Untersuchung von CD117 (KIT) – Alterationen in Ovarialkarzinomen
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Aus dem Pathologischen Institut der Universität Basel Prof. Dr. med. M. J. MIHATSCH Untersuchung von CD117 (KIT) – Alterationen in Ovarialkarzinomen mittels direkter Sequenzierung und Tumor-Array-Technologie Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. vorgelegt 2008 von Christopher Belgardt geboren in Iserlohn 2 Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1.Gutachter: Prof. Dr. med. Holger Moch 2.Gutachter: Prof. Dr. med. Hans-Peter Zahradnik Jahr der Promotion: 2008 3 Danksagung Ich danke Prof. Dr. med. Holger Moch für die Bereitstellung des Themas und für die ausgesprochen zufrieden stellende Betreuung der Arbeit, insbesondere der schriftlichen Ausarbeitung. Ich danke Prof. Dr. med. Hans-Peter Zahradnik für die Übernahme des Zweit-Gutachtens. Herzlicher Dank gilt PD Dr. phil. Peter Schraml, für seine enge Betreuung vor allem des experimentellen Teils der Arbeit und dafür jederzeit ein offenes Ohr für Probleme gehabt zu haben. Ich danke Dr. phil. Kirsten Struckmann, die mich zu Beginn geduldig und verständlich in die Grundlagen der Laborarbeit einführte. Herzlicher dank an Alex Rufle, der mir anschließend ein stets hilfsbereiter, aufmunternder und kompetenter Berater bei allen Widrigkeiten des Laboralltages war. PD Dr. phil. Ronald Simon gilt herzlicher Dank für die kompetente und schnelle Hilfe vor allem bei Computerproblemen. Und ich danke meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung auf diesem Weg. 4 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 5 2. Material und Methoden 10 2.1. Patienten und Tumoren 10 2.2. Tumor-Array Herstellung 11 2.3. Immunhistochemie 13 2.4. KIT-Mutationsanalyse 14 3. -2.4.1 Tumoren 14 -2.4.2 PCR 16 -2.4.3 Sequenzierung 21 Ergebnisse 23 3.1. CD-117 Expression 23 3.2. KIT-Mutationsanalyse 26 -3.2.1 DNA-Extraktion 26 -3.2.2 PCR-Analyse 26 -3.2.3 Sequenzanalyse 30 4. Diskussion 34 5. Zusammenfassung 38 6. Referenzen 39 5 1. Einleitung Ovarialkarzinome sind die fünfthäufigste Tumorart bei Frauen und in den westlichen Industrieländern die Geschlechtsorgane. häufigste Noch um zum die Tode führende Tumorart Jahrhundertwende waren der weiblichen Zervix- und Endometriumkarzinome führend. In den USA werden jährlich 24’000 neue Fälle von epithelialen Ovarialkarzinomen registriert und 13’600 Frauen sterben jährlich an dieser Erkrankung (Boring et al., 1994). In den letzten 20 Jahren hat sich die Prognose für Patientinnen mit Ovarialkarzinomen nicht verändert. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt etwa 40%. Die primäre klinische Symptomlosigkeit und fehlende Screening-Verfahren erklären, dass ca. 75% der Patientinnen erst in fortgeschrittenen, nicht mehr kurativ behandelbaren Stadien mit ausgedehnter Metastasierung diagnostiziert werden. Das 5-Jahres-Überleben in dieser Patientinnengruppe beträgt lediglich 10-20%. Patientinnen mit frühen Erkrankungsstadien, die auf die Ovarien oder das kleine Becken beschränkt sind, haben eine 5-Jahres-Überlebensrate von 80%. Das biologische Verhalten von Ovarialkarzinomen ist äusserst variabel und aufgrund morphologischer Parameter nicht vorhersehbar. Allerdings hat die Unterscheidung zwischen nicht-invasiven, sogenannten Borderline Läsionen (atypisch proliferierende epitheliale Ovarialtumoren, atypische Hyperplasie, prämalignen Atypie, Adenocarcinoma in situ oder ovarielle intraepitheliale Neoplasie), und invasiven Ovarialkarzinomen wesentlichen Einfluss auf die Patientinnen-Prognose. Denn Borderline Läsionen haben eine mit benignen Ovarialtumoren vergleichbare Prognose und müssen daher sicher von den invasiven Ovarialtumoren abgegrenzt werden (Leake et al., 1992; Scully, 1982). Bei invasiven Ovarialkarzinomen tritt die Bedeutung histologischer Parameter (Grad, histologischer Subtyp) hinter dem Tumorstadium als Prognoseparameter zurück. Allerdings geht man heute davon aus, dass molekulare Zellveränderungen in Zukunft als Prognoseparameter dienen können (Dietel and Hauptmann, 2000). Die Therapie des Ovarialkarzinoms hat sich in den letzten Jahren nur unwesentlich verändert. Grundsätzlich sollte jeder Ovarialtumor operativ entfernt werden. Das Ausmass des Eingriffs wird durch die Dignität und Ausdehnung des Tumors sowie das Alter der Patientin bestimmt. Bei den häufigeren fortgeschrittenen Stadien des Ovarialkarzinoms wird ein sogenanntes „Debulking“ durchgeführt. Der postoperativ verbliebene Tumorrest ist für Patientinnen mit fortgeschrittenem Ovarialkarzinom der entscheidende Prognosefaktor. 6 Ziel des operativen Vorgehens ist daher die komplette Tumorresektion, falls diese nicht erreichbar ist, zumindest eine Reduktion des Tumors auf einen Durchmesser von deutlich < 1 cm. Das Ovarialkarzinom gilt als ausgesprochen chemotherapiesensible; daher wird postoperativ meist eine Chemotherapie durchgeführt Für das Frühstadium des Ovarialkarzinoms ist eine adjuvante Chemotherapie nur bei high risk Tumoren indiziert (Figo Ia/b mit G II/III, alle Ic und II-Tumoren), bei low risk Ovarialkarzinome (FIGO Ia/Ib mit G I, ggf. G II) kann auf eine Chemotherapie verzichtet werden. Patientinnen mit einer prognostisch ungünstigen Histologie (hellzelliges Karzinom, Transitionalzellkarzinom) benötigen, ebenso wie Patientinnen mit fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen (FIGO II-IV ), obligat und unabhängig vom Stadium eine Chemotherapie, wobei die Chemotherapie umso effektiver wird, je kleiner die postoperative Tumorlast ist. Die über lange Zeit als Standardtherapie eingesetzte Kombination von Cisplatin und Cyclophosphamid, wurde ab 1994 durch die Kombination von Carboplatin und Cyclophosphamid abgelöst, da diese Therapie bei gleicher Wirksamkeit ein besseres Nebenwirkungsprofil zeigte. Zurzeit wird die höchste Rate klinischer und histologischer Vollremissionen, sowie eine Verlängerung der progressionsfreien Zeit als auch der Gesamtüberlebenszeit im Vergleich zu anderen Chemotherapien, mit der Kombination aus einer Platinverbindung (Cisplatin oder Carboplatin) und Paclitaxel erzielt. Somit stellt die Kombination einer Platinverbindung und Paclitaxel den derzeitigen Standard der Primärtherapie dar. Für die „Second-Line-Therapie“ bei Tumor-Rezidiven gibt es zur Zeit keinen kurativen Ansatz. Teilweise werden intraperitoneale Chemotherapie-Verfahren, Ganz-AbdomenBestrahlungen oder Hormontherapien mit überwiegend geringem Erfolg eingesetzt (Lutz, 2001). Bei diesen schlechten Ergebnissen mit der Therapie des fortgeschrittenen Ovarialkarzinoms besteht ein Bedarf an neuen Therapie-Möglichkeiten. In den vergangenen Jahren sind deutliche Fortschritte in der Behandlung bestimmter solider Tumoren erzielt worden. Ein Beispiel dafür sind die Erfolge bei der Behandlung von Mammakarzinomen mit einem monoklonalen Antikörper gegen HER-2/neu. HER-2/neu ist ein transmembranöser Tyrosin-Kinase-Wachstumfaktor-Rezeptor, dessen Überexpression assoziiert ist mit einem schlechteren Ansprechen auf Chemotherapie und/oder einer Resistenz gegen eine antiöstrogene Therapie (Pegram et al., 1998). Trastuzumab, der monoklonale, humanisierte gegen HER-2/neu gerichtete Antikörper bindet recht spezifisch an das Rezeptor-Protein, was zu einer signifikanten Mammakarzinom-Zelllinien führte (Leonard et al., 2002). Tumorwachstumshemmung im 7 Aktuell wird in verschiedenen klinischen Studien weiter untersucht, inwieweit die Trastuzumab (Herceptin) Therapie die Behandlung von fortgeschrittenen Mammakarzinomen verbessern kann. Ein ähnlicher neuer Ansatz ist die Therapie von chronischen myeloischen Leukämien (CML) und gastro-intestinalen stromalen Tumoren (GIST) mit einem neu entwickelten kleinen Molekül „STI-571“ (auch Glivec oder Gleevec genannt) (Schleuning and Hiddemann, 2001). 4-[(4-Methyl-1-piperazinyl)methyl]-N-[4-methyl-3[4--(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]-phenyl] benzamide methanesulfonate Abb. 1 : Chemische Strukturformel von STI-571 STI-571 (Abb.1) bindet an die ATP-Bindungstasche des bei CML auftretenden Fusionsproteins Bcr-Abl und verhindert damit das Andocken von ATP. In der Folge kann das Protein keine Phosphatreste von ATP auf seine Substrate übertragen und verliert somit seine Tyrosinkinaseaktivität (Abb.2). In gleicherweise werden die Kinasen des PDGF-R und der Tyrosin-Kinase-Rezeptor KIT gehemmt. Über diesen Mechanismus führt STI-571 in KIT expremierenden Tumoren zu einer Wachstumshemmung der Tumorzellen, was sich therapeutisch in einer geringeren Tumorvermehrung niederschlägt. KIT wird in den meisten GIST stark exprimiert (SarlomoRikala et al., 1998) und verschiedene Studien haben inzwischen gezeigt, dass für GISTPatienten eine Therapie mit STI-571 von Vorteil ist (Berman and O'Leary, 2001). 8 Abb. 2 : Wirkungsweise von STI-571. Neben GIST wurden in den vergangenen Jahren noch andere Tumoren identifiziert, bei denen KIT exprimiert sein soll. In zahlreichen Arbeiten wurde die KIT-Expression in verschiedenen soliden Tumoren untersucht. KIT-Positivität fand man in myxoiden Chondrosarkomen, Ewing Sarkomen, Schwannomen, Melanomen, Angiosarkomen (Hornick and Fletcher, 2002), Seminomen (Izquierdo et al., 1995; Strohmeyer et al., 1995), kleinzelligen Karzinomen der Lunge und Mammakarzinomen (Tsuura et al., 1994). Die KIT-Expression wurde mit verschiedenen Antikörpern bestimmt. Kommerziell sind heute Antikörper der Firmen DAKO, Novokastra, Labvision, Ancell und anderen erhältlich, die, wie die Erfahrung zeigt, sehr unterschiedliche Qualität bezüglich Sensivität und Spezifität aufweisen. Eine KIT-Expression wurde besonders häufig in Ovarialkarzinomen beobachtet, wo immunhistochemisch eine KIT-Positivität zwischen 70% und 90% der Ovarialkarzinome beschrieben wurde (Tonary et al., 2000). Tonary et al. haben mittels RT-PCR gezeigt, dass der Verlust der KIT-Expression mit einer schlechten Prognose von Ovarialkarzinomen assoziiert ist. Dieser Befund und die Tatsache, dass in akuten myeloischen Leukämien eine Korrelation zwischen KIT-Expression und der Multi-Drug-Resistance besteht (Sincock and Ashman, 1997), macht KIT zu einem interessanten Protein, da es damit prognostische und prädiktive Bedeutung besitzen könnte. Für das KIT-Gen sind verschiedene Mutationen beschrieben worden, die mit einer sogenannten "gain of function" in GIST assoziiert sind, sie betreffen am häufigsten das Exon 11 des KIT-Gens (Hirota et al., 2001; Lasota et al., 1999; Yamaguchi et al., 2000). 9 Weitere Mutationen sind auch in den Exonen 9 und 13 gefunden worden (Hirota et al., 2001; Lasota et al., 2000; Lux et al., 2000; Sakurai et al., 2001). GIST mit KIT Mutationen haben im Vergleich zu GIST ohne Mutation ein erhöhtes Progressionsrisiko (Taniguchi et al., 1999). Die klinische Bedeutung der verschiedenen Mutationen ist für GIST im einzelnen noch nicht aufgeklärt. ZIELE Angesichts der potentiellen prognostischen und therapeutischen Bedeutung der KIT Expression und der beschriebenen Häufigkeit von Expression des KIT-Gens in Ovarialtumoren, wurde die vorliegende Inaugural-Dissertation unter der folgenden Zielsetzung durchgeführt: 1. Untersuchung der Häufigkeit von CD117 Expression in einem grossen Kollektiv von Ovarialkarzinomen nach standardisiertem immunhistochemischem Protokoll. 2. Die Untersuchung der Häufigkeit von KIT-Genmutationen in Ovarialkarzinomen mittels direkter Sequenzierung von Exon 2, 8, 9, 11, 13 und 17. In diesen Exonen wurden bereits Mutationen in verschiedenen Tumortypen beschrieben (Furitsu et al., 1993; Gari et al., 1999; Hirota et al., 1998; Kanakura et al., 1994; Lasota et al., 1999; Lasota et al., 2000; Lux et al., 2000; Nagata et al., 1995; Nakata et al., 1995; Sakurai et al., 2001; Tian et al., 1999; Yamaguchi et al., 2000). 10 2. Material und Methoden 2.1. Tumoren Für die Tumor-Array-Herstellung wurden alle zwischen 1980-1994 am Institut für Pathologie der Universität Basel bearbeiteten Ovarialtumoren erfasst. Nach Ausschluss von Metastasen verblieben verfügbare Paraffinblöcke von 266 Ovarialkarzinomen, 54 Borderline Tumoren und 24 nicht epithelialen Tumoren. Von diesen Patienten wurden die histologischen Schnitte ausgewertet. Alle Schnitte von den Tumoren wurden von einem Pathologen (H. Moch) nachbeurteilt. Tumorstadium und Differenzierungsgrad wurden entsprechend der Kriterien von UICC ( 1997) und WHO (Scully and Sobin, 1999) beurteilt. Das histologische Grading wurde immer an der Stelle mit den deutlichsten Kernatypien vorgenommen. Das Tumorstadium wurde aufgrund der Angaben im Pathologiebericht sowie klinischer Angaben bestimmt. Einen Überblick über Tumorgrad und Stadium der Ovarialkarzinome gibt Tabelle 1. Tabelle 1 : Verteilung der histologischen Typen der Ovarialkarzinome Serös Grad Stadium muzinös endometrioid klarzellig undifferenziert n n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) G1 84 21 (7,9) 30 (11,3) 22 (8,3) 11 (4,1) 0 G2 91 41 (15) 8 (3) 32 (12) 10 (3,8) 0 G3 91 58 (21,8) 1 (0,4) 14 (5,3) 3 (1,1) 15 (5,6) PT1 52 12 (4,5) 12 (4,5) 18 (6,8) 8 (3) 2 (0,8) PT2 34 17 (6,4) 0 10 (3,8) 3 (1,1) 4 (1,6) PT3 86 54 (20) 7 (2,6) 14 (5,3) 3 (1,1) 8 (3) PT4 5 3 (1,1) 0 2 (0,8) 0 0 Nicht 89 34 (7,5) 20 (7,5) 24 (9) 10 (3,8) 1 (0,4) eruierbar 11 2.2. Tumor-Array-Herstellung Das Tumor-Array-Verfahren erlaubt das Einbringen von bis zu 1000 Gewebezylindern (Dm 0.6mm) von histologisch definierten Regionen verschiedener Tumoren in einen einzigen Paraffinblock (Kononen et al., 1998). Das Funktionsprinzip des „Arrayers“ ist in Abbildung 3a, b dargestellt. Abbildung 4 zeigt einen HE gefärbten Ovartumor-Gewebearray-Schnitt (a), sowie ein vergrössertes Array Element, welches ein muzinöses Ovarkarzinom darstellt (b). Abb. 3a : Prinzip der Tumor-Array-Herstellung. Das Instrument besteht aus einem dünnen, an der Spitze geschärften Hohlzylinder (innerer Durchmesser ca. 600 μm), welcher in einem X-Y-Achsen-Präzisionsgerät gehalten wird. Ein genau in den Hohlzylinder passender Stahldraht ermöglicht das Ausstoen von Gewebestücken in mit einem analogen Instrument (äusserer Durchmesser ca. 600 μm) vorgefertigte Löcher im Empfängerblock (Tumor-Array). Ein verstellbarer "EindringStopper" sichert eine konstante Länge von Zylindern und vorgefertigten Löchern im Empfängerblock. Bis zu 1000 Gewebezylinder können in einen 20 x 40 mm messenden Empfänger-Paraffinblock eingebracht werden. 12 Abb. 3b : Herstellung eines Ovarialtumor-Gewebearrays. Abb. 4a : Gewebearray mit 266 Ovarialkarzinomen 13 Abb. 4b : Gewebszylinder aus einem muzinösen Ovarialkarzinom. 2.3. Immunhistochemie Für die immunhistochemische Untersuchung des Ovartumor-Gewebearray-Schnittes wurde das Ventana NexES IHC Staining System verwendet. Der polyklonale Kaninchenantikörper gegen humanes CD-117 (KIT Protein) (DAKO A/S, Dänemark) wurde in einer Verdünnung 1:20 eingesetzt. Zur Antigendemaskierung wurde der Schnitt gemäss Standardprotokoll vor der Inkubation mit dem Antikörper zunächst entparaffiniert und rehydriert. Der Gewebearrayschnitt wurde dann mit Wasserdampf 3 Minuten bei 120°C und 1 Bar Überdruck behandelt. Zum Nachweis der Peroxidase wurde Diaminobenzidin als Chromogen verwendet. Als positive Kontrollen dienten gastrointestinale Stromatumoren mit bekannter Positivität für das Antigen CD-117. Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen durch das Detektionssystem, wurden in einer Negativkontrolle die Antigen-Bindungsstelle durch Zugabe eines synthetischen Peptids blockiert. 14 Entsprechend den Ergebnissen der Immunhistochemie wurden die Tumoren wie folgt klassifiziert: -negativ: keine Färbung nachweisbar bzw. Färbung sowohl im ungeblockten als auch im geblockten Päparat -schwach positiv: Anfärbung deutlich schwächer als in der Positivkontrolle (GIST), keine Anfärbung im geblockten Präparat -stark positiv: Anfärbung gleich intensiv oder nur gering schwächer als in der Positivkontrolle (GIST), keine Anfärbung im geblockten Präparat 2.4. KIT -Mutationsanalyse 2.4.1. Tumoren Vierunddreissig seröse, 5 muzinöse Ovarkarzinome, sowie ein endometrioider Tumor des Ovartumor-Gewebe-Chips wurden für die KIT-Mutationsanalyse ausgewählt. Alle Karzinome waren in gepuffertem Formalin fixiert worden, um eine für PCR- und Sequenzanalysen ausreichende DNA Qualität zu erhalten. Aus der markierten Tumorregion des in Paraffin eingebetteten Gewebes wurden je 2-3 Proben von 0.6 mm Durchmesser mit Hilfe eines für die Herstellung von Gewebe Mikroarrays verwendeten Stanzgerätes (Abb. 1) ausgestanzt und in ein 2ml Eppendorf-Tube überführt. 15 Abb. 5 : Paraffinblock mit Formalin-fixiertem Ovarkarzinom und entsprechendem HE-Schnitt mit den markierten Tumorregionen. Die Extraktion der genomischen DNS der Tumoren aus den Gewebsproben erfolgte nach folgendem Standardprotokoll (Protocol for isolation of genomic DNA from Paraffinemdedded Tissue, QIAGEN). Zunächst wurde das Gewebe durch zweimalige Zugabe von 1200 μl Xylol unter kurzem vortexen (Vortex Genie 2, Bender & Holbein AG) entparaffiniert und nach 5 Minuten zentrifugieren bei 14'000 U/min und Raumtemperatur (Zentrifuge 5415D, Eppendorf) der Überstand abpipettiert. Es folgte eine zweimalige Behandlung mit 1200 μl absolutem Ethanol, der nach kurzem 'Vortexen' und anschlieendem Zentrifugieren für 5 Minuten bei 14'000 U/min und Raumtemparatur wieder abpipettiert und verworfen wurde. Das Gewebe wurde in den geöffneten Plastiktubes bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten getrocknet. Die Proben wurden in 180 μl Puffer ATL (QIAGEN) resuspendiert und mit je 20 μl Proteinase K Lösung (QIAGEN) bei 56 ˚C über Nacht in einem Thermomixer (Eppendorf comfort) inkubiert, bis das Gewebe vollständig lysiert war. Das lysierte Gewebe wurde in mit DNAbindender Silikatmembran augerüstete 2 ml Tubes (QIAamp spin column) überführt und das Lysat bei 8000 U/min für eine Minute abzentrifugiert. Die an die Membran gebundene DNA wurde mit 2 Puffern (AW1 und AW2) gewaschen und mit AE Puffer eluiert. 16 2.4.2. PCR Mit der PCR-Technik wurden die Exone 2, 8, 9, 11, 13 und 17 des KIT- Gens für die Sequenzierung amplifiziert. Wegen des Alters und der Fixierung der verwendeten Gewebeproben in Formalin wurden zwei PCR-Runden pro Exon durchgeführt, um eine für die Sequenzierung ausreichende Menge an PCR Produkten zu erhalten. Die Exonsequenzen sind in Abbildung 5, die für die PCR verwendeten Primer in Tabelle 2 dargestellt. Exon 2 atggaactcagtattggaagaagtgctttatttcgccaaggaagaagatcatactcaacacgatt taccttgagtcataaccttcttcacgaaataaagcggttccttcttctagtatgagttgtgctaa ctgtttttcttggcaggctcttctcaaccatctgtgagtccaggggaaccgtctccacCATCCAT gacaaaaagaaccgtccgagaagagttggtagacactcaggtccccttggcagaggtggtaggta Forward primer CCATCCAGGAAAAtcagacttaatagtccgcgtgggcgacgagattaggctgttatgcactgatc ggtaggtccttttagtctgaattatcaggcgcacccgctgctctaatccgacaatacgtgactag cgggctttgtcaaatggacttttgagatcctggatgaaacgaatgagaataagcagaatgaatgg gcccgaaacagtttacctgaaaactctaggacctactttgcttactcttattcgtcttacttacc atcacggaaaaggcagaagccaccaacaccggcaaatacacgtgcaccaacaaacacggcttaag tagtgccttttccgtcttcggtggttgtggccgtttatgtgcacgtggttgtttgtgccgaattc caattccatttatgtgtttgttagaggtaaatgcttggctttctgcagtgctgtgctttcaagaa gttaaggtaaatacacaaacaatctCCATTTACGAACCGAAAGACGTCAcgacacgaaagttctt Nested-reverse-/ Reverse primer tttaatatcctgctcttaat aaattataggacgagaatta Exon 8 Forward primer tgaagtgaatgttGCTGAGGTTTTCCAGCACTCtgacatatggccatttctgttttcctgtagca acttcacttacaacgactccaaaaggtcgtgagactgtataccggtaaagacaaaaggacatcgt aaaccagaaatcctgacttacgacaggctcgtgaatggcatgctccaatgtgtggcagcaggatt tttggtctttaggactgaatgctgtccgagcacttaccgtacgaggttacacaccgtcgtcctaa cccagagcccacaatagattggtatttttgtccaggaactgagcagaggtgagatgattattttt gggtctcgggtgttatctaaccataaaaaCAGGTCCTTGACTCGTCTCCactctactaataaaaa Nested reverse primer ggcactgcttatatagcagaggggaaggactgcaattcacttgaa ccgtgacgaatatTACGTCTCCCCTTCCTGACgttaagtgaactt Reverse primer 17 Exon 9 Forward/ Nested forward primer tatgtatttatttatttTCCTAGAGTAAGCCAGGGCTTTTGTTTTCTtccctttagatgctctgc atacataaataaataaaaggatctcattcggtcccgaaaacaaaagaagggaaatctacgagacg ttctgtactgccagtggatgtgcagacactaaactcatctgggccaccgtttggaaagctagtgg aagacatgacggtcacctacacgtctgtgatttgagtagacccggtggcaaacctttcgatcacc ttcagagttctatagattctagtgcattcaagcacaatggcacggttgaatgtaaggcttacaac aagtctcaagatatctaagatcacgtaagttcgtgttaccgtgccaacttacattccgaatgttg gatgtgggcaagacttctgcctattttaactttgcatttaaaggtaacaacaaaggtatatttct ctacacccgttctgaagacggataaaattgaaacgtaaatttccattgttgtttccatataaaga ttttaatccaatttaaggggatgtttaggctctgtctacca aaaattaggttaaattccCCTACAAATCCGAGACAGATGGT Reverse primer Exon 11 Forward primer acaggtaaccatttatttgttctctctCCAGAGTGCTCTAATGACTGagacaataattattaaaa tgtccattggtaaataaacaagagagaggtctcacgagattactgactctgttattaataatttt ggtgatctatttttccctttctccccacagaaacccatgtatgaagtacagtggaaggttgttga ccactagataaaaagggaaagaggggtgtctttgggtacatacttcatgtcaccttccaacaact ggagataaatggaaacaattatgtttacatagacccaacacaacttccttatgatcacaaatggg cctctatttacctttgttaatacaaatgtatctgggttgtgttgaaggaatactagtgtttaccC agtttcccagaaacaggctgagttttggtcagtatgaaacagggggtttccatgtcacctttttg TCAAAGGGTCTTTGTCCGACTCAaaacCAGTCATACTTTGTCCCCGAaaggtacagtggaaaaac Nested reverse primer Reverse primer Exon 13 Forward/Nested forward primer gtaagttcctgtatggtactgcatgcGCTTGACATCAGTTTGCCAGTTGtgctttttgctaaaat cattcaaggacataccatgacgtacgcgaactgtagtcaaacggtcaacacgaaaaacgatttta gcatgtttccaattttagcgagtgcccatttgacagaacgggaagccctcatgtctgaactcaaa cgtacaaaggttaaaatcgctcacgggtaaactgtcttgcccttcgggagtacagacttgagttt gtcctgagttaccttggtaatcacatgaatattgtgaatctacttggagcctgcaccattggagg caggactcaatggaaccattagtgtacttataacacttagatgaacctcggacgtggtaacctcc taaagccgtgtccaagctgccttttattgtctgtcaggttatcaaaacatgacattttaatatga ATTTCGGCACAGGTTCGACGGAAAataacagacagtccaatagttttgtactgtaaaattatact Reverse-Primer 18 Exon 17 aaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacct tttcaatcaaaagtgagaaatgttcaattttacttaaatttaccaaaagaaaagaggaggttgga Forward primer aatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatccTCCTTACTCATGGTCGGATCacaaag ttatcacataagtgtctctgaaccgtcggtctttataggaggaatgagtaccagcctagtgtttc atttgtgattttggtctagccagagacatcaagaatgattctaattatgtggttaaaggaaacgt taaacactaaaaccagatcggtctctgtagttcttactaagattaatacaccaatttcctttgca gagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtt ctcatGGGTAAGAGACGAACTGTCAGGACgtttcctaaaaatcaa Nested reverse/ reverse primer Abb. 5 : Sequenzen der Exone (blau) 2, 8, 9, 11, 13 und 17 von KIT. Die Primersequenzen sind in grossen Buchstaben angegeben. Tabelle 2 : Verwendete Primer Exon 2 Exon 8 Exon 9 Exon 11 Exon 13 Exon 17 Forward Primer Reverse Primer Nested-Reverse Primer Forward Primer Reverse Primer Nested-Reverse Primer Forward Primer Reverse Primer Nested-Forward Primer Forward Primer Reverse Primer Nested-Reverse Primer Forward Primer Reverse Primer Nested-Forward Primer Forward Primer Reverse Primer Nested-Reverse Primer 5`-CAT CCA TCC ATC CAG GAA AA- 3` 5`-ACT GCA GAA AGC CAA GCA TT- 3` 5`-GCA GAA AGC CAA GCA TTT ACC - 3` 5`-GCT GAG GTT TTC CAG CAC TC- 3` 5`-CAG TCC TTC CCC TCT GCA T- 3` 5`-CCT CTG CTC AGT TCC TGG AC- 3` 5`-TCC TAG AGT AAG CCA GGG CTT- 3` 5`-TGG TAG ACA GAG CCT AAA CAT CC- 3` 5`-AGC CAG GGC TTT TGT TTT CT- 3` 5`-CCA GAG TGC TCT AAT GAC TG- 3` 5`-AGC CCC TGT TTC ATA CTG AC- 3` 5`-ACT CAG CCT GTT TCT GGG AAA CT- 3` 5`-GCT TGA CAT CAG TTT GCC AG- 3` 5`-AAA GGC AGC TTG GAC ACG GCT TTA- 3` 5`-TGA CAT CAG TTT GCC AGT TG- 3` 5`-TCC TTA CTC ATG GTC GGA C- 3` 5`-CAG GAC TGT CAA GCA GAG AA- 3` 5`-ACT GTC AAG CAG AGA ATG GG -3` Die Amplifikation der Exone 2, 8, 9, 13 und 17 erfolgte in der ersten PCR-Runde mittels Multiplex-PCR in einem Ansatz. Für das Exon 11 musste eine getrennte PCR durchgeführt werden, da sich die PCR-Fragmente des Exons 11 (209 Basen) und des Exons 13 (193 Basen) auf dem Agarosegel nicht ausreichend auftrennen lieen. In der zweiten PCR-Runde wurde jedes Exon nochmals einzeln durch seminested-PCR amplifiziert. Hierbei wurde als Template 5 μl des 1:50 mit Aqua dest. verdünnten PCR-Produkts der ersten Runde verwendet. 19 Zu Beginn einer PCR wurde der Mastermix zusammen pipettiert, in dem alle pro PCR-Ansatz benötigten Reagenzien multipliziert mit der Anzahl der Samples enthalten waren. Als nächstes wurde die vom Protokoll vorgegebene Menge Mastermix in jedes einzelne PCRTube vorgelegt und an einem anderen Arbeitsplatz das Template hinzugefügt. Tabelle 3 : Mastermix für die Multiplex- PCR der Exone 2, 8, 9, 13 und 17 MastermixReagenzien Volumen/ pro Sample Konzentration Hersteller Aqua dest. 10X PCR Buffer dNTP-Mix MgCl2 Primer-Mix 12,5μl 2,5 μl 2,0 μl 1,0 μl 1,0 μl 15 mM MgCl2 je 2,5 mM 25 mM siehe Tabelle 4 B.Braun Applied Biosystems Perkin Elmer Qiagen MWG AmpliTaq Gold® 1,0 μl 5 U/μl Applied Biosystems Gesamtmenge 20μl + 5 μl Template Cyclerprogramm 95°C 95°C 55°C 10 min. 10 sec. 20 sec. 72°C 72°C 4°C 40 sec. 7 min. 41 X Tabelle 4 : Zusammensetzung des Primer-Mix PrimerFoward Reverse Exon 2 Exon 8 Exon 9 Exon 13 Exon 17 2 pmol/μl 2 pmol/μl 2 pmol/μl 2 pmol/μl 5 pmol/μl 5 pmol/μl 4 pmol/μl 4 pmol/μl 4 pmol/μl 4 pmol/μl 20 Tabelle 5 : Mastermix für die erste PCR- Runde des Exon 11. MastermixReagenzien Volumen/ pro Sample Aqua dest. 10X PCR Buffer dNTP Mix MgCl2 Forward-Primer 10.4 Reverse-Primer 11.3 AmpliTaq Gold 15 μl 2,5 μl 2,0 μl 1,0 μl 1,0 μl 1,0 μl 0,5 μl Gesamtmenge 20 μl + 2 μl Template Konzentration Hersteller 15 mM MgCl2 je 2,5 mM 25 mM 5 pmol/μl 5 pmol/μl 5 U/μl B.Braun Applied Biosystems Perkin Elmer Qiagen MWG MWG Applied Biosystems Cyclerprogramm: 95°C 95°C 55°C 10 min. 10 sec. 20 sec. 72°C 72°C 4°C 40 sec. 7 min. 41 X Tabelle 6 : Mastermix für die Seminested-PCRs der Exone 2, 8, 9, 11, 13, 17 MastermixReagenzien Volumen/ pro Sample Konzentration Hersteller Aqua dest. 10X PCR Buffer dNTP- Mix Forward Primer Reverse-Primer AmpliTaq Gold® 13 μl 2,5 μl 2,0 μl 1,0 μl 1,0 μl 0,5 μl 15 mM MgCl2 je 2,5 mM 2 pmol/μl 2 pmol/μl 5 U/μl B.Braun Applied Biosystems Perkin Elmer MWG MWG Applied Biosystems Gesamtmenge 20μl + 5 μl Template (PCR-Produkt 1:50 mit H2O verdünnt) Cyclerprogramm: 95°C 95°C 55°C 10 min. 10 sec. 20 sec. 72°C 72°C 4°C 40 sec. 7 min. 35 X 21 Für den Amplifikationsnachweis wurden nach der ersten und zweiten PCR-Runde je 8 μl der PCR-Produkte mit 2 μl Loading-Dye gemischt, auf ein 1,2%-iges (1,2 g Agarose in 100ml TAE-Puffer) oder ein 4%-iges (Multiplex-PCR) Agarosegel (4 g Agarose in 100ml TAEPuffer) geladen und bei einem Spannungsfeld von 10V/cm elektrophoretisch aufgetrennt. Das im Gel enthaltene Ethidiumbromid (5 μl 1%-iges EtBr in 100 ml Agarose) interkaliert mit den DNA-Strängen und luminesziert unter UV-Licht (Wellenlänge: 312 nm), wodurch das PCRErgebnis unter einer UV-Quelle visualisiert und mit einer Digitalkamera dokumentiert werden konnte. 2.4.3. Sequenzierung Die Sequenzierung erfolgte nach dem Prinzip des Kettenabbruchs von Sanger. Dabei wird mit einem Primer eine einseitige PCR, unter Verwendung eines Gemischs aus normalen dNTP`s und fluoreszenzmarkierten ddNTP`s (Didesoxynukleotide), durchgeführt. Der Einbau eines der vier unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP terminiert die Verlängerung der DNA-Kette, wobei Fragmente unterschiedlicher Länge mit einem markierten Didesoxynukleotid am 3'-Ende entstehen. Danach werden die Fragmente in einer Kapillar-Gelelektrophorese aufgetrennt und passieren dabei einen Laserstrahl, der die in die DNA-Stränge eingebauten Fluorochrome anregt. Das von ihnen emittierte Licht wird von einer Fotozelle registriert und die Daten vom Computer analysiert. Die Sequenzierungs-PCR wurde nach untenstehendem Protokoll durchgeführt. Dabei wurde zuerst der Mastermix zusammenpipettiert, kurz gemischt, je 19 μl in 0,2 ml Tubes vorgelegt und daraufhin das Template (1μl des Seminested-PCR-Produkts) hinzugefügt. Anschlieend folgte die Amplifizierung im Thermocycler. 22 Tabelle 7 : Sequenzier-Protokoll MastermixReagenzien Volumen/ pro Sample BigDyeTerminator Aqua dest. Primer Template 8μl 10μl 1μl 1μl Gesamtvolumen: 20μl Konzentration Hersteller 10 pmol/μl 125-250 ng/μl PE Biosystems B.Braun MWG Seminested-PCR-Produkt Cyclerprogramm: 95°C 50°C 10 sec. 5 sec. 60°C 4°C 4 min. 25 X Um die DNA von nicht eingebauten Primern und Nukleotiden zu reinigen, wurde sie anschlieend mit Ethanol/Natrium-Acetat präzipitiert. Durch Zugabe von je 50 μl Ethanol (absolut) und 2 μl Na-Acetat (3 M; pH 5,11) und anschliessender Lagerung für mindestens eine Stunde bei –20°C wurde die DNA präzipitiert und durch 30 minütiges Zentrifugieren bei 4000 rpM bei 4°C pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet mit 70%-igem, auf –20°C vorgekühltem, Ethanol gewaschen. Die nachfolgende Trocknung des Pellets erfolgte bis zu 25 Minuten bei Raumtemperatur. In 12μl „Template Suppression Reagent“ wurde die DNA durch leichtes Vortexen erneut gelöst und danach bis zur Sequenzanalyse bei –20°C aufbewahrt. Für die Sequenzanalyse wurde der ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) verwendet. 23 Abb. 6 : Geöffneter ABI PRISM Genetic Analyzer. 3. Ergebnisse 3.1. Immunhistochemische Bestimmung der Expression des KIT Proteins (CD-117) am Ovarialtumor-Gewebechip Die Expression des KIT Proteins (CD117) wurde immunhistochemisch an einem Ovarialtumor-Gewebearray untersucht, auf dem sich 266 epitheliale Ovarialtumoren , sowie 24 Tumoren anderen Ursprungs befanden. Desweiteren ging ein Array mit 54 BorderlineTumoren in die Untersuchung mit ein. Insgesamt fanden sich in 15 von 344 Tumoren eine Expression. Eine weitere Aufschlüsselung der Ergebnisse findet sich in Tabelle 8. Zusätzlich zu erwähnen ist eine häufig vorkommende artefizielle Anfärbung, die durch das weiterbestehn der Färbung im geblockten Kontrollpräparat von tatsächlichen Expressionen zu differenzieren war. 24 Tabelle 8 : CD117- Expression nach Histologie aufgeschlüsselt Histologie Gesamtzahl leicht positiv stark positiv epitheliale Tumoren serös-papillär 120 0 1 muzinös 39 1 1 endometrioid 68 1 1 Müller-Mischtumor 15 2 0 Plattenephitel-Karzinom 1 0 0 undifferenziert 15 1 1 Nicht verwertbar 8 - 266 -5 -4 54 2 0 Dottersacktumor 4 1 0 malig. Brennertumor 5 0 0 granulosa Tumor 10 1 0 Dysgerminom 5 1 1 - 24 - 3 - 1 Borderline Tumoren Tumoren anderen Ursprungs In den Abbildungen 8-11 werden Bildbeispiele für die immunhistochemischen Färbungen gegeben. In Abbildung 8+9 erkennt man die regelrechte Färbung der Positiv-Kontrolle, sowie das Verschwinden der Anfärbbarkeit in der mit einem künstlichen Peptid geblockten NegativKontrolle. Die Abbildung 10 zeigen eine typisch membranständige Anfärbung eines deutlich expressionspositiven endometroiden Ovarialkarzinoms. Ein Bespiel für eine artefizielle Färbung gibt Abbildung 11; im geblockten Kontrollpräparat bleibt die Anfärbarkeit kaum abgeschwächt bestehen. 25 Abb. 8 : Positivkontrolle (GIST) Abb. 9 : Negativkontrolle (cd117 geblockt) Abb. 10 : CD 117 positives endometroides Ovarialkarzinom mit Ausschnittsvergrösserung 26 Abb. 11 : Beispiel einer falsch positiven immunhistologischen Anfärbung,: Auch das geblockte Präparat ist deutlich, obwohl abgeschwächt gefärbt. links : ungeblocktes 3.2. rechts : geblocktes Präparat KIT-Mutationsanalyse 3.2.1. DNA Extraktion Von insgesamt 40 Karzinome wurde die DNA extrahiert. Das Vorhandensein von DNA und ihre Qualität wurde mit einer Agarosegel-Analyse bestimmt (Abbildung 12). M 1 Abb. 12 : 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Agarosegel-Analyse der DNA von 17 Ovarialtumoren; Alle 17 DNA Proben sind schwer degradiert 14 15 M: 16 17 DNA M Marker 27 3.2.2. PCR-Analyse Die aus der ersten und zweiten PCR-Runde amplifizierten 6 Exone des KIT Gens wurden auf einem Agarosegel analysiert. In den Abbildungen 13-19 werden Beispiele der PCR-Analyse nach der ersten und zweiten PCR-Runde gezeigt. Die Fragmentlängen der einzelnen PCRProdukte nach der ersten PCR waren für Exon 2- 251 bp, Exon 8-214 bp, Exon 9- 284 bp, Exon 11- 209 bp, Exon 13- 193 bp und Exon 17- 120 bp. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 9 Exon 9 Exon 2 Exon 8 Exon 13 Exon 17 Abb. 13 : Agarosegel-Analyse einer Multiplex-PCR von 18 Tumoren M: DNA Marker. M 1 Abb. 14 : 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Exon 2 nested PCR-Analyse von 18 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 248 bp). 28 M 1 2 Abb. 15 : 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Exon 8 nested PCR-Analyse von 18 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 166 bp). M 1 2 Abb. 16 : 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Exon 9 nested PCR-Analyse von 18 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 274 bp). M Abb. 17 : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Exon 11 nested PCR-Analyse von 12 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 185 bp). 11 12 29 M 1 2 Abb. 18 : 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Exon 13 nested PCR-Analyse von 19 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 189 bp). M 1 Abb. 19 : 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Exon 17 nested PCR-Analyse von 18 Ovarialtumoren (PCR-Produktlänge 116 bp). 30 3.2.3. Sequenzanalyse Die Exone 2, 8, 9, 11, 13 und 17 wurden in 40 Ovarialkarzinomen auf Mutationen untersucht. Bei fraglichen Ergebnissen wurde wiederholt vorwärts und rückwärts sequenziert. In keinem Tumor fand sich eine KIT-Mutation. In den Abb. 20-25 sind Beispiele der Exonsequenzen in verschiedenen Ovarialtumoren gezeigt. Abb. 20 : DNA Sequenz des Exons 2 (vorwärts) eines Ovarialtumors 31 Abb. 21 : DNA Sequenz des Exons 8 (vorwärts) eines Ovarialtumors. Abb. 22 : DNA Sequenz des Exons 9 (vorwärts) eines Ovarialtumors. 32 Abb. 23 : DNA Sequenz des Exons 11 (vorwärts) eines Ovarialtumors. Abb. 24 : DNA Sequenz des Exons 13 (vorwärts) eines Ovarialtumors. 33 Abb. 25 : DNA Sequenz des Exons 17 (vorwärts) eines Ovarialtumors. 34 DISKUSSION In der vorliegenden experimentellen Arbeit wurde eine Mutationsanalyse des KIT-Gens mittels direkter Sequenzierung und eine Analyse der KIT-Protein-Expression an einem Gewebechip von Ovarialtumoren durchgeführt. KIT ist ein Therapie-Target für eine kürzlich entwickelte Therapie mit kleinen Molekülen (STI-571) (Berman and O'Leary, 2001). Damit hat der Nachweis der KIT-Protein-Expression im Tumorgewebe erhebliche praktische Bedeutung für potentielle Therapiemöglichkeiten. Insgesamt wurde gezeigt, dass Ovarialkarzinome selten KIT exprimieren und KIT-Genmutationen waren nicht nachweisbar. KIT gehört zur Familie der Tyrosin-Kinase-Wachstumsfaktor-Rezeptoren und wurde erstmals von Chabot et al. als Proto-Onkogen beschrieben (Chabot et al., 1988). Das KIT-Gen ist auf Chromosom 4 (4q11-12) lokalisiert (www.ensembl.org). Das Gen-Produkt KIT, ein 145-160 kD transmembranes Protein, ist der Rezeptor für den Stammzellfaktor (SCF), der auch als Mastzell-Wachstumsfaktor bekannt ist. Als ein transmembraner Tyrosin-Kinase-Rezeptor vom Typ III, wird KIT infolge Bindung von SCF phosphoryliert und startet eine Kaskade intrazytoplasmatischer Signalübertragungen (Ashman, 1999). Es wurde gezeigt, dass das KITProtein in hämatopoietischen Stammzellen, Gewebsmastzellen, Basalzellen der Haut, Melanozyten, Epithelzellen der Brust, Keimzellen und in den interstitiellen Zellen von Cajal exprimiert ist (Arber et al., 1998; Tsuura et al., 1994). Aufmerksamkeit erhielt KIT –auch CD117 genannt- mit dem Befund, dass der immunhistologische Nachweis einer KITExpression zur Identifikation gastro-intestinaler stromaler Tumoren (GIST) geeignet ist (Huizinga et al., 1995). Die Erforschung der KIT-Expression in GIST führte zur Entwicklung neuer Therapie-Schemata. Das neu entwickelte Therapie-Molekül STI-571 bindet kompetetiv an das CD117-Protein und blockiert dadurch seine Tyrosin-Kinase-Aktivität. Dies führt schließlich zu einem Wachstumsstopp der Zelle (Demetri, 2001). Inzwischen wurde die STI-571 Therapie erfolgreich für die Behandlung von chronischen myeloischen Leukämien eingesetzt (Mauro and Druker, 2001); kürzliche Publikationen beschreiben auch eine Wirksamkeit bei GIST ((Berman and O'Leary, 2001; Joensuu and Dimitrijevic, 2001). GIST gehören zu mesenchymalen Neoplasien des Gastro-Intestinaltrakts. Die Histogenese dieser Tumoren war lange Zeit unklar. Es wurde sowohl eine glatt-muskuläre als auch eine neurogene Herkunft diskutiert. Die eindeutige Zuordnung dieser Tumorgruppe zu den interstitiellen Zellen von Cajal, die als Schrittmacherzellen des Gastro-Intestinaltrakts angesehen werden, konnte erst durch den immunhistologischen Nachweis der CD117Expression erfolgen. 35 Je nach Studiendesign lassen sich 70-100% der GIST mit dem CD117 Antikörper anfärben. Das Färbeprodukt wird teils als diffus zytoplasmatisch, granulär mit Membran-Akzentuierung oder perinukleär beschrieben (Cheuk et al., 2000; Graadt van Roggen et al., 2001; Li et al., 2000; Miettinen and Lasota, 2001; Miettinen et al., 2000a; Miettinen et al., 2000b; Seidal and Edvardsson, 1999; Tazawa et al., 1999). Der Nachweis der CD117-Expression ist zwar hoch sensitiv für GIST, aber nicht spezifisch für diesen Tumortyp. In den vergangenen Jahren wurde gezeigt, dass sich andere Tumoren ebenfalls mit CD117 Antikörpern färben lassen. Neben der Identifikation von Mastzellen im Knochenmark wird CD117 zur Klassifikation der Mastozytose benutzt. Interessanterweise exprimieren auch Keimzellen und Neoplasien von Keimzellen CD117. In diesen Zellen wurden auch KIT-Genmutationen beschrieben (Kissel et al., 2000; Tian et al., 1999). Intratubuläre Keimzellen des Hodens und Seminome zeigen eine membranöse Färbung für KIT. In verschiedenen Arbeiten wurde auch eine schwache bis mässige zytoplasmatische Expression von CD117 in kleinzelligen Lungenkarzinomen, epithelialen Ovarialtumoren, Endometriumkarzinomen, Schilddrüsenkarzinomen, Melanomen, verschiedenen Speicheldrüsenneoplasien, Angiosarkomen, Mammakarzinomen, Phylloidestumoren der Mamma und bei akuter myeloischer Leukämien beschrieben (Arber et al., 1998; Horie et al., 1993; Lammie et al., 1994). Die Befunde waren Anlass zur Durchführeng unserer Untersuchungen. Überraschenderweise fanden wir lediglich in 15 von 336 Ovarialtumoren eine KIT-Expression. Auch die direkte Sequenzierung des KIT-Gens erbrachte keinen Anhalt für eine Genmutation. Unsere Befunde stehen im Gegensatz zu Arbeiten von Arber et al. und Tonari et al. (Arber et al., 1998; Tonary et al., 2000). Arber et al. benutzten einen polyklonalen CD117-Antikörper (Anti-c-KIT, Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan) in einer Verdünnung von 1:400 und färbten 567 Tumoren und 117 Normalgewebe von 18 verschiedenen Organen mit Hilfe eines Multi-Tumorblocks. Diese Autoren beschreiben eine deutliche CD117-Expression in Mastzellerkrankungen, Keimzelltumoren des Hodens, Endometriumkarzinomen (100%), Schilddrüsenkarzinomen (100%), kleinzelligen Karzinomen und malignen Melanomen sowie in 87% der Ovarialkarzinome. Wenig später analysierten Tonari et al. (Tonary et al., 2000) mittels Northern- und Western-blot Analysen, sowie reverser Transkriptions-PCR und Immunhistochemie die KIT-Expression in Ovarialkarzinomen. Auch diese Autoren beschreiben eine häufige KIT-Expression in Borderline-Ovarialtumoren (87%) sowie in 71% der Ovarialkarzinome. 36 Tonari et al. benutzten ebenfalls einen polyklonalen Anti-KIT-Antikörper (Oncogen, Cambridge, MA1:100). In normalen menschlichen Ovarialepithelzellen konnten Tonary et al. mit RT-PCR und Northern-blot Analysen keine KIT-Expression nachweisen. Demgegenüber zeigten sie mit Hilfe einer Western-blot Analyse eine häufige KIT-Expression. Interessanterweise finden diese Autoren eine Assoziation zwischen dem Verlust der KITExpression und einer ungünstigen Patienten-Prognose. Auch die Progression von Melanomen soll mit einem Verlust der KIT-Expression einhergehen. Aufgrund dieser Ergebnisse postulieren die Autoren, dass KIT verantwortlich ist für die Hemmung der Proliferation oder für einen intrazellulären Mechanismus der autokrinen Wachstumgsregulation von Karzinomzellen. Diese Befunde der häufigen KIT-Expression stehen jedoch in deutlichem Gegensatz zu unseren Untersuchungen, in denen wir keine immunhistochemisch erkennbare KIT-Expression nachweisen konnten. Die diskrepanten Ergebnisse der verschiedenen Studien könnten auf die Verwendung verschiedener Antikörper zurückzuführen sein. In den letzten Jahren wurden zahlreiche KITAntikörper entwickelt, die für die Untersuchung von Paraffingewebe unterschiedlich geeignet sind. Es ist bekannt, dass verschiedene Antikörper aber auch unterschiedliche AntigenRetrieval-Methoden und Färbeprotokolle zu unterschiedlichen Befunden führen können. Solche Variabilitäten sind den Pathologen gut bekannt und häufig Gegenstand kontroverser Diskussionen. In einer grösseren Untersuchung wurde am Institut für Pathologie Basel die Zuverlässigkeit der verschiedenen CD117-Antikörper getestet. Dabei wurden von mehreren Herstellern monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper, mit verschiedenen Färbeprotokollen und nach Blockierung des Antigens getestet. Dabei zeigte die Mehrzahl der Antikörper ein hohes Mass an unspezifischen Reaktionen. Lediglich der polyklonale CD117-Antikörper von DAKO erbrachte reproduzierbar spezifische Färbeergebnisse unter Einsatz des beschriebenen immunhistologischen Protokolls. Häufig werden Antikörper für differential-diagnostische Fragestellungen eingesetzt und haben nur indirekt therapeutische Konsequenzen. Im Falle von KIT hat jedoch das Färbeergebnis einen direkten Einfluss auf die Auswahl der Therapie und eine exakte Färbung ist Voraussetzung für den Einsatz der STI-571 Therapie. Groe Phase II bzw. Phase III Studien laufen augenblicklich in den USA und in Europa mit sehr schneller Rekrutierung groer Patientenzahlen. Die Therapie mittels STI-571 scheint bei GIST und myeloischen Leukämien sehr effizient; es werden wenige Nebenwirkungen beschrieben. Durch die beschriebenen Expressionen in anderen Tumoren werden neue Protokolle für klinische Studien geöffnet. 37 Oft fordern Onkologen und Patienten eine KIT-Therapie aufgrund einer positiven CD117 Färbung. Durch die potenzielle Therapie-Relevanz der CD117 Expression gewinnen unsere Befunde der fehlenden CD117-Expression in Ovarialkarziomen zunehmende Bedeutung. Unsere Befunde lassen vermuten, dass die beschriebenen positiven KIT Reaktionen falschpositive Resultate sind. In unserer Untersuchung verwendeten wir den polyklonalen Antikörper gegen CD117 von DAKO. Bei Verwendung dieses Antikörpers zeigten lediglich 15 der 336 untersuchten Ovarialtumoren (4,5%) eine KIT-Expression. Dies entspricht den Ergebnissen der Sequenzanalyse. Bei der Sequenz-Analyse fanden wir keine Mutationen, die zu einer KIT-Überexpression führen könnten. In unserer KIT-Mutations-Analyse beschränkten wir uns auf die Untersuchung von Exon 2, Exon 8, Exon 9, Exon 11, Exon 13 und Exon 17. In diesen Exons wurden "gain of function" Mutationen beschrieben (Furitsu et al., 1993; Gari et al., 1999; Hirota et al., 1998; Kanakura et al., 1994; Lasota et al., 1999; Lasota et al., 2000; Lux et al., 2000; Nagata et al., 1995; Nakata et al., 1995; Sakurai et al., 2001; Tian et al., 1999; Yamaguchi et al., 2000). Dabei sind in etwa 70% der GIST Mutationen im Exon 11 vorzufinden (Lasota et al., 1999). Exon 11 Mutationen werden aber auch als Keimlinien-Mutationen in familiären GIST beschrieben (Maeyama et al., 2001). In GIST sind möglicherweise KIT-Genmutationen mit einer erhöhten Aggressivität der Tumorzellen assoziiert (Taniguchi et al., 1999). Zusammenfassend zeigt sich in der vorliegenden Arbeit, dass die Ergebnisse anderer Gruppen sorgfältig überprüft werden müssen. Reproduzierbare Färbungen für KIT sind unabdingbar für einen therapeutischen Einsatz von STI-571. Bei problematischen Antikörpern wie CD117 ist die Überprüfung der IHC-Ergebnisse in Referenzlabors zu erwägen. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit klinischen Studien bei neuen Therapieansätzen. 38 Zusammenfassung 1. Mutationen des KIT-Gens können zu einer Überexpression von CD117 führen. Gastrointestinale stromale Tumoren (GIST`s) sind durch die Überexpression von CD117 charakterisiert. 2. STI-571 (Glivec oder Gleevec) ist ein chemisch synthetisiertes Molekül, welches die Tyrosin-Kinase Funktion von KIT gezielt hemmt. Studien haben gezeigt, dass GIST-Patienten von der Therapie mit STI-571 profitieren. 3. Die Literaturangaben über KIT-Expressions-Befunde bei Ovarialkarzinomen sind widersprüchlich und variieren zwischen 0 und 90%. Zusätzlich wurde über eine prognostische Bedeutung des Verlustes der KIT-Expression in Ovarialkarzinomen berichtet. 4. Da Ovarialkarzinome trotz Chemotherapie in fortgeschrittenen Stadien eine sehr schlechte Prognose aufweisen, wäre der Einsatz der STI-571 Therapie von groer klinischer Bedeutung. 5. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der KIT-Expression unter Verwendung eines Antikörpers von DAKO in einem grossen Tumorkollektiv von 344 Ovarialtumoren. Die Untersuchung von 6 Exons auf Mutationen des KIT-Gens in 40 Ovarialtumoren, mittels direkter Sequenzierung sollte die Prävalenz von C-KIT –Mutationen aufklären. 6. Eine KIT-Expression unter Verwendung des polyklonale Kaninchenantikörper gegen humanes CD-117 (KIT Protein) (DAKO A/S, Dänemark) lie sich lediglich in 15 von 336 Ovarialtumoren nachweisen Die Diskrepanz zu früheren Untersuchungen mit Expressionhäufigkeiten von bis zu 90% ist sehr wahrscheinlich auf den Einsatz unterschiedlicher immunhistologischer Färbeprotokolle bzw. Artefakte bei PT-PCR zurückzuführen. 7. Die Mutationsanalyse mittels direkter Sequenzierung, bestätigt die erhobenen immunhistologischen Befunde. In den 40 untersuchten Ovarialtumoren konnten keine Mutationen der Exone 2, 8, 9, 11, 13, 17 festgestellt werden. 8. Die Ergebnisse dieser Studie gewinnen durch die derzeit angelaufenen klinischen Phase 2 und 3 Studien mit Glivec groe praktische Relevanz, obgleich es sich um ein negatives Untersuchungsresultat handelt. Der Einsatz von STI-571 für die Therapie von Ovarialtumor-Patientinnen wird durch die vorgelegten Befunde in Frage gestellt. 39 Referenzen ( 1997): TNM classification of malignant tumours. Wiley-Liss. New York. Arber DA, Tamayo R, Weiss LM (1998) Paraffin section detection of the c-kit gene product (CD117) in human tissues: value in the diagnosis of mast cell disorders. Hum Pathol 29, 498-504 Ashman LK (1999) The biology of stem cell factor and its receptor C-kit. Int J Biochem Cell Biol 31, 1037-51 Berman J, O'Leary TJ (2001) Gastrointestinal stromal tumor workshop. Hum Pathol 32, 57882 Boring CC, Squires TS, Tong T, Montgomery S (1994) Cancer statistics, 1994. CA Cancer J Clin 44, 7-26 Chabot B, Stephenson DA, Chapman VM, Besmer P, Bernstein A (1988) The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus. 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