Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter

Vermehrung oder Eliminierung
antibiotikaresistenter Bakterien in
Biogasanlagen?
Prof. Dr. Dr.-Ing. Peter Kämpfer
Dr. rer. nat. Stefanie P. Glaeser
Msc. Thorsten Schauss
Institut für Angewandte Mikrobiologie
Justus-Liebig-Universität Gießen
Potentieller Transfer antibiotikaresistenter Bakterien
aus der Landwirtschaft
Eingangsproben:
Gülle und Festmist aus
intensiver Tierhaltung
Pharmazeutika (Antibiotika)
Futtermittelrückstände (Cu, Zn)
Pathogene Bakterien
Bakterielle Sporen
Antibiotiaresistente Bakterien
Resistenzgene
Viren
Biogasanlagen als
technologische Barriere für
pathogene und antibiotikaresistente Bakterien ??
Ausgangsproben:
Fermentierter Rückstand
aus Biogasanlagen
Pharmazeutika (Antibiotika)
Futtermittelrückstände (Cu, Zn)
Pathogene Bakterien
Bakterielle Sporen
Antibiotiaresistente Bakterien
Resistenzgene
Viren
Dargestellte Ergebnisse aus Untersuchungen von:
15 Biogasanlagen 2012-2014 (BGA001-BGA015)
Eingangsproben/Gärsubstrat (nur Gülle/Festmistanteil)
Ausgangsproben/Gärrest
Vorkommen potentiell humanpathogener
antibiotikaresistenter Bakterien in der Großtierhaltung
Extended-Spectrum- Beta- Lactamase (ESBL)-tragende Enterobacteriaceae
> Gram-negative Gammaproteobacteria
> Klinisch relevant: Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli
Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)
> Gram-positive Firmicutes
> Klinisch relevant: Staphylococcus aureus
saureus.mlst.ne
t
Vancomycin-resistente Enterococcus spp. (VRE)
> Gram-positive Firmicutes
> Klinisch relevant: Enterocccus faecalis, Enterococcus faecium
efaecalis.mlst.net
ESBL – Extended-Spectrum-Beta-Lactamasen
Beta-Laktamasen: bakterielle Enzyme, hydrolysieren Laktam-Ringstrukturen der Antibiotika
Punktmutationen in den enzymcodierenden Genen können „Effektivität der Enzyme” erhöhen
(=Extended-Spectrum Beta-Laktamasen; ESBL)
-> Hydrolysieren Cephalosporine (1. – 4. Generation)
Erstes ESBL Auftreten:
SHV-2 in 1983 Klebsiella ozeanae
Bisher 9 Familien an Beta-Laktamasen bekannt:
TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB,
GES, TLA, BES, OXA
SHV-2
CTX-M
Paterson and Bonomo (2005) Clin. Microbiol. Rev. 218(4): 657-686
CTX-M
Dominierend nach TEM und SHV
Zum ersten Mal beschrieben in 1992
Erfolgreiche/schnelle Verbreitung ->110 CTX-M Typen sind bekannt
ESBL E. coli Populationen bei Mensch, domestizierten
Tieren und Wildtieren
ESBL tragende E. coli gleicher Sequenztypen
wurden bei Menschen, Wildtieren und domestizierten
Tieren detektiert
Möglicher Transmission:
Großtierhaltung
Genomische
DNA
Mensch
Plasmid mit
ESBL Gen
1.
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 2
2.
Gunther et al. (2011) Frontiers in Microbiology 2(246): 1-13
ESBL tragende Enterobacteriaceae
CHROMagar ESBL
(MastDiagonistica)
Genomische
DNA
Plasmid mit
ESBL Gen
Multiplex-PCR
(Parallele Detektion verschiedener Gene)
blaSHV (747 bp)
blaCTX-M (593 bp)
blaTEM (445 bp)
Monstein et al. (2007) APMIS 115, 1400-1408
Detektionprinzip - ESBL, MRSA, VRE Detektion
Direktplattierung vs. spezifischer Voranreicherung
10 g
1x
Eingangs/Ausgangsproben
10 g
10 g
1g
0.1 g
1x
2x
3x
Serielle
Verdünnung in
0.9% NaCl
1. Selektive Voranreicherung
(Selektivmedium mit Antibiotika)
24 Stunden, 37°C
Plattierung auf
CHROMAgarTM
ESBL, VRE, MRSA
24 Stunden, 37°C
2. Vereinzelungsausstrich
CHROMAgarTM ESBL, VRE, MRSA
24 Stunden, 37°C
3. Screening einzelner Kolonien
Nachweis von Resistenzgenen (Multiplex-PCRs)
“Phylogenetische” Identifizierung: 16S rRNA Gen
Ergebnisse der Direktplattierung auf
CHROMAgar ESBL
E. coli
Direktplattierung
auf CHROMAgar ESBL
Erfassung koloniebildender Einheiten (KBE)
Ergebnisse von 5 BGAs
Beprobt 2012
Konzentration auf CHROMAgar ESBL kultivierbare Bakterien waren in
Eingangsproben deutlich höher als im Gärrest.
ESBL-E. coli (pink-gefärbte Kolonien) wurden nur in Eingangsproben detektiert.
Phylogenetische Identifizierung:
Pink gefärbte Kolonien: Spezifisch ESBL-E. coli
Blaue Kolonien: Citrobacter, Enterobacter, aber auch Aeromonas (unspezifisch)
Braun/Beige Kolonien: Größtenteils Pseudomonaden, Acinetobacter
FAZIT: Spezifischer Nachweis, aber geringe Detektionseffizienz bei
der Direktplattierung
Phylogenetische Identifizierung nach der
Direktplattierung
n=6
n=3
n=5
n=7
n=5
n=1
n=4
n=6
n=4
n=3
n: Anzahl analysierter unterschiedlicher Koloniemorphologien
In schwarz dargestellt sind E. coli, alle E. coli trugen ein ESBL Gen
Neben E. coli wurde nur ein Morganella sp. Isolat mit einem ESBL Gen detektiert.
Vergleich Direktplattierung – Voranreicherung zur
Detektion von ESBL E. coli auf CHROMAgar ESBL
Pinke Kolonien repräsentieren ESBL-E. coli
-> Obwohl der Nachweis bei der Direktplattierung nicht möglich war waren fast alle
Proben nach Voranreicherung positiv.
ESBL E. coli Nachweis Vergleich der
Direktplattierung und nach Voranreicherung
SHV+TEM
SHV
TEM
Nummern in den Kästchen repräsentieren
die Anzahlen von E. coli Kolonien die die
oben genannten ESBL Gene trugen.
1
Den Hauptanteil machten CTX-M Gene
aus, zusätzlich detektierten TEM Gene sind
vermutlich keine ESBL sondern
chromosomal codierte TEM-1 Gene
(vereinzelt bestätigt mit Sequenzdaten)
HV+TEM
HV
EM
TX-M
TX-M+TEM
Output
HV+TEM
Input
BGA 015
CTX-M
CTX-M+TEM
SHV+TEM
TEM
SHV
6 5
1 8
HV
October
3
6 1
7 1
6
3
5
3
1 2
3
1 4 2
2
4
EM
July/
August
4 7
2 2
4
TX-M
April
Output
1
11
5
TX-M+TEM
February
2013/2014
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
CTX-M
BGA 001
CTX-M+TEM
Input
Untersuchung von zwei BGAs
(BGA001 und 015)
zwischen Februar 2013 und Februar 2014
(4 Probenahmen)
DP: Direktplatterung (aus 10 g)
10 g, 1g , 0.1 g = Mengen an
Ausgangsmaterial das in den die
Voranreicherung eingesetzt wurde
Abundanz verschiedener ESBL Gentypen bei
E. coli Isolaten (BGA001 und BGA015)
n=72
Fraction of E. coli with respective ESBL genes (%)
100%
n=40
2
n=8
3
SHV+TEM
4
90%
80%
n=57
SHV
TEM
25
CTX-M
70%
27
60%
7
41
50%
40%
30%
44
20%
13
10%
9
1
Input
BGA015
Output
BGA015
0%
Input
BGA001
Output
BGA001
Zusammenfassung aller isolierten
und gescreenten
E. coli Isolate aus BGA001 und
BGA015 der Untersuchungen
zwischen Februar 2013 und
Februar 2014
Total: 176 Isolate
Auftreten verschiedener CTX-M Gruppen
Zusammenfassung der Daten von BGA001 und BGA015
Analyse basiert auf 66 sequenzierten CTX-M Genen
Input
Output
CTX-M-9
6%
CTX-M-2
2%
CTX-M-9
12%
CTX-M-2
5%
CTX-M-9
15%
CTX-M-1
83%
n = 48 CTX-M Gene
Total
CTX-M-2
3%
CTX-M-1
89%
n = 18 CTX-M Gene
CTX-M-1
85%
n = 66 CTX-M Gene
CTX-M Gene der isolierten E. coli wurden waren aus der CTX-M-1 Gruppe
(>80%), CTX-M-9 und 2 wurden mit geringer Abundanz nachgewiesen.
Nachweis Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)
CHROMagar MRSA
(Mast Diagnostica)
Multiplex-PCR
Poulsen et al. (2003)
Nachweis Vancomycin resistenter Enterokokken (VRE)
CHROMagar VRE
(Mast Diagnostica)
Multiplex-PCR
Kariyama et al. (2008)
1: E. faecalis mit vanA
4: E. faecium mit vanB
MRSA and VRE Screening nach Voranreicherung
MRSA
Multiplex-PCR Screening:
mecA positive (Methicillin-resistance),
Kein Nachweis von MRSA
BGA-1 BGA-15
Input
x
x
Feb
Output
Not investigated
Input
x
x
x
x
Phyl. Identifikation (partielle 16S rRNA Gensequenzierung):
>99% Staphylococcus haemolyticus
100% Staphylococcus sciuri subsp. sciuri
100% Staphylococcus lentum
April
Output
Input
July
Output
VRE
BGA-1
BGA-15
vanA vanB vanC1 vanA vanB vanC1
Input
x
x
Multiplex-PCR screening:
vanA, vanB, vanC1
Kein Nachweis von E. faecalis, E. faecium-VRE
Feb
Output
Not investigated
Input
x
Output
x
x
x
April
x
x
Input
July
Output
x
Phyl. Identifikation (partielle 16S rRNA
Gensequenzierung)
E. vikkiensis/E.pseudoavium/E.devriessei (vanA)
E. casseliflavus/E.gallinarum (vanB and/or vanC1)
E. lemanii (vanA)
Ergebniszusammenfassung
•
Biogasanlagen eliminieren ESBL und VRE nicht vollständig
•
Probenabhängig wurden ESBL-tragende E. coli und VRE in Eingangs- und
Ausgangsproben von Biogasanlagen detektiert
•
ESBL Gene wurden in Eingangs- und Ausgangsproben auch
kultivierungsunabhängig detektiert
•
MRSA konnten nicht nachgewiesen werden:
mecA tragende Staphylokokken wurden kultivierungsabhängig nur in zwei
Eingangsproben nachgewiesen;
kultivierungsunabhängig wurden mecA Gene in Eingangs- und
Ausgangsproben detektiert
Eingangsprobe
Ausgangsprobe
Ergebniszusammenfassung
Input sample
ESBL
Output sample
ESBL
MRS
VRE
Potentielle
Pathogene
Bakterien
VRE
Pot. pathogenieBakteria