Trennung und Charakterisierung von Proteinen durch Polyacrylamid
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Trennung und Charakterisierung von Proteinen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Native PAGE Laufgeschwindigkeit der Proteine im Gel ist abhängig von: - - Größe - Elektrischen Ladung + Denaturiende PAGE (SDS-PAGE) Natriumdodecylsulfat (SDS) Färbung mit Coomassie-Blau Bestimmung des Molekulargewichts eines Proteins durch SDS-PAGE Die elektrophoretische Mobilität ist umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts Verlauf einer Proteinreinigung Isoelektrische Fokussierung: pH – Gradient im Gel Isoelektrische Fokussierung 2-Dimensionale Gelelektrophorese 2-Dimensionale Gelelektrophorese Bestimmung der AminosäureZusammensetzung eines Proteins Hydrolyse des Proteins durch 6 M HCl bei 110ºC und Trennung der Aminosäuren durch Ionenaustausch – Säulenchromatographie Nachweis und Quantifizierung der Aminosäuren Amin Derivat Nachweisgrenze: 10 pmol (ca. 1 Nanogramm) einer Aminosäure Bestimmung der N-terminalen Aminosäure Dabsylchlorid Bildung eines Sulfonamids Hydrolyse mit 6 M HCl Dabsyl-Alanin Bestimmung der Primärstruktur: Aminosäure-Sequenzanalyse Edman - Abbau Phenylthiohydantoin-Alanin Chemische Spaltung der Polypeptidkette mit Bromcyan Enzymatische Spaltung der Polypeptidkette mit Proteasen Massenspektrometrie MALDI-TOF (Matrix assisted Laser desorption Ionization) Bestimmung der drei-dimensionalen Struktur durch Röntgenkristallstrukturanalyse Kristallisation von Proteinen Proteinkristalle Vom Kristall zur 3D-Struktur Struktur und Funktion der Proteine • • • • • • • Enzymatische Katalyse Transport und Speicherung Koordinierte Bewegung Mechanische Stützfunktion Immunabwehr Erzeugung u. Übertragung von Nervenimpulsen Kontrolle von Wachstum und Differenzierung Katalytische Aktivität der Enzyme 7 Carboanhydrase: Reaktion 10 mal schneller als die unkatalysierte Übergangszustand (nicht katalysiert) Freie Energie (katalysiert) Substrat Produkt Reaktionsverlauf Einfluss eines Enzyms auf eine chemische Reaktion • Enzyme beschleunigen Reaktionen durch die Stabilisierung der Übergangszustände • Enzyme können Reaktionsgleichgewichte nicht verschieben !! Enzyme Katalysieren meist nur eine Reaktion Enzym Familie Reaktions-Typ Oxidoreduktasen Oxidation/Reduktion Transferasen Übertragung von Gruppen Hydrolasen Hydrolyse Lyasen Bildung von Doppelbindungen Isomerasen Isomerisierung (intramolekularer Gruppentransfer) Ligasen Verknüpfung von 2 Substraten Enzyme Hohe Spezifität für Substrat Beispiel: Proteasen Substrat Produkt(e) Hydrolytische Spaltung Trypsin Hydrolytische Spaltung Thrombin Katalytisches (aktives) Zentrum (Schlüssel – Schloß – Modell) Substrat Aktives Zentrum Enzym-Substrat Komplex Enzym
