Methoden - Sterne und Weltraum

Methoden
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TIRF-Mikroskopie und ihre Anwendung in der
Biologie
Georgios Tsiavaliaris und Dietmar J. Manstein,
Institut für Biophysikalische Chemie, Medizinische Hochschule Hannover
In der konventionellen Epifluoreszenzmikroskopie wird die Probe in ihrem vollen
Volumen gleichmäßig ausgeleuchtet, wodurch Fluorophore sowohl innerhalb wie
auch außerhalb der Fokusebene angeregt
und zur Emission gebracht werden (Abb. 1A).
In der Fluoreszenzmikroskopie haben möglichst dünne optische Schnitte den Vorteil,
dass über und unter der eingestellten Fokusebene induzierte Fluoreszenz das gewünschte Signal nicht überstrahlt. Konfokale Laserscanningmikroskopie mit Lochblenden vor den Detektoren und RealTime-Scanner mit rotierenden Lochblenden
(Nipkow-Scheiben) funktionieren nach diesem Prinzip. Die Dicke der optischen
Schnitte, die mit diesen Systemen erreicht
werden kann, variiert zwischen 400 und 1000
nm. Die Methode der Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
erlaubt es deutlich dünnere optische Schnitte von 50 bis 150 nm Dicke zu erzeugen
(STEYER and ALMERS 2001, TOOMRE and
MANSTEIN 2001, AXELROD 2003). Das durch
die totale interne Reflexion von Licht, beim
Übergang von einem Medium mit höherem
Brechungsindex (n) in ein Medium mit niedrigerem Brechungsindex, erzeugte Anregungsfeld wird häufig als eveneszentes Feld
bezeichnet. Das eveneszente Feld zeichnet sich dadurch aus, dass seine Intensität
mit wachsendem Abstand von der Grenzfläche exponentiell abfällt. Die vollständige
Unterdrückung der Fluoreszenzanregung
außerhalb dieser dünnen Schicht führt zu einer Verbesserung des Signal-Rausch-Ver-
hältnis in der Fokusebene, die es sogar ermöglicht mit Hilfe der TIRFM die Emission
einzelner Fluorophore zu beobachten (VALE
ET AL. 1996, FUNATSU ET AL. 1997). Diesem
Vorteil der TIRFM steht eine wichtige Einschränkung gegenüber: Während in der konfokalen Laserscanningmikroskopie die Position der optischen Schnittebene variiert
werden kann, ist sie in der TIRFM auf eine
einzige Ebene an der Grenzschicht zwischen
Deckglas und Flüssigkeit festgelegt. Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten ein
TIRF-Mikroskop zu realisieren. Bei der Objektiveinkopplung wird der Laserstrahl direkt durch das Objektiv eingekoppelt (Abb.
1B), bei der Prismeneinkopplung wird die
Erzeugung des evaneszenten Feldes mit
Hilfe von Prismen erreicht (Abb. 1C).
Grundlagen der TIRF-Mikroskopie
Wie bereits erwähnt entstehen evaneszente
Wellen an dielektrischen Grenzflächen beim
Übergang von einem optisch dichteren zu einem optisch dünneren Medium. Das Verhalten des Licht an der Grenzfläche wird
durch das Snelliussche Brechungsgesetz (n1
sinθ1 = n2 sinθ2) beschrieben. Im Allgemei-
Abb. 1: Vergleich der Objektiveinkopplung bei inverser Epifluoreszenzmikroskopie und TIRF-Mikroskopie. (A) Schematischer Darstellung eines konventionellen Epifluoreszenzmikroskops. Das Anregungslicht (Blau) wird durch die Mitte des Objektivs auf die hintere Fokusebene fokussiert und tritt in Richtung
der optischen Achse aus dem Objektiv wieder heraus. (B) Bei der Objektiveinkopplung am inversen TIRF-Mikroskop wird zur Erzeugung des evanszenten
Feldes der Strahl durch Spiegel parallel zur optischen Achse verschoben und an der Seite des Immersionsobjektives eingekoppelt. Anregungs- und Emissionslicht (Grün) durchdringen gemeinsam das Objektiv und werden mit entsprechenden dichroischen Spiegeln separiert. (C) Bei der Prismeneinkopplung
wird das Anregungslicht nicht in den Mikroskopkörper eingekoppelt, wodurch sich ein besonders hohes Signal-Rausch-Verhältnis ergibt.
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nen wird, in Abhängigkeit vom
Einfallswinkels θ und von der
Polarisation der einfallenden
Lichtwelle, ein Teil des Anregungslichts unter einem bestimmten Winkel θ2 gebrochen
und der Rest reflektiert (Abb.
2A). Bei einem Brechungswinkel
von θ2 = 90° ergibt sich für den
Einfallswinkel θ1:
θC = arcsin (n2/n1)
Wenn man für n1 und n2 typische
Werte für die Brechungsindices
von Zytosol (1,36) und Glas
(1,515) einsetzt, dann erhält man
für den kritischen Winkel θC einen Wert von 63,85°. Für θ1 > θC
propagiert die Welle entlang der
Grenzfläche. Sie dringt außerdem in das dünnere Medium
ein. Dabei lässt sich das Intensitätsprofil der evaneszenten
Welle vereinfacht durch folgende Gleichung beschreiben:
I(z) = I(0) e-z/d
Wobei für die Eindringtiefe d
der evaneszenten Welle gilt:
d=
λ
4π
n 12
sin2 θ1 – n 22
Abbildung 2B verdeutlicht die
Abhängigkeit der Intensität der
evaneszenten Welle vom Einfallswinkel θ und dem Abstand
z zur Grenzschicht.
Aufbau eines TIRF-Mikroskops
Beim Bau eines TIRF-Mikroskops sind folgende praktische
Punkte zu beachten. Die Erzeugung eines evaneszenten Felds
mittels Objektiveinkopplung ist nur
möglich wenn die numerische
Apertur (NA) des Objektivs größer als 1,38 ist. Heute stellen fast
alle Mikroskophersteller geeignete Objektive mit einer NA im
Bereich zwischen 1,40 und 1,65
her. Dabei sind zwei Dinge zu
beachten. Zum einen schwankt
der Toleranzbereich von Objektiven, die vor 1998 gebaut wurden und die Aufschrift NA=1,40
tragen, zwischen 1.36 und 1,41.
Dies bedeutet, dass mit einigen
dieser älteren Objektive keine
Totalreflexion erzeugt werden
kann. Zum anderen können ObBIOspektrum · 5/03 · 9. Jahrgang
jektive mit NA größer als 1,48
nur in Kombination mit Deckgläsern und Immersionsmedien
mit entsprechend hohem Brechungsindex benutzt werden.
Für Objektive mit einer NA von
1,65, wie sie von Olympus hergestellt werden, verwendet man
Deckgläser und Immersionsöl
mit einem Brechungsindex von
1,780. Die Deckgläser werden
meist aus SF11oder LAFN21
von Schott bzw. PBH11 oder SLAH64 von Ohara hergestellt
und dürfen nicht dicker als 150
µm sein. Wir verwenden Deckgläser mit einem Durchmesser
von 20 und 32 mm in Kombination mit speziellen Badkammern, die sich passgenau in den
x-y-Tisch unseres Mikroskops
einfügen lassen. Entsprechende
Deckgläser werden als so genannte Planscheiben oder
Rundscheiben von den Firmen
Vision GmbH (Rodenberg) und
PlanOptik GmbH (Elsoff) hergestellt. Ein geeignetes Immersionsöl wird unter der Bezeichnung LRIM 165 von der Firma
Cargille Laboratories (Cedar
Grove, NJ, USA) hergestellt.
Die Prismeneinkopplung, wie
in Abbildung 1C schematisch dargestellt, ist einfacher in Aufbau
und Handhabung. Sie hat den
großen Vorteil, dass das Anregungslicht nie in den Mikroskopkörper eingekoppelt wird.
Dadurch ergibt sich im Vergleich
zur Objektiveinkopplung ein
deutlich besseres Signal-RauschVerhältnis. Außerdem ist die Justage des Lasers auf das Prisma in
der Regel nicht durch räumlich
begrenzte Verhältnisse erschwert. Verwendet man einen
Halbzylinder statt eines klassischen Prismas, dann lässt sich
der Einfallswinkel des ankommenden Laserstrahls und somit
auch die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes verändern.
Wir verwenden als Prisma einen
15 mm langen Halbstab mit einem Radius von 7,5 mm, dessen
Basis um 1 mm gekürzt wurde.
Dieses Prisma ist aus dem
Schwerflint SF11 hergestellt
und mit einer Antireflexionsbeschichtung für den sichtbaren
Bereich versehen (Vision
GmbH, Rodenberg). Es wird in
Kombination mit Deckgläsern
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Abb. 2: Das Verhalten einer elektromagnetischen Welle beim Übergang von einem optisch dichteren
zu einem optisch dünneren Medium. (A) In Abhängigkeit vom Einfallswickel, der Polarisation der
einfallenden Lichtwelle und den Brechungsindizes findet an der Grenzfläche der beiden Medien
Brechung bzw. Reflexion statt. Bei Überschreitung eines bestimmten kritischen Winkel θc baut sich
entlang der Grenzschicht eine evanszente Feld auf. (B) Abhängigkeit der Intensität der evaneszenten
Welle vom Einfallswinkel θ und dem Abstand z zur Grenzschicht.
aus SF11 und dem Immersionsöl LRIM 165
der Firma Cargille Laboratories verwendet.
Ein Nachteil bei der Prismeneinkopplung
ist, dass die Probe nicht mehr frei zugänglich
ist, da sich das Prisma und das zur Beobachtung verwendete Objektiv auf den jeweils
gegenüberliegenden Seiten der Deckgläser
befinden (Abb. 1C). Außerdem stellt die Geometrie des Aufbaus besondere Anforderungen an das zur Sammlung des Fluoreszenzlichts verwendete Objektiv. Dieses sollte einen großen Arbeitsabstand erlauben und
sich durch geringe sphärische und chromatische Abberation auszeichnen. Aus diesem
Grund verwenden wir ein 63x Wasser-Achroplan Objektiv mit einer numerischen Aper-
tur von 0,90 und einem Arbeitsabstand von
2 mm (Zeiss, Oberkochen).
Spezielle Entwicklungen für zellbiologische
Anwendungen
Zusätzlich zu den beiden oben beschriebenen Methoden ein TIRFM zu bauen, gibt
es eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten, die abhängig von der biologischen Anwendung, erwünscht oder essentiell notwendig sind. Für zellbiologische Anwendungen ist es oft wichtig verschiedene Fluorophore anregen zu können, was die Verfügbarkeit verschiedener Laserlinien voraussetzt (TOOMRE ET AL. 2000, KRYLYSHKI-
NA ET AL. 2003). Im Prinzip lässt sich dies
durch die Kombination mehrerer kompakter Diodenlaser mit einer Ausgangsleistung
von mehr als 20 mW erreichen. Wir verwenden für diesen Zweck wassergekühlte Argon/Krypton-Ionenlaser mit einer Ausgangsleistung von 5–10 W. Diese Lösung
mag zunächst als übertrieben erscheinen, sie
hat allerdings einige entscheidende Vorteile. Setzt man diese Argon/Krypton-Ionenlaser in Verbindung mit polychromatischen
akusto-optischen Modulatoren (AOM) ein,
dann kann man aus dem Strahl eines im
„Multi-Line“ Modus betriebenen Lasers
einzelne Laserlinien auswählen und jede Linie in ihrer Intensität modulieren.
Der AOM nutzt die Tatsache, dass der
Ablenkwinkel zwischen der 0. und 1. Ordnung sowohl eine Funktion der optischen
Wellenlänge als auch der akustischen Frequenz ist. Durch Abstimmen dieser Parameter erreicht man, dass der Ablenkwinkel
für die gewünschten Laserlinien in der 1.
Ordnung stets gleich bleibt und angewählte
Laserlinien unter dem gleichen Winkel aus
dem AOM austreten. Abhängig von der verwendeten Treiberelektronik kann man vier
oder mehr Linien direkt aus dem Aufnahmeprogramm kontrollieren. Die Umschaltung von einer Laserlinie auf eine andere erfolgt dabei innerhalb weniger Mikrosekunden. Ein weiterer Vorteil ist, dass der AOM
auch als sehr schneller Shutter wirkt. In unseren Mikroskopen wird das Laserlicht über
eine Einkopplungsoptik in ein „Singlemode“ Glasfaserkabel (PointSource, Southampton, UK) eingekoppelt, welches das
Licht zur Einkopplungsoptik des Mikroskops führt. Für die polychromatische Einkopplung geeignete Glasfasern werden bis
zu einer Länge von 10 m gefertigt. Ihre Verwendung ermöglicht es einen Laser und
AOM ohne größere Umbauten an mehreren
Mikroskopstativen zu benutzen.
Der Einsatz mehrerer Laserlinien ist bei
der Prismeneinkopplung einfacher zu realisieren, bei der Objektiveinkopplung allerdings auch möglich. Bei der Einkopplung
über das Objektiv haben wir den in Abbildung
3 gezeigten Aufbau gewählt, der statt eines
dichroitischen Spiegels ein Prismenpaar verwendet. Bei dieser Anordnung erfolgt die
Einkopplung unabhängig von der Wellenlänge des anregenden Lichts, ansonsten
müsste jeweils ein geeigneter dichroitischer
Spiegel eingesetzt werden, und das total reflektierte Licht wird effizient aus dem
Mikroskopkörper herausgeleitet. Das Austreten des total reflektierten Lichts aus dem
Mikroskop ist dabei auch eine nützliche Hilfe bei der Justierung. Natürlich setzen alle
Arten der TIRFM den Einsatz von Filtern
voraus, die das Anregungslicht auf der Detektorseite wirkungsvoll blocken. Hier hat
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sich der Einsatz holografischer Notchfilter
bewährt.
Für Zellbiologische Anwendungen ist es
meist erforderlich auch Information über
Prozesse zu erhalten, die tiefer im inneren
der Zelle ablaufen (OHEIM and STUHMER
2000, TOOMRE et al. 2000). Dabei ist es wichtig zu berücksichtigen, dass man schnell zwischen TIRF- und Epifluoreszenzanregung
umschalten kann. Bei der Prismeneinkopplung kann dies leicht realisiert werden da die
Strahlengänge des Anregungslichts vollständig getrennt sind. Für die Objektiveinkopplung gibt es einige kommerzielle Lösungen, die allerdings entweder kein schnelles Umschalten zwischen den Anregungsquellen erlauben oder starke Unterschiede
in der Eindringtiefe über den abgebildeten
Bereich zeigen.
Einzelmolekül Anwendungen
Kinetische Untersuchungen an Einzelmolekülen sind ein weiterer wichtiger Bereich
in dem TIRF-Mikroskope eingesetzt werden (OIWA et al. 2000, SEITZ et al. 2002, KAYA
et al. 2003). Bei dieser Anwendung sind die
physikalischen Eigenschaften des Lichts
von größerer Bedeutung und dies erfordert
entsprechende Anpassungen. Fluorophore
werden nur angeregt wenn ihre Absorptionsdipole in der Polarisationsrichtung des
Lichts ausgerichtet sind. Da Laserlicht linear polarisiert ist und die beobachteten Fluorophore rotieren, ändert sich die Anregungsintensität der die einzelnen fluoreszierenden Moleküle ausgesetzt sind fortwährend. Wenn der Fluorophor an ein langsam rotierendes Molekül wie ein Protein gebunden ist, kann es durch die anisotrope Anregung zu Variationen der Emissionsintensität kommen, die das gewünschte Signale
überlagern. Deshalb ist es bei der Durchführung von Einzelmolekülmessungen notwendig entsprechende Vorkehrungen zu
treffen. Die isotrope Anregung von Einzelmolekülen kann unter anderem mit Hilfe
eines speziellen Prismas erreicht werden
(WAKELIN and BAGSHAW 2003).
Die hier aufgeführten Beispiele sollen
verdeutlichen, dass die TIRFM ein weites
Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten
hat und auf unterschiedliche Weisen realisiert werden kann. Darüber hinaus können
andere Fluoreszenztechniken wie FRET,
FLIM und FCS leicht mit der TIRFM
kombiniert werden, um dieses Anwendungsspektrum noch weiter zu vergrößern.
Danksagung
Die Arbeiten wurden von der Max-PlanckGesellschaft und der Volkswagen-Stiftung
gefördert.
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Abb. 3: Schematischer Aufbau eines TIRF-Mikroskops mit Objektiveinkopplung. Ein neu entwickelter
Prismen-Filterblock ermöglicht eine effiziente Feinjustierung des evanszenten Feldes. Hierbei wird der
Anregungsstrahl über ein aluminiumbeschichtetes Prisma (5 x 5 x 5 mm) aus BK7 Glas (Opto-Sigma,
Santa Ana, CA, USA) in den seitlichen Rand der Objektivöffnung des Objektivs eingekoppelt. Der Anregungsstrahl verlässt bei Totalreflexion das Objektiv und wird durch ein identisches Prisma auf der
gegenüberliegenden Seite herausgeleitet. Die beiden Prismen befinden sich auf einem Miniaturverschiebetisch (Linos, Göttingen) und sind individuell verstellbar. Hierdurch wird eine exakte Ein- und
Auskopplung an den seitlichen Öffnungsrändern des Objektivs gewährleistet.
combination for near isotropic fluorescence excitation by
total internal reflection. J Microsc 209: 143–8
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Georgios Tsiavaliaris und
Prof. Dr. Dietmar J. Manstein
Institut für Biophysikalische Chemie, OE4350
Medizinische Hochschule Hannover,
Carl-Neuberg-Str. 1
D-30623 Hannover
Tel.: 0511 532 3700
Fax: 0511 532 5966
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