose auslöst. Obwohl die Apoptose der Monozyten in dieser Arbeit
nicht untersucht wurde, halten wir es für möglich, dass die Anwesenheit apoptotischer Zellen in
beiden Populationen die IL-10 Produktion der T-Zellen induziert hat,16 möglicherweise
unabhängig davon, ob die Monozyten nach der initialen LPS-Stimulation IL-10 produziert
haben oder nicht.
Die Technik der Sortierung von Leukozyten anhand ihrer Zytokinproduktion wurde
ursprünglich entwickelt, um die verschiedene Subpopulationen von T-Zellen zu charakterisieren
und zu trennen.5 Dabei werden die Zellen, die das entsprechende Zytokin produzieren, mit der
Hilfe einer Zelloberflächen-Affinitätsmatrix detektiert. Dieser Matrix besteht aus anti-ZytokinAntikörpermolekülen, die an der Zelloberfläche gebunden sind. Fängt die Zelle an, Zytokine zu
produzieren, werden diese gleich an die Zelloberfläche gebunden. Die gebundene
Zytokinmoleküle können dann mit einem konventionellen Fluoreszenzmarkierten anti-ZytokinAntikörper detektiert werden. Die auf dieser Weise markierte Zellen können danach
durchflusszytometrisch analysiert oder sortiert werden.
Durch die Technik der Zellsortierung wurde uns ermöglicht, die CD4+ T-Helferzellen parallel
mit den Monozyten zu isolieren. Die Sortierung ergab eine gemischte Population von naiven
TH-Zellen und Effektorzellen. Da wir die Differenzierung von TH1- bzw. TH2-Zellen aus naiven
T-Zellen unter verschiedenen Bedingungen untersuchten, mussten die naive T-Zellen zuerst
angereichert
werden.
Dies
wurde
mit
der
Hilfe
einer
immunomagnetischen
36
Zellseparationstechnik durchgeführt und ergab eine Reinheit von 92,42 % für die naiven
T-Helferzellen. Diese Methode für die Anreicherung naiver T-Helferzellen wird weltweit
verwendet und unsere Reinheitsergebnisse stimmen gut mit dem von anderen Arbeitsgruppen
angegebenen Werte (90-99%) überein.81,33,13
4.1 Die Stabilität der IL-10 und IL-12 Produktion der
sortierten Monozytensubpopulationen
Durch die Messung der Zytokinproduktion mittels ELISA wurde untersucht, ob die früher
beobachtete Dichotomie der beiden antagonistisch wirkenden Zytokine IL-10 und IL-12 sich
auch nach der Separation zeigt bzw. inwieweit die Separation in Bezug auf die IL-10 Produktion
erfolgreich war.
Die Monozyten der IL-10 positiven Population zeigten eine vermehrte IL-10 Produktion im
Vergleich mit den Zellen der Negativpopulation, dies wurde bereits ausführlich diskutiert.
Vorergebnisse unserer Arbeitsgruppe hatten eine dichotome Verteilung von IL-10 und IL-12p40
Produktion bei Monozyten ergeben. Die zwei Populationen zeigten nur minimale Unterschiede
bezüglich ihrer IL-12p40 Produktion. Diese Beobachtung widerspricht scheinbar unseren
vorherigen Ergebnissen einer dichotomischen Produktion von IL-10 und IL-12. Allerdings
wurden die separierten Zellen erst ca. 18 h nach LPS-Stimulation in die Kulturschale gegeben
und dann für weitere 48 Stunden dort belassen und sodass der späte Kulturbeginn deutlich nach
dem Gipfel der IL-12p40 Produktion nach LPS-Stimulation liegt. Diese setzt bereits nach 6
Stunden ein und erreicht ihren Gipfel bei ungefähr 8 Stunden.59 Es ist somit davon auszugehen,
dass aufgrund der Bedingungen die sich durch den Versuchaufbau ergeben bezüglich eines
Unterschiedes in der IL-12p40 Produktion zwischen IL-10 produzierenden und nicht
produzierenden Monozyten keine Stellung bezogen werden kann.
4.2 Die TH1/TH2-Polarisiernede Fähigkeit der sortierten
Monozytensubpopulationen
Bei
den
hier
vorgestellten
Versuchen
wurde
der
Effekt
der
sortierten
Monozytensubpopulationen auf das TH1/TH2 System untersucht. Mit Hilfe unserer Experimente
konnte festgestellt werden, dass die Aktivierung von CD4+ Effektor T-Lymphozyten (TH1 bzw.
TH2-Zellen) durch die Monozyten reguliert wird. In weiteren Versuchen zeigte sich, dass die
37
untersuchten Subpopulationen der Monozyten die Differenzierung von T-Effektorzellen aus
naiven TH-Lymphozyten tatsächlich unterschiedlich beeinflussen.
4.2.1 Der Effekt der IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten auf die
Aktivierung von T-Effektorzellen
Während einer primären Immunantwort kommt es zu der Entstehung von T-Effektorzellen, die
aufgrund ihrer Zytokinproduktion in TH1- bzw. TH2-Zellen aufgeteilt werden können.
T-Effektorzellen sind Lymphozyten, die in ihrer Vergangenheit Antigenkontakt hatten. Wenn es
mit diesem Antigen zu einem erneuten Kontakt kommt, wird eine schnelle, antigenspezifische
sekundäre Immunantwort durch die Ausschüttung verschiedener Zytokine induziert. Die
Aktivierung dieser Zellen erfolgt durch die Interaktion zwischen dem MHCII-Molekül mit dem
Antigen auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zelle und dem TCR-Molekül der
T-Zelle. Im Gegensatz zu naiven T-Zellen wird während ihrer Aktivierung keine Kostimulation
benötigt (nur wenn das Antigen in einer niedrigen Konzentration in Verfügung steht). Obwohl
die Zytokinsekretion der T-Effektorzellen ziemlich stabil ist und die ursprünglich entstandenen
TH1/TH2 Muster wenig variiert werden, kann die Zytokinfreisetzung von verschiedenen,
während der Aktivierung anwesenden Faktoren moduliert werden. Diese Faktoren umfassen den
Typ der antigenpräsentierenden Zelle, die von den APCs produzierten Zytokine und (wenn das
durch den TCR ausgelöste Aktivierungssignal wegen einer niedrigen Antigenkonzentration
nicht ausreichend ist) kostimulatorische Signale.
Der Einfluss von IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten auf die Reaktivierung von
T-Effektorzellen wurde mit der Hilfe von anti-CD3 monoklonalen Antikörper untersucht.
Dieses Molekül bindet an den TCR-CD3 Komplex, simuliert auf dieser Weise eine MHCIITCR-Interaktion und löst ein maximales TCR-Signal aus, das zur Aktivierung und der
Zytokinsynthese der T-Zelle führt. Immobilisierte anti-CD3 Antikörper sind optimale Auslöser
der Zytokinproduktion sowohl in TH1- als auch in TH2-Effektorzellen. Das Molekül hat eine
große Affinität zum TCR und es kann in einer viel größeren Dichte gegeben werden, als man
von einem TCR/MHCII Komplexen erwarten würde. Es kann mit dem Fc-Ende des Moleküls in
einer an Kulturplatten gebundenen Form gegeben werden, sodass eine effektive TCR-Bindung
möglich ist.
In diesem Versuch wurden T-Effektorzellen mit den untersuchten Monozytensubpopulationen
in der Anwesendheit vom immobilisierten anti-CD3 Antikörper für 48 h kultiviert und die
Produktion von typischen TH1- bzw. TH2-Zytokine wurden mittels ELISA untersucht.
38
Durch diese Stimulation kam es zu einer Induktion der IL-4 und IFN-γ Produktion der
T-Lymphozyten im Vergleich mit den unstimulierten Zellen, die keine Zytokinproduktion
zeigten. Nach der Zugabe von Monozyten wurde nur die IL-4 Produktion der Lymphozyten
verändert: beide Monozytenpopulationen haben die IL-4 Produktion der T-Effektorzellen
signifikant unterdrückt. Diese Beobachtung könnte vielleicht durch die erhebliche IL-10
Produktion beider Monozytenpopulationen erklärt werden. Dagegen wurde die Produktion
von IFN-γ von beiden Monozytensubpopulationen nicht beeinflusst. Da IL-10 die
Zytokinproduktion sowohl von Th1 als auch Th2 Zellen unterdrückt,38 spricht die
unveränderte IFN-γ Produktion für einen IL-10 unabhängigen Mechanismus. Außerdem
zeigten sich auch nur minimale Unterschiede bezüglich der Zytokinproduktion von
Lymphozyten, die entweder mit IL-10 positiven oder IL-10 negativen Monozyten
kokultiviert wurden. Aufgrund dieser Ergebnisse ist davon auszugehen, dass der gewählte
Versuchsaufbau nicht optimal gewählt war, um Unterschiede in den antigenpräsentierenden
Eigenschaften der unterschiedlichen Monozytenpopulationen zu testen. Der anti-CD3
Stimulus erwies sich alleine als zu stark, als dass noch eine unterschiedliche Beeinflussung
durch die verschiedene Monozytenpopulationen erkennbar geworden wären. IL-10 kann
eine selektive Hemmung des CD28-Signaltransduktionsweges bewirken und ist ein
bedeutender Faktor der Toleranzinduktion von T-Lymphozyten.68 Dieser Mechanismus
funktioniert nur wenn die T-Lymphozyten durch eine kleine Anzahl von TCR Molekülen
aktiviert werden und deshalb vom CD28-Kostimulationsweg abhängig sind. T-Zellen, die
allein von ihren TCR Molekülen einen starken Signal bekommen und auf dieser Weise
keine CD28-Kostimulation benötigen, werden von IL-10 nicht unterdrückt.2 In unserem
Modell wurden die T-Effektorzellen mittels eines starken TCR-Signals ohne Kostimulation
aktiviert und das kann dafür eine Erklärung sein, warum die monozytäre IL-10 Produktion
die IFN-γ Produktion der aktivierten T-Effektorzellen nur minimal unterdrückte. Im
Fortgang der Untersuchung verzichteten wir dann (erfolgreich) ganz auf die Zugabe eines
weiteren T-Zellstimulus.
4.2.2 Der Effekt der IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten auf die
Aktivierung von naiven T-Lymphozyten und ihrer Differenzierung
zu T-Effektorzellen
Nach dem initialen Kontakt mit Antigen kommt es zu der Aktivierung der antigenspezifischen
naiven T-Lymphozyten, die durch die Produktion von IL-2 proliferieren und zu TH1 oder TH2
Lymphozyten differenzieren. TH1-Zellen fördern zellvermittelte Immunreaktionen: von der
39
Ausschüttung von TH1-Zytokine werden zytotoxische Funktionen und DTH-Reaktionen
aktiviert. TH2-Zytokine begünstigen die Produktion von Antikörper, besonders die IgE-Synthese
und
fördern
die
Proliferation
und
Funktion
von
eosinophilen
Granulozyten113,24;
dementsprechend spielen TH2-Zytokine in Allergien eine wichtige Rolle. Antikörper sind
effektiv gegen lösliche Toxine und einige Bakterien; zytotoxische T-Lymphozyten töten
virusinfizierte Zellen.
Das Muster einer primären Immunantwort, d. h. die Entstehung von entweder TH1 oder TH2
Lymphozyten ist im Allgemeinen vorherzusehen und häufig entsprechend, aber ein falsches
Muster kann schwere Konsequenzen haben. Die Bedingungen der Entscheidung neben einer
Immunantwort von Typ I oder Typ II umfassen den Typ der antigenpräsentierenden Zelle, die
Natur132,64 und Menge102 des Antigens, die kostimulatorischen Signale, die neben der
MHC-II/TCR Interaktion anwesend sind,127 und verschiedene Zytokine, die von der APC und
von anderen Zellen, die sich in der Umgebung befinden, produziert werden.117
Bei den hier vorgestellten Experimenten wurde der Einfluss von IL-10 positiven und IL-10
negativen Monozyten auf die Differenzierung von TH1 bzw. TH2 Lymphozyten aus naiven
T-Zellen untersucht. Für die Aktivierung der naiven T-Zellen wurde ein bakterieller
Superantigen (Staphylococcus Enterotoxin B) verwendet.
Superantigene sind bakterielle oder virale Proteine, die eine große Anzahl von CD4+ T-Zellen
aktivieren können. Die unmäßige poliklonale Aktivierung führt zu einer massiven
Zytokinauschüttung, die für den toxischen Effekt der Superantigene teilweise verantwortlich ist.
Sie wurden mit unterschiedlichen akuten und kronischen Erkrankungen wie z. B.
Nahrungsmittelvergiftung, Toxisches Shock-Syndrom,8 Allergien62 und Kawasaki-Syndrom1 in
Zusammenhang gebracht. Weiterhin hervorrufen sie eine Dysregulation von Immunreaktionen,
die zu Autoimmunerkrankungen oder zu Immundefizienz führt. Sie funktionieren als
virulenzfaktoren durch die Verwicklung der normalen Immunantwort und verzögern die
Entstehung der pathogenspezifischen Immunität128
Superantigene zeigen mehrere Unterschiede im Vergleich mit konventionellen Antigene.
Normale Antigene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen oder endogen
produziert und nach der Aufarbeitung in dem antigenbindenden Graben des MHC-I oder
MHC-II Moleküls zu antigenspezifischen T-Zellen präsentiert. Dagegen funktionieren
Superantigene als intakte Moleküle und verbinden sich direkt mit dem MHC-II-Molekül
außerhalb
des
antigenbindenden
Grabes,
ohne
vorherige
Prozessierung.92,39
Der
Superantigen/MHC-II Komplex verbindet sich direkt mit der variablen Region der β-Kette (Vβ)
des TCR-Moleküls, auf dieser Weise die T-Zelle aktivierend.70 Staphylococcus Enterotoxin B
aktiviert nur T-Zellen, die als Bestandteil ihres T-Zell Rezeptor die Vβ8-Kette exprimieren.138
40
Da der Anteil der Vβ8+ Zellen nur insgesamt ca. 5% der gesamten CD4+ T-Helferzellen
beträgt,31 wirkt SEB als ein oligoklonaler Aktivator der T-Zellen.
Unter allen oligoklonalen Stimulatoren von T-Zellen steht die Aktivation mit Superantigene am
nahesten der physiologischen Aktivation durch die Erkennung spezifischer Antigene.47
Deswegen erwies sich die in vitro Aktivation von naiven T-Zellen oder T-Effektorzellen mit
Superantigene in der Anwesendheit verschiedener antigenpräsentierenden Zellen als eine
optimale Methode zur Untersuchung des TH1/TH2 Systems.52,12 In diesem Modell spielen
Kostimulatormoleküle
auch eine wichtige Rolle
neben
der
Zytokinproduktion der
antigenpräsentierenden Zelle in der Beeinflussung des TH1/TH2 Gleichgewichts.
In unserem Versuchsaufbau wurden naive T-Lymphozyten mit IL-10 positiven bzw. negativen
Monozyten in der Anwesendheit von Staphylococcus Enterotoxin B kultiviert. Nach 5 Tagen
wurde Die Produktion
von den TH1/TH2
Leitzytokine
IFN-γ und
IL-4
in den
Zellkulturüberständen mittels ELISA gemessen. Die aktivierte T-Zellen wurden mit exogenem
IL-2 vermehrt und nach weiteren 5 Tagen mit PMA/Ca-Ionophor stimuliert. Die intrazelluläre
Anreicherung von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 wurde durchflusszytometrisch untersucht, die
Ausschüttung von IFN-γ und IL-4 in die Zellüberstände wurde mittels ELISA gemessen.
4.2.2.1 Die Produktion von IFN-γ und IL-4 nach 5-tägiger Kokultur der
T-Lymphozyten mit IL-10 positiven und IL-10 negativen Monozyten in der
Anwesendheit von SEB
Nach 5 Tage wurde eine massive IFN-γ Produktion der ursprünglich naiven Lymphozyten
detektiert, aber nur wenn sie mit Monozyten in der Anwesendheit von SEB kokultiviert wurden.
Lymphozyten allein oder mit Monozyten, ohne SEB produzierten kein IFN-γ. Die Stimulation
der naiven T-Zellen mit SEB führte auch zu keiner messbaren IFN-γ Produktion, dagegen
wurde bei den stimulierten T-Effektorzellen eine mäßige IFN-γ Produktion detektiert. Von
diesen Beobachtungen können schon folgende Schlussfolgerungen gezogen werden:
1. Für die Aktivierung der naiven T-Helferzellen müssen neben dem oligoklonalen T-ZellAktivator SEB auch Monozyten als antigenpräsentierende Zellen anwesend sein. Dies
entspricht dem Mechanismus wie die Aktivierung von T-Lymphozyten durch Superantigene
funktioniert: das MHC-II Molekül auf der antigenpräsentierende Zelle und der T-Zell
Rezeptor in dem Zellmembran der T-Lymphozyt werden miteinander verbindet. Diese
Vernetzung führt zur Aktivierung der naiven T-Zelle, wie es von der massiven IFN-γ
Ausschüttung widergespiegelt ist. Naive T-Zellen, ohne Monozyten wurden durch SEB
nicht aktiviert. Dies bedeutet erstmal, dass die Anwesendheit der professionellen
antigenpräsentierenden Zelle mit dem MHC-II Molekül für die T-Zell-Aktivierung nötig ist.
41
2. Weil SEB ein hochpotenter Aktivator der T-Lymphozyten ist, ist es für die Aktivierung der
naiven T-Zellen ausreichend, wenn die APCs nur in sehr geringer Anzahl zur Verfügung
stehen. Deshalb bietet diese Beobachtung eine Überprüfung über die Reinheit der naiven
T-Zell Population: es waren keine MHC-II tragende Monozyten oder T-Helferzellen dabei.
3. Weil die T-Zellen in der Kokultur mit Monozyten nicht aktiviert wurden, können wir davon
ausgehen, dass für die Aktivierung der naiven T-Zellen tatsächlich der Superantigen
verantwortlich ist.
4. Die Aktivierung der T-Effektorzellen lässt sich dadurch erklären, das sie durch die
Expression von MHC-II Molekülen in der Lage sind, das Superantigen einander zu
präsentieren.145
Die Produktion von IL-4 war bei allen Kokulturansätzen nur minimal. Im Vergleich mit den
Kokulturansätzen mit Monozyten produzierten die allein mit SEB stimulierte naive T-Zellen
und T-Gedächtniszellen eine leicht erhöhte Menge an IL-4. Die mäßige IL-4 Produktion und
starke IFN-γ Ausschüttung der naiven T-Helferzellen entspricht einem TH1-Zytokinmuster. Das
stimmt gut mit den Ergebnissen von Sasama et al. überein,114 die gezeigt haben, dass die
Mehrheit der naiven T-Lymphozyten eine starke TH1-Deviation zeigen.
Außerdem wurde nur eine minimale Unterschied zwischen den IL-10 positiven und IL-10
negativen Monozyten bezüglich der Zytokinproduktion der mit ihnen kokultivierten und
aktivierten naiven T-Lymphozyten: bei den IL-10 positiven Monozyten produzierten die
T-Zellen etwas weniger IFN-γ und etwas mehr IL-4. Das heißt, die mit den IL-10 positiven
Monozyten kokultivierten Lymphozyten zeigten eine leichte Tendenz zu TH2-Lymphozyten zu
differenzieren. Das entspricht dem bekannten Effekt des IL-10 Moleküls auf das TH1/TH2Gleichgewicht: die TH2 Antwort wird gefördert, während die TH1 Reaktion gehemmt wird.94
4.2.2.2 Die Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 nach 5-tägiger Expansion mit
IL-2 und Restimulation mit PMA/Ca-Ionophore
Nach 5-tägiger Kokultur der Lymphozyten mit IL-10 positiven und IL-10 negativen Monozyten
und Aktivierung mit SEB wurden sie für weitere 5 Tage mit exogenem IL-2 expandiert und mit
PMA/Ca-Ionophor
restimuliert.
PMA
(phorbol
12-mysirate
13-acetate)
aktiviert
T-Lymphozyten in vitro und in vivo durch die Aktivierung der Proteinkinase C. Ca-Ionophor ist
ein Substanz, die die Durchlässigkeit der Zellmembran für Ca++ erhöht. Die Kombination dieser
beiden Stimulantien wird weltweit für die Aktivierung von T-Zellen benutzt.
Die Produktion von IFN-γ und IL-4 wurde in den Zellkulturüberständen mittels ELISA
gemessen, die Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-2 und IL-13 wurde auf Einzelzellebene
42
durchflusszytometrisch detektiert. Die Produktion von IFN-γ (ELISA-Werte) nach der
Restimulation zeigte dasselbe Muster wie nach der initialen Stimulation: T-Lymphozyten allein
oder mit SEB aber ohne Monozyten produzierten nur eine minimale Menge an IFN-γ. Die
höchsten Werte wurden bei den Lymphozyten, die zusammen mit IL-10 positiven bzw. IL-10
negativen Monozyten in der Anwesendheit von SEB kultiviert wurden, detektiert. Der bereits
beschriebene Unterschied (mehr IFN-γ bei den mit IL-10 negativen Monozyten kokultivierten
T-Zellen) war auch hier feststellbar. Naive T-Zellen produzierten eine vergleichbare Menge an
IFN-γ wie mit SEB stimulierten CD45RO+ T-Effektorzellen.
Die IL-4 Produktion zeigte ein ähnliches Muster: es wurde von den unstimulierten T-Zellen (mit
oder ohne Monozyten) kaum exprimiert. Bei den zwei Ansätzen mit Monozyten und SEB wurde
eine starke IL-4 Ausschüttung festzustellen, wobei T-Zellen, die mit IL-10 positiven Monozyten
aktiviert wurden, produzierten etwas mehr IL-4. Die T-Gedächtniszellen produzierten auch eine
große Menge an IL-4; außerdem war eine mäßige IL-4 Produktion bei den ursprünglich naiven,
stimulierten T-Lymphozyten zu beobachten.
Das Zytokinproduktionsmuster der naiven T-Lymphozyten nach erfolgter Expansion und
Restimulation mit Ca-Ionophore und PMA zeigte in gleiche Richtung, wie die Daten nach 5tägiger Kokultur ohne Restimulation: T-Zellen, die initial mit IL-10 positiven Monozyten
kokultiviert und anschließend restimuliert wurden, produzierten mehr IL-4 und weniger IFN-γ.
Nach diesen Beobachtungen über die ELISA-Daten der IL-4 und IFN-γ Produktion könnte man
neben einem TH2-induzierenden und TH1-hemmenden Effekt der IL-10 produzierenden
Monozyten argumentieren, aber neben den minimalen, statistisch nicht signifikanten
Unterschieden muss noch ein Faktor berücksichtigt werden:
Durch die polyklonale Aktivierung durch SEB und die Wirkung des exogenen IL-2 entstand
eine massive Proliferation und Vermehrung der Lymphozyten, genauso wie das in vivo während
der Entstehung einer antigenspezifischen Immunität passiert. Am schnellsten vermehrten sich
die in der Anwesendheit von IL-10 positiven oder negativen Monozyten mit SEB aktivierten
Lymphozyten, aber die Proliferationsgeschwindigkeit war wegen des Effekts von IL-10 auch
zwischen diesen zwei Ansätzen unterschiedlich. Wegen der unterschiedlichen Zellmengen in
den untersuchten Ansätzen ist in diesem System die Möglichkeit einer Aussage über die
Modulation der TH1/TH2 Immunantwort limitiert.
Deshalb wurde hier die Methode der intrazellulären durchflusszytometrischen Zytokinmessung
verwendet, die es ermöglicht, die Produktion von TH1 (IL-2, IFN-γ) und TH2 Zytokine (IL-4 und
IL-13) auf Einzelzellebene zu untersuchen. Die intrazelluläre Zytokinmessung war nur bei den
Ansätzen möglich, bei denen Lymphozyten zusammen mit Monozyten in Anwesenheit von SEB
kultiviert worden waren. Bei den anderen Ansätzen wurden nur sehr wenige Zellen detektiert
und die Messung der Zytokinproduktion konnte nicht beurteilt werden.
43
Bei fast allen Messungen, bei denen die Zellen gleichzeitig gegen IFN-γ und IL-4 markiert
wurden, war eine dichotome Produktion der TH1/TH2 Leitzytokine feststellbar (Abbildung 10).
Das entspricht dem ursprünglichen TH1/TH2-Modell, nach dem diese zwei Zytokine von zwei
verschiedenen Subpopulationen der T-Helferzellen produziert werden.
Insgesamt war eine große Anzahl der Lymphozyten IFN-γ positiv. Da die Fluoreszenz der
IFN-γ positiven Zellen eine große Streuung gezeigt hat, und die exakte Abgrenzung der IFN-γ
positiven Zellen von der Negativpopulation kaum möglich war, sind bei dieser Messung die
RSMF-Werte mehr informativ als die Prozentualangaben. Die zelluläre Anreicherung von IFN-γ
zeigte einen mäßigen Unterschied zwischen den beiden Ansätzen, die Anzahl IFN-γ
produzierender Zellen bzw. die RSMF-Werte für IFN-γ war bei den mit IL-10 positiven
Monozyten kokultivierten Lymphozyten vermindert. Der Unterschied der RSMF-Werte war
etwas deutlicher als bei den Prozentualwerten.
Die Messung der IL-4 Produktion ergab insgesamt nur eine kleineren Anteil IL-4
produzierender
Zellen. Die
IL-4
produzierende Zellpopulation war
aber
von der
Negativpopulation gut unterscheidbar und die gesamte Fluoreszenz der IL-4 positiven Zellen
war homogener, als bei IFN-γ. Deshalb sind hier die Prozentualangaben besser zu interpretieren.
Die Anzahl IL-4 positiver Lymphozyten war nach Kokultivierung mit IL-10 positiven
Monozyten im Vergleich mit den mit IL-10 negativen Monozyten kokultivierten T-Zellen leicht
erhöht. Die Unterschiede der RSMF-Daten zeigte gleiche Richtung, war aber nur minimal.
Insgesamt zeigten ca. die Hälfte der Zellen IL-2 Produktion mit einer leichten Unterschied
zwischen den zwei Populationen: sowohl die Prozentzahl als auch die RSMF-Werte waren bei
den IL-10 positiven Zellen leicht erhöht. Da IL-2 ein wichtiges parakrines und autokrines
Wachstumsfaktor der aktivierten und proliferierenden Lymphozyten ist, war die massive IL-2
Ausschüttung in diesem Modell nicht überraschend.
Sowohl bei den ELISA-Daten, als auch bei den Ergebnissen der intrazellulärer Zytokinmessung
waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Zytokinsekretionsmuster zwischen den
mit IL-10 negativen oder mit IL-10 positiven Monozyten kokultivierten naiven T-Lymphozyten.
Die Experimente zur Beurteilung des Effekts von IL-10 positiven bzw. IL-10 negativen
Monozyten auf die Aktivierung von T-Effektorzellen ergaben auch keinen signifikanten
Nachweiß der Regulation. Bei unseren Experimenten besteht ein grundsätzliches Problem
dadurch, dass die Monozyten generell schlecht in der Lage sind, naive T-Zellen effektiv zu
aktivieren. In vivo erfolgt die Aktivierung der T-Zellen durch die dendritischen Zellen, die heute
als die potentesten Aktivatoren der T-Zellen gelten. Der Ort der T-Zell-Aktivierung ist der
Lymphknoten, in dem sich normalerweise keine Monozyten befinden. Deshalb ist über die
Beeinflussung des TH1/TH2-Gleichgewichtes anhand dieser Experimenten keine sichere
Aussage möglich.
44
Tendenziell wurde die Aktivierung des TH2-Immunantworts durch IL-10 positiven Monozyten
begünstigt, während die TH1-Immunantwort gehemmt wurde. Dies würde dem bekannten TH1hemmenden und TH2-fördernden Effekt von IL-10 entsprechen. So wurde es in einem
Mausmodell der atopischen Dermatitis gezeigt, dass IL-10 für die allergische Entzündung der
Haut unentbehrlich ist.82 IL-10 defizienten Mäuse zeigten eine verminderte eosinophile
Infiltration und eine verringerte Produktion der TH2-Zytokine IL-4 und IL-5. Die Rolle von
IL-10 als TH2-förderndes Zytokin während der allergischen Atemwegsentzündung ist nicht
vollständig geklärt. Einige Studien berichteten über eine verminderte eosinophile Infiltration
und Mukusproduktion in den Lungen von IL-10 defizienten Mäuse,141,86 zusammen mit
verminderter IL-5 und erhöhter IFN-γ Produktion. Eine andere Arbeit zeigte aber eine
vermehrte Atemwegsentzündung mit verminderter IL-5 aber mit normaler IL-4, IL-13 und
IFN-γ Produktion in der bronchoalveolären Lavage von IL-10-Knockout-Mäusen. 129
4.3 Die Fähigkeit der Monozyten zu Dendritischen Zellen
zu differenzieren
Dendritische Zellen, die als hochpotente antigenpräsentierende Zellen des Immunsystems
gelten, lassen sich aus Monozyten differenzieren. Da IL-10 auf die Differenzierung von
dendritischen Zellen hemmend wirkt, ergab sich die Vermutung, dass die anhand ihrer IL-10
Produktion separierte Populationen der Monozyten auch unterschiedliche Fähigkeiten zeigen, in
dem geeigneten Zytokinmilieu zu dendritischen Zellen zu differenzieren. In diesem
Versuchsaufbau wurden IL-10 positive und IL-10 negative Monozyten mit der Hilfe von IL-4
und
GM-CSF
behandelt
und
am Ende
der
Kultur
mit LPS
stimuliert.
Dieses
Behandlungsprotokoll der Monozyten führt zu der Ausdifferenzierung von CD1a und CD83
positiven, reifen dendritischen Zellen. In dieser Arbeit wurde in diesem Versuchsaufbau mit den
sortierten Monozyten nur ein einziges Experiment durchgeführt. Dies ergab, dass IL-10
produzierende Monozyten nicht in der Lage sind, zu dendritischen Zellen zu differenzieren. Die
IL-10 negativen Monozyten differenzierten zu CD1a+CD83+ reifen dendritischen Zellen. Nach
Kultur der ursprünglichen IL-10 positiven Monozyten mit IL-4 und GM-CSF wurden insgesamt
nur sehr wenige Zellen detektiert, die kaum spezifische Marker für dendritische Zellen
exprimierten.
Diese Beobachtung kann mit dem hemmenden Effekt des IL-10 Moleküls auf die
Differenzierung von dendritischen Zelle erklärt werden. Es wurde erst vom Allavena et al
beschrieben,3 dass Monozyten in der Anwesendheit von IL-10 nicht zu dendritischen Zellen,
sondern zu Makrophagen differenzieren.
45
5 ZUSAMMENFASSUNG
Seit der Entdeckung des TH1/TH2 Systems wurden zahlreiche immunpatologische Mechanismen
mit der selektiven Aktivierung von TH1 oder TH2 Lymphozyten und dadurch mit der Entstehung
einer Typ-I oder Typ-II Immunantwort erklärt. Die Entscheidung neben einer TH1 oder TH2
Immunreaktion kommt während der Präsentation des Antigens mittels professioneller
antigenpräsentierenden Zellen zustande und wird von der antigenpräsentierenden Zelle
bestimmt. In dieser Arbeit wurde es versucht, Monozyten, den Vorläuferzellen der potentsten
antigenpräsentierender Zellen, der dendritischen Zellen, anhand ihres Zytokinsekretionsmusters
in Analogie mit dem TH1/TH2 Systems zu charakterisieren. IL-10 und IL-12 sind zwei wichtige
Zytokine, die neben Lymphozyten auch von antigenpräsentierenden Zellen produziert werden
und in der Regulation der Immunantwort eine zentrale Rolle spielen. In unseren Vorarbeiten
wurde die dichotome Bildung des IL-10 und IL-12 von Monozyten beobachtet. Mit Hilfe eines
hochmodernes Verfahrens, das die Kombination eines Zytokin-Sekretionsassays und der
durchflusszytometrischen Zellsortierung kombiniert, wurde in dieser Arbeit versucht, die IL-10
produzierende Population der Monozyten aufzureinigen und im Vergleich mit der
Restpopulation weiter zu charakterisieren. Die Erfolg der Aufreinigung wurde von der Analyse
des Zytokinprofils der sortierten Monozyten bestätigt: die IL-10 positiven Monozyten erhielten
ihre Fähigkeit, im Vergleich mit der Restpopulation eine große Menge an IL-10 zu produzieren.
Dagegen wurde eine verminderte IL-12 Produktion nicht bestätigt. Des Weiteren wurden
diverse in vitro Assays verwendet, um die Modulation des TH1/TH2 Gleichgewichts durch IL-10
positiven und IL-10 negativen Monozyten zu untersuchen. Zum einen wurde die Regulation der
T-Effektor Lymphozytenaktivierung untersucht, wobei ein minimaler TH2-polarisierender
Effekt der IL-10 positiven Monozyten zu vermuten war. Danach wurde untersucht, wie die
Aktivierung von naiven T-Lymphozyten und ihre Differenzierung zu TH1 bzw. TH2 Effektor
Lymphozyten von IL-10 positiven bzw. negativen Monozyten reguliert wird. In diesem
Experiment wurde es festgestellt, dass die IL-10 positive Monozyten möglicherweise die
Entwicklung von TH2-Lymphozyten begünstigt. Wegen des Mangels an signifikanten
Unterschieden zwischen den beiden Monozytensubpopulationen können aber keine belastbaren
Schlussfolgerungen bezüglich ihres Einflusses auf die TH1/TH2 Immunantwort gezogen werden.
In weiteren Experimenten wurde das Potential der sortierten Monozyten untersucht, zu
dendritischen Zellen zu differenzieren, wobei die IL-10 positiven Monozyten eine verminderte
Kapazität zur Reifung zeigten. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten lassen den Schluss auf
die Existenz von zwei, anhand ihrer Zytokinsekretionsmuster funktionell unterschiedlichen
Subpopulationen der Monozyten zu.
46
Literatur
6 LITERATURVERZEICHNIS
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7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNG 1: MÖGLICHKEITEN DER WEITEREN DIFFERENZIERUNG AUS MONOZYTEN. ................................... 7
ABBILDUNG 2: DAS IL-10 SECRETION ASSAY/DETECTION KIT ...................................................................... 17
ABBILDUNG 3: DAS PRINZIP DER ZELLSORTIERUNG. ..................................................................................... 18
ABBILDUNG 4: DIE IDENTIFIZIERUNG VON DEN GEWÜNSCHTEN ZELLPOPULATIONEN. .................................... 19
ABBILDUNG 5: DIE SEPARATION VON NAIVEN CD4+ LYMPHOZYTEN VON GEDÄCHTNISZELLEN..................... 21
ABBILDUNG 6: DIE REANALYSE DER SORTZELLEN FÜR DIE BESTIMMUNG DER REINHEIT................................ 25
ABBILDUNG 7: DIE STABILITÄT DER IL-10, IL-12P40 UND IL-12P70 PRODUKTION DER SORTIERTEN
MONOZYTEN...................................................................................................................................... 26
ABBILDUNG 8: DER EINFLUSS DER ZWEI MONOZYTENSUBPOPULATIONEN AUF DIE AKTIVIERUNG VON TEFFEKTORZELLEN. ............................................................................................................................. 27
ABBILDUNG 9: DER EINFLUSS DER ZWEI MONOZYTENSUBPOPULATIONEN AUF DIE DIFFERENZIERUNG VON
NAIVEN T-HELFERZELLEN. ................................................................................................................. 28
ABBILDUNG 10: DER EINFLUSS DER ZWEI MONOZYTENPOPULATIONEN AUF DIE DIFFERENZIERUNG DER NAIVEN
T-HELFERZELLEN............................................................................................................................... 29
ABBILDUNG 11: DER EINFLUSS DER ZWEI MONOZYTENPOPULATIONEN AUF DIE LYMPHOZYTÄRE BILDUNG VON
IFN-Γ, IL-4, IL-2 UND IL-13. ............................................................................................................ 30
ABBILDUNG 12: DER EINFLUSS DER ZWEI MONOZYTENPOPULATIONEN AUF DIE LYMPHOZYTÄRE BILDUNG VON
IFN-Γ(A) UND IL-4(B) NACH EXPANSION MIT IL-2 UND ANSCHLIEßEND STIMULATION MIT PMA/CAIONOPHORE. ....................................................................................................................................... 31
ABBILDUNG 13: DIE FÄHIGKEIT IL-10 POSITIVER (A) UND IL-10 NEGATIVER (B) MONOZYTEN, ZU
DENDRITISCHEN ZELLEN ZU DIFFERENZIEREN. ..................................................................................... 32
8 LEBENSLAUF
Tibor Veres
geboren am 11. Juni 1978 in Budapest, Ungarn
Eltern
Gyula Veres
Gizella Veresné geb. Kovács
Schulbildung
1984-1992
Gárdonyi Géza Altalános Iskola, Budapest
1992-1996
Városmajori Gimnázium, Budapest
Studium
1996-2003
Semmelweis Universität Budapest,
Allgemeinmedizinische Fakultät
von 10/2001 bis 08 2002
Experimentelle Doktorarbeit zur Charakterisierung IL-10 und
IL-12 produzierender Monozyten, Abteilung Pneumologie,
Universitätsklinikum Freiburg
seit 10/2003
Studium an der Medizinischen Hochschule Hannover im
internationalen MD/PhD Program „Molecular Medicine“,
Ausführung des Vorschungsprojekt in der Fraunhofer Institut für
Toxikologie und Experimentelle Medizin
Praktische Tätigkeiten
07-08/1998
Innere Medizin, James Paget Hospital NHS Trust, Gorleston,
Great Yarmouth, Großbritanien
07-08/2000
Chirurgie, James Paget Hospital NHS Trust, Gorleston, Great
Yarmouth, Großbritanien
08/2002
Innere Medizin, Universitätsklinikum Freiburg
10-11/2002
Chirurgie, Morriston Hospital, Morriston, Swansea,
Großbritannien
02/2003
Geburtshilfe und Frauenheilkunde, Charité Universitätsklinikum
Berlin
03-04/2003
Pädiatrie, Charité Universitätsklinikum Berlin
(SOCRATES – ERASMUS Program)
9 DANKSAGUNG
Herrn PD Dr. Gernot Zissel danke ich für die Überlassung des aktuellen Themas
Herrn Prof. Dr. Nikolaus Freudenberg danke ich für seine Bereitschaft, diese Arbeit als
Zweitgutachter zu bewerten
Frau Dr. Antje Prasse danke ich für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung und für ihre
ständige Hilfsbereitschaft bei der Durchführung der Experimenten und bei der Korrektur dieser
Arbeit
Außerdem bedanke ich mich für die Unterstützung und Optimismus vom Herrn PD Dr. Werner
Luttmann
Bei Frau Siglinde Bock und Frau Dr. Ljiljana Mijovic möchte ich mich ganz herzlich für die
Einarbeitung in die grundlegende Arbeitstechniken bedanken
Ich bedanke mich bei den Probanden, die für meine Arbeit Blut gespendet haben
Mein Dank gilt außerdem allen Doktoranden und Diplomanden, die für die gute Atmosphäre im
Labor gesorgt haben