Erwartungshorizont für Klausur BMZ

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Erwartungshorizont für Klausur BMZ-Teil GENETIK
(Vorlesung und Kurs)
1
MOLEKULARE BASIS der ERBINFORMATION
1.1
DNA als Erbträger, Struktur und Funktion
1.1.1 DNA - Das transformierende Prinzip
Experiment von Griffith: Ansatz, Ergebnis, Aussage
Bakterienformen S (Wildtyp mit Mucopolysaccharid-Hülle) und R( Mutante ohne Hülle, bei S-Form
stirbt Maus bei R-Form überlebt sie
Wenn die S-Zellen getötet werden, überlebt die Maus, aber wenn die abgetöteten S-Zellen mit
lebenden R-Zellen verabreicht werden stirbt die Maus, da sich in ihrem Blut plötzlich lebende S-Zellen
befinden
Aussage: DNA von hitzegetöteten S-Bakterien hat R-Bakterien transformiert, da die Gene für die
Biosynthese der S-Kapsel übertragen wurden
Experimente von Avery et al.: Ansatz, Ergebnis, Aussage
Gleicher Ansatz wie Griffith, allerdings mit den Zellextrakten der S-Bakterien und lebenden RBakterien; Vorbehandlung mit makromolekülabbauenden Enzymen (zB Polysaccharide, Lipide,
RNA,Proteine und DNA)
Ergebnis: Maus stirbt nur bei zerstörter DNA nicht
Aussage: DNA ist das „transformierende Prinzip“
Experimente von Hershey und Chase: Ansatz, Ergebnis, Aussage
2 Ansätze mit Phagen:
35
Ansatz 1: Phagen werden mit radioaktivem S markiert, der in Proteine eingebaut wird; nach dem
infizieren von Bakterien mit diesen Phagen und anschließendem abtrennen ist die Radioaktivität im
Überstand und nicht in den Bakterien messbar
32
Ansatz 2: Phagen werden mit radioaktivem Phosphor P vermehrt, der sich in die DNA einlagert; die
Radioaktivität befindet sich in den Bakterien nach der Infektion
Aussage: Die DNA ist die Erbsubstanz und nicht die Proteine
1.1.2 DNA-Struktur
Chargaff Regeln: Basenzusammensetzung von DNAs
Basenpaarungen: A-T, G-C ; Purin:Pyrimidin = 1:1; GC-Gehalt variiert artspezifisch
Röntgenstrukturanalyse-Daten (Franklin/Wilkins)
Erkenntnisse: Helizität, Periodizität, Abstände in der DNA
Modell Doppelhelix (Watson und Crick)
1) 2 antiparallele Polydesoxyribonucleotidstränge mit entgegengesetzter Polarität
2) außen: Pentose-Phosphat
3) innen: N-haltige Basen „gestapelt“
4) Je 2 Basen in den entgegengesetzten Strängen liegen gegenüber und sind über H-Brücken
verbunden G-C drei, A-T zwei
5) die 2 DNA-Stränge bilden eine rechtsgängige, plektonemische Helix
6) eine umdrehung: 10 bp mit 3,4nm; abstand zweier Basen in einem Strang: 0,34nm; Durchmesser:
2nm; Basen stehen senkrecht zur Helixachse; 36° versetzung zweier benachtbarter Basen
7) DNA-Helix hat 2 Furchen (major, minor)
1.2
Die DNA-Replikation
1.2.1 Replikationsmodus
Experimentelle Beweise: semikonservativ, bidirektional, semi-diskontinuierlich
15
Semikonservativ: E.coli auf Nährboden mit N vermehren ->sie bilden schwere DNA; danach auf
Boden und insgesamt 2 Generationen abwarten: es gibt sowohl leichte als auch Misch-DNA
14
N-
1
3
Bidirektional: DNA replizieren mit radioaktiven H Thymidine; man erhält einen schwachen
radioaktiven impuls am startpunkt, der immer stärker wird, aber in beide richtungen nach außen
schwächer wird
Semi-diskontinuierlich: findet an beiden Strängen statt, da die replikation bidirektional abläuft
1.2.2 Molekulare Mechanismen
Replikation: Funktionen der beteiligte Enzyme/Proteine
Helicase
Primase
DNA Polymerase III
DNA Polymerase I
DNA-Ligase
DnaA, DnaC
SSB
DNA-Gyrase
entwinden und trennen der DNA-Stränge
Synthese von RNA-Primern
DNA Synthese an leading und lagging Strang
Entfernung der Primer du Auffüllen der Lücken (Reparatursynthese)
Erzeugung kovalenter Bindungen in der Pentose-Phosphat-Kette
(besonders Verbindung der Okazaki-Fragmente
Erkennung des Origins (Ursprung Replikation)
Einzelstrangbindeproteine zur Stabilisation der Einzelstränge
Topoisomerase; Entspannung der DNA durch Öffnen der
Phosphorsäureesterbindung für einen kurzen Moment
Telomer-Replikation: Telomerstruktur, Telomerase
Am Ende der Chromosomen befinden sich arttypische Sequenzen, sog. Telomere, welche sich beim
Menschen 100-1000-mal wiederholen (Abfolge TTAGGG)
Die Telomerase besitzt das entsprechende RNA-Template und kann den Leitstrang weiter verlängern
und der andere Strang wird wie üblich durch DNA-Pol III und Ligase verlängert -> Ergebnis: längeres
Telomer mit einem 3’-Überhang.
1.2.3 Anwendungen: DNA-Sequenzierung, PCR
DNA-Sequenzierung: Sanger Methode – Strategie und biochemische Reaktionen;
Erzeugung basenspezifischer Kettenabbrüchen führt zu DNA-Fragmenten welche markiert werden, für
jede Base ein Reaktionsgemisch
Rolle von Di-desoxy-Nukleotid-Triphosphaten,
kann am 3’-Ende nicht erweitert werden ->Kettenabbruch
Lesen von Sequenzierungsdaten,
Gelelektrophorese, Auswertung der Länge der einzelnen Stränge; Fluoreszensmarkierung,
Chromatographie, Laserdedektion
Genomsequenzierungsstrategien,
„geordnet“: Lange Fragmente herstellen, klonieren und der Reihe nach ordnen und dies mit immer
kürzeren Fragmenten wiederholen, bis man die kleinsten Fragmente kloniert und welche man
sequenziert und zusammensetzt
„ungeordnet“: Zerschneiden der DNA, klonieren, jedes Fragment sequenzieren und durch nen
computer zusammensetzen lassen
Genomorganisation Pro-/Eukaryoten
Prokaryonten: Gesamtlänge aller Nukleotidsequenzen= Gesamtlänge unterschiedlicher NukleotidSequenzen
Eukaryonten: längere Nukleotid-Sequenz als unterschiedliche Sequenzen: repetitive DNA, Telomere,
Centromer, Mini-Satelliten
Satelliten-DNA (tandem repeats), SINE (short interspersed repetitive elements), LINE (long
interspersed repetitive elements
PCR: Voraussetzungen/Anwendungen der PCR
Voraussetzungen: bekannte Teilsequenz des DNA-templates, primer-Paare (einer pro Strang), taqpolymerase, dNTPs (Substrat für DNA-Synthese), Thermocycler
2
Genexpression
2.1
Der Genetische Code
Degeneration und „wobbel“ des Codes
Degeneration: AS werden durch mehr als ein Codon codiert, t-RNAs für gleiche AS erkennen mehrere
synonyme Codons
„wobbel“: die 3.Position eines Codons ist „wackelig“ und kann auch mit anderen Basen „wobbeln“ (bsp.
G mit U)
2
Aminoacylierung von tRNAs (die Schlüsselrolle der Reaktion)
1)Wird vom Enzym Aminoacyl-tRNA-Synthetase gemacht, aktives Z bidet ATP und AS;
2)abspaltung zweier Phosphatgruppen und bindung an AS als AMP
3)passende t-RNA bindetunter AMP-Abspaltung an AS und die Aminoacyl-t-RNA wird frei
Diese Beladung ist entscheidend, da das Ribosom nicht die Identität der Codons erkennt sondern die
Aminoacyl-t-RNA ist bestimmend dafür, welche AS eingebaut wird.
Funktion der Nonsense (Stopp) Codons
Nat. Vorkommen am ende des Codierbereiches, bewirkt Termination (Abbruch) der Translation
Translation und nonsense-Suppression
Nonsense-Mutationen durch Punktmutation führen zur frühzeitigen Termination der Translation
Komponenten Prokaryoten-Translation
mRNA, Aminoacylierte tRNAs, Ribosom, Translationsfaktoren: je 3 für Initation, Elongation und
Termination
Inititation: Unterschiede Pro- Eukaryoten
Prokaryonten: an AUG Codon, welches im abstand von 5-10N seine Shine-Delgarno-Sequ. SD (3-9
Basen) hat, welche mit dem Ribosom interagiert
Eukaryonten: besitzen keine SD, Initation erfolgt am ersten AUG Codon der mRNA, welches durch
scanning des 40S Ribosoms ausgehend vom 5’-ende erkannt wird
Molekulare Mechanismen im Translationszyklus
1) Codon-Erkennung durch t-RNA -> Bindung in der A-Stelle des Ribosoms; dabei wandert die
vorherige t-RNA, an der die AS-Kette hängt, unter GTP-Verbrauch an die P-Stelle
2) Die Peptidkette wird weitergegeben an die A-Stelle, wo sie mit der neuen AS verknüpft wird
3) Unter GTP-Verbrauch wandert nun die in der P-Stelle gebundene RNA in die E-Stelle und
alles rückt eins weiter, wodurch die A-Stelle wieder frei wird
Prinzip der Supression von nonsense-Mutationen durch Supressor tRNAs
Durch eine Mutation im Anticodon einer t-RNA entsteht eine Supressor r-RNA, welche in der Lage ist
an eine nonsense-Mutation zu binden und somit wird die Translation nicht abgebrochen.
2.2
Genexpression und Regulation
Positive/negative Regulation des lac-Operons
Regulationsprinzipien Genexpression allgemein: bei katabolischen (LactoseVerwertung)
Das Operon ist im Grundzustand abgeschaltet und muss durch einen Induktor induziert werden,
welche an ein Regulatorprotein binden
anabolischen (Trp-Synthese) Reaktionen
(alle gene zur Trp-Synthese in einem Operon (Operator, Promotor, offenes Leseraster); Trp aktiviert
den Repressor, welcher an den Operator bindet und die RNA-Polymerase blockiert; Trp als CoRepressor)
werden immer transkribiert und das Operon kann reprimiert werden
Definitionen und Komponenten:
Operon, Cluster von Genen mit gemeinsamen Operator (DNA-Bindungsstelle des Repressors); es
wird nur eine mRNA transkribiert, auf der mehrere Gene sind
Cistron, genetische Einheit, in der Mutationen nicht komplementiert werden können
Polycistronische mRNA, mRNA für mehrere Proteine, jeweils mit SD-Seq, Start- und Stopp
Codon
positive und negative Kontrolle,
Komplementation verhältnis zweier Genloci zueinander
(cis-trans-Test) zur Feststellung, ob 2 mutante Phänotypen durch dasselbe Gen verursacht werden
Mutationen A und B im gleichen Gen ->mutierter Phänotyp (cis)
in verschiedenen Genen ergänzen sich die Aktivitäten zur normalen Funktion (trans)
3
Regulationsmechanismen:
Gene und Mechanismus der negative Regulation des lac-Operons;
lacZ:beta-Galactosidase->Abbau der Lactose un Galactose und Glucose; lacY: Permease->
Lactoseaufnahme in die Zelle; lacA:Transacetylase->Inaktivierung des Induktors IPTG/Allolactose
Repressor immer aktiv und bindet an den Operator -> keine Lactose vorhanden; Induktor (IPTG)
inaktiviert ihn, wenn Lactose vorhanden ist
Glucoseeffekt (Katabolitrepression) und positive Regulation;
Die Zelle hat Glucosereste, die sie aufbraucht, bevor sie Lactose verwertet;
Niedriger Glucosegehalt ->hoher cAMP-Spiegel ->aktiviert das Regulatorprotein CAP, welches sich an
die DNA im Promotor anlagert und die transskription des lac-Operons fördert
Mutanten des lac-Operons,
-
c
-
lacZ – z ; ... O – Operator - O (kann Repressor nicht mehr binden; lacI – Repressor – I (kein
S
q
funktionaler Repressor); I (Superrepressor, an den kein Induktor binden kann),I überexprimiert
Experimenteller Ansatz zur Unterscheidung von Is- und Oc-Mutanten
Nachweismethoden: lac+/lac- Phänotypen auf Medien,
Nutzung von IPTG (Induktor),
Nachweis von ß-Gal auf Medien und Photometrischer assay zur Quantifizierung über
ONPG
3.1
Besonderheiten der Genexpression in Eukaryoten
Transkriptionsregulation:
Aktivatoren, binden an Enhancer um die Transkription zu beschleunigen, indem sie durch Biegung
der DNA näher an den Promotor gebracht werden und binden an Transkribtionsfaktoren, welche einen
Initationskomplex ausbilden
Enhancer, etwas weiter vom Promotor entfernte distale Kontrollelemente
Promotoren; besitzt jedes Gen, wie Prokaryonten
Intron-Exon Struktur von Genen; Gene besitzen Introns (keine genetische Information) und
Exons, welche den genetischen Code enthalten;
mRNA Modifikationen und splicing (alternatives splicing)
primäres Transkript enthält Introns welche beim splicing durch ein Splicosom herausgetrennt werden,
ebenfalls erhält die mRNA ein 5’-Capping und eine 3’-Polyadenylierung
Beim alternativen Splicing kann die prä-mRNA auf verschiedene Weiße gespliced werden, wodurch
unterschiedliche, aber sehr ähnliche Proteine translatiert werden
4.1
Molekulare Basis und Anwendungen der Gentechnik
Restriktion-Modifikation
Lambda Restriktion/Modifikation durch P1-System bei Vermehrung auf E. coli
Stamm A mit Prophagen P1: Lambda-Phage vermehrt sich nicht ->Restriktion (keine P1
Stamm B: Lambda-Phage vermehrt sich; Phagen die Stamm A geschafft haben schaffen es auch
nachher Stamm A zu infizieren ->Modifikation des P1-Phagens welcher in das Genom integriert ist
Molekulare Mechanismen Res/Mod (Methylierung der DNA an Erkennungsstellen der RE),
Restriktion: Schneiden der DNA an spezifischen Sequenzen (Stucky/Blunt-ends)
Erkennungs und Schnittsequenzen
1)Erkennungs und Schnittstelle sind nicht identisch, ca.1kb entfernt
2)Erkennungsstelle und Schnittstelle sind identisch
2) assymetr. Erkennungsstelle und Schnittstelle sind nicht identisch, ca.24-26BP entfernt
Kriterien der Eignung von Klasse II Restriktionsendonukleasen für Gentechnik
Separate Enzyme für Restriktion und Modifikation, Erkennungs- und Schnittstelle sind identisch,
symmetrische Schnittsequenzen (palidromisch)
Vektoren, Genbibliotheken(Anzahl Klone, die ein gesamtes Genom repräsentieren)
Kriterien für die Nutzung/Anwendung von Plasmid- und Lambda-Vektoren
Plasmid: Resistenzgene, viele RE-Schnittstellen, Kontrolle durch lac-Operon
Lambda
4
Genomische und cDNA-Genbibliotheken,
Genomisch: alle Sequenzen eines Genoms
cDNA: nur transkribierte Genfrequenzen (reife mRNA)
cDNA-Synthese
mRNA wird komplementär mit einem DNA-Strang ergänzt, lösen der mRNA, 2.Strang
synthetisieren
Vor- und Nachteile von Genom- und cDNA-Bibliotheken
Genombibliothek: man hat noch Introns und Promotoren in der Sequenz -> muss differenziert werden
cDNA-Bib: keine Introns, keine Promotoren ->reine Gene
Reverse Genetik: Ziele, Anwendungen
Prinzipien/Unterschiede der „forward“ und „reversen“ Genetik
Forward: Vom Phänotyp zur Gensequenz
Revers: Vom Gen zur Funktion (mithilfe von Mutationen in einem Gen( Insertionsmutanten,
Genaustausch)
5 Klassische Genetik
5.1. Die drei Mendelschen Gesetze
Inhalte der drei Regeln, Einfaktoren-Kreuzung, Punnett-Viereck,
Zweifaktorenkreuzung
1.Regel:Bei einer Kreuzung zweier Pflanzen, die sich in einem Merkmal unterscheiden, erhält man in
Bezug auf dieses Merkmal gleichförmig aussehende F1-Hybride, egal ob das Merkmal von Vater oder
Mutter war (Uniformitäts- oder Reziprozitätsregel)
2.Regel: In einer F2-Generation treten die Merkmale der P-Gen. Wieder auf und zwar im Verhältnis 3:1
oder 1:2:1 bei intermediären Merkmalen (Spaltungsregel)
3.Regel: Merkmale werden unabhängig voneinander vererbt. In einer F2-Gen. Treten die Merkmale im
Verhältnis 9:3:3:1 auf.
5.2. Abweichungen von und Erweitungen der Mendel’schen Regeln
5.2.1. Kopplung und Rekombination
Gene sind teilweise aneinander gekoppelt (gleiches Chromosom), aber es kann zur homologen
Rekombination kommen
Bei nicht gekoppelten: Die Chromosomen werden zufällig in der Metaphaseplatte angeordnet
Kopplungsgruppen, mehrere Gene, welche nicht unabhängig voneinander vererbt werden
Kopplung kann durch Rückkreuzung gezeigt werden,
Kreuzung mit dem homozygot-rezessiven Elternteil
Homologe Rekombination in der Meiose (vor der Prophase)
Doppelstrangbruch-Modell und seine molekularen Grundlagen (Doppelstrangbruch DSB,
Einzelstrangbereiche durch RecBCD-pathway, RecBCD bindet an DSB und löst durch eine
Helicase die DNA-Stränge und eine Exonuclease zerstört diese bis zum chi-Punkt, ab wo nur noch der
5’-3’-Strang (vom RecBCD-Verlauf her gesehn) aufgelöst wird
Einzelstrangbindung durch RecA, RecA bindet an den Einzelstrang (mit jeder Menge
Untereinheiten) in primary binding site und danach noch die doppelsträngige DNA in der secondary
binding site
Suche nach homologem Doppelstrang und Stranginvasion, RecA scannt den DNA-Strang
entlag bis zu dem homologen Doppelstrang; danach wird die Stranginvasion gemacht
Ausbildung von 2 Holliday-Junctions, Es werden 2 Stranginvasionen gemacht
Auffüllen der Lücken über DNA- Polymerase und Ligase, nach der Stranginvasion löst sich
die RecA und die entstandenen Lücken werden aufgefüllt
Holliday-Junctions werden von RuvA gebunden, RuvA rekrutiert Ruv B, Ruv B
fungiert als ATPase und liefert Energie für die Branchmigration (entlangbewegen der
Stränge),
Heteroduplexbereiche durch Branch-migration, 1DNA-Molekül mit 2 Strängen
unterschiedlicher Herkunft
5
Genkonversion, nichtreziproker Austausch von DNA-sequenzen; eine Sequenz wird übertragen,
die andere nicht (Mismatch)
zwei Möglichkeiten zur Auflösung der Holliday-Junction durch RuvC, crossoverproducts, non-crossover-products)
5.2.2. Rekombination und Genkartierung
Rekombinationsfrequenz, Rekombinanten/Gesamtzahl aller Individuen
Einheit centiMorgan (cM), 1cM entspricht 1% Rekombinationshäufigkeit
Prinzip einer 3 Gen-Kartierung (Kursexperiment)
3 Merkmale auf einem Chromosom, Bestimmung der Rekombinationsfrequenz, kleinster Wert
Mittelmarker
5.2.3. Geschlechtschromosomal gebundene Vererbung
Gen liegt auf einem Geschlechtschromosom
Geschlechtbestimmung bei Mensch und Drosophila,
männchen:2 Autosomensätze und 1X, Weibchen: 2A und 2X
Abweichung von den Mendel’schen Regeln, 1:1 Verteilung in F1 und F2 einer der
reziproken Kreuzungen (Kursexperiment)
Uniformitätsregel, Reziprozitätsregel und Spaltungsregel passen nicht zu Mendel
6 Mutationen
6.1 Genmutationen
Punktmutationen, Änderung einzelner Nukleotide
Ratermutationen, Einschub oder Ausfall eines Nukleotids ->Leseraster wird verschoben
Mutationen sind spontane zufällige und seltene Ereignisse,
Tautomerie, durch Bildung von Enolformen kann sich die Basenpaarung verändern,
da sich die Anzahl möglicher H-Brücken verändert (zB. T-G, C-A)
Fixierung der Mutation durch Replikation, eine Mutation durch Tautomerie wird bei der
replikation fixiert, indem eine falsche Base als Partner eingebaut wird
Mutagenese, Erzeugung von Mutationen in Erbgut
chem. Mutagene, salpetrige Säure, Hydroxyradikale, H2O2, O2-, Basenanaloge, welche wie eine
Base paaren (zB 2-Aminopurin)
indirekte Mutationen entstehen durch die Aktivierung von Reparaturmechanismen,
UV-Mutagenese, UV-Strahlung kann zu Pyrimidindimeren führen ->Reparaturmechanismen
Photoreaktivierung, durch Blaulicht (Photolyase)
Excisionsreparatur, uvrABC-Endonuklease erkennt Dimere und setzt Einzelstrangschnitte etwas
erfernt, uvrD-Helicase entfernt das DNA-Stück, DNA-Poly I und Ligase schließen Lücke
Auslösung der SOS Antwort durch Aktivierung von RecA, RecA aktiviert das SOS-System,
welches die Schäden repariert
Error prone-repair durch umuC und umuD (Kursexperiment),
ungenaue Reparatur: DNA-Poly III stoppt am Schaden, DNA-Poly V übernimmt (Genprodukte der
SOS-Gene umuC und umuD)
Rückmutation, Wiederherstellung der ursprünglichen Basenpaarung oder auch lediglich eine
Wiederherstellung der Proteinfunktion (muss nicht identische Basen haben)
Ames-Test, Identifikation chem. Mutagene: potenzielles Mutagen und Kontrollgruppe auf
+
Medium ohne Histidin ->kein wachstum, außer durch Mutation wurde His erzeugt, großer Unterschied
Kontroll-Test, dann ist der Stoff mutagen
Suppressormutationen 1) 2.Mutation im betroffenen Gen bei Rastermuttionen
2)2. Mutation in einem anderen Gen -> zB. veränderte t-RNA
7 Austausch der genetischen Information bei Prokaryoten
7.1. Grundlagen der Bakterien- und Phagen-Genetik
6
Voraussetzungen für Genaustausch;
Vererbbarer Merkmalsunterschied durch Genmutation, Erkennung der Mutanten (Screening, Selektion)
Isolierung/Charakterisierung von Mutanten;
Charakterisierung nach Auxotrophie(verschiedene Minimalmedien),AB-resistenzen einbaun in Plasmid
7.2. Konjugation, Transduktion, Transformation
3 Mechanismen;
Konjugation (F-Plasmid und relevante Gene/Sequenzen, Donoren, Rezipienten,
Rekombination); Übertragung eines F-Plasmids von einer Donorzelle F+ auf eine Rezipientenzelle
-
F , Kontakt durch Sexpilus, wessen Gene auf dem F-Plasmid kodiert ist, F-Plasmid wird verdoppelt
und übertragen; der Rezipient ist nun ebenfalls ein Donor geworden
Hfr hat das F-Plasmid ins Genom integriert, gleicher Gentransfer, allerdings wird bei der Replikation
mehr des Genoms reproduziert, was mitübertragen wird
Vergleich recA-Abhängigkeit F’ – Hfr-Transfer (Kursexperiment);
Da nicht das ganze F-Plasmid übertragen wird muss es bei der Rezipientenzelle durch Rekombination
erfolgreich ins Genom integriert werden (durch recA)
Transformation (natürliche – künstliche Systeme);
Übertragung von DNA und Integration/eigenständiges Plasmid in der neuen Zelle
Natürlich: S-/R-Bakterien von Griffith
Künstlich: Ca++-Behandlung von Zellen zur Adsorption von DNA, Hitze->Aufnahme DNA
Allgemeine und spezielle Transduktion (Phage P1 – Phage Lambda);
Allgemeine: beliebige chromosomale Gene können übertragen werden (zB Phage 1) Tranduzierende
Phagen entstehen bei fehlerhafter Aufnahme von Bakterien-DNA in neue Phagen
Spezielle:lytischer Zyklus: Phagen-DNA wird injiziert und neue Phagen werden gebildet
Lysogener Zyklus: Phagen-DNA integriert sich in das Bakteriengenom (->Prophage) zB Lambda-P.,
aber nur wenige spezielle Gene können übertragen werden
7
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