Poster - Universität Hohenheim

UNIVERSITÄT HOHENHEIM
LANDESANSTALT FÜR BIENENKUNDE
Anne‐Amélie Larue, Lars Steiner, Peter Rosenkranz
alarue@uni‐hohenheim.de
Ist Nosema ceranae wirklich ein neuer
Bienenkiller? - Infektionsverlauf und
Überlebensraten im Käfigtest
2. Material & Methoden
1. Einleitung
Seitdem Nosema ceranae als Parasit in Honigbienen (A. mellifera) in Europa nachgewiesen wurde und offensichtlich die
ursprüngliche Art N.apis verdrängt, steht die Frage nach der Virulenz dieses neu eingeschleppten Mikrosporidiums im Raum.
Berichte von umfangreichen Nosema bedingten Völkerverlusten aus Spanien konnten bisher in Mitteleuropa nicht bestätigt werden.
Allerdings gibt es über die Pathogenese beider Nosema-Arten bisher noch viele offene Fragen. Wir haben daher vergleichende
Käfigtests mit N.ceranae und N.apis durchgeführt, um anhand der Lebensdauer infizierter Bienen eventuelle Virulenzunterschiede
Infektionsversuch
¾ Für den Infektionsversuch mit N.ceranae wurde frisches Sporenmaterial aus zuvor infizierten und gekäfigten Bienen verwendet.
¾ N.apis-Sporen wurden aus eingefrorenem Bienenmaterial der
Universität Uppsala (SLU) gewonnen.
nachzuweisen.
¾ Den frisch geschlüpften Bienen wurden 200.000 Sporen der
jeweiligen Sporensuspension in
Aufbau
Zuckerwasser per Einzelfütterung
verabreicht (Abb. 4).
¾ Die Kontrollkäfige bekamen ausschließlich Zuckerwasser.
¾ Jeder Versuchskäfig wurde mit jeweils 40 gefütterten Jungbienen +
5 Ammenbienen
A
bi
(
(zur
Pfl
Pflege
und
d Stabilisierung)
St bili i
) angesetzt.
t t
¾ Der Versuch wurde über einen Zeitraum von 26 Tagen durchgeführt.
N.ceranae
Abb. 4 : Pipettenfütterung einer frisch geschlüpfte Jungbiene
Probennahme, Totenfall und Verhaltensbeobachtungen
¾ Alle 2-3 Tage wurden 3 lebende Bienen aus den Käfigen
entnommen, mit CO2
N.apis
Bienen
wurde
betäubt und eingefroren. In diesen
dann
die
Anzahl
der
Nosemasporen
mikroskopisch mit einer Thoma-Zählkammer bestimmt und bei
Nosemabefall die Artbestimmung über PCR durchgeführt
(siehe unten).
¾Der
Abb. 1: Nosema ceranae lichtmikroskopisch vergrößert (400x)
Totenfall
entnommen
wurde
und
täglich
für
spätere
kontrolliert,
gegebenfalls
Nosema-Bestimmungen
eingefroren.
¾Zusätzlich
wurden
bei
den
Versuchskäfige
tägliche
Verhaltensbeobachtungen gemacht. Hierfür wurden die Käfige
einzeln
für
5
Minuten
beobachtet
und
entsprechende
Verhaltensweisen notiert.
¾Zugesetzte Ammenbienen wurden weiß markiert.
Abb. 5 : Probenahme und Totenfallkontrolle
Die für die PCR verwendeten Primer (nach Bogenschütz 2008)
¾ Mit
dieser von Bogenschütz
(2008)
Abb. 2: Verkotete Rähmchen in nosemabefallenem Volk
erarbeiteten
konnten in einem Arbeitsgang
Abb. 3: Tote Bienen im Gitterboden von nosemabefallenem Volk
“Pathogen” (Nosema pos./ neg.)
und
die
Artbestimmung
durchgeführt werden (Abb. 6).
3. Ergebnisse
Name
Länge in bp Tm °C Sequenz in 5'- 3' -Richtung
CON-2350_F
26
55,6
TGTATAAAATGGAAGAAGATTACTAC Pathogen
CON-2700_R
19
58,2
CTGATGCGGTATAGGTACG
Pathogen
Spezifitätslevel
Methode
DIV apis 2600 F
DIV_apis_2600_F
24
54,2
AATAATTCTTCATTTTACTACGAC
Nosema apis
DIV_apis_3200_R
24
54,8
ATATACTAGTGGTTTCACACTTTC
Nosema apis
DIV_ceranae_2600_F 24
61,2
AAACTATTTTAAGGCGACTTGATG
Nosema ceranae
DIV_ceranae_3200_R 24
54,7
ATACTAGTGGTTTCACAAATAATC
Nosema ceranae
4. Schlussfolgerungen
Verhalten
¾ Die Mortalität nach Infektion mit einer sehr hohen Dosis an Nosemasporen beginnt ca. 14 Tage post infectionem
unabhängig von der Nosema-Art.
¾Unterschiede bezüglich des Verhaltens zwischen infizierten und nicht
¾ Trotz einer hohen Startinfektion und extrem hohen Sporenbelastung
p
g der Einzelbienen lebten befallene Bienen
infizierten Bienen waren nicht festzustellen.
festzustellen So wurden in allen
teilweise über 3 Wochen.
Versuchskäfigen trophallaktische Kontakte in gleichem Umfang
¾ Die Infektion mit eingefrorenem Material von N.apis verlief deutlich langsamer als mit N. ceranae und mit einem
beobachtet .
um den Faktor 5 geringeren maximalen Sporenbelastung der Einzelbienen Æ Nicht nur bei N. ceranae sondern
¾In keinem Käfig wurden Kotspritzer nachgewiesen.
auch bei N. apis muss unbedingt mit frischem (nicht eingefrorenem) Sporenmaterial gearbeitet werden (Fries pers.
Mittlg.).
¾ Trotzdem war die Mortalität im N.apis-Käfig vergleichbar mit der in den stärker infizierten N.ceranae-Käfigen.
PCR
¾Der Nosemabefall („Pathogen“) die jeweilige Nosema-Art (N. ceranae/
Abb. 6: Beispiel für die molekulargenetische Artbestimmung mit den von
uns verwendeten Primerrn: unbefallen (3-6, 11-13); N. ceranae (1,2, 7, 9,
14); N. apis (10, 15)
Probe 8 wies ausschließlich einen Pathogennachweis nach
Sporen pro Bien
ne in Mio.
Infektionsverlauf
160
140
120
100
80
60
40
20
0
12
¾Bei beiden mit N. ceranae infizierten Versuchskäfigen wurde extrem
den N. ceranae-Käfigen nachweisbar mit Maximalwerten von lediglich
14
16
19
21
23
26
Tage nach Infektion
hohe Infektionen mit bis zu 160 Millionen Sporen/ Biene festgestellt.
¾Bei dem mit N. apis infiziertem Käfig war die Infektion später als bei
Bienenkiller in Deutschland?!
180
N. apis) konnte mit unserer molekulargenetischen Methode, mit einer
Ausnahme (Probe Nr. 8), eindeutig nachgewiesen werden (Abb. 6).
¾ Nach unseren ersten Käfigversuchen ist daher N. ceranae nicht virulenter als N. apis Æ kein neuer
Ceranae 1
Ceranae 2
Apis 1
Kontrolle 1
Kontrolle 2
Abb. 7: Infektionsverlauf von den Versuchskäfigen mit N.ceranae, N.apis
und den Kontrollen
30 Millionen Sporen/ Biene.
¾In der „Kontrolle 2“ wurde nach 2 Wochen eine Kontamination mit N.
20
18
ceranae festgestellt (vermutlich durch die zugesetzten Ammenbienen)
Vergleich des Totenfalls zwischen
N.apis und N.ceranae
¾ Bei der Kontrolle 1 (kein Nosemabefall während des Versuches)
wurden lediglich 3 tote Bienen bis zum Versuchsende gezählt.
¾ In den N. ceranae-Käfigen begann der Totenfall jeweils nach knapp 2
16
Totenanzah
hl
mit einem mittleren Infektionsverlauf bis max.
max 40 Millionen Sporen.
Sporen
14
12
10
Abb. 9: Käfige im Brutschrank mit wassergefülltem Teller für benötigte Luftfeuchte
und Thermometer zur Temperaturkontrolle
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Wochen und stieg auf insgesamt 16-20 Bienen an.
¾ Bei dem N. apis-Käfig war dieser Totenfall mit 16 Bienen gleich groß
trotz niedrigerer Sporenbelastung der Bienen.
¾ Der mit N. ceranae kontaminierte Kontrollkäfig 2 wies mit insgesamt 9
toten Bienen eine mittlere Mortalitätsrate auf.
Tage nach Infektion
Ceranae 1
Ceranae 2
Apis 1
Kontrolle 1
Kontrolle 2
Abb. 8: Mortalitätsverlauf von den Versuchskäfigen mit N.ceranae, N.apis
und den Kontrollen (n=40 Bienen pro Käfig)
Abb. 10: Etabliertes Käfigsystem mit ausgebautem Wabenstück,
Pollenwabe und Fütterungsspritze