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Prävention statt Dekontamination
Sicher von der Filtration zur Inkubation in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle
J. Grigat
D
ie höchstmögliche Qualität eines
Endproduktes, das sämtlichen Vorschriften und Regularien entspricht,
ist nur zu erreichen, wenn die Qualitätssicherung nicht auf die Kontrolle des Endprodukts limitiert wird. Vielmehr sollte neben
den eingesetzten Rohstoffen der gesamte
Herstellungsprozess einer kontinuierlichen
Überwachung unterzogen werden.
In der pharmazeutischen Industrie wird hierzu
eine Risikoanalyse einzelner Produktionsschritte
durchgeführt, anhand derer In-Prozess Kontrollen
definiert werden. Schwankungen und insbesondere Anstiege der mikrobiologischen Belastung
können somit während der Produktion rechtzeitig
erkannt und Gegenmaßnahmen eingeleitet werden. Auch wenn sich das Kontaminationsrisiko
durch entsprechende GMP-gerechte Produktion,
Dekontamination und Sterilisierung der Endprodukte sowie Hygienevorschriften deutlich verringert hat, ist die Qualitätskontrolle des Endprodukts
nach wie vor von zentraler Bedeutung.
Keimzahlbestimmung
Bei der Keimzahlbestimmung handelt es sich um
die quantitative Analyse von Mikroorganismen.
Dies kann sowohl die Gesamtkeimzahl als auch
bestimmte produktrelevante Spezies von Mikroorganismen betreffen. So sind für verschiedene
Produkte aus unterschiedlichen Industriezweigen (Pharma-, Getränke-, Abwasserindustrie
etc.) Grenzwerte für Mikroorganismen definiert,
die nicht überschritten werden dürfen. Ob bei
der Überprüfung von Trinkwasser oder Pharmazeutika, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit
von Ergebnissen freigaberelevanter Tests ist
aufgrund des potentiellen Einflusses pathogener Keime auf die Gesundheit der Verbraucher
essentiell.
Membranfiltration
Bei der Keimzahlbestimmung ist die Membranfiltration weiterhin die Methode der Wahl um in
flüssigen Proben Mikroorganismen zuverlässig
zu quantifizieren. Das Prinzip dieser Methode
basiert auf der Konzentrierung von Keimen aus
relativ großen Probevolumina auf der Oberfläche eines Membranfilters und ihrer anschließenden Kultivierung, bei der Filter mit den zurückgehaltenen Keimen auf ein Nährmedium
aufgebracht werden.
Im Gegensatz zur direkten Bebrütung einer
Probe, bietet die Membranfiltration den Vorteil,
dass große Probevolumina getestet, und dabei
selbst einzelne Mikroorganismen detektiert wer-
den können. Zudem können Hemmstoffe, wie
Antibiotika oder Konservierungsmittel durch Spülen der Membran mit Puffern entfernt werden, so
dass das Keimwachstum nicht unterdrückt wird.
Mikrobiologische Tests
in der Pharmazeutischen Industrie
Aus mikrobiologischer Sicht lassen sich pharmazeutische Produkte in zwei Kategorien einteilen:
unsterile und sterile Produkte. Für beide Kategorien muss das potentielle Gesundheitsrisiko, welches durch Mikroorganismen und deren Toxine
entsteht, für die Patienten eliminiert bzw. minimiert werden. Zugeich gilt es aber auch die Qualität und Wirkung des Produkts zu wahren.
Als steril definierte Produkte (Augentropfen,
Kochsalzlösungen, Antibiotika etc.) müssen auf
Sterilität überprüft (USP Kapitel 71 und EP Kapitel 2.6.1) und nach ihrer Kontrolle mittels eines
Sterilitätstests als keimfrei bestätigt werden. Im
Gegensatz hierzu werden unsterile Endprodukte
entsprechend des Microbial Limit Test (nach USP
Kapitel 61 und EP Kapitel 2.6.12) auf die Keimanzahl untersucht. In der Pharmaindustrie erfolgen
des Weiteren auch mikrobiologische Qualitätskontrollen des Rohmaterials (zumeist Wasser)
sowie sogenannte Bioburden Analysen während
des Herstellprozesses.
Kritische Schritte bei
der Keimzahlbestimmung
Der klassische Aufbau zur Durchführung einer
Membranfiltration besteht aus einer Vakuumpumpe, einer Absaugleiste, Membranfiltern,
Trichtern oder Filtrationseinheiten, Nährmedien und Pinzette.
Bei dieser Methode wird üblicherweise nach
Abflammen oder dem Desinfizieren der Filterunterstützung ein Membranfilter aufgelegt,
dann ein Trichter aufgesetzt und anschließend
die Probe eingefüllt und durch Anlegen des
Vakuums filtriert. Im Anschluss wird der Membranfilter mit Hilfe einer Pinzette auf einen
Nähragar aufgelegt und für eine definierte Zeit
bei vorgegebener Temperatur im Brutschrank
inkubiert. Die Bewertung erfolgt nach Ende der
Inkubationszeit durch Auszählen der einzelnen
Kolonie bildenden Einheiten (KBE) im Vergleich
zu den zugelassenen Grenzwerten für die jeweilige Probe.
Das Abflammen bzw. Desinfizieren der Filterunterstützung birgt ein zusätzliches Kontaminationsrisiko durch Ungenauigkeiten in
der Anwendung. Besonders kritisch ist hierbei
die Einhaltung der Inkubationsdauer des Desinfektionsmittels um eine 100 %ige Wirkung
entfalten zu können, die Wahl des Desinfektionsmittels, (nicht nur bakteriozid sondern
sporizid) sowie der regelmäßige Wechsel des
Desinfektionsmittels. Das Abflammen birgt,
neben einer Gefahr für das Laborpersonal auch
Abb. 2: Der innovative Deckel
der Microsart@media Medienschale
ermöglicht einen berührungsfreien Transfer
der Filtermenbran auf das Nährmedium.
Abb. 1: Ein separat
abnehmbarer Deckel
ermöglicht nach der
Inkubation die einfache
Entnahme einzelner
Kolonien zur weiteren
Analyse.
das Risiko, dass nicht alle potentiell verkeimten
Stellen lange genug sowie mit dem heißesten
Punkt der Flamme erreicht werden.
Minimierung von
Sekundärkontaminationen
Im Falle der Verwendung einer Einmal-Filtrationseinheit können diese Dekontaminations-Schritte
gänzlich entfallen, sofern eine Einmal-Basisunterstützung eingesetzt wird. Somit bliebe ausschließlich der Transfer des Membranfilters auf das Agarmedium als besonders kritischer Schritt, der das
Risiko einer Sekundärkontamination erhöht und
zu falsch-positiven Resultaten führen kann. Grund
hierfür ist die Verwendung einer Pinzette für den
Transfer der Membran. Zwar wird auch sie abgeflammt bzw. sterilisiert verwendet. Dennoch ist ihr
Einsatz kritisch, da eine potentielle Übertragung
von Keimen und damit eine Manipulation des
Membranfilters möglich ist.
Die Produkte der Sartorius Microsart-Familie
erhöhen die Sicherheit und die Effizienz der mikrobiologischen Qualitätskontrolle indem sie sowohl die Desinfektion bzw. das Abflammen der
Filterunterstützung als auch die Verwendung einer
Pinzette zum Transfer der Membran auf das Nährmedium überflüssig machen.
Zu diesem System gehören die Filtrationseinheiten Microsart @filter sowie die Nährmedienschalen Microsart @media. Bei Microsart @filter
handelt es sich um eine sterile, gebrauchsfertige
Kombination eines Trichters, einer Filtrationsbasis
sowie eines Membranfilters. Die Filtrationseinheit wird auf die Edelstahlleiste aufgesetzt, um
die Probe direkt zu filtrieren. Danach lässt sich
der Trichter durch einen Klick-Fit Verschluss ganz
leicht von der Basisunterstützung entfernen.
Durch den Einsatz dieser Filtrationseinheit entfällt der kritische Dekontaminationsschritt der
Edelstahlbasis.
Microsart @media sind Agar-Medienschalen,
die für den „Microbial Limits Test“ zur Ermittlung
der mikrobiellen Grenzwerte eingesetzt werden.
Sie sind mit unterschiedlichen Agar-Nährmedien
befüllt, steril verpackt und in Kombination mit
den Filtrationseinheiten sofort einsetzbar. Sie
zeichnen sich durch einen innovativen Deckel
aus, der einen berührungsfreien Transfer der
Membran auf den Agar ohne die Verwendung
von Pinzetten ermöglicht. Der Membranfilter
wird dabei mit Hilfe des Deckels von der Basis der
Filtrationseinheit abgenommen, auf dem Agar
platziert und kann nach dem Verschluss der Medienschale inkubiert werden.
Lösung für sicheren Membrantransfer
Die Kombination von Agar-Medienschalen und
den Filtrationseinheiten stellt ein völlig neues
Konzept für den Agar- und Membrantransfer
dar. Bei der Entwicklung wurden beide Produkte
aufeinander abgestimmt und der aktive Deckel
passgenau für die Basis konzipiert. Da zwischen
Probenahme und Inkubation nun nur noch wenige Schritte liegen, lässt sich mit diesem neuen
System ein ergonomischer und schneller Arbeitsablauf erzielen. Gleichzeitig können durch
den berührungsfreien Membrantransfer noch
zuverlässigere Ergebnisse in der Analyse erzielt
und Sekundärkontaminationen auf ein absolutes
Minimum reduziert werden.
KONTAKT |
Dr. Jasmin Grigat
Product Manager Microbiology
Lab Products & Services
Sartorius Stedim Biotech GmbH
Tel.: 0551/308-3326
[email protected]
www.sartorius.com/microsart