Poster-DVG-Tagung2 1

DVG-Fachgruppentagung
„Bakteriologie und Mykologie“
15. - 17. Juni 2006
Psittakose oder Ornithose?
Speziesspezifischer Nachweis von Chlamydien bei Haustieren
mittels Real-Time-PCR
A. Pantchev1, R. Bauerfeind2, K. Sachse3, J. Tyczka2 und R. Sting1
1
2
JUSTUS-LIEBIGUNIVERSITÄT
GIESSEN
CHEMISCHES UND
VETERINÄRUNTERSUCHUNGSAMT
STUTTGART
3
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Deutschland
Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere,
Justus-Liebig-Universität Giessen, Deutschland
Nationales Referenzlabor für Psittakose, Friedrich-Loeffler-Institut Jena,
Deutschland
Einleitung
Chlamydien gehören zu den wichtigsten
Zoonoseerregern, nicht nur wegen deren weltweiten
Verbreitung und Vorkommen bei zahlreichen Tierarten,
sondern auch wegen der von der Spezies abhängigen
unterschiedlichen Bedeutung für Mensch und Tier.
Aufgrund von phylogenetischen Studien der 16S und
23S rRNA-Gene, wurde im Jahr 1999 durch Everett et al.
die Familie der Chlamydiaceae in die zwei Genera
Chlamydia (C.) und Chlamydophila (Cp.), sowie in neun
verschiedene Spezies (C. trachomatis, C. suis,
C. muridarum, Cp. psittaci, Cp. abortus, Cp. felis,
Cp. caviae, Cp. pecorum, Cp. pneumoniae) eingeteilt.
Laut der Neufassung der Psittakose-Verordnung vom
20.12.2005, liegt bei Papageien und Sittichen nur dann
eine anzeigepflichtige Psittakose vor, wenn eine Infektion
mit Cp. psittaci oder klinische Anzeichen bestehen. Bei
einer Infektion von anderen Vögeln handelt es sich
hingegen um eine meldepflichtige Ornithose. Bisher
konnte jedoch in der Routinediagnostik noch kein
Testsystem etabliert werden, das eine einfache
Differenzierung der Chlamydienspezies ermöglicht.
Ziel der Studie ist es, eine Speziesdifferenzierung in der
veterinärmedizinische Diagnostik zu ermöglichen und
die tierartliche Häufigkeitsverteilung der verschiedenen
tierpathogenen Chlamydienspezies (Cp. psittaci,
Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae, C. suis)
zu analysieren, hierfür wurde ein System von sieben
Real-Time-PCR-Einzelassays (TaqMan-System)
etabliert. Dabei dienten das ompA-Gen sowie ribosomale
RNA-Gene als Zielsequenzen für den spezifischen
Erregernachweis. Zur Differenzierung der ChlamydienSpezies außer Cp. psittaci wurde jeweils eine klassische
TaqMan-Sonde entworfen. Aufgrund einer sehr großen
Homologie der Gensequenzen von Cp. psittaci und
Cp. abortus wurden zur Identifizierung von Cp. psittaci
zwei TaqManMGB-Sonden entwickelt. DNA-Proben von
Psittaziden, Tauben und verschiedenen Säugetierarten,
die in einer für die Familie der Chlamydiaceae
spezifischen PCR bereits positiv getestet worden waren,
wurden anschließend mit dem hier vorgestellten
speziesspezifischen Real-Time- PCR-Verfahren
nachuntersucht.
Foto: Wieland Beck
Schlußfolgerungen
Eine Differenzierung
Differenzierung von
von tierpathogenen
tierpathogenen Chlamydienspezies
Chlamydienspezies ist
ist
•• Eine
mittels Real-Time
Real-Time PCR
PCR grundsätzlich
grundsätzlich möglich.
möglich.
mittels
Bei Psittaziden
Psittaziden und
und Tauben
Taubenwurde
wurde nicht
nicht nur
nurCp.
Cp. psittaci
psittaci (16/23
(16/23 ;;
•• Bei
70 %),
%), sondern
sondern auch
auch Cp.
Cp. abortus
abortus (22
(22 %)
%) nachgewiesen.
nachgewiesen. Dies
Dies
70
unterstreicht die
die Notwendigkeit
Notwendigkeit der
der Speziesdifferenzierung
Speziesdifferenzierung bei
bei
unterstreicht
aviären Chlamydieninfektionen.
Chlamydieninfektionen.
aviären
Bei Schweinen,
Schweinen, Rindern
Rindern und
und Schafen
Schafenwurden
wurdenjeweils
jeweilsmehrere
mehrere
•• Bei
Cp./Chlamydia-Spezies identifiziert.
identifiziert.
Cp./Chlamydia-Spezies
Bei Katzen
Katzen und
undMeerschweinchen
Meerschweinchenwar
war mit
mit Cp.
Cp.felis
felis bzw.
bzw. Cp.
Cp. caviae
caviae
•• Bei
jeweilsnur
nur eine
eine Spezies
Spezies nachweisbar.
nachweisbar.
jeweils
Cp. felis
felis und
und Cp.
Cp. caviae
caviae konnten
konnten interessanterweise
interessanterweiseauch
auch in
in
•• Cp.
Probenmaterial von
von Hunden
Hunden festgestellt
festgestelltwerden.
werden.
Probenmaterial
Ergebnisse
Tabelle 2: Nachweisgrenze für Cp. psittaci, Cp. abortus,
Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae und C. suis
mittels speziesspezifischer Einzelassays in der
Real-Time PCR
Tabelle 1: Nachweis von Chlamydia- und Chlamydophila spp. (C./Cp.-Spezies) bei Haustieren
mittels TaqMan - und TaqMan MGB-Sonden in der Real-Time PCR
Probenherkunft
Probenanzahl
Anzahl reagierender Proben
Anzahl nicht
reagierender
Proben
Sonde spezifisch für
C./Cp.Spezies
Cp.
psittaci
Cp.
abortus
C.
suis
Cp.
pecorum
Cp.
felis
Cp.
caviae
Probenmaterial
CT-Werte der für die einzelnen Chlamydienspezies
jeweils spezifischen Real-Time PCR
Erregerkonzentration in der Suspension (EBE2)/ml)
Chlamydienstämme
Cp. psittaci 11)
105
104
103
102
22/24
25/27
29/31
33/34
36/37 39/ *3)
Cp. psittaci 21)
21/23
24/26
28/29
32/33
35/36
39/39
101
100
Katze
11
11
0
0
0
0
11
0
0
Meerschweinchen
Papagei/ Sittich
5
20
5
20
0
14
0
4
0
0
0
0
0
0
5
0
0
2
Cp. psittaci 31)
23/24
27/28
31/31
34/35
38/38
40/41
Cp. abortus 3
21
25
28
32
35
39
Taube
Schaf
Schwein
3
12
11
3
12
11
2
0
1
1
12
7
0
0
9
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Cp. pecorum
21
24
28
31
35
38
Cp. felis
24
27
30
34
37
Cp. caviae
23
26
30
33
36
Rind
Hund
Summe
10
4
76
10
4
76
2
0
19
7
0
31
1
0
10
1
0
4
0
3
14
0
1
6
0
0
2
*
*
2)
3)
Rinder
(n=10)
10%
10%
10%
Cp. abortus
Schweine
(n=11)
10%
9%
60%
C. suis
Cp. abortus
und C. suis
9%
36%
46%
Zwei Einzelassays für Cp. psittaci (Assay1/Assay2)
EBE: Einschluß- bildende Einheit
Kein CT-Wert
Tabelle 3: Ergebnisse (CT-Werte) der speziesspezifischen Real-Time PCR
mit DNA von sieben bekannten Chlamydienisolaten
Speziesspezifischer
Real-Time
PCR-Assay
für
Cp. psittaci
und Cp. abortus
Cp. psittaci 1)
Cp. psittaci
Cp. pecorum
Cp. pecorum
Cp. felis
Cp. abortus
Cp. caviae
Abbildung 1: Nachweis von Chlamydia (C.) und Chlamydophila (Cp.) spp. bei Rindern und Schweinen
mittels TaqMan - und TaqMan MGB-Sonde in der Real-Time PCR
1)
CT-Werte der Chlamydienisolate
Cp.
Cp.
psittaci psittaci
1
2
Cp.
psittaci
3
Cp.
Cp.
Cp.
abortus abortus pecorum
1
2
25/25
*
*
*
*
31/32
*
*
*
*
*2) /40
25
*
*
*
29/30
*
*
*
*
Real-Time PCR: Jede Probe wurde in dem entwickelten System mit den sieben
Einzelassays untersucht. Zusätzlich wurde eine Positiv- und eine Negativkontrolle für jeden
Einzelassay getestet. Als Positivkontrolle diente DNA von in Zellkultur angezüchteten
Chlamydienisolaten (Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere, Gießen).
Pro Reaktionsansatz wurden 12,5 µl qPCR Master Mix (Eurogentec, Seraing, Belgien),
Forward Primer, Reverse Primer (Endkonzentration jeweils 0,9 µM), Sonde
(Endkonzentration 0,2 µM), 8,1 µl steriles deion. Wasser (Sigma, Deisenhofen) und 2 µl
DNA-Probe zu einem Reaktionsansatz von 25 µl pipettiert.
In der Real-Time PCR wurden 45 Zyklen durchlaufen (10 Minuten 95°C Präinkubation, 15
Sekunden 95°C Denaturierung, 1 Minute 60°C Annealin g und Elongation).
* /39
24
*
*
*
*
*
27
*
*
Cp.
felis
Cp.
C.
caviae suis
*
*
*
30
*
*
*
*
*
27
*
*
*
*
*
Zwei Einzelassays für Cp. psittaci (Assay1/Assay2)
CT-Wert
2) Kein
Literatur
Material und Methoden
Proben: Die Proben wurden freundlicherweise von der Vet Med Labor GmbH, Ludwigsburg,
und vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Fellbach, zur Verfügung
gestellt. Es handelt sich um DNA, die aus Konjunktival-, Genitaltupfern,
Nachgeburtsmaterial und Kot von Katzen, Meerschweinchen, Papageien, Sittichen, Tauben,
Rindern, Schafen, Schweinen und Hunden gewonnen wurde (mit den DNAAufreinigungskits der Firma Qiagen, entsprechend den Anleitungen des Herstellers) und die
in einer Chlamydien-spezifischen Real-Time-PCR reagiert hatten. Die Proben wurden in
dem Zeitraum vom 1. Juli 2004 bis 30. Mai 2006 gesammelt.
*/ *
*/ *
*/ *
*
*
*
*
wird noch bearbeitet
C. suis
1)
10-1
Bestimmung der Nachweisgrenze: Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der
Einzelassays wurden Isolate von Cp. psittaci, Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae und
C. suis in Zellkulturen (Buffalo Green Monkey, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems)
angezüchtet. Folgende Chlamydien-Stämme wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt:
Cp. psittaci-Stamm Z 1904/82 (Cp. psittaci 1), Cp. abortus-Stämme Z 178/02 (Cp. abortus 1) und
Z 1215/86 (Cp. abortus 2), Cp. pecorum-Stamm Z 114/02, Cp. caviae-Stamm 432, Cp. felisStamm Z 3202-II/91, C. suis-Stamm Z 359/02 vom Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten
der Tiere, Gießen, Cp.psittaci-Stämme C12 (Cp. psittaci 2) und C19 (Cp. psittaci 3) und Cp.
abortus-Stamm C18198 (Cp. abortus 3) vom Nationalen Referenzlabor für Psittakose, Jena. Eine
Konzentrationsbestimmung der Chlamydien in den Suspensionen erfolgte mikroskopisch nach
Giménez-Färbungen. Durch die Herstellung von Verdünnungsreihen der aus den
Chlamydienisolaten gewonnenen DNA konnte die Nachweisgrenze für jeden Assay festgelegt
werden (s. Tabelle 2).
Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft (BMVEL):
Verordnung zum Schutz gegen die Psittakose und Ornithose, Entwurf vom 23.12.2005
DeGraves, F.J., D. Gao, H.R. Hehnen, T. Schlapp und B. Kaltenboeck (2003) J. Clin.
Microbiol. 41, 1726-1729
Dennis, W., J. Storz (1982) Am. J. Vet. Res., 43,1897-1902
Everett, K.D.E. und A.A. Andersen (1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 803-813
Everett, K.D.E., R.M. Bush und A.A. Andersen (1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 415-440
Gresham, A.C., Dixon, C.E., B.J. Bevan (1996) Vet. Rec. 138 (25), 622-623
Helps, C., N. Reeves, S. Tasker, D. Harbour (2001) J. Clin. Microbiol. 39 (7), 2675-2676
Kaltenböck, B., N. Schmeer und R. Schneider (1997) J. Clin. Microbiol. 35, 1835-1841
Sachse, K., E. Grosmann (2002) Dtsch. Tierärztl. Wschr. 109, 142-148.
Bestimmung der Spezifität: Zum Nachweis der Spezifität der entwickelten Methode, wurde
die vorliegende DNA der verschiedenen Chlamydienisolate in jedem Einzelassay getestet (vgl.
Tabelle 3).
Korrespondenz
Dr. Reinhard Sting
Diese Arbeit wurde freundlicherweise durch Mittel der
Grimminger-Stiftung für Zoonosenforschung unterstützt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Schaflandstr. 3/3,
D-70736 Fellbach
Tel.: 0711/34261693, Fax: 0711/34261729, E-Mail: [email protected]