Detektion spezifischer T-Zellantworten gegen die Mitose
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin III Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. H. Döhner Detektion spezifischer T-Zellantworten gegen die Mitose-assoziierten Antigene Survivin und Aurorakinase bei der AML Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Stephanie Egenrieder Schwäbisch Gmünd 2011 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Greiner 2. Berichterstatter: PD Dr. Zimmermann Tag der Promotion: 15.06.2012 Für Philipp T. Egenrieder INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1. EINLEITUNG 1 1.1 Akute myeloische Leukämie 1 1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie 1 1.1.2 Diagnostik und Klassifikation der Akuten myeloischen Leukämie 2 1.1.3 Symptomatik und klinischer Verlauf 6 1.1.4 Therapie der Akuten myeloischen Leukämie 7 Immunologische Grundlagen 9 1.2.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex 9 1.2.2 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten 10 1.2.3 Reaktionen des Immunsystems auf neoplastisches Gewebe 11 1.3 Identifizierung Leukämie-Assoziierter Antigene 13 1.4 Immuntherapien bei malignen hämatologischen Erkrankungen 17 1.5 Zielsetzung 19 2. MATERIAL UND METHODEN 20 2.1 Grundausstattungen 20 2.1.1 Allgemeine Laborgeräte 20 2.1.2 Plastikwaren 21 2.2 Chemikalien 22 2.3 Puffer 23 2.4 Zelllinie, Antikörper und Zytokine 24 2.5 Kulturmedien 26 2.6 Peptide 27 2.7 Patienten 27 2.8 Probengewinnung, Zellisolation- und archivierung 28 2.8.1 Probengewinnung 28 2.8.2 Zellisolation und –archivierung 29 HLA-Typisierung der Patientenproben mittels FACS-Analyse 30 1.2 2.9 2.10 Zellseparation und Anlegen einer MLPC 32 I 2.11 ELISPOT- Assay 35 2.12 Statistische Methoden 40 3. ERGEBNISSE 41 3.1 Bestimmung des Oberflächenantigens HLA-A2 mittels FACS-Analyse 41 3.2 Auswahl der verwendeten Peptide 42 3.3 Zelluläre Immunantworten gegen Survivin, Aurorakinase A und B bei 3.4 gesunden Probanden 43 3.3.1 IFN-γ-ELISPOT 44 3.3.2 Granzyme B-ELISPOT 47 Zelluläre Immunantworten gegen Survivin, Aurorakinase A und Aurorakinase B bei AML-Patienten 50 3.4.1 IFN-γ-ELISPOT 51 3.4.2 Granzyme B-ELISPOT 53 4. DISKUSSION 56 4.1 Nachweis einer zellulären Immunantwort gegen die Mitose assoziierten Antigene Survivin, Aurorakinase A und B 56 4.1.1 Detektion spezifischer T-Zellantworten mittels ELISPOT-Assay 57 4.1.2 Unterschiede in der Immunogenität der Epitope bei gesunden Probanden und AML-Patienten 4.2 59 Immuntherapien und Vakzinierungen bei malignen hämatologischen Erkrankungen 60 4.2.1 Peptidvakzinierungsstudien in der klinischen Prüfung 62 4.3 Ausblick 63 5. ZUSAMMENFASSUNG 64 6. LITERATURVERZEICHNIS 65 II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS °C Grad Celsius A. dest. Aqua destillata AB/ AK Antikörper Abb. Abbildung Ag Antigen AML Akute myeloische Leukämie APC Antigenpräsentierende Zelle APL Akute Promyelozyten Leukämie Ara-C Cytarabin ATRA all-trans-retinoic acid BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat bzw. beziehungsweise CBF Core binding factor CD Cluster of differentiation CML Chronisch myeloische Leukämie CMV Cytomegalie Virus CPC chromosome passenger complex CR Komplette Remission CT/CG cancer testis/-germline CTL Zytotoxischer T-Lymphozyt DC Dentritische Zelle d.h. das heisst DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISPOT Enzyme Linked ImmunoSPOT et al. und Mitarbeiter Fa. Firma FAB French-American-British Group Klassifikation FACS Durchflusszytometer/ fluorescence activated cell sorter FCS fötales Kälberserum/ fetal calf serum FITC Fluoresceinisothiocyanat FLT3 fms-related tyrosine kinase 3 III GvHD Graft versus Host disease GvL-Effekt Graft versus Leukemia- Effekt Gy Gray (Einheit) h Stunde HAM Hochdosis Ara-C plus Mitoxantrone HiDAC high dose Ara-C HLA Humanes Leukozyten Antigen/ human leucocyte antigen IAP inhibitor of apoptosis IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin IMP Influenza Matrix Protein INCENP inner centrosome protein inv Inversion ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motifs ITD internal tandem duplication i.v. intravenös KIR killer cell immunoglobulin passenger complex KM Knochenmark KMT Knochenmarktransplantation LAA Leukämie assoziiertes Antigen LAK-Zellen Lymphokin aktivierte Killerzellen MHC Major Histocompatibility Complex/ Haupthistokompatibilitätskomplex µg Mikrogramm µl Mikroliter mg Milligramm ml Milliliter min Minute MDR multi drug resistance MDS Myelodysplastisches Syndrom MLPC Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur/ Mixed lymphocyte peptide culture IV MRD minimal residual disease NBT Nitro- blue- tetrazoliumchloride NK Natürliche Killer-Zelle NOS not otherwise specified NPM Nukleophosmin PB peripheres Blut PBMC periphere Blutmonozyten/ peripheral blood monoclonal cell PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung pH Potentia hydrogenii PR partielle Remission P/S Penicillin/ Streptomycin RHAMM receptor for hyaluronan-mediated motility RIT radioimmunotherapy RT Raumtemperatur sAML sekundäre AML SEREX serological analysis of recombinat cDNA expression libraries SZT Stammzelltransplantation t Translokation TAA Tumor-Assoziiertes Antigen Tab. Tabelle t-AML therapieassoziierte AML TBI total body irradiation TCR T- Zell- Rezeptor TH T-Helferzelle u.a. unter anderem U/min Umdrehungen pro Minute WHO World Health Organisation WT1-Gen Wilms-Tumor-Gen z.T. zum Teil V 1. EINLEITUNG 1. EINLEITUNG 1.1 Akute myeloische Leukämie 1.1.1 Epidemiologie und Ätiologie Die heterogene Gruppe der myeloischen Erkrankungen zeigt ein Malignitätsspektrum, das von langsam fortschreitenden bis hin zu foudroyant tödlichen Verläufen reicht. Dabei werden Leukämien entsprechend ihrem Spontanverlauf als chronisch oder akut bezeichnet. Die akute myeloische Leukämie (AML) ist dadurch charakterisiert, dass die Differenzierung, die Selbsterneuerung und die Proliferation der myeloischen Progenitorzellen im Knochenmark durch somatisch erworbene Aberrationen gestört ist, und folgend durch das Wachstum einer klonalen Population neoplastischer Zellen relativ rasch eine hämatopoetischen Insuffizienz entsteht [19,76,106]. Der AML kommt zudem eine besondere Bedeutung zu, da sie den größten Anteil an akuten Leukämien im Erwachsenenalter ausmacht [42], insgesamt 25% [15,46, 129] und gleichzeitig die geringste Überlebensrate aller Leukämien vorzuweisen hat [15]. Das größte Krebsregister Amerikas, das Surveillance Epidemiology and End Results des National Cancer Institutes, gibt für die Jahre 2003-2007 eine altersadjustierte Inzidenz der AML von insgesamt 3,5/100.000 Einwohnern an. Dabei liegt die Inzidenz in der männlichen Bevölkerung bei 4,3 und in der weiblichen Bevölkerung bei 2,9 [113]. In Deutschland kann die AML-Inzidenz bisher nur abgeschätzt werden, da noch kein einheitliches Krebsregister für Leukämien bei Erwachsenen vorliegt. Die Anzahl der Neuerkrankungen und die Sterblichkeit nehmen mit steigendem Alter zu [15,76], so liegt die Inzidenz bei 30-jährigen noch bei 1,2 Fällen pro 100.000 und bei den 80-jährigen bei über 20 Fällen pro 100.000 Einwohnern. Das mediane Erkrankungsalter liegt bei 70 Jahren [114]. In den meisten Fällen ist die Ätiologie der Erkrankung unklar. Jedoch sind einige Risikofaktoren bekannt, die mit der Entstehung der AML assoziiert sein können (Tabelle 1) [15]. Bei der chemotherapiebedingten AML sind die zwei häufigsten Formen mit der Therapie von Alkylantien und der Therapie von Topoisomerase-IIInhibitoren assoziiert, wobei die sAML (sekundäre AML) nach Alkylantientherapie 1 1. EINLEITUNG nach 5-7 Jahren und die nach Topoisomerase-II-Inhibitoren-Therapie bereits nach 2-3 Jahren auftreten kann [50]. Keiner der aufgeführten Risikofaktoren kann alleine als Ursache für die Entstehung der AML verantwortlich gemacht werden. Vielmehr muss bei der Leukämogenese von einer multifaktoriellen Genese in dafür suszeptiblen hämatopoetischen Progenitorzellen ausgegangen werden. Tabelle 1: Mit AML assoziierte Risikofaktoren [15]. Genetische Störungen: Physikalische und Chemische Expositionen: Down-Syndrom Benzole Klinefelter-Syndrom Pestizide Ataxia teleangiectasia Herbizide Kostman-Syndrom Einbalsamierungsmittel Neurofibromatose Tabakrauch Fanconi Anämie Li-Fraumeni-Syndrom Chemotherapie: Strahlenexposition: Alkylantien Topoisomerase-II-Inhibitoren Nichttherapeutisch Anthrazykline Therapeutisch Taxane 1.1.2 Diagnostik und Klassifikation der Akuten myeloischen Leukämie Es gibt diagnostische Methoden, die bei Verdacht auf eine AML standardmäßig vor Therapiebeginn durchgeführt werden sollten. Dazu gehört an erster Stelle die zytomorphologische Untersuchung von Ausstrichpräparaten des peripheren Blutes und des Knochenmarks. Für die Diagnose der AML müssen mindestens 20% Blasten in den Ausstrichen vorliegen [18]. Bei jeder neu zu Immunphänotypisierung diagnostizierenden vorgenommen AML sollte werden. des Dazu Weiteren werden eine mittels Multiparameter-Flowzytometrie, d.h. mit mindestens 3-4 farbiger Markierung, die Oberflächenantigene der Zellen bestimmt, um eine Zelllinienzugehörigkeit auszumachen. Besonderen Stellenwert bekommt diese Methode bei undifferenzierten Leukämien, die anhand ihrer Morphologie oder ihrer Zytochemie keiner Zelllinie zugeordnet werden können. Einen weiteren wichtigen Stellenwert hat dieser diagnostische Schritt bei der Überwachung einer MRD (minimal residual 2 1. EINLEITUNG disease), da auch bei geringen Blastenzahlen die neoplastischen Zellen anhand ihrer charakteristischen Oberflächenantigene identifiziert werden können. Bei ungefähr 55% der Leukämien im Erwachsenenalter liegen chromosomale Aberrationen vor. Da diese Veränderungen die Prognose der AML mit am stärksten beeinflussen (Tabelle 2), ist auch die zytogenetische Untersuchung ein obligatorischer Bestandteil der AML-Diagnostik. Für diese Untersuchungen werden mindestens 20 Metaphasezellen benötigt. Tabelle 2: Prognose der AML in Abhängigkeit des zytogenetischen Befundes für Patienten unter 55-60 Jahren [22,23,30]. t=Translokation, inv=Inversion Prognostisch günstige Gruppe beinhaltet ~20% der Fälle ≤60 Jahre leukämische Blasten mit t(15;17), t(8;21) oder inv(16) t(15;17) hat ein Heilungsrate von 85%, t(8;21) und inv(16) von 50%; bei älteren Patienten kommen diese günstigen Aberrationen seltener vor Prognostisch intermediäre Gruppe Prognostisch ungünstige Gruppe mittleres Rezidivrisiko ~15% der 15- bis 60-jährigen leukämische Blasten haben normalen Karyotyp oder zytogenetische Aberrationen, welche nicht in den anderen beiden Gruppen definiert sind leukämische Blasten mit den zytogenetischen Aberrationen: >2 Chromosomen betroffen, Monosomie 5 oder 7, del5q, Aberrration in 3q → die Aberrationen kommen bei älteren Patienten oder sAML häufiger vor → unter den jüngeren Patienten liegt die 5-Jahres Überlebswahrscheinlichkeit <5% Innerhalb einer solchen Gruppe verschlechtert sich die Prognose eines AMLPatienten unter Standardtherapie mit zunehmendem Alter [25,106]. Die enormen Fortschritte im Bereich der molekulargenetischen Diagnostik haben zu einem besseren Verständnis der molekularen Pathogenese der Leukämien geführt, so wie auch zur Beschreibung zahlreicher, den Krankheitsverlauf bestimmenden spezifischen Mutationen. Dies veranlasste die WHO zur Überarbeitung der AML-Klassifikation. In der Version von 2008 (Tabelle 3) werden die Subtypen dieser Leukämie nicht nur durch klinische Merkmale und ihre Zytogenetik definiert, sondern auch durch ihre molekulargenetischen Aberrationen. 3 1. EINLEITUNG Tabelle 3: Kategorien der AML mit zugehörigen Vorläuferneoplasien und akute Leukämien unklarer Abstammung (modifiziert nach der WHO-Klassifikation von 2008) [18]. AML=akute myeloische Leukämie, APL= Akute Promyelozyten Leukämie, t=Translokation, inv=Inversion, NPM= Nukleophosmin, CEBPA= CCAAT/enhancer-binding protein alpha AML mit regelmäßig auftretenden genetischen Aberrationen ● AML mit t(8;21)(q22;q22) ● AML mit inv(16)(p13.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22) ● APL (Akute Promyelozyten Leukämie) mit t(15;17)(q22;q12) ● AML mit t(15;17)(p22;q23) ● AML mit t(6;9)(p23;q34) ● AML mit inv(3)(q21q26,2) ● AML (megaloblastär) mit t(1;22)(p13;q13) ● Vorläufige Entität: AML mit NPM1-Mutation ● Vorläufige Entität: AML mit CEBPA-Mutation AML mit Myelodysplastischem Syndrom assoziierten Veränderungen Therapie assoziierte myeloische Neoplasien Nicht anders klassifizierte AML Die Anzeichen sprechen immer mehr dafür, dass die beiden NPM1- und CEBPAMutationen zu den so genannten Klasse-II-Mutationen gehören, d.h. es sind primäre genetische Läsionen, die die hämatopoetische Differenzierung direkt beeinträchtigen. Mutationen im FLT3-Gen kommen dagegen in unterschiedlichen AML-Subtypen vor und stellen deshalb keine eigene Subgruppe dar. Es handelt sich bei diesen Mutationen um Klasse-I-Mutationen. Mutationen dieser Art verschaffen ihren Zellen einen Proliferations- oder Überlebensvorteil. NPM1 (Nukleophosmin)-Mutationen stellen die genetische Veränderung dar, die bei erwachsenen AML-Patienten am häufigsten vorkommt. In normalen Karyotypen kommt sie in 45-64% vor, in allen Fällen der AML zu 25-35%. Durch Mutationen kommt es zum Verlust der Bindungsfähigkeit von NPM1 an die Nucleoli der Zellen, wodurch es zu einer übermäßigen Translokation des Phosphoproteins in das Zytoplasma kommt. NPM1-Mutationen sind generell mit einem guten Ansprechen auf die Induktionschemotherapie verbunden. "NPM1 4 1. EINLEITUNG ohne FLT3-ITD" Genotypen sind zudem mit gutem Rezidivfreien- und Gesamtüberleben assoziiert [19,99]. FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3)-Mutationen können zu einer konstitutionellen Aktivierung dieses Rezeptors führen. Üblicherweise ist dabei eine der beiden funktionellen Domänen des Rezeptors betroffen, der juxtamembranöse (JM) Teil oder die Tyrosinkinase (TKD). Durch "internal tandem duplications" (ITD) in der JM-Domäne verliert der Rezeptor seine Fähigkeit zur Autoinhibition, eine Mutation die in 28-34% der Fälle mit normalem Karyotyp vorkommt. Studien haben gezeigt, dass eine AML mit normalem Karyotyp und FLT3-ITD Mutation schlechtere Chancen hat, als eine AML ohne diese Mutation. Somatisch erworbene Mutationen wie NPM1 oder FLT3 haben eine höhere Prävalenz in normalen Karyotypen, kommen aber auch in AML-Erkrankungen mit abnormalem Karyotyp vor (Abbildung 1) [19]. Abbildung 1: Zytogenetische Subgruppen der AML und damit auftretende molekulargenetische Aberrationen, aus: Döhner, K. et al. Haematologica 2008;93:976-982 [19].NPM= Nukleophosmin, CEBPA= CCAAT/enhancer-binding protein alpha, RAS= Rat sarcoma, FLT= fms-related tyrosine kinase Neben den zytogenetischen und molekulargenetischen Veränderungen, die die Prognose einer AML beeinflussen, gibt es noch andere Sachverhalte, die den Verlauf einer solchen Leukämie bestimmen können. So gelten einer AML vorangegangene Chemotherapien oder vorangegangene hämatologische 5 1. EINLEITUNG Störungen, wie z.B. ein MDS (Myelodysplastisches Syndrom) oder ein länger als drei Monate andauerndes Intervall einer Zytopenie, als prognostisch ungünstige Faktoren [76,106]. Gleiches gilt für erhöhte Leukozytenzahlen bei Diagnosestellung, so ist die Leukozytenzahl bzw. die Anzahl zirkulierender Blasten umgekehrt proportional zur Remissionsrate. Erhöhte Lactatdehydrogenase-Werte im Serum werden bei Diagnosestellung ebenfalls als ungünstiger Faktor angesehen [106]. Das Alter des Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung gilt als einer der wichtigsten prognostischen Faktoren zur Erlangung einer vollständigen Remission bzw. dem Überleben [30]. Ein Grund hierfür ist unter anderem das schlechtere Ansprechen der leukämischen Blasten älterer Patienten gegenüber bestimmten Chemotherapeutika. Die Leukämiezellen dieser Patientengruppe exprimieren häufiger das MDR1 (multi drug resistance)-Gen, welches für ein Protein kodiert, das zahlreiche lipophile Komponenten aktiv aus dem Zellinneren schafft, so auch chemotherapeutische Medikamente wie Anthrazykline [25]. 1.1.3 Symptomatik und klinischer Verlauf Das klinische Bild und die Symptome der AML werden durch den Grad der Verdrängung der Hämatopoese im Knochenmark bestimmt. Diese kann zum Beispiel schleichend oder akut zu einer normochromen, normozytären Anämie, einer Leukozytose, einer Leukopenie, Leukozytenfehlfunktionen und einer Thrombopenie führen. Dementsprechend klagen die Patienten zunächst häufig über unspezifische Symptome wie Müdigkeit, Dyspnoe, Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust, Fieber und Zeichen einer gestörten Hämatopoese, wie etwa Petechien oder einer gestörten Blutstillung [15,76]. Hierbei kann es auch zu klinisch manifesten gastrointestinalen, intrapulmonalen oder intracerebralen Blutungen kommen. Eine leukämische Infiltration des extramedullären Gewebes mit leukämischen Blasten kann zur Hepato- und Splenomegalie führen, aber auch eine Infiltration der Haut ist möglich [76]. Diese Manifestationsformen sind typisch für monozytäre Subtypen der AML [16]. Initialsymptome wie Knochenschmerzen, Lymphknotenschwellung, unspezifischer Hustenreiz oder Kopfschmerzen treten seltener auf. Eine unbehandelte AML nimmt ausnahmslos einen tödlichen Verlauf. 6 1. EINLEITUNG Bei entsprechender Supportivtherapie können die Patienten zwischen 11-20 Wochen überleben, sterben letztendlich aber an den Komplikationen des Versagens des hämatopoetischen Systems [15]. Eine möglichst rasche diagnostische Abklärung und die anschließende adäquate Therapie sind daher unerlässlich. 1.1.4 Therapie der Akuten myeloischen Leukämie Patienten mit neu diagnostizierter AML werden in aller Regel einem zweiphasigen Therapieplan zugeführt. Das Ziel der ersten Phase, der Induktionsphase, ist es, eine komplette Remission (CR) zu erreichen. In der zweiten Phase, der Konsolidierungsphase, soll die Überlebenszeit der Patienten verlängert werden, indem alle noch vorhandenen leukämischen Zellen vernichtet werden und somit das Risiko eines Rezidivs minimiert wird [76]. 60-80% der jungen Patienten erreichen mit einer gängigen Standardtherapie eine vollständige Remission. Allerdings haben nur 20-30% eine längerfristige krankheitsfreie Überlebenszeit. Die meisten Patienten versterben innerhalb der ersten zwei Jahre nach Erreichen einer CR. Über 60-jährige erreichen nur zu 40-55% eine komplette Remission [106]. In den letzten Jahren bestand die Induktionstherapie aus dem üblichen "3+7" Regime. Dieses setzt sich zusammen aus 3 Tagen an denen ein Anthrazyklin, z.B. Daunorubicin oder Idarubicin verabreicht wird, und 7 Tagen an denen dem Patienten kontinuierlich und intravenös Cytarabin (AraC) verabreicht wird. Für Cytarabin gelten die Standarddosen zwischen 100-200 mg/m² [18] und für Daunorubicin mindestens 60mg/m²/d. Mit zunehmendem Wissen über die molekulare Pathogenese der AML und ihrer Prognose, wächst das Bestreben nach gezielten, neuen individuellen Behandlungsansätzen. Diese genotypspezifischen Therapiekonzepte werden derzeit in mehreren klinischen Studien untersucht. Ein Beispiel für eine solch gezielte Therapie ist die Therapie von Patienten mit FLT3 Mutation. Patienten, die jünger als 60 Jahre sind werden im Rahmen der CALGB 10603-Studie behandelt. Das Therapiekonzept dieser randomisierten 7 1. EINLEITUNG Doppelblindstudie besteht in einer Induktionstherapie mit Daunorubicin (DNR), Ara-C und Midostaurin, bzw. aus DNR, Ara-C und einem Placebopräparat. Midostaurin hemmt unter anderem die FLT3-Tyrosinkinase. Es folgen vier Zyklen der Konsolidierung mit HiDAC (High Dose Ara-C) und Midostaurin bzw. dem Placebopräparat. Zur Erhaltungstherapie bekommen die Patienten der Placebogruppe weiterhin das Placebo, sowie die Patienten der anderen Gruppe weiterhin Midostaurin erhalten. Die Therapie für über 60-jährige wird in der AMLSG10-07 Studie erprobt. Hierbei erhalten die Patienten zur Induktion DNR, Ara-C und Sutent. Sutent (Sunitinib) inhibiert ebenfalls u.a. die Rezeptor- Tyrosinkinase. Zur Konsolidierung verwendet man HiDAC und Sutent, zur Erhaltungstherapie Sutent. Patienten mit NPM1 Mutation werden im Rahmen der AMLSG 09-09 Studie therapiert. Die Induktionstherapie besteht hierbei aus 2 Zyklen ATRA (all-transretinoic acid) und ICE (Idarubicin, Cytarabin und Etoposid) +/- GO (Gemtuzumab Ozogamicin). Es folgt 1 Zyklus ATRA und Ara-C +/- GO und weitere 2 Zyklen ATRA plus Ara-C für beide Gruppen. Im Rahmen der AML HD98-B Studie konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer NPM1-Mutation ohne FLT3-ITD unter der Therapie mit ATRA ein signifikant besseres Outcome hatten, als die Patienten, die kein ATRA erhielten [100]. GO ist ein humanisierter anti-CD33 Antikörper, der mit dem zytotoxischen Calicheamicin konjugiert ist. Nachdem der Antikörper an das CD33-Antigen CD33-positiver leukämischer Zellen gebunden hat, wird das Toxin internalisiert und führt zum Untergang der CD33-tragenden Zellen. Die hohe CD33-Expression ist ein Kennzeichen der NPM1-mutierten leukämischen Zellen [75]. Die hier aufgeführten Studienprotokolle spiegeln die Tatsache wider, dass die Entstehung einer Leukämie ein mehrstufiger Prozess ist, und die Therapie deshalb auf mehreren Ebenen ablaufen sollte. So wird das Ausschalten einer einzelnen Mutation in aller Regel nicht zum gewünschten Therapieerfolg führen, kann jedoch in Kombination mit adäquater zytostatischer Therapie den Therapieverlauf positiv beeinflussen. Es muss daher von großem Interesse sein, neue Strukturen zu identifizieren, gegen die gezielte Therapien entwickelt werden können. Ein viel versprechendes Feld stellen hierfür die Immuntherapien dar. 8 1. EINLEITUNG 1.2 Immunologische Grundlagen 1.2.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex Bei der zellulären Immunantwort gegen autologe und allogene Körperzellen spielen CD8+ T-Lymphozyten eine zentrale Rolle. Sie erkennen und reagieren auf Antigene die ihnen auf MHC (Major Histocompatibility Complex)-I-Molekülen von entsprechenden Körperzellen präsentiert werden. Diese MHCs, synonym auch HLA (Humanes Leukozyten Antigen) oder Haupthistokompatibilitätskomplex dienen in diesem Zusammenhang der Antigenpräsentation intrazellulärer, zytoplasmatischer Antigene [21,34]. In den 1950er Jahren gelang Jean Dausset durch serologische Untersuchungen die Identifizierung des MHC. Er konnte zeigen, dass es beim Menschen mindestens sechs verschiedene Alloantigene gibt, die alle im selben Genlokus auf Chromosom 6 kodiert sind und für die Abstoßung von Spenderleukozyten verantwortlich waren. Ende der 60er Jahre immunisierte McDevitt kongene Mausstämme mit einfachen unterschiedlichen Antigenen. Das Resultat seiner Versuche war, dass der Haplotyp im MHC bestimmt ob ein antigenes Epitop immunogen wirkt oder nicht bzw. ob das entsprechende Antigen überhaupt stabil präsentiert werden kann. MHC-I-Moleküle kommen auf der Zelloberfläche von praktisch allen kernhaltigen Körperzellen vor [34], die man auch als herkömmliche antigenpräsentierende Zellen bezeichnen könnte. Antigene, die auf den Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, können nur von CD8+T-Zellen, sogenannten zytotoxischen T-Zellen (CTL), erkannt werden. Ein MHC-I besteht aus drei zusammenhängenden Domänen in Kombination mit dem β2-Mikroglobulin. Die Gensequenzen für diese drei Domänen liegen in der Klasse-I-Region auf Chromosom 6. Es liegen immer drei Hauptantigene vor: HLA-A, HLA-B und HLA-C, die en-bloc einmal von der Mutter und einmal vom Vater auf die Nachkommen vererbt werden. Jedes Individuum hat folglich sechs Allele für seine MHC-I-Moleküle. Die Wahrscheinlichkeit unter Geschwistern einen identischen MHC-I-Haplotyp zu besitzen, beträgt 25%. Neben den MHC-I-Molekülen gibt es auch die MHC-IIMoleküle. Diese Moleküle werden auf spezialisierten antigenpräsentierenden 9 1. EINLEITUNG Zellen wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert. Die den Molekülen zu Grunde liegende Gensequenzen befinden sich ebenfalls auf Chromosom 6 in der Klasse-II-Region. Die auf MHC-II-Molekülen präsentierten Antigene können nur von CD4+ T-Zellen, sogenannten T-Helferzellen (TH), erkannt werden [20]. 1.2.2 Antigenerkennung und Aktivierung von T-Lymphozyten Die T-Zelle gilt als einer der Hauptakteure in der Immunantwort des Menschen. Durch die Rezeptoren der T-Zelle werden Peptidantigene, welche von MHCs auf antigenpräsentierenden Zellen dargeboten werden, spezifisch erkannt. Durch den Kontakt MHC-assoziierter Peptide und T-Zell-Rezeptoren (TCR) kommt es zu einer Aktivierung der T-Zelle [49]. Ein TCR-Komplex kann aber nur dann optimale Signale weiterleiten, wenn er an seine Co-Rezeptoren CD4 oder CD8 bindet. TH-Zellen, die auf MHC-II beschränkt sind, exprimieren CD4. T-Lymphozyten, die auf MHC-I beschränkt sind, exprimieren CD8 als Corezeptor. Corezeptoren binden wie der TCR selbst den MHC/Peptid-Komplex, und ermöglichen damit eine leichtere und schnellere Aktivierung der T-Zelle. Der TCR besteht aus zwei antigenbindenden Anteilen, der TCRα- und der TCRβ- Kette. Zusätzlich zu diesen hochvariablen Heterodimeren wird der TCR durch mehrere unterschiedliche akzessorische Ketten ergänzt. Diese werden benötigt, um den TCR an die Zelloberfläche zu transportieren und um die Signaltransduktion auszulösen, sobald die Rezeptoren an einen MHC/Peptid-Komplex binden. Die invarianten Anteile werden immer aus dem CD3-Komplex sowie der ζ-Kette, welche als Homodimer zytoplasmatisch lokalisiert ist, gebildet. Die CD3-Proteine besitzen in ihren zytoplasmatischen Anteilen eine einzelne ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs). Die ζ-Kette weist nur einen kurzen extrazellulären Anteil auf, beinhaltet in ihrem zytoplasmatischen Anteil jedoch drei ITAMs [54]. Hat ein Lymphozyt sein spezifisches Antigen erkannt, kommt es als erstes zu einer Phosphorylierung der Tyrosinreste in den ITAMs. Bindet z.B. CD8 an MHC-I, assoziiert die Kinase Lck, welche konstitutiv 10 1. EINLEITUNG mit der zytoplasmatischen Domäne der Corezeptoren CD4 und CD8 verbunden ist, zytoplasmatisch mit den ITAMs und phosphoryliert diese. Erst wenn die ITAMs der ζ-Kette phosphoryliert sind, bindet daran die ZAP-70-Kinase, welche ebenfalls von der CD8 assoziierten Lck phosphoryliert wird. Die nun aktivierte ZAP-70Tyrosinkinase phosphoryliert wiederum zwei weitere Proteine, LAT und SLP-76. In den sich anschließenden Schritten wird das Antigen-Signal von der Zellmembran so dem Zellkern übermittelt. Hier induzieren die aktivierten Transkriptionsfaktoren NFκB, NFAT und Ap-1 eine spezifische Gentranskription, die zur Proliferation und Differenzierung der T-Zelle führt [108]. 1.2.3 Reaktionen des Immunsystems auf neoplastisches Gewebe Die Rolle des Immunsystems bei der Tumorentstehung bzw. des Tumorwachstums konnte erstmals an immundefizienten Mäusen beschrieben werden. Es wurde beobachtet, dass diese Tiere eine höhere Inzidenz an spontan entstandene oder durch Chemikalien induzierte Neoplasien aufwiesen [89]. Für ein funktionierendes Immunsystem gibt es grundsätzlich zwei Möglichkeiten, auf neoplastische Zellen zu reagieren. Es kann eine Abwehr gegen Tumorspezifische-Antigene, d.h. Antigene die nur in neoplastischen Zellen vorkommen ablaufen, oder die Abwehr kann sich gegen Tumor-assoziierte-Antigene richten. Tumor-assoziierte- Antigene sind Antigene, die in normalen und in neoplastischen Zellen auf unterschiedliche Art und Weise exprimiert werden [39]. So wird z.B. die Aurorakinase A, ein Mitglied der Serin/Threonin Kinasen-Familie, u.a. bei AMLErkrankungen überexprimiert, ist jedoch im gesunden Menschen nur in den Testes und im Thymus nachweisbar [87]. Solch überexprimierten Proteine werden genauso wie Proteine gesunder Zellen durch Proteasomen gespalten und präsentiert. Der Untergang neoplastischer Zellen ermöglicht es, dass APCs diese Proteine aufnehmen, und sie neben MHC-I auch auf MHC-II-Molekülen präsentieren [27]. Die Präsentation auf MHC-I führt so zu einer Ausreifung von CD8+ CTLs, die in der Lage sind neoplastische Zellen, welche ebenfalls das entsprechende Antigen auf MHC-I darbieten, zu lysieren. Antigene, die auf MHC-II präsentiert werden, führen letztendlich zu einer Aktivierung CD4+ Zellen. Die so aktivierten TH-Zellen können 11 1. EINLEITUNG sowohl die Proliferation und Differenzierung von CTLs, als auch die von B-Zellen stimulieren. Dies ermöglicht neben einer zytotoxischen Lyse neoplastischer Zellen auch eine antikörpervermittelte Lyse (siehe Abbildung 2). Das Ziel der Immuntherapie ist es daher, durch eine Vakzinierung mit einem entsprechenden Antigen eine tumorspezifische Immunantwort auszulösen oder sie zu verstärken [118]. Freisetzung der TAAs durch die Tumorzelle Phagozytose der TAAs, proteasomale Spaltung und MHC-Präsentation Aktivierung + der CD8 Zelle über TCR + Aktivierung der CD4 Zelle über TCR Aktivierung der B-Zelle und AKProduktion Direkte Lyse durch CTL AK-vermittelte Zelllyse _________________________________________________________________ Abbildung 2: Schematische Übersicht der Immunabwehr gegen eine neoplastische Zelle. Die antigenpräsentierende Zelle (APC) kann die TAAs (Tumor-assoziierte Antigene) phagozytieren und auf MHC(Major Histocompatibility Complex)-I und MHC-II präsentieren. Über MHC-I werden naive + CD(Cluster of differentiation)8 T-Zellen zur CTL(zytotoxischer T-Lymphozyt)-Differenzierung + stimuliert. Über MHC-II werden CD4 Zellen aktiviert, so können auch ausdifferenzierte B- Lymphozyten über den indirekten Weg neoplastische Zellen lysieren. 12 1. EINLEITUNG 1.3 Identifizierung Leukämie-Assoziierter Antigene Kommt es zu einer malignen Transformation auf zellulärer Ebene, so führt dies zu einem veränderten Expressionsmuster der betroffenen Zelle. Neben einem Verlust von Oberflächenantigenen, kann es auch zu einer Überexpression von Proteinen bzw. Antigenen kommen. Diese proteinogenen Strukturen, die in neoplastischen Zellen exprimiert bzw. präsentiert werden, bezeichnet man als Tumor- assoziierte Antigene (TAA). Handelt es sich um TAAs im Rahmen einer leukämischen Erkrankung, so spricht man von Leukämie- assoziierten Antigenen (LAA). Eine viel versprechende Gruppe solcher LAAs sind die Cancer-Testis/-Germline (CT/CG)Antigene. Hierbei handelt es sich um Antigene, welche in diversen Tumorentitäten exprimiert werden, jedoch in gesunden Zellen mit der Ausnahme von Trophoblasten und Keimzellen testikulären Ursprungs nicht zu finden sind. Da diese letztgenannten Zellen jedoch keine MHC-I Moleküle auf ihrer Zelloberfläche tragen, führt die CT/CG-Antigenexpression auch in Tumorpatienten nicht zu einer Immunreaktion gegen die Trophoblasten und Keimzellen testikulären Ursprungs. Diese Tatsache verleiht den CT/CG- Proteinen die Eigenschaft tumorspezifisch und damit ein geeignetes Ziel einer Immuntherapie zu sein [45]. Um eine antigenspezifische Immuntherapie entwickeln zu können, hat man bereits Anfang der 70er Jahre begonnen, TAAs von Melanom- und NierenzellkarzinomPatienten mittels CTL- Klonierungstechniken zu identifizieren [120,93,41]. Es gelang hierbei, mittels TAAs spezifische cytotoxische T-Lymphozyten zu aktivieren, welche dann die TAA- exprimierenden Tumorzellen in vitro und in vivo erkennen und lysieren konnten [60,112]. Die Existenz von Leukämie- assoziierten Antigenen sah man darin begründet, dass im Therapieverlauf nach allogener Stammzelltransplantation eine gesteigerte spezifische T-Zell-Antwort gegen leukämische Blasten nachgewiesen werden konnte [85]. Die Identifizierung Leukämie- assoziierter Antigene läuft nach wie vor über die Klonierung von spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten ab. Weitere Verfahren stellen die Massenspektrometrie und die SEREX- Methode dar [47]. Die SEREX- Methode, serological analysis of recombinat cDNA expression libraries, wurde 1995 von Sahin et al. etabliert, und beruht darauf, dass IgGs aus autologen Patientenseren spezifische Tumorantigene erkennen. Mithilfe dieser Methode konnten bereits 13 1. EINLEITUNG mehr als 2000 unterschiedliche Tumorantigene aus über 15 verschiedenen Tumorentitäten entdeckt werden [70]. Unter den identifizierten Antigenen sind Leukämie- assoziierte Antigene zu nennen, welche in AML- Patienten spezifische T-Zellantworten induzieren können. Diverse Epitope dieser Antigene sind in der Lage, eine Zelllyse der autologen leukämischen Blasten durch spezifische cytotoxische T-Lymphozyten zu induzieren [43,46, 63,122,123]. So wurde zum Beispiel mit RHAMM ein LAA identifiziert, welches als Rezeptor der Hyaluronsäure- vermittelten Motilität eine grundlegende Rolle im Ablauf der Mitose spielt und dadurch entscheidend Einfluss auf die Zellproliferation der Tumorzelle nimmt [42]. Es ist in 70% aller AML- Patienten zu detektieren [41]. Die TumorImmunology-Group der Universität Ulm konnte für dieses LAA die Induktion sowohl von CD4-Zellen als auch von CD8-Zellen nachweisen [43]. Mit dem PRAME- Antigen gelang die Identifikation eines LAAs, welches bedeutenden Einfluss auf die Differenzierung einer Zelle nimmt. Prame bindet an den Retinsäure-Rezeptor in Anwesenheit der Retinsäure und unterbindet so die Transkription der Gene, welche die Differenzierung einer Zelle und den Zellzyklusarrest induzieren würden [42]. Dieses LAA ist in etwa 64% der AMLPatienten zu detektieren [44,63]. Für WT-1, ein LAA das die Zelldifferenzierung von gesunden hämatopoetischen Stammzellen und auch von leukämischen Blasten inhibiert [107], werden Expressionfrequenzen in AML- Patienten von 67%, 77% und 89% beschrieben [4,44, 88]. Die LAAs Proteinase 3, welches in 67% [44] der AML-Patienten zu finden ist und das in 100% [13] der AML-Patienten vorkommende Survivin werden zu den Apoptose assoziierten LAAs gerechnet. Letztgenanntes ist das kleinste Mitglied der IAP (inhibitor of apoptosis)-Familie [116], und auf Chromosom 17q25 lokalisiert. In adulten Zellen gesunder Menschen wird Survivin ausschließlich im Thymus, in der Plazenta, in CD34+ Stammzellen und in basalen Epithelzellen exprimiert. Survivin fungiert als eines der Schlüsselmoleküle der Mitoseregulation und des programmierten Zelltods. Man weiß, dass das Protein sowohl die Caspase-9 inhibieren kann, als auch den Checkpoint der Mitosespindeln reguliert, Angiogenese fördert und eine gewisse Chemoresistenz vermittelt. Die Survivin Expression, die ihren Höhepunkt während der G2/M-Phase findet, wird durch den p53-Wildtyp unterdrückt [84], in AMLZellen jedoch wird sie z.B. durch hämatopoetische Zytokine hochreguliert [11]. Die Deletion von Survivin reduziert Wachstumsfaktor-unabhängige Zellproliferation 14 1. EINLEITUNG und erhöht die Apoptoserate [33]. Damit stellt dieses Antigen ein potentielles Ziel einer Immuntherapie dar. Wobser et al. gelang 2005 erstmalig durch Vakzinierung mit einem von Survivin abstammenden Epitop eine komplette Remission hepatischer Filiae bei einem Patienten mit Pankreaskarzinom [125]. Die Aurorakinasen Threoninkinasen. A und Die B sind katalytischen während Domänen der Mitose dieser aktive Serin-/ Proteine haben untereinander eine Homologie von 70% [77]. Die Aurorakinase A wurde 1997 von Sen et al. entdeckt [102]. Ihr Gen liegt auf Chromosom 20q13.2 [77], und wird in sich häufig teilenden Geweben verstärkt exprimiert, so z.B. in Thymus- oder in testikulärem Gewebe [38]. Der Gipfel der Aurora A mRNA-Expression, sowie die höchste nachzuweisende Kinasenaktivität, ist typischerweise am Übergang von der G2- zur M-Phase der Mitose zu detektieren [38]. Von der frühen Prophase bis zur Telophase befindet sich Aurora A am Centrosom, für dessen Reifung sie zuständig ist, sowie von der Pro- bis zur Anaphase an den Mikrotubuli der Spindelpole [38,64,128], um hier für eine korrekte Ausbildung des bipolaren Spindelapparates zu sorgen (Abbildung 3) [8,87]. Durch Injektionen von blockierenden Antikörpern gegen Aurora A in synchronisierte Zellen die bereits die G2-Phase passiert hatten, konnte eine Vielfalt an mitotischen Defekten ausgelöst werden, wie z.B. falsch ausgerichtete Chromosomen, fehlerhafte Zytokinese oder multipolare Spindelapparate [37,81]. Nach der Entdeckung von Aurora A konnte Sen et al. zeigen, dass die Kinase in maligne verändertem Mammagewebe häufig überexprimiert wird [102]. In den folgenden Jahren gelang es mehreren Arbeitsgruppen die Überexpression von Aurora A in diversen weiteren Tumorentitäten nachzuweisen [,55,73,126]. Ochi et al. konnten durch ihre Studien nachweisen, dass Aurora A auch in leukämischen Zellen, v.a. der CML, überexprimiert wird. Aurora A-spezifische CTLs konnten leukämische Zellen, HLA A2-abhängig, jedoch keine gesunden Zellen lysieren [87]. Aurora B liegt als katalytische Komponente in einem Komplex mit Survivin [124], Borealin [35] und INCENP (inner centromere protein) [6] vor. Gemeinsam bilden sie den CPC (chromosome passenger complex). Fehlt eines der Bausteine, so führt dies zu einer Dislokation der übrigen Bestandteile [7]. Die jeweilige Lokalisation des Komplexes korreliert mit seiner Funktion. So liegt er zu Beginn der Mitose entlang der DNA, wo er durch die Phosphorylierung spezifischer Histone für die Kondensations des Chromatins sorgt [8]. Während der 15 1. EINLEITUNG Prometaphase wandert der Komplex von den Armen der Chromosomen zu den centromeren Regionen. Hier sorgt er für die korrekte Anlage der Mikrotubuli an die Kinetochoren. Während der Meta- und Anaphase nimmt der CPC Einfluss auf die Zytokinese, wo er am Aufbau der Zellteilungsspindeln beteiligt ist (Abbildung 3) [117]. Eine Überexpression des auf Chromosom 17p13.1 lokalisierten Proteins findet man in verschiedenen Tumoren, häufig auch mit gleichzeitiger Überexpression der Aurora A [36]. A. Pro- Prometa- Meta- Ana- Telophase Zytokinese B. Reifung des Zentrosoms und Trennung, Eintritt in Mitose Ausbildung bipolarer Spindelapparat C. Kondensation der Chromosomen Korrektur fehlerhafter Anlagerungen Lokalisation im Zentrum des Spindelapparates Abbildung 3: Lokalisation und Funktion der Aurorakinasen A und B während der Mitose. A.: Schema der Mitosephasen, B.: Lokalisation und Funktion der Aurorakinase A, C: Lokalisation und Funktion der Aurorakinase B. In blau dargestellt ist die DNA, in rot die jeweilige Aurorakinase und in grün α-Tubulin. Modifiziert nach: Boss et al., The Oncologist 2009; 14: 780-793 [8] 16 1. EINLEITUNG 1.4 Immuntherapien bei malignen hämatologischen Erkrankungen Kommt es unter der Standardtherapie bestehend aus Chemotherapie mit oder ohne Stammzelltransplantation zu einem Rezidiv, oder liegt eine therapierefraktäre Erkrankung vor, verringern sich die Überlebenschancen der AML-Patienten drastisch. Deshalb bedarf es zusätzlicher Therapieoptionen, v.a. zur Behandlung der MRD. Mit der Entdeckung der LAAs konnte der Grundstein zu einer aktiven Immuntherapie gelegt werden. Ihr Ziel ist die Immunisierung der Patienten mit LAA-Epitopen, und eine dadurch gerichtete zytotoxische Abwehr der Patienten gegen ihre, die spezifischen Epitope präsentierenden Tumorzellen. Eine zweite Form der Immuntherapie stellt die passive Immunisierung dar. Sie basiert auf der Gabe von Antikörpern, T- oder NK-Zellen. Der Patient erhält so eine bereits in vitro erzeugte Immunität, die dann in vivo spezifisch und effektiv leukämische Zellen vernichten kann [109]. Eine der passiven Immuntherapien stellt die Behandlung mit monoklonalen Antikörpern dar. Ziel dieser Therapie ist es, die Antikörper spezifisch an die Oberfläche leukämischer Zellen zu binden. Daraufhin folgt eine AK-abhängige Zytotoxizität oder eine Aktivierung des Komplementsystems. Solche Antikörper können nativ oder mit radioaktiven Substanzen oder Medikamenten gekoppelt, verabreicht werden [86]. Anfang der 90er Jahre wurde von Porter et al. eine weitere Methode der passiven Immuntherapie eingeführt: die Infusion von Spenderlymphozyten für die Behandlung von AML-Patienten nach stattgehabter KMT, die ein Rezidiv erlitten haben [92]. Die Spenderlymphozyten sollen für eine Verstärkung des graft-versus-leukemia Effekt sorgen. Einer der Hauptnachteile dieses Verfahrens ist eine mögliche Reaktion der Spenderleukozyten gegen gesunde Zellen des Empfängers, d.h. der Entwicklung einer graft-versus-hostdisease (GvHD). Ziel muss es daher sein, nur solche Lymphozyten zu transfundieren, welche spezifisch gegen ein bestimmtes LAA gerichtet sind, und somit das Risiko einer GvHD zu minimieren. Eine Möglichkeit hierfür ist die Identifikation und Infusion von spezifischen allogenen oder autologen T-Zellen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, für hochaffine TCRs kodierende Gene aus entsprechenden T-Zellen zu isolieren. Die so gewonnene DNA kann folgend für Transfektionen von T-Zellen und anschließender Infusion in den Patienten dienen 17 1. EINLEITUNG [111]. Die Transfusion von alloreaktiven NK-Zellen stellt eine weitere Methode zur passiven Immunisierung dar. Das Wirkprinzip dieser Methode besteht darin, dass NK-Zellen eines Donors über einen Mismatch ihrer KIRs (killer cell immunoglobulin like receptors) und der fehlenden MHC I-Molekülen des Spenders auf Zellen des Patienten, aktiviert werden [97]. Diese Aktivität der NKs wurde in klinischen Studien mit AML Patienten erprobt. Es zeigte sich, dass dadurch bei Empfängern eines haploidentischen Knochenmarktransplantats das Risiko eines Rezidivs reduziert werden kann [71]. Im Gegensatz zur passiven Immuntherapie steht die aktive Therapie. Mit Interleukin-2 hat man ein Zytokin gefunden, welches sowohl die Proliferation als auch die Aktivierung von T- und NK-Zellen induzieren kann. Das Zytokin wurde als nichtspezifisches, aktives Immuntherapeutikum in diversen Studien auf seine antileukämische Wirksamkeit getestet. Unter hochdosierter IL-2 Therapie konnte ein signifikanter Anstieg aktivierter T- und NK-Zellen bei Patienten mit rezidivierter oder therapierefraktärer AML nachgewiesen werden [29]. Nachteil dieser Behandlung ist die Toxizität des IL-2, die z.B. zu schweren Thrombozytopenien führen kann [80]. Jedoch gab es auch eine Studie in der IL-2 im Rahmen der Konsolidierungstherapie eingesetzt wurde, und ein positives Outcome bewirken konnten [10]. Eine andere Methode zur aktiven Immunisierung ist die Vakzinierung mit kompletten Tumorzellen. Hierunter gibt es unterschiedliche Ansätze. Einer davon ist die Verabreichung inaktivierter leukämischer Zellen. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass gegen mehrere LAAs eine gleichzeitige Immunantwort generiert werden Verabreichung von vitro in kann. Eine veränderten andere Möglichkeit Leukämiezellen, welche ist die durch Gentransfektion verändert wurden, und so z.B. vermehrt Immunmodulatoren exprimieren, die die Differenzierung von AML-Zellen zu effektiven APCs fördern [112]. Die derzeit am häufigsten untersuchte Möglichkeit der aktiven und gezielten Immuntherapie ist die Vakzinierung mit Peptiden. Sie führen als Epitope von LAAs zu einer Differenzierung von CTLs, welche dann wiederum gezielt die LAA exprimierende Tumorzellen lysieren können. Maslak et al. konnten im Rahmen ihrer Studie mit AML-Patienten in kompletter Remission, durch die sichere Verabreichung eines polyvalenten WT-1 Impfstoffes, eine Immunantwort dieser Patienten induzieren [82]. Ebenso gelang es Schmitt et al. sowohl eine 18 1. EINLEITUNG immunologische als auch eine klinische Antwort auf eine Vakzinierung mit einem von RHAMM abstammenden LAA in AML-Patienten zu bewirken [101]. 1.5 Zielsetzung Trotz guter Remissionsraten unter Standardtherapie bei AML-Patienten, ist der Verlauf unter einer MRD, einer therapierefraktären AML oder einem Rezidiv problematisch. Vor allem für die Therapie der Patienten, die sich aufgrund verschiedener Komorbiditäten nicht der Standardtherapie unterziehen können, ist die Entwicklung von neuen Therapiekonzepten unerlässlich. Eines dieser Konzepte stellt die Immuntherapie dar. Sowohl bei der passiven, als auch bei der aktiven Immunisierung versucht man, in vivo antileukämische Effekte zu erzielen oder bereits vorhandene Kapazitäten zu augmentieren. Für die AML wurden in den letzten Jahren mehrere LAAs identifiziert, die sich als Ziel einer entsprechenden Therapie eignen könnten. Ebenso wurde die Immunogenität mehrerer dieser Strukturen bereits in klinischen Studien nachgewiesen [82,101]. Es gilt nun, deren klinische Wirksamkeit weiter zu untersuchen, und weitere geeignete Impfstoffe zu entwickeln. Von besonderem Interesse sind hierbei LAAs, die durch ihre mitoseassoziierten Funktionen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung des Krankheitsstatus spielen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb solche Strukturen, Epitope der Antigene Survivin, Aurorakinase A und B, auf ihre Immunogenität bei AML Patienten und damit einer eventuellen Eignung als Target einer Immuntherapie zu untersuchen. Hierzu wurden IFN-γ und Granzyme B ELISPOT-Assays sowohl bei gesunden Probanden als auch bei AML-Patienten durchgeführt. 19 2. MATERIAL UND METHODEN 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1 Grundausstattungen 2.1.1 Allgemeine Laborgeräte Brutschrank B5042E, CO2-Auto-Zero, Heraeus Instruments, Hanau Digitalwaage Sartorius BP110S, Sartorius Mechatronics, Göttingen ELISPOT-Reader Immuno Spot, C.T.L. Europe, Reutlingen FACS-Gerät FACScan, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Gefrierschrank -20°C: Superfrost, Liebherr, Ochsenhausen -80°C: Ultra Low, Sanyo Fisher, München Kühlschrank +4°C: Liebherr, Ochsenhausen Laminar Flow Hera- Safe HS- 18, Heraeus Instruments, Hanau Magnetständer MACS MultiStand, Milteny Biotec, Bergisch Gladbach Mikroskop Carl Zeiss, 10-, 16-, 25- und 100-fache Vergrößerung, Jena Neubauer Zählkammer Zeiss, Oberkochen pH-Messgerät 827pH lab, Metrohm, Filderstadt Pipettboy pipettboy acu, IBS Integra Biosciences, Fernwald Pipetten 0,5-10 µl 10-100 µl 50-250 µl 200-1000 µl Eppendorf Reference, Eppendorf AG, Hamburg Stickstofftank Taylor Wharton Type M280, Mildstedt Vortexer Vortex Genie 2, Scientific Industries, New York, USA Wasserbad Julabo GFL Typ 1003, Julabo Labortechnik GmbH Seelbach/West 20 2. MATERIAL UND METHODEN Zentrifuge Beckmann-Coulter, CL-GS6R, Beckman-Coulter Instruments, Fullerton, USA 2.1.2 Plastikwaren Alle Plastikwaren wurden von den jeweiligen Firmen steril bezogen: Einfrier-Röhrchen Nunc Cryo TubeTM Vials 1,8 ml Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark Einmalspritzen 1 ml, Terumo Syringe, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien ELISPOT- Platten MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well filtration Assay Plate, Millipore, Bedford, USA Injektionskanüle Gr. 1, Braun AG, Melsungen Pipettenspitzen 0,1 – 10 µl 2 – 200 µl 50 – 1000 µl Eppendorf AG, Hamburg Platten FALCON multiwell 12-, 24-wells FALCON microtest™ U-Bottom 96 wells BD Labware, Franklin Lakes, USA Pre-separation Filter MACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Eppendorfgefäße Safe-Lock Tube 1,5 ml und 2 ml Eppendorf AG, Hamburg Röhrchen FALCON® Polypropylen Tubes, 15 ml und 50 ml Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA Sterilfilter Minisart RC 15 Sartorius, Hannover Stripetten 2 ml 5 ml 10 ml 25 ml 50 ml Costar Stripette, Corning Inc., New York, USA 21 2. MATERIAL UND METHODEN Trennsäulen MACS MS+ Separation Columns, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Zellkulturflaschen NUNCLONTM Surface, 400 ml Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark 2.2 Chemikalien Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von den jeweiligen Firmen bezogen: AB-Serum Deutsches Rotes Kreuz, Ulm AEC-Substratset Fa. BD Biosciences, San Jose, USA Aqua destillata Spüllösung 1000 ml Fa. Fresenius Kabi, Bad Homburg β2-Mikroglobulin Fa. Calbiochem, La Jolla, USA DMSO Dimethylsulfoxid, Fa. Merck, Darmstadt Färbetabletten 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate und Nitroblue tetrazolium chloride, Fa. Sigma-Aldrich, San Louis, USA Fetales Kälberserum Sera Plus Fa. Pan Biotech GmbH, Aidenbach Ficoll Separating Solution Fa. Biochrom AG, Berlin Granzyme B-Antikörper Fa. BD Biosciences, San Jose, USA IFN-γ-Antikörper Fa. Mabtech, Hamburg IL-7 Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach IL-2 Fa. Sigma-Aldrich, San Louis, USA 22 2. MATERIAL UND METHODEN L-Glutamin Fa. Biochrom AG, Berlin MicroBeads CD8 Fa. Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach DPBS 10x Fa. Gibco, Invitrogen Auckland, NZ Penicillin/ Streptomycin Fa. Gibco BRL, Eggenstein RPMI 1640 Fa. Biochrom AG Trypanblau-Lösung 0,4% Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen Tween20 Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen Zelllinien Deutsche Sammlung von Zellen und Mikroorganismen, Braunschweig; American Type Culture Collection, Manassas, USA 2.3 Puffer Coating-Puffer In 100 ml Aqua bidest. wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: 318 mg Natriumcarbonat 580 mg Natriumhydrogencarbonat 49 mg Natrium-Azid Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und steril filtriert. Substrat-Puffer In 500 ml Aqua bidest. wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: 0,1 M TRIS (6,05 g/500 ml) 0,1 M NaCl (2,9 g/500 ml) 5 mM MgCl2 (237 g/500 ml) Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und steril filtriert. 23 2. MATERIAL UND METHODEN Dilution- Puffer In 500 ml PBS wurden 50 ml FCS gelöst. Der Dilution-Puffer enthält so 10% FCS. PBS, phosphate buffered saline In 1 l Aqua bidest. wurden folgende Salze gelöst: 8,0 g Natriumchlorid 0,2 g Kaliumchlorid 1,44 g Natriumhydrogenphosphat 0,24 g Kaliumhydrogenphosphat Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und steril filtriert. PBStween- Puffer In 1 l PBS-Puffer wurden 0,5 ml Tween20 gelöst. Separations-Puffer 500 ml PBS enthalten: 2 mM EDTA 0,5% hitzeinaktiviertes FCS Blocklösung Granzyme B-ELISPOT 500 ml 1640 RPMI- Medium enthalten folgende Inhaltsstoffe: 50 ml hitzeinaktiviertes FCS 5 ml Penicillin/ Streptomycin 5 ml L-Glutamin Blocklösung IFN- γ- ELISPOT In 500 ml PBS wurden 5 ml hitzeinaktiviertes AB-Serum gelöst. 2.4 Zelllinien, Antikörper und Zytokine Die American Type Culture Collection (ATCC) ist ein 1925 gegründetes, global agierendes und nicht profitorientiertes Unternehmen mit Sitz in Manassa, VA. Die ATCC bietet unter anderem humane Zelllinien an. 24 2. MATERIAL UND METHODEN Die deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) stellt das deutsche Pendant zur ATCC dar. Folgende, in den beiden Unternehmen verzeichnete Zelllinien wurden verwendet: T2: ATCC-Nummer: CRL-1992 Die T2-Zelllinie ist eine Variante der T1-Zelllinie die unter Auswahl des monoklonalen Antikörpers SFR1-MI.3 (gegen eine monomorphe Determinante auf HLA-DR) hergestellt wird. Die humanen Lymphoblasten synthetisieren HLA-B5, aber exprimieren es nicht. Die Zelllinie exprimiert HLA-A2 und ist CD7+. Sowohl die T2- als auch die T1-Zelllinie sind hilfreich in der Erforschung der Antigenprozessierung und der Erkennung von MHC-I-Antigenen durch T-Zellen. K562: DSMZ-Nummer: ACC 10 Die Zellen dieser Zelllinie wurden 1970 aus dem Pleuraerguss einer 53-jährigen CML- Patientin im Stadium der Blastenkrise gewonnen. K-562 Blasten sind multipotente, hämatopoetische, maligne Zellen, die sich spontan in Progenitorzellen der erythrozytären, granulozytären und monozytären Reihe differenzieren können. Die Zellen exprimieren keine HLA Antigene. FACS-Antikörper (Fa. Becton-Dickinson) FITC konjugierter Maus-IgG1-Antikörper (Isotypenkontrolle) FITC konjugierter α-Human HLA-A2 Antikörper Interleukin-2 (IL-2): Die Sekretion von IL-2, sowie auch die Expression seines Rezeptors, werden durch die Bindung eines Antigens an den T-Zellrezeptor stimuliert. Die IL-2/ IL-2Rezeptor Interaktion stimuliert auf diese Weise das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben der antigenspezifischen cytotoxischen T-Zelle (CTL). IL-2 ist damit unter anderem auch für die Bildung von T-Gedächtniszellen zuständig. IL-2 wurde zur Kultivierung von T-Zellen eingesetzt. 25 2. MATERIAL UND METHODEN Interleukin-7 (IL-7): IL-7 ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der von Stromazellen des Knochenmarks und von Thymozyten gebildet wird. Er stimuliert die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu lymphoiden Progenitorzellen, B-, T- und NK-Zellen. Desweiteren ist das Zytokin ein Cofaktor im V(D)JRearrangement des T-Zellrezeptors. IL-7 schützt zudem humane CD4+ Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen vor Apoptose bei mangelnder Stimulation und fehlender Zytokine [14]. Aufgrund dieser Eigenschaften, wurde IL-7 zur Kultivierung von T-Zellen eingesetzt. 2.5 Zellkulturmedien Medium zur T-Zell-Kultivierung T-Zellen wurden in 1640 RPMI-Medium kultiviert. In 500 ml 1640 RPMI-Medium wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: 1% Penicillin/ Streptomycin 1% L-Glutamin 10% hitzeinaktiviertes und steril filtriertes, humanes AB-Serum Medium zur K562-Zell-Kultivierung K562-Zellen wurden in 1640 RPMI-Medium kultiviert. In 500 ml RPMI-Medium wurden folgende Inhaltsstoffe gelöst: 1% Penicillin/ Streptomycin 1% L-Glutamin 10% hitzeinaktiviertes FCS Einfriermedium Als Einfriermedium wurde RPMI-Medium mit 20% AB-Serum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin und 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) verwendet. 26 2. MATERIAL UND METHODEN Seruminaktivierung Die für die Zellkultivierung verwendeten Seren wurden in einem Wasserbad bei 56°C für 30 min hitzeinaktiviert. Auf diese Weise sollten hitzelabile Komplementfaktoren zerstört werden. Das hitzeinaktivierte Serum wurde portioniert und bei -20°C bis zur Verwendung gelagert. 2.6 Peptide Peptidepitope der Mitose-assoziierten Antigene Survivin, Aurorakinase A und B wurden mit Hilfe der im Internet zugänglichen Datenbank SYFPEITHI ausgewählt. Dabei handelt es sich um eine Datenbank, welche es einem ermöglicht Peptidmotive zu analysieren und letztendlich diverse, auf ein bestimmtes HLA-Motiv kompatible Peptidsequenzen liefert. Dabei wird jeder Sequenz ein Score zugeteilt, welcher mit der Wahrscheinlichkeit korreliert, dass die entsprechende Sequenz immunogen wirkt. Zum Nachweis spezifischer TZell-Antworten wurden die in Tabelle 5 aufgeführten Peptide verwendet. Die Peptide wurden von GL Biochem Ltd., Shanghai, China bezogen. 2.7 Patienten Alle Proben wurden ausschließlich von AML-Patienten entnommen, welche hierfür eine Einverständnisserklärung unterzeichnet hatten. Diese war zuvor von der Ethikkommission der Universität Ulm approbiert worden. Die Materialgewinnung erfolgte zum Zeitpunkt der Diagnosestellung (Anteil der Blasten >90%) sowie zum Zeitpunkt des Erreichens einer kompletten hämatologischen (CR) und/oder zytogenetischen Remission. Die Patienten wurden zur Therapie ihrer Erkrankung mit einer Polychemotherapie behandelt. Bei manchen der Patienten wurde zur Behandlung ihrer akuten myeloischen Leukämie eine allogene Stammzelltransplantation durchgeführt. Alle AMLPatienten, ihre Therapiebehandlung und der Grad ihrer Erkrankung zum Zeitpunkt der Probenentnahme wurden in Tabelle 4 aufgelistet: 27 2. MATERIAL UND METHODEN Tabelle 4: Die verwendeten Patientenproben und Charakteristika. RARS=refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten; TBI=total body irradiation, Cy=Cyclophosphamid, CR=complete remission, t- AML=Therapieassoziierte AML, HAM=Hochdosis AraC plus Mitoxantrone, PR= partial remission, Patient Geschlecht Alter WHOKlassifikation Zytogenetik Therapie MDS=Myelodysplastisches Syndrom, NOS=not otherwise specified RIT=radioimmunotherapy 1 m 58 MDS, RARS 46XY alloPBSCT (TBI,Cy)/CR 2 m 59 m 52 AML Intergroup/CR 4 m 58 45X,Y,inv(16) (p13q22) 46XY , inv(16) (p13q22) 45X,-Y AMLSG 07-04/CR 3 AML mit regelm. auftretenden genet. Aberraionen AML mit regelm. auftretenden genet. Aberrationen t-AML 5 m 57 AML mit regelm.auftretenden genet. Aberrationen 6 m 70 AML mit regelm.auftretenden genet. Aberrationen AMLSG 06-04, Dasatinib, BI1230.4Studie/refractory disease 7 w 44 AML NOS 47XY,+8, t(9;16) (p22q22), t(9;11) 48XY,+8,+3, +13,inv(16) (p13.1q22), del(7) (q22q32) 46XX 8 w 40 AML NOS 45XX,-7 haploPBSCT (RIT,TBI,Cy)/CR 9 w 42 AML NOS 46XX alloPBSCT (TBI,Cy)/CR 2.8 Azacitidine, AMLSG 08-07, Mitoxantrone,Etoposide,Cytarabine/re fractory disease AMLSG 07-04 + Redinduktion HAM/PR alloPBSCT in 2nd CR(TBI,Cy)/CR Probengewinnung, Zellisolation und -archivierung 2.8.1 Probengewinnung Die Gewinnung von peripheren Blutmonozyten, PBMCs, erfolgte aus HLA-A2+ typisiertem, mit EDTA versetztem Buffy Coat-Blut. Dieses wurde uns von der Blutbank des Deutschen Roten Kreuzes, Universität Ulm, Abteilung Transfusionsmedizin, zur Verfügung gestellt. Aus heparinisierten Vollblutproben der AML-Patienten, Patienten der Universitätsklinik Ulm, Klinik für Innere Medizin III, wurden deren PBMCs gewonnen. 28 2. MATERIAL UND METHODEN Buffy Coat-Blutproben sind auf die zellulären Bestandteile der gesunden Spender aufkonzentrierte Proben. Dabei entsprechen 90 ml davon einem Äquivalent von 450 ml einer Vollblutspende. Den AML-Patienten wurde peripheres Blut (PB) mittels venöser Punktion abgenommen. Unmittelbar nach Entnahme wurde dieses Material heparinisiert (10:1 mit Natrium-Heparin). 2.8.2 Zellisolation und –archivierung Blut besteht etwa zu 55% aus Blutplasma und zu 45% aus korpuskulären Bestandteilen, welche in Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten zu unterteilen sind. Aufgrund der unterschiedlichen Größe und des spezifischen Gewichts dieser zellulären Bestandteile, kann zur Gewinnung der Monozyten die Dichtegradientenzentrifugation herangezogen werden. Hierzu wurde ein Teil des Buffy-Coat-Blutes mit einem Teil PBS gemischt und in einem Verhältnis von 1:2 über eine Ficoll-Lösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,077 g/ml geschichtet und dann bei 2000 U/min für 20 min bei Raumtemperatur (RT) und mit gelöster Bremse zentrifugiert. Das heparinisierte Patientenblut wurde zu zwei Teilen mit einem Teil PBS gemischt, und dann ebenfalls in einem Verhältnis von 1:2 über die Ficoll-Lösung geschichtet. Im weiteren Verfahren wurden beide Probenarten analog behandelt. Während Erythrozyten und Granulozyten aufgrund ihres größeren spezifischen Gewichts den Gradienten passieren können, sammeln sich Lymphozyten, Monozyten, welche zusammen die PBMCs ausmachen, und Thrombozyten aufgrund ihres geringeren spezifischen Gewichtes an der Plasma- Gradientengrenze an. Nach der Zentrifugation befanden sich die mononukleären Zellen zwischen der Plasma- und der Ficollschicht und wurden mit Hilfe einer sterilen Stripette abpipettiert. Um die in der PBMC-Fraktion noch enthaltenen Thrombozyten zu entfernen, wurden die PBMCs zweimal mit EDTA gewaschen, d.h. Zentrifugation mit EDTA bei 1200 U/min für 10 min bei Raumtemperatur. Nach diesem Verfahren wurde die in den Proben enthaltene Zellzahl mittels Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Der Farbstoff Trypanblau dringt umgehend in tote Zellen ein und lässt diese unter dem Mikroskop deutlich blau erscheinen. Im Gegensatz dazu nehmen viable Zellen Trypanblau nur sehr langsam auf, und erscheinen unter dem Mikroskop zunächst leuchtend 29 2. MATERIAL UND METHODEN transparent. Zur Ermittlung der Zellzahl wurde ein Teil der zu bestimmenden Zellsuspension mit der Farbstofflösung in definiertem Verhältnis gemischt und in eine Neubauer-Zählkammer überführt. Nach dem Auszählen der viablen Zellen in den vier Großquadraten erfolgte die Berechnung der Zellzahl pro 1 ml nach folgender Formel: N V 10 4 n N = Zahl der insgesamt gezählten Zellen n = Zahl der ausgezählten Großquadrate V = Verdünnungsfaktor 104 = Kammerfaktor Zur Kryokonservierung der Zellen wurde das Einfriermedium verwendet. Die Archivierung der Monozyten erfolgte jeweils als Zellpellet mit 1x106 bis maximal 5x107 Zellen in 1,5 ml Einfriermedium in Kryoröhrchen. Diese wurden im -80°C Gefrierschrank zwischengelagert und am nächsten Tag in den Flüssigstickstofftank überführt. 2.9 HLA-Typisierung der Patientenproben mittels FACS-Analyse Mit Hilfe der Durchflusszytometrie/FACS (fluorescence-activated-cell-sorter) lassen sich Informationen über die Zellgröße, die Granularität und das Vorhandensein spezifischer Fluoreszenzen von einzelnen Zellpopulationen gewinnen. Die HLA-Typisierung setzt so voraus, dass beim Vorhandensein z.B. des HLA-A2 auf der Zelloberfläche, FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) gekoppelte spezifische, monoklonale Antikörper an dieses Oberflächenantigen binden und uns so ein spezifisches Signal liefern: die entsprechenden Zellen sind damit als HLA-A2+ typisiert. Diese Messung der Zellen beruht darauf, dass die entsprechend markierten Zellen von einem Argonionenlaser in der Messküvette erfasst werden. Es kommt 30 2. MATERIAL UND METHODEN dadurch zu einer Anregung der AK-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe, die daraufhin Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren. Diese Emission liefert uns das spezifische Signal. Die Größe der Zellen (FSC, Forwardscatter) und ihre Granularität (SSC, Sidescatter) werden unabhängig des Fluoreszenzfarbstoffes erfasst. Damit dieser Prozess möglichst genau ablaufen kann, wird das ganze Flüssigkeitsversorgungssystem des FACS-Geräts vor Beginn der Zytometrie unter Druck gesetzt. Dies garantiert uns den feinen, laminaren Probenfluss durch die Messküvette. Im Idealfall werden so einzelne Zellen von dem Laser erfasst, die dann je nach gebundenem Farbstoff und damit spezifischer Oberflächenantigene Licht emittieren. Sowohl die HLA-A2-AK, als auch die Mouse-IgG1-AK sind FITC konjugiert. FITC ist ein gängiger Farbstoff mit niedriger Molekularmasse. Seine Anregungswellenlänge liegt bei 488 nm, sein Absorptionsmaximum bei 495 nm und sein Emissionsmaximum bei 519 nm. Zur Typisierung der HLAs der AML-Patienten wurden für die FACS-Analyse die jeweiligen kryokonservierten Zellen getaut, in AB-Medium aufgenommen und für etwa 10 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Pro Messung und pro FACS-Röhrchen wurden mindestens 2 x105 Zellen benötigt. Nach der Zentrifugation wurden diese in 2 ml PBS mit 1% FCS aufgenommen. Pro Patient wurden in 2 FACS-Röhrchen je 1 ml dieser Zellsuspension gegeben und nochmals zentrifugiert. Der Überstand wurde jeweils verworfen und zu den in den FACS-Röhrchen verbliebenen Zellen wurde in das erste Röhrchen 10 µl des FITC-gekoppelten Maus-IgG-AK pipettiert und in das zweite Röhrchen wurden 2 µl des FITC-gekoppelten HLA-A2-AK pipettiert. Der Mouse-IgG-AK bindet nicht an Oberflächenantigene humaner Zellen und dient so dem Ausschluss unspezifischer FITC-Bindungen. Die beiden Proben mussten daraufhin für 20 min im Dunkeln und bei RT inkubiert werden. Nach der Inkubation wurden die Zellen noch zweimal in PBS gewaschen um ungebundene Antikörper loszuwerden. Abschließend erfolgte die Aufnahme der Zellen in mindestens 200 µl PBS. Dieses Volumen wurde von der Zellzahl abhängig gemacht, sodass die Durchflusszahl der Zellen am FACS-Gerät bei der Messung bei etwa 300 Zellen/Sekunde lag. 31 2. MATERIAL UND METHODEN Unter Verwendung der Software „CellQuestTM“ wurden die Zellen auf die Intensität der Fluoreszenz hin analysiert. 2.10 Zellseparation und Anlegen einer MLPC Um eine MLPC (Mixed Lymphocyte Peptide Culture) anlegen zu können, müssen die aus peripherem Blut gewonnenen Blutmonozyten (PBMCs) zunächst in CD8+ und CD8- Zellfraktionen separiert werden. Dies ist nötig, da man die CD8antigenpräsentierenden Zellen mit dem entsprechenden Antigen beimpfen möchte, damit diese das Antigen präsentieren und später in Kultur die CD8+ Zellen darauf spezifisch stimulieren. Zur Separation der Zellfraktionen wurden MACS MicroBeads verwendet. Dies sind kleine Magnetpartikel, die an monoklonale Maus-AK gebunden sind. Die Maus-AK binden wiederum spezifisch an humane CD8+-Oberflächenantigene. MLPC Tag 0 Im ersten Arbeitsschritt dieses Verfahrens wurden die kryokonservierten Zellen zunächst im 37°C warmem Wasserbad getaut, in 20 ml Plain-Medium aufgenommen und für 10min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 5 ml Separationspuffer überführt. Während einer zweiten Zentrifugation wurde von dieser Zellsuspension die Zellzahl bestimmt. Im Weiteren folgte die Inkubation der Zellen mit den MicroBeads. Pro 1 x107 ausgezählter Zellen wurden auf das Zellpellet 80 µl Separationspuffer und 20 µl MicroBeads gegeben. Diese Suspension wurde nun für 15 min bei +4°C inkubiert. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden 5 ml Separationspuffer auf die Suspension gegeben, es folgte eine erneute Zentrifugation mit 1200 U/min für 10 min, um die nichtgebundenen MicroBeads-konjugierten AKs loszuwerden. Der Überstand wurde nach Zentrifugation wieder verworfen. Das gereinigte Zellpellet wurde im nächsten Arbeitsschritt in 500 µl Separationspuffer resuspendiert. Bereits während der Inkubationszeit wurden die Trennsäulen vorbereitet. Dazu wurde für jede Probe eine Trennsäule mit aufgesetztem Prä-Separationsfilter am Magnetständer befestigt. Der Prä-Separationsfilter hatte die Funktion, eventuell 32 2. MATERIAL UND METHODEN nicht vollständig resuspendierte Zellklümpchen zurückzuhalten, damit diese die Magnetsäulen nicht verstopfen. Die Säule samt Prä-Separationsfilter musste dann mit 500 µl Separationspuffer befeuchtet werden. Der Puffer wurde unter der Säule aufgefangen und verworfen. Nun wurde das in 500 µl Separationspuffer resuspendierte, gereinigte Zellpellet auf die Säule gegeben, und mit 3 x 500 µl Separationspuffer nachgespült. Durch die MicroBeads blieben die CD8+ Zellen in der magnetisierten Säule hängen, wohingegen die CD8- Zellen in einem Röhrchen unter der Säule aufgefangen werden konnten. Nachdem alle Zellen die Säule passiert hatten, wurde diese vom Magnetständer entfernt und auf ein kleines Falcon-Röhrchen gesetzt. Auf die Säule wurden 1000 µl Separationspuffer gegeben. Der Puffer wurde dann mit einem Stempel durch die Säule gepresst, was bewirkte, dass sich die CD8+ Zellen aus der Säule lösten und in einem weiteren Röhrchen aufgefangen werden konnten. Die CD8- Zellen wurden in 10 ml, die CD8+ in 4 ml AB-Medium überführt. Die Zellzahlen der beiden Zellfraktionen wurden bestimmt. Die CD8+ Zellen wurden nach Zentrifugation mit AB-Medium auf eine 5 Konzentration von 5 x10 Zellen pro 500 µl gebracht. Die CD8- antigenpräsentierenden Zellen (APCs) wurden mit 30 Gy einer Caesium-37-Quelle bestrahlt, um zu verhindern, dass die mononukleären Zellen als Reaktion auf die T-Zellen aktiviert werden und proliferieren. Nach der Bestrahlung wurden die CD8- Zellen zuerst zentrifugiert und dann auf eine Konzentration von 2x106 Zellen pro 500 µl AB-Medium gebracht. Zu den CD8Zellen wurde pro 500 µl 1,25 µg β2-Mikroglobulin dazugegeben. Dies bewirkte eine stabile Bindung und damit Präsentation der Antigene. Für jedes zu testende Peptid, einschließlich Negativprobe und Positivprobe/-n, wurde ein 15 ml Falcon vorbereitet. In jedes dieser Falcons wurden 500 µl der β2MG haltigen CD8- Zellsuspension pipettiert. Dazu kam in eines der Falcons nichts, da dieses als Negativprobe diente. In Versuchsansätzen mit Patientenproben, wurde als Positivprobe das IMP-Peptid (10 µg) verwendet, in Ansätzen mit Proben von gesunden Spendern ein Falcon mit IMP-Peptid (10 µg) und ein zweites mit CMV-Peptid (10 µg) In jedes weitere Falcon wurden zu der Zellsuspension jeweils 10 µg des entsprechenden Peptids dazu pipettiert: 33 2. MATERIAL UND METHODEN 2x106 CD8- Zellen in 500 µl AB-Medium 1,25 µg β2-Mikroglobulin 10 µg des entsprechenden Peptids FALCON 500 µl - Abbildung 4: Übersicht über das peptide-pulsing der CD8 APCs(=antigenpräsentierende Zellen). Die Peptid-gepulsten APCs sowie die Negativprobe wurden nun alle für 1,5 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die CD8+ Zellen mit einer Konzentration von 5 x105 Zellen pro 500 µl AB-Medium wurden zu 500 µl pro Well auf eine 24-Well Platte gegeben. Dabei wurden für die Negativ- und Positivprobe/-n, und für jedes zu testende Peptid ein Well bereitgestellt. Die nicht genutzten Wells wurden mit 1 ml PBS aufgefüllt, um eine Verdunstung der Zellsuspension möglichst zu vermeiden. Nach Ablauf der Inkubationszeit der CD8- Zellen wurden die APCs alle zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet wieder in 500 µl des ABMediums überführt. So wurden die nicht internalisierten Peptide aus der Suspension entfernt. Zu jedem CD8+ Zellen enthaltenden Well wurden nun die 500 µl der gepulsten CD8- Zellsuspension dazugegeben und bei +37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert: WELL 1000 µl 2x106 CD8- Zellen in 500 µl AB-Medium + 1,25 µg β2-Mikroglobulin + 10 µg des entsprechenden Peptids 5 + 5 x10 CD8 Zellen in 500 µl AB-Medium Abbildund 5: Übersicht über die angelegte MLPC(= mixed lymphoctye peptide culture). MLPC Tag 1 Nach der Coinkubation der gepulsten CD8- und den CD8+ Zellen über Nacht wurde jedes Well der MLPC mit 100 µl AB-Medium und 2,5 ng IL-2 und 20 ng IL-7 stimuliert und für weitere 7 Tage bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. 34 2. MATERIAL UND METHODEN MLPC Tag 8 (am ELISPOT Tag 2) Die stimulierten Lymphozyten wurden an diesem Tag aus der Kultur entnommen. Dazu wurde jedes Well in ein neues Falcon abpipettiert. Die Wells wurden anschließend nochmals mit 1000 µl AB-Medium nachgespült. Diese Lösung wurde in das entsprechende Falcon gegeben. Der Zellverlust konnte so möglichst gering gehalten werden. Jedes Falcon wurde bei 1200 U/min für 10 min zentrifugiert, und anschließend in einer Konzentration von 10x104 Zellen in 500 µl AB-Medium gebracht. Die Falcons wurden bei Raumtemperatur solange ins Dunkel gestellt, bis sie für den nächsten Schritt des ELISPOT-Assays verwendet werden konnten. 2.11 Nachweis spezifischer T-Zellantworten gegen Mitose-assoziierte Antigene mithilfe des ELISPOT-Assays Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum Nachweis spezifischer zellulärer Immunantworten gegen die Mitose-assoziierten Antigene Survivin, AurorakinaseA und -B der Enzyme Linked ImmunoSPOT-Assay angewandt. Der ELISPOT ist ein hoch sensitiver Test zur Analyse von Zellaktivierung auf der Ebene der einzelnen Zelle. Das Prinzip dieses Verfahrens beruht letztendlich im Nachweis von IFN-γ und Granzyme B, welche von spezifisch aktivierten TLymphozyten sezerniert werden. Die ELISPOT–Assays wurden auf Nitrozelluloseplatten vom Typ „MultiScreen Assay System 96–well Filtration Plate“ der Firma Milipore durchgeführt. Die Böden der Platten bestehen aus einer Nitrozellulosemischung, die Proteine und Nukleinsäuren bindet. In den durchgeführten Versuchen wurde die Nitrozellulose mit zytokinspezifischen Antikörpern (AK1) beschichtet. Ein zweiter AK (AK2) band an die sezernierten Zytokine. Ein enzymkonjugierter Farbstoff band an AK2. Jeder Spot ist somit ein „Fingerabdruck“ von Zytokin produzierenden T-Zellen, so genannte "spot forming units". Die Anzahl der Spots lässt auf die Frequenz von spezifischen T-Zellen schließen. Im ELISPOT-Assay wurden für jedes Peptid 3 Wells auf der ELISPOT-Platte angelegt. Die Auswertung der fertigen ELISPOT–Platten erfolgte automatisiert mit dem KS ELISPOT–System Version 4.2.0 der Firma Zeiss. Das System besteht aus einem 35 2. MATERIAL UND METHODEN Auflichtmikroskop mit Motortisch und Autofokus. Jedes einzelne Well der ELISPOT-Platte kann vom Motortisch präzise angesteuert werden. Eine angeschlossene Farbkamera nimmt die Zytokinspots auf, die digitalisiert und anschließend durch die Software bezüglich Größe und Anzahl ausgewertet werden. Es wurden die Mittelwerte berechnet. ELISPOT Tag 1 (am MLPC Tag 7) - Coating IFN-γ Die ELISPOT-Platte für den IFN-γ-Nachweis wurde über Nacht und bei +4°C mit dem ersten Antikörper, einem monoklonalen, antihumanen IFN-γ-Antikörper inkubiert. Der Antikörper (AK1), Coating antibody 1-D1K, mit einer Konzentration von 1 µg/µl, wurde mit ELISPOT Coating-Puffer auf eine Konzentration von 15 µg/ml verdünnt. 70 µl der Antikörperlösung wurden in jedes der 3 Wells eines jeden Peptids pipettiert. Der Antikörper bindet mit seinem Fc-Teil an die Nitrocellulose-Membran, der Fab Teil ist frei für die Bindung des IFN-γ. - Coating Gr.B Die ELISPOT-Platte für den Granzyme B-Nachweis wurde bei +4°C über Nacht mit dem ersten Antikörper, einem monoklonalen, antihumanen Granzyme BAntikörper inkubiert. Dieser Capture Antikörper, mit der Konzentration von 1 µg/µl wurde im Verhältnis von 1:200 in PBS verdünnt. In jedes der 3 Wells eines jeden Peptids wurden 100 µl der Antikörperlösung pipettiert. Der Antikörper bindet mit seinem Fc-Teil an die Nitrocellulose-Membran, der Fab Teil ist frei für die Bindung des sezernierten Granzyme B. ELISPOT Tag 2 (am MLPC Tag 8) - Pulsen der antigenpräsentierenden T2-Zellen IFN-γ und Gr. B Aus der Zellkulturflasche der T2-Zellen wurden 25 ml der Zellsuspension entnommen und für 10 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 2 ml AB-Medium resuspendiert. Hieraus wurde die Zellzahl bestimmt, und die Zellen anschließend auf eine Konzentration von 0,4x106 T2-Zellen pro 500 µl gebracht. Es folgte die Zugabe von 1,25 µg β2-MG. Aus dieser fertigen Zellsuspension wurde nun für die Negativ- und Positivprobe/n und für jedes zu testende Peptid 500 µl entnommen und in ein kleines Falcon 36 2. MATERIAL UND METHODEN pipettiert. Die Zellen wurden daraufhin mit 10 µg des entsprechenden Peptids gepulst, zur Negativprobe wurde kein Peptid hinzugefügt. Die gepulsten T2Zellen wurden für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach abgelaufener Inkubation wurden alle Falcons zentrifugiert und die Pelletts wieder in 500 µl frischen AB-Mediums aufgenommen. - Blocken der Platten IFN-γ Die über Nacht mit dem Coating-Anitkörper (AK1) inkubierten ELISPOT-Platten wurden zweimal mit jeweils 200 µl PBS pro Well gewaschen. Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Nitrocellulose-Membran mit 100 µl PBS + 10% humanen AB-Serum pro Well für 2 h bei Raumtemperatur geblockt. Danach wurden die Wells erneut sechsmal mit 200 µl PBS pro Well gewaschen. - Blocken der Platten Gr. B Die über Nacht mit dem Capture-Anitkörper (AK1) inkubierten ELISPOT-Platten wurden einmal mit 10%FCS) pro Well jeweils 200 µl Granzyme B-Blocklösung (RPMI1640/ gewaschen. Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Nitrocellulose-Membran mit 100 µl pro Well eben dieser Blocklösung für 2 h bei Raumtemperatur geblockt. Danach wurden die Wells einmal mit 200 µl PBS pro Well gewaschen. - Aufbringen der Zellen auf die Platte IFN-γ und Gr. B Die für 8 Tage mit einem spezifischen Peptid stimulierten CD8+ Lymphozyten aus der MLPC (MLPC am Tag 8), in einer Konzentration von 10x104 Zellen in 500 µl wurden zusammen mit den, mit entsprechendem Peptid gepulsten T2-Zellen, in einer Konzentration von 0,4x104 Zellen in 500 µl gemischt. In jedes der drei für ein bestimmtes Peptid vorgesehenen Wells, sowohl auf der IFN-γ-Platte als auch auf der Granzyme B-Platte, wurden von dieser Zellsuspension 100 µl pipettiert. Die ELISPOT-Platten wurden über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. 37 2. MATERIAL UND METHODEN ELISPOT Tag 3 - Detektion der sezernierten Zytokine IFN-γ Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen von der ELISPOT-Platte gewaschen. Dies geschah fünfmal mit 200 µl PBS pro Well und fünfmal mit 200 µl 0,05%-igem PBStween pro Well. In den nun folgenden Arbeitsschritten sollte das IFN-γ nachgewiesen werden, welches von den peptidspezifischen T-Zellen nach erneuter Stimulation durch die gepulsten T2-Zellen sezerniert wurde. Dafür wurde ein zweiter, monoklonaler anti-humaner IFN-γ-Antikörper verwendet. Dieser bindet mit seinem FabFragment an ein weiteres Epitop von IFN-γ. An seinem Fc-Teil ist der Antikörper mit Biotin markiert. Die ELISPOT-Platte wurde mit dem monoklonalen, biotinylierten antihumanen IFN-γ-Antikörper in einer Konzentration von 1 µg pro 1 ml PBStween für zwei Stunden bei RT inkubiert. Dazu wurden von der AK-Lösung 100 µl in jedes Well gegeben. Nach erfolgter Inkubation wurde die Platte sechsmal mit je 200 µl PBStween gewaschen. Im Anschluss wurden in jedes Well 100 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung, in einem Verhältnis von 1:1000 in PBStween gegeben. Die Platte musste so für eine Stunde bei RT inkubieren. Nach abgelaufener Zeit wurde die Platte sechsmal mit 200 µl PBStween gewaschen, und zweimal mit 200 µl Substratpuffer pro Well. Die Platte konnte nun entwickelt werden. - Detektion der sezernierten Zytokine Gr.B Die Platte wurde zweimal mit 100 µl Aqua dest. pro Well gewaschen, wobei das Aqua dest. jeweils 2-3 min einwirken konnte. Anschließend wurde die Platte dreimal mit 100 µl PBStween pro Well gewaschen. Als Antwort auf die Präsentation der Peptide durch die T2-Zellen, sollten Peptid-spezifische T-Zellen aktiviert werden und Granzyme B sezernieren. Zu diesem Zwecke wurde ein zweiter, monoklonaler anti-humaner Granzyme B-Antikörper verwendet. Dieser Capture Antikörper (AK2) bindet mit seinem Fab-Fragment an Granzyme B. Die ELISPOT-Platte wurde mit dem monoklonalen, antihumanen Granzyme BAntikörper, mit der Konzentration von 0,5 µg/µl im Verhältnis von 1:250 in Dilution-Puffer verdünnt. In jedes Well wurden von dieser Antikörper-Lösung 100 µl pipettiert. Die Platte wurde für zwei Stunden bei RT inkubiert. 38 2. MATERIAL UND METHODEN Nach Ablauf der Inkubation wurde die Platte dreimal mit je 200 µl PBStween pro Well gewaschen. Die ELISPOT-Platte wurde dann mit 100 µl pro Well einer Avidin-Peroxidase-Lösung (Avidin-HRP), in einem Verhältnis von 1:100 mit Dilution-Puffer verdünnt, beladen und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Nach der einstündigen Inkubationszeit wurde die Platte viermal mit 100 µl PBStween pro Well und dann noch zweimal mit 100 µl PBS pro Well gewaschen. Die Platte konnte nun entwickelt werden. - Färbung IFN-γ Zur Sichtbarmachung der Spots wurde im Dunkeln eine Substrat-Lösung angesetzt: Für diese Lösung wurde eine Tablette BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat) in 500 µl DMF (Dimethylformamid) gelöst, sowie eine Tablette NBT (nitroblue tetrazolium chloride) in 1 ml Aqua dest. gelöst. Beide Lösungen wurden mit Hilfe eines 0,45 µm Filters filtriert. Die gebrauchsfertige Substrat-Lösung wurde dann aus 10 ml Substratpuffer, 330 µl der NBT-Lösung und 33 µl der BCIP-Lösung zusammengestellt. Von dieser Lösung wurden rasch 100 µl in jedes Well pipettiert. Durch Streptavidin-Peroxidase und die Substrat-Lösung erfolgte eine Farbreaktion und das sezernierte Zytokinmolekül wurde indirekt als blauer, regelmäßig begrenzter Spot sichtbar. Die Substratlösung durfte nicht länger als 2min einwirken, da sonst der Hintergrund auf der NitrocelluloseMembran zu kräftig geworden wäre, und das Auswerten der Spots nicht mehr möglich gewesen wäre. Aus diesem Grund wurde die Färbung durch dreimaliges Waschen der Platte mit je 100 µl Aqua dest. pro Well gestoppt. Die Platte musste nun noch über Nacht trocknen, ehe sie mittels des ELISPOT-Readers ausgewertet werden konnten. -Färbung Gr.B Zur Spotentwicklung musste zunächst eine Entwicklungslösung hergestellt werden. Dafür wurden pro 1 ml einer AEC-Substratlösung 20 µl einer AECChromogen-Lösung miteinander gemischt. 100 µl dieser Lösung wurden in jedes Well der Platte pipettiert. Die chromogene Substratlösung konnte bis zum Sichtbarwerden der roten Spots einwirken, jedoch nicht länger als 15 min. Die Farbreaktion wurde durch dreimaliges Waschen der Platte mit jeweils 100 µl 39 2. MATERIAL UND METHODEN Aqua dest. abgestoppt. Auch diese Platte musste erst trocknen, ehe sie mit dem ELISPOT-Reader ausgewertet werden konnte. Enzyme-Linked ImmunoSPOT - Assay Coating der ELISPOT-Platte mit dem Anti-Gr.B-AK (AK1) über Nacht Waschen und Blocking mit RPMI / 10% FCS Inkubation mit den T-Zellen und den peptidgepulsten T2-Zellen Nach dem Waschvorgang wird monoklonaler, Anti-Gr.B-AK (AK2) und anschließend AvidinPeroxidase auf die Platte gebracht. Entwicklung der roten Spots erfolgt durch die chromogene Substratlösung Antigenpräsentierende T2-Zelle T-Zelle, die Granzyme B sezerniert Granzyme B Komplex aus Farbstoff konjugiertem Granzyme B Antikörper (AK2) Abbildung 6: Schematische Darstellung der Durchführung des ELISPOT–Assay am Beispiel des Granzyme B-ELISPOT. 2.12 Statistische Methoden Die Ergebnisse aller Versuchansätze, die unter gleichen Bedingungen abgelaufen waren, wurden durch Berechnung von Mittelwerten (arithmetischer Mittelwert n 1 x xi n i 1 ) berechnet. 40 3. ERGEBNISSE 3. ERGEBNISSE 3.1 Bestimmung des Oberflächenantigens HLA-A2 mittels FACS-Analyse Für die MLPC und den folgenden ELISPOT-Assay wurden Zellproben von zwölf gesunden Probanden und von neun AML-Patienten verwendet. Es wurden nur HLA-A2 exprimierende Zellen verwendet, da das Vorkommen dieses Allels in der westeuropäischen, kaukasischen Bevölkerung besonders hoch ist, und somit ausreichend Probenmaterial gewonnen werden konnte. Nach der Datenbank www.allelefrequencies.net beträgt die Expressionsfrequenz für den Phänotyp HLA-A2 in Westeuropa 49,9% [2]. Aus diesem Grund wurden die peripheren mononukleären Zellen aller Proben vor Versuchsbeginn mittels FACS-Analyse in entsprechender Weise auf ihre HLA-A2-Expression hin untersucht. Abbildung 7 zeigt die Darstellung einer Patientenprobe, bei der die untersuchten Zellen HLA-A2 exprimieren. A. Abbildung B. 7: FACS-Analyse Gesamtpopulation bestehend von aus C. PBMCs Mono- (peripheral und blood monoclonal Lymphozyten, B.: cells). A.: Mouse-FITC (Fluoresceinisothiocyanat) inkubierte Zellen, zum Ausschluß unspezifischer Bindungsstellen, C.: HLA-A2-FITC inkubierte Zellen, mit dem Nachweis des HLA-A2-Oberflächenantigens (HLA=humanes Leukozytenantigen). Im Vergleich hierzu zeigt Abbildung 8 die Ergebnisse der FACS- Analyse einer Zellprobe, deren Zellen kein HLA-A2 exprimieren. Diese Probe konnte nicht als Versuchsprobe verwendet werden. Mit Hilfe dieser Methode konnten zwölf geeignete gesunde Probanden (HV I-XII), und neun geeignete AML-Patienten (Pat. I-IX) für die MLPCs und anschließenden ELISPOT-Assays rekrutiert werden. 41 3. ERGEBNISSE A. B. C. Abbildung 8: FACS(fluorescence activated cell sorter)-Analyse von PBMCs(peripheral blood monoclonal cells). A.: Gesamtpopulation bestehend aus Mono- und Lymphozyten, B.: MouseFITC(Fluoresceinisothiocyanat)) inkubierte Zellen, zum Ausschluß unspezifischer Bindungsstellen, C.: HLA(humanes Leukozytenantigen)-A2-FITC inkubierte Zellen, mit fehlendem Nachweis des HLA-A2-Oberflächenantigens. 3.2 Auswahl der verwendeten Peptide Folgende HLA A*0201 kompatiblen Peptide wurden zur Stimulation der hierfür geeigneten Zellproben verwendet. Tabelle 5: Die verwendeten, mittels SYFPEITHI ermittelten, HLA*0201 spezifischen Peptide. PEPTID PEPTIDSEQUENZ PEPTIDPOSITION SCORE Survivin 1 LTLGEFLKL 96 23 Survivin 2 ELTLGEFLKL 95 19 Aurorakinase A1 TLCGTLDYL 288 26 Aurorakinase A2 YLILEYAPL 207 26 Aurorakinase B1 KIADFGWSV 215 25 Aurorakinase B2 LLLGLKGEL 206 29 Aurorakinase B3 LMYCHGKKV 188 22 Aurorakinase B4 TMCGTLDYL 232 24 Aurorakinase B5 VLPPSALQSV 334 29 Aurorakinase B6 ALMYCHGKKV 187 23 42 3. ERGEBNISSE 3.3 Zelluläre Immunantworten gegen Survivin, Aurorakinase A und B bei gesunden Probanden Der Nachweis, ob eines der Epitope der LAAs Survivin, Aurorakinase A oder B eine spezifische zelluläre Immunantwort auslösen konnte, erfolgte über die Durchführung eines ELISPOT-Assays. Als Positivkontrollen für die CMV-positiven, gesunden Probanden dienten das CMV-Peptid und das Influenza-Matrix Peptid (IMP). Gegen letztgenanntes, intravirales Peptid liegt aufgrund einer sehr hohen Durchseuchungsrate, mit 5-20% Betroffenen in der Bevölkerung pro Grippewelle [3], in den meisten Probanden eine Population von Gedächtnis-T-Zellen vor, deren Existenz in vitro durch einmalige Stimulation und anschließendem ELISPOTAssay nachweisbar war. Das CMV-Peptid ist Teil des Matrixproteins pp65 des humanen Zytomegalieviruses. Auch gegen dieses Protein liegt aufgrund einer hohen Durchseuchungsrate von ungefähr 60% in entwickelten Ländern [24], in vielen Probanden eine stimulierbare Population von Gedächtnis-T-Zellen vor. 43 3. ERGEBNISSE 3.3.1 IFN-γ-ELISPOT Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse der IFN-γ Freisetzung durch CD8+ T-Zellen eines gesunden Probanden (HV XI). well1 well2 well3 MW Spotanzahl 250 200 150 100 50 0 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IM P no pe pt id e CM V Peptid Abbildung 9: IFN(Interferon)-γ-ELISPOT-Messwerte einer MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) eines gesunden Probanden (HV XI) nach Stimulation mit CMV (Zytomegalievirus), IMP (Influenza Matrix Protein), Survivin 1, Survivin 2, Aurorakinase A1-A2 und Aurorakinase B1-B6. Es wurden die Mittelwerte (MW) aus den dreifachen Messwerten (well1-3) ermittelt und dargestellt. Die Anzahl der IFN-γ Spots wurde standardisiert durch einen ELISPOT-Reader ausgelesen. Auswertbar sind alle Versuche, bei denen die Negativprobe negativ ist, und die Positivprobe positiv. Dies ist der Fall, wenn für IMP oder CMV mindestens doppelt so viele Spots gezählt wurden als in der no-peptide-Fraktion. Eine positive Immunantwort durch CD8+ T-Zellen konnte in diesem Sinne bei HV XI für die Peptide Survivin 2 (Mittelwert = 132 Spots), Aurorakinase A1 (Mittelwert = 115 Spots) und für Aurorakinase B3 (Mittelwert = 123 Spots) nachgewiesen werden. Der Nachweis einer IFN-γ Sekretion in der Negativprobe, sowie bei Stimulation durch CMV, S1, A2, B1, B2 und B4-6 wurde als unspezifische TZellaktivität gedeutet. In Abbildung 10 erfolgt die Darstellung der korrespondierenden Spots auf der ELISPOT-Platte, die ebenfalls mittels ELISPOT-Reader eingelesen wurde. 44 3. ERGEBNISSE well 3 well 2 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IMP CMV no peptide well 1 Abbildung 10: IFN(Interferon)-γ ELISPOT der MLPC(mixed lymphocyte peptide culture) von HV XI nach Stimulation mit entsprechenden Peptiden. Das Einlesen der Platte erfolgte mittels ELISPOTReader. Auf diese Weise konnten 12 gesunde Probanden (HV I-XII) mittels IFN-γ ELISPOT-Assay auf ihre Immunantwort gegen die von Survivin abstammenden Peptide S1 und S2, die Peptide A1 und A2 der Aurorakinase A, sowie die sechs von der Aurorakinase B abstammenden Peptide B1-B6 untersucht werden. Die Versuche zeigten keine spezifische T-Zellantwort gegen S1, B5 und B6. Hingegen war eine geringe Stimulation der Lymphozyten durch das Epitop B2 möglich, 10% der HVs zeigten hierfür eine positive Immunantwort. Die Epitope B3 und 4 konnten in 30% der Probanden eine Immunantwort auslösen. Mit 50% positiver Immunantworten wurden die Epitope S2 und B2, sowie mit 60% das Epitop A2 getestet. Die höchste Frequenz an positiven Immunantworten konnten mit 70% durch das von der Aurorakinase A abstammende Peptid A1 erzielt werden. Für die HVs VII und VIII war eine Auswertung durch den ELISPOT-Reader nicht möglich, da der Hintergrund der Platten so stark gefärbt war, dass eine reproduzierbare Auszählung der Spots nicht gewährleistet werden konnte. Tabelle 6 gibt einen Überblick über die Ergebnisse der IFN-γ ELISPOT-Assays. 45 3. ERGEBNISSE Tabelle 6: Übersicht über die positiven IFN(Interferon)-γ ELISPOT-Assay-Ergebnisse (= +) bei zehn auswertbaren gesunden Probanden (HV I-VI und IX-XII). S1 HV S2 A1 I A2 B1 + + B2 II + + + + III + + + + + + IV V + + + + VI + + + + B3 B4 + B5 B6 + + IX X + XI + + + + XII positiv 0 50 70 60 50 + + 10 30 30 0 0 in % 46 3. ERGEBNISSE 3.3.2 Granzyme B-ELISPOT Parallel zu den IFN-γ Assays wurden die entsprechenden Assays für die Granzyme B-Färbung durchgeführt. Abbildung 11 zeigt die Ergebnisse der Granzyme B-Freisetzung CD8+T-Zellen durch nach Stimulation mit den entsprechenden Peptiden bei HV XI. well1 well2 well3 MW Spot- 120 anzahl 100 80 60 40 20 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IM P CM V Peptid no pe pti de 0 Abbildung 11: Granzyme B-ELISPOT-Messwerte einer MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) eines gesunden Probanden (HV XI) nach Stimulation mit CMV(Zytomegalievirus), IMP(Influeza Matrix Protein), Survivin 1, Survivin 2, Aurorakinase A1-A2 und Aurorakinase B1-B6. Es wurden die Mittelwerte (MW) aus den dreifachen Messwerten (well1-3) ermittelt und dargestellt. Wie auch in der IFN-γ-Färbung für HV XI, sind auch in dieser Färbung die Ergebnisse für S2 (Mittelwert=43), A1 (Mittelwert=18) und B3 als positive Immunantworten zu werten. Der Nachweis einer Granzyme B-Sekretion in der Negativprobe, sowie bei Stimulation durch CMV, S1, A2, B1, B2 und B4-6 wurde als unspezifische T-Zellaktivität gedeutet. In Abbildung 12 erfolgt die Darstellung der korrespondierenden Spots auf der ELISPOT-Platte, die mittels ELISPOTReader eingelesen und dargestellt wurde. 47 3. ERGEBNISSE well 3 well 2 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IMP CMV no peptide well 1 Abbildung 12: Granzyme B ELISPOT der MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) von HV XI nach Stimulation mit entsprechenden Peptiden. Das Einlesen der Platte erfolgte ebenfalls mittels ELISPOT-Reader. Es wurden die Versuche mit den Zellen zwölf gesunder Probanden (HV I-XII) durchgeführt. Davon konnten die Ergebnisse dreier (HV I, III und X) nicht ausgewertet werden. Bei den Ergebnissen zu HV I wies die Negativprobe eine gleich starke Aktivität auf wie die Positivprobe. Bei HV III war die Reaktivität der "no peptide"-Fraktion gleich der der Peptid-gepulsten Zellen, und bei HV X war die Färbung so stark, dass die genaue Anzahl der Spots nicht vom ELISPOT-Reader ausgewertet werden konnte. Unter den insgesamt neun auswertbaren Versuchsergebnissen der HVs in der Granzyme B-Färbung wurde für die Epitope B5 und B6 keine Immunantwort detektiert. Allein bei HV XII, d.h. in 11% der auswertbaren Fälle konnte durch S1 eine Immunantwort induziert werden. Die Peptide B2, B3 und B4 konnten jeweils in 22% der Fälle eine Granzyme B-Sekretion und damit eine positive Immunantwort auslösen. Wie auch in den Interferon-γ Färbungen, konnte auch in den Granzyme B-Färbungen mit 33% am häufigsten durch die Peptide S2, A1, A2 und B1 eine positive Immunantwort ausgelöst und nachgewiesen werden. Tabelle 7 gibt eine Übersicht über alle Ergebnisse der Granzyme B-Färbung. 48 3. ERGEBNISSE Tabelle 7: Übersicht über die positiven Granzyme B ELISPOT-Assay-Ergebnisse (= +)bei neun von zwölf gesunden Probanden (HV I-XII). S1 HV S2 A1 A2 II B1 B2 B3 B4 B5 + B6 + IV V + + + + VI + + + + VII + + VIII IX XI + XII + positiv 11 + 33 + 33 33 + + + 33 22 22 22 0 0 in % Abbildung 13 gibt eine Übersicht über alle Ergebnisse der Zellstimulation durch die verwendeten Peptide. Wie anhand des Kurvenverlaufs ersichtlich ist, korreliert die Häufigkeit einer positiven Immunantwort auf eines der Peptide in beiden Färbungen. % der positiven Immunantworten IFN-γ in % Gr.B in % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 S1 S2 A1 A2 B1 B2 B3 B4 B5 B6 Peptid Abbildung 13: Übersicht der positiven Immunantworten durch Stimulation mit den verwendeten Peptiden. Die blaue Kurve gibt die Frequenz der positiven Ergebnisse in der IFN(Interferon)-γFärbung wieder, die rote Kurve die der Granzyme B-Färbung. 49 3. ERGEBNISSE Dies führte zu dem Ergebnis, dass unter den gesunden Probanden in unserem Testsystem das Peptid A1 die höchste Immunogenität besitzt, gefolgt von den beiden Peptiden A2 und S2. 3.4 Zelluläre Immunantworten gegen Survivin, Aurorakinase A und Aurorakinase B bei AML-Patienten Der Nachweis von spezifischen zellulären Immunantworten gegen ausgewählte Epitope der LAAs Survivin, Aurorakinase A und B bei AML-Patienten (klinische Charakteristika siehe Tabelle 4) erfolgte wie bei den gesunden Probanden, HV IXII, mittels MLPC und ELISPOT-Assay. In den Versuchen mit Zellmaterial von AML-Patienten wurde als Positivkontrolle nur das IMP-Peptid verwendet, da sich hierdurch in den HV-Versuchen eine verlässlichere Immunantwort auslösen ließ als durch das CMV-Peptid, und die verfügbare Zellzahlen für eine Testung mit beiden Positivproben nicht ausgereicht hätten. Aus einigen der Patientenproben ließen sich ebenfalls nicht genügend CD8+ Zellen gewinnen, dass eine MLPC mit allen Peptiden möglich gewesen wäre. Deshalb haben wir, entsprechend den Ergebnissen aus den zuvor durchgeführten HV-Versuchen, eine Rangfolge der Epitope nach Immunogenitätsgrad erstellt (Abb. 14). A1 A2 B1 S2 B4 S1 B2 B3 B5 B6 Abbildung 14: Rangfolge der Epitope nach Immunogenität in den HV(healthy volunteer)Versuchen. Je nach Vorhandensein von CD(cluster of differentiation)8+ Zellen wurden Patientenproben mit Peptiden dieser Rangfolge entsprechend in MLPC(mixed lymphocyte peptide culture) gebracht. 50 3. ERGEBNISSE 3.4.1 IFN-γ-ELISPOT In Abbildung 15 erfolgt die Darstellung der Ergebnisse des ELISPOTs eines Patienten für die IFN-γ-Freisetzung durch CD8+ Zellen. Patient 3 befand sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme in kompletter Remission (siehe auch Tabelle 4). well2 well3 MW Sur vivi n1 Sur vivi n2 Aur aA1 Aur aA2 Aur aB1 Aur aB2 Aur aB3 Aur aB4 Aur aB5 Aur aB6 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 no pep tide Spotanzahl IMP well1 Peptid Abbildung 15: IFN (Interferon)-γ-ELISPOT-Messwerte einer MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) eines AML-Patienten (Pat.3) nach Stimulation mit IMP (Influenza Matrix Protein), Survivin 1, Survivin 2, Aurorakinase A1-A2 und Aurorakinase B1-B6. Es wurden die Mittelwerte (MW) aus den dreifachen Messwerten (well1-3) ermittelt und dargestellt. Nach standardisierter Auswertung konnten für diesen Patienten die Epitope Survivin 1 (MW = 18Spots), Aurorakinase A2 (MW = 48Spots), B2 (MW = 15Spots), B3 (MW = 21Spots) und B5 (MW = 21Spots) als positiv, d.h. immunogen gewertet werden. Die geringe Interferonsekretion in der Negativprobe sowie in den S2-, A1-, B1-, B4- und B6-gepulsten Proben wurde als unspezifische T-Zellaktivität gewertet. In Abbildung 16 folgt die zu diesem Patienten korrespondierende Darstellung der Spots auf der ELISPOT-Platte. 51 3. ERGEBNISSE well 1 well 2 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IMP no peptide well 3 Abbildung 16: IFN Interferon)-γ ELISPOT der MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) von Patient 3 nach Stimulation mit entsprechenden Peptiden. Das Einlesen der Platte erfolgte mittels ELISPOT-Reader. Auf diese Weise wurden insgesamt neun AML-Patienten (Patient 1-9) mittels IFN-γ ELISPOT-Assay auf ihre Immunantworten gegen die oben aufgeführten Epitope untersucht. Unter den auswertbaren Versuchen zeigte sich eine fehlende Immunogenität für die Epitope S2, A1 und B6. S2 und A1 wurden für alle neun Patienten getestet, B6 für vier Patienten. Das Peptid A2 konnte in einem von sieben Patientenmaterialien, d.h. in 14% der Fälle eine Immunantwort hervorrufen. Die Epitope S1, B1, B2 und B4 -jeweils ein positives Testergebnis in jeweils sechs durchgeführten Versuchen- konnten in 17% der Fälle eine IFN-γ-Sekretion induzieren. Das Epitop B5 induzierte in einem von vier Versuchsansätzen, d.h. in 25% der Fälle, eine positive Immunantwort. Ebenfalls eine positive Immunantwort und in diesem Fall in 33% der untersuchten Proben, vermochte das Epitop B3 eine IFN-γ-Sekretion zu bewirken. Da letztendlich für jedes Epitop nur jeweils einmal eine spezifische T-Zellantwort ausgelöst werden konnte, ist eine Interpretation über die mehr oder weniger immunogenen, abgeleiteten Peptide nur in Zusammenschau mit den Testergebnissen der Granzyme B-ELISPOTs sinnvoll. 52 3. ERGEBNISSE 3.4.2 Granzyme B-ELISPOT Die folgende Abbildung (Abb. 17) zeigt die Ergebnisse der Granzyme B-Sekretion durch spezifische T-Zellen in Patient 3. well1 well2 well3 MW Spot- 200 anzahl 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Aur a B6 Aur a B5 Aur aB 4 Aur aB 3 Aur aB 2 Aur a B1 Aur a A2 2 S ur vivin Aur a A1 1 Su r vivin IMP no p e ptid e Peptid Abbildung 17: Gr. B-ELISPOT-Messwerte einer MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) eines AML-Patienten (Pat.3) nach Stimulation mit IMP (Influenza Matrix Protein), Survivin 1, Survivin 2, Aurorakinase A1-A2 und Aurorakinase B1-B6. Es wurden die Mittelwerte (MW) aus den dreifachen Messwerten (well1-3) ermittelt und dargestellt. Die Epitope A2 und B3 wurden wegen des positiven Testergebnisses als immunogen bewertet. So erzielte A2 einen Mittelwert von 112 Spots und B3 einen Mittelwert von 14 Spots. Die hierzu korrespondierende Darstellung der Spots auf der ELISPOT-Platte folgt in Abbildung 18. Entsprechend der IFN-γ Versuche, wurden auch für die Gr.B Versuche das Zellmaterial von neun AML-Patienten verwendet. Unter diesen durchgeführten und auswertbaren Versuchen konnte für die Peptide S1 und B6 keine Immunogenität nachgewiesen werden. 53 3. ERGEBNISSE well 1 well 2 B6 B5 B4 B3 B2 B1 A2 A1 S2 S1 IMP no peptide well 3 Abbildung 18: Granzyme B ELISPOT der MLPC (mixed lymphocyte peptide culture) von Patient 3 nach Stimulation mit entsprechenden Peptiden. Das Einlesen der Platte erfolgte mittels ELISPOTReader. A1 zeigte in einem von zehn Ansätzen und damit in 10% eine positive Gr.BSekretion. In einem von neun Ansätzen, d.h. in 11% der Fälle, konnte für S2 eine Gr.B-Sekretion nachgewiesen werden. Mit dem Epitop B2 gelang in einem von acht Ansätzen, d.h. in 13% der Fälle die Induktion einer Immunantwort. Durch B1 gelang in zwei von zehn Versuchen und damit in 20% der Fälle die Induktion einer spezifischen Immunantwort. Für B3 gelang in einem von vier Versuchen (25%) eine Immunstimulation, B4 in drei von neun Ansätzen (33%). Für die beiden Epitope A2 und B5 konnte in jeweils 40% der Fälle eine positive Immunantwort induziert werden. A2 gelang dies in vier von zehn Versuchen, B5 in zwei von fünf Fällen. Tabelle 8 gibt einen Überblick über alle IFN-γ und Gr.B-Versuche. Sie zeigt welche Versuchsansätze auswertbar waren und welche nicht. Diese Tabelle zeigt auch, welche Peptide in Abhängigkeit des verfügbaren Zellmaterials getestet werden konnten, und ob die getesteten Epitope eine Immunantwort auslösen konnten oder nicht. Da nicht alle Patienten mit allen Peptiden getestet wurden, wurde die Immunogenität dahingehend bewertet, in wie vielen Patienten eine positive Immunantwort -egal ob im IFN-γ, Gr.B oder in beiden Versuchsteilen- pro getesteter Patienten nachgewiesen werden konnte. Nach dieser Vorgehensweise stellt das Epitop B5 das immunogenste Peptid dar. Es wurde in fünf Patienten getestet, und konnte in dreien davon eine spezifische Immunantwort induzieren, d.h. in 60% der Fälle. Die Epitope B4 und B1 konnten in 38% der Fälle eine solche Immunantwort induzieren. Beide Peptide wurden in acht 54 3. ERGEBNISSE Patientenmaterialien getestet, davon in dreien positiv. B4 konnte in einer der Proben sowohl im IFN-γ-Ansatz, als auch im Gr.B-Ansatz eine Immunantwort auslösen. A2 wurde in drei von neun Patientenproben, und damit in 33% der Fälle positiv getestet. B2 konnte in 29% der Fälle, d.h. in zwei von sieben getesteten Patientenproben eine Immunantwort auslösen. Mit B3 konnte in einem von vier (25%) getesteten Patientenmaterialien eine positive Reaktion nachgewiesen werden. S1 kam auf 14% positive Immunantworten (1/7), S2 auf 13% (1/8) und A1 auf 6% (1/9). Durch das Peptid B6 konnte keine Immunantwort nachgewiesen werden. Die potentesten, immunogen wirkenden Epitope unter den AML-Patienten sind hiermit die von der Aurorakinase B abgeleiteten Peptide B5, B1 und B4, gefolgt von dem von der Aurorakinase A abgeleiteten Peptid A2. Tabelle 8: Übersicht über alle mit Patientenmaterial durchgeführten Versuche. Konnten bei einem Patienten Peptide aufgrund des zur Verfügung stehenden Zellmaterials nicht getestet werden, so sind die entsprechenden Zellen mit n.d. = not done gekennzeichnet. Für ein positives Ergebnis steht ein +, für ein negatives Ergebnis steht ein -. IFN= Interferon, Gr.= Granzyme auswertbar S1 S2 A1 A2 B1 B2 B3 B4 B5 B6 1 IFN nein 1 Gr.B ja - - - + - + - - - - 2 IFN ja - - - - - - - + - - 2 Gr.B ja - + - + + - - + + - 3 IFN ja + - - + - + + - + - 3 Gr.B ja - - - + - - + - - - 4 IFN ja - - - - + - - - - - 4 Gr.B ja - - + - - - - + + - 5 IFN nein 5 Gr.B ja n.d. n.d. - - + n.d. n.d. + n.d. n.d. 6 IFN ja n.d. - - - - n.d. n.d. - n.d. n.d. 6 Gr.B ja n.d. - - - - n.d. n.d. - n.d. n.d. 7 IFN ja - - - - n.d. - n.d. - n.d. n.d. 7 Gr.B ja - - - - n.d. - n.d. - n.d. n.d. 8 IFN ja - - - - - - n.d. - - - 8 Gr.B ja - - - - - - n.d. - - - 9 IFN ja - - - - - - n.d. n.d. n.d. n.d. 9 Gr.B ja - - - - - - n.d. n.d. n.d. n.d. 14 13 33 38 29 25 positiv in % der Patienten (in mind. einer Färbung) 6 38 60 0 55 4. DISKUSSION 4. DISKUSSION Eine effiziente Immuntherapie bei Patienten mit hämatologischen Erkrankungen setzt die Identifikation spezifischer Leukämie assoziierter Antigene (LAA) und deren immunologische Charakterisierung voraus. In der hier vorgestellten Arbeit wurden zytotoxische T-Zell-Antworten gegen die LAAs Survivin, Aurorakinase A und B bei der akuten myeloischen Leukämie untersucht. 4.1 Nachweis einer zellulären Immunantwort gegen die Mitoseassoziierten Antigene Survivin, sowie Aurorakinase A und B Das LAA Survivin ist das kleinste Mitglied der IAP (inhibitor of apoptosis)-Familie [116]. In adulten Zellen gesunder Menschen wird dieses Protein ausschließlich im Thymus, in der Plazenta, in CD34+ Stammzellen und in basalen Epithelzellen exprimiert. In leukämischen Zellen von AML-Patienten, ist es in 100% der Fälle nachweisbar [13]. Als IAP kann Survivin sowohl die Caspase-9 inhibieren, als auch den Checkpoint der Mitosespindeln regulieren. Die Cystein-AspartylProtease Caspase-9 spielt eine tragende Rolle für die intrinsische, d.h. die mitochondriale Apoptose. Erfährt die Zelle einen apoptotischen Stimulus, wird von den Mitochondrien Cytochrom C freigesetzt. Dies führt zur Formation des multimeren Apoptosomen-Komplexes, welcher wiederum die Caspase-9 aktiviert. Die aktivierte Protease spaltet und aktiviert in Folge die Caspasen-3 und -7 und führt so letztendlich zum Untergang der Zelle [1]. Auf diese Weise kann Survivin durch Inhibition der Caspase-9 den programmierten Zelltod verhindern. Ebenso fördert Survivin die Angiogenese und vermittelt eine gewisse Chemoresistenz. Entsprechend seiner Funktion, findet Survivin den Höhepunkt seiner Expression in der G2/M-Phase des Mitosezyklus, und wird in gesunden Menschen durch den p53-Wildtyp supprimiert [84]. In AML-Patienten sind Zytokine jedoch dafür verantwortlich, dass die Survivinexpression gesteigert wird [11], und damit die wachstumsfaktorunabhängige Zellproliferation erhöht und die Apoptoserate reduziert wird [33]. Survivin stellt ein geeignetes Ziel für eine Immuntherapie dar, da es zum einen in gesunden Zellen supprimiert wird und damit die Gefahr einer Schädigung gesunder Zellen gering sein müsste. Zum anderen wäre eine 56 4. DISKUSSION wiedergewonnene Kontrolle der erhöhten Zellproliferation und eine gesteigerte Apoptoserate in den leukämischen Zellen durch eine gezielte Immuntherapie gegen Survivin ein Schlüssel in der Therapie der AML. Die Aurorakinase A ist eine Serin-/Threoninkinase, welche vor allem während der Mitose aktiv ist. So findet man ihren Expressionspeak während der G2/M-Phase [38]. Blockiert man Aurorakinase A in dieser Phase, kommt es zu zahlreichen mitotischen Defekten [81]. In gesunden Personen lässt sich in hochproliferativen Geweben, wie Thymus oder Testes, eine verstärkte Expression der Kinase nachweisen [38]. Aufgrund der Blut-Thymus/-Hoden Schranke dieser Organe kann die Immuntherapie gegen Aurorakinase A daher zielgerichtet gegen tumoröse Zellen eingesetzt werden. Die zweite hier untersuchte Serin-/Threoninkinase ist die Aurorakinase B. Sie bildet das katalytische Zentrum des CPC (chromosome passenger complex). Auch hier korreliert die Lokalisation des Komplexes mit seiner Funktion. So nimmt er Einfluss auf die Kondensation des Chromatins [8], die korrekte Anlage der Mikrotubuli und den Aufbau der Zellspindeln [117]. Neben weiteren Tumorentitäten, findet sich auch in der AML eine Überexpression des Proteins [49]. 4.1.1 Detektion spezifischer T-Zellantworten mittels ELISPOT-Assay Um spezifische T-Zell-Antworten gegen LAAs nachzuweisen, wurde der ELISPOT-Assay durchgeführt. Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass sezernierte Zytokinmoleküle in direkter Umgebung der aktivierten CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten durch Färbung sichtbar gemacht werden. Es können bereits geringe Frequenzen von sezernierenden Zellen detektiert werden [57]. Die Differenzierung von einer naiven T-Zelle in einen CTL erfordert die Hilfe von CD4+ TH1-Zellen. Diese Zellen werden von APCs aktiviert, die den TH-Zellen über MHC-II ihre Antigene präsentieren. Die aktivierte TH1-Zelle sezerniert daraufhin unter anderem das Zytokin IL-2, welches die Differenzierung einer CD8+ T-Zelle fördert [70]. Für die MLPC wurden neben bestrahlten, antigenpräsentierenden CD8- Zellen, CD8+ T-Zellen in die Kultur gegeben. Zur Stimulation der Differenzierung der CD8+ T-Zellen wurde an Tag 1 der MLPC IL-2 und IL-7 in die 57 4. DISKUSSION Zellkultur pipettiert. Somit gelang es auch ohne das Vorliegen von TH-Zellen, immunkompetente, d.h. zytokinsezernierende T-Lymphozyten zu kultivieren. Damit waren die Rahmenbedingungen für die Aktivierung und Proliferation spezifischer T-Zellen gegeben. Die zytotoxischen T-Zellen können bei Antigenkontakt verschiedene Effektormechanismen ausführen. Als die wichtigsten antiviralen und antitumoralen Antworten werden die durch IFN-γ- und Granzyme B-Freisetzung vermittelten Antworten angesehen [91]. IFN-γ und Granzyme B können unabhängig voneinander oder in Zusammenarbeit Tumorwachstum und Infektionen kontrollieren [16,88]. In den ELISPOT-Assays wiesen wir als Surrogatmarker für die CTL-Aktivierung die Interferon-γ-Sekretion nach. Als Zeichen der ex vivo erzeugten zytolytischen Kapazität der CTLs, wiesen wir die Granzyme B-Sekretion nach [103]. Granzyme B ist als zytolytisches Protein in den Granulae von CD8+ T-Zellen und NK-Zellen gespeichert [78,85,103], und ist massgeblich an der Lyse von virusinfizierten und tumorösen Zellen beteiligt [28,35,107]. Granzyme B wird nicht von naiven CTLs sezerniert [45,62,95]. Shafer-Weaver et al. beschrieb erstmals die Granzyme B-Sekretion durch CTLs, neben der IFN-γ-Sekretion als Surrogatmarker für die spezifische T- Zellaktivierung, als Maß der zytotoxischen Kompetenz von CTLs und NK-Zellen festzulegen [104]. Die Granzyme B-Sekretion gilt hierbei als der spezifischere Nachweis, da sie direkt mit der Zytotoxizität des T-Lymphozyten korreliert. Der IFN-γ ELISPOT-Assay ist einer der meist verwendeten Assays um entsprechende Immunantworten nach Tumorvakzinierung nachzuweisen [48]. Dennoch korreliert er weniger stark mit der zytotoxischen Kompetenz der CD8+ T-Zellen [78]. Der Grund hierfür liegt darin, dass IFN-γ, im Gegensatz zu Granzyme B, nicht nur in aktivierten, zytolytischen Zellen exprimiert wird [12], sondern z.B. bereits bei einer Vermehrung von T-Lymphozyten [104], eine der Grenzen des IFN-γ-Assays [127]. Eine Schwäche beider ELISPOT-Assays ist die unspezifische T-Zellaktivität, d.h. die Hintergrundaktivität, die interindividuell mehr oder weniger stark ausgeprägt sein kann. Ein Grund für das Vorhandensein der Hintergrund-Spots kann in den Eigenschaften des verwendeten Zellmediums, bzw. dem darin enthaltenen Serum liegen. Man geht davon aus, dass sowohl mitogene als auch suppressorische Moleküle in den Sera vorliegen können [53]. Man könnte daher eventuell allein aufgrund der Eigenschaften des Serums eine T-Zellvermehrung detektieren. 58 4. DISKUSSION Mander et al. konnten zeigen, dass die Hintergrundaktivität nicht signifikant von der Art des verwendeten Serums abhängt, dass es jedoch je nach Protokoll mit Serum enthaltendem Medium zu einer leicht erhöhten Spotanzahl des Hintergrunds kommen kann [79]. Da die Viabilität der Zellen des ELISPOTs nicht geringer ist, wenn serumfreie Medien verwendet werden, ist es daher zu überlegen standardisierte, serumfreie Medien für den Assay zu verwenden [53,79]. 4.1.2 Unterschiede in der Immunogenität der Epitope bei gesunden Probanden und AML-Patienten Um eine immunologische Charakterisierung treffen zu können, haben wir zwei Survivin-Epitope, sowie zwei Aurorakinase A und sechs Aurorakinase B-Epitope getestet (siehe Tabelle 5). Die Immunogenität dieser Epitope haben wir zunächst in gesunden Probanden getestet. Davon ausgehend, dass die immunogensten Epitope aus diesen Versuchen auch in den Versuchen mit Zellen aus AMLPatienten die stärksten Immunantworten auslösen können, sind die Epitope entsprechend dem Ranking der Top-Peptide (siehe Abbildung 13) mit AML-Zellen getestet worden. Es fällt bei Betrachtung der Testergebnisse auf, dass innerhalb einer MLPC unterschiedliche Ergebnisse für den IFN-γ- und Granzyme B-Assay beobachtet werden können. Im Rahmen der HV-Testung fällt auf fast jedes positive Gr.BErgebnis ein positives IFN-γ-Ergebnis. Wohingegen für manche Peptide nur positive IFN-γ-Ergebnisse vorliegen. Der Grund hierfür könnte die unspezifischere Sekretion des Interferons sein. Im Gegensatz zu Granzyme B wird es bereits bei Vermehrung von T-Zellen sezerniert, ohne dass diese bereits zytotoxisch sein müssten. Diese Beobachtungen treffen nicht auf die Versuche mit AML-Zellen zu. Möglicherweise hängt deren Aktivierung und Differenzierung weniger stark von IFN-γ ab, was einen Nachweis desselben schwieriger macht. Die Immunogenität der einzelnen Peptide scheint davon abzuhängen, ob das Peptid gesunden T-Lymphozyten präsentiert wird, oder leukämischen TLymphozyten. So konnte in den HV-Versuchen mit den Epitopen A1, A2 und S2 59 4. DISKUSSION die stärksten spezifischen Immunantworten induziert werden, in den AMLVersuchen jedoch durch die Peptide B5, B1, B4, und A2. Diese unterschiedlich anmutende Immunogenität ist zu diskutieren. Die CD8Zellen wurden vor dem Pulsen mit Peptid und dem Hinzufügen zur MLPC als APCs bestrahlt, so dass man eine unterschiedliche proteasomale Spaltung der Peptide in gesunden oder in leukämischen APCs ausschließen kann. Ein Erklärungsansatz für die unterschiedliche Immunogenität, d.h. der Stärke der Immunantwort liegt in der Herunterregulation von MHC I Molekülen auf leukämischen Blasten [119]. Immunantworten gegen tumorassoziierte Antigene können so in AML-Patienten generell schwächer ausfallen. Eine Erklärung für die antigenbezogene unterschiedliche Immuninduktion zwischen gesunden und leukämischen Zellen kann durchaus darin liegen, dass in unserem Fall die Epitope B1, B4, B5 und A2 bereits in vivo bei AML-Patienten präsentiert wurden, und für diese Epitope bereits immunkompetente Gedächtnis-T-Zellen vorlagen. Um die Wertigkeit der Aurorakinase B mit den Epitopen B5, B1 und B4 als mögliches Immuntherapeutikum zu charakterisieren, müssen die Daten an einem größeren Patientenkollektiv -auch unter Beachtung des Krankheitsstatus- validiert werden. Außerdem muss im Weiteren eine spezifische Zytolyse nachgewiesen werden, z.B. mithilfe eines Chrom-Release-Assays. 4.2 Immuntherapien und Vakzinierungen bei malignen hämatologischen Erkrankungen Der nach allogener Stammzelltransplantation und der Spenderlymphozytengabe beobachtete Graft-versus-leukemia (GvL) -Effekt festigt die Annahme, dass TLymphozyten in der Bekämpfung von leukämischen Zellen eine bedeutende Rolle spielen [41,43]. Kolb et al. konnten 1988 die Effektivität des GvL-Effekts erstmals beim Menschen zeigen. Einem CML-Patienten mit Rezidiv wurden Spenderlymphozyten verabreicht, woraufhin der Patient in eine langanhaltende Remission überführt werden konnte [66]. Bestärkt wird diese Erkenntnis auch durch die erhöhten Rezidivraten, die bei dem Versuch die GvHD zu umgehen, unter T-Zell depletierten Knochenmarktransplantationen auftraten [67,96]. Die höchste Rezidivrate war unter einer solchen Lymphozytendepletion bei CML60 4. DISKUSSION Patienten zu beobachten, eine etwas geringere Rezidivrate unter AML-Patienten [51,65]. Das Ziel einer Vakzinierung mit Tumor assoziierten Antigenen ist daher, eine aktive Immunantwort des Patienten zu induzieren, die einen systemischen, lang währenden T-Zell vermittelten Schutz vor residualen Tumorzellen und Mikrometastasen bietet. Einschränkend muss an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass eine Therapie die auf einer T-Zell vermittelten Tumorzellkontrolle beruht, beispielsweise nicht vor einem Befall der Gewebe schützt, die unter normalen Umständen für das Immunsystem unzugänglich sind, wie etwa das ZNS [65]. Entsprechende Verlaufskontrollen sind unerlässlich. Mittlerweile gibt es eine Reihe bekannter Leukämie assoziierter Antigene, die für Immuntherapien eingesetzt werden können. Die Antigene werden dem MHC IPräsentationsweg des Patienten in Form von ganzen Zellen, Proteinen, Peptiden oder DNA, d.h. im Rahmen einer Gentransfektion zugeführt. Da die daraus hervorgehenden antigenen Epitope nur auf bestimmten MHC I, und damit nur in entsprechenden Patienten präsentiert werden können, ist die Anzahl der Patienten für eine solch spezifische Immuntherapie begrenzt. In einem Großteil der bislang durchgeführten Studien beschränkt man sich auf Antigene, die auf einem sehr häufig exprimierten MHC I, dem HLA-A2, präsentiert werden. Neben den aktiven Immunisierungen stehen die passiven Immunisierungen. Hierunter gibt es durchaus Möglichkeiten, den MHC-I Präsentationsweg zu umgehen. Eine davon ist die Therapie mit monoklonalen Antikörpern. Hierbei binden AKs spezifisch an die Oberflächenmoleküle leukämischer Zellen, beispielsweise an CD33. Es folgt eine AK-abhängige Zytotoxizität oder eine Aktivierung des Komplementsystems [86]. Eine weitere Möglichkeit, den MHC-I Weg zu umgehen, ist die Verabreichung von alloreaktiven NK-Zellen. Das Wirkprinzip dieser Methode besteht darin, dass natürliche Killerzellen eines Spenders über einen Mismatch ihrer KIRs (killer cell immunoglobulin like receptors) und der fehlenden MHC I-Molekülen des Spenders auf Zellen des Patienten, aktiviert werden [97]. Diese Methode würde sich besonders dann als wirksam erweisen, wenn die MHC-I Expression durch die Tumorzellen herunter reguliert wurde. Voraussetzung für die Eignung eines Antigens als Zielstruktur einer Immuntherapie ist seine konstante Expression im Tumorgewebe, d.h. in leukämischen Zellen, und einer damit verbundenen tumorfördernden Wirkung. Die von uns untersuchten Antigene erfüllen durchaus diese Anforderung. Alle von uns 61 4. DISKUSSION getesteten Mitose-assoziierten-Antigene werden auch in Zellen gesunder Menschen exprimiert. Jedoch entkommen sie hier durch ihre streng regulierte Expression weitestgehend einer gegen sie gerichteten Immunantwort. Das ideale LAA könnte eines sein, welches in dieser Form in gesunden Zellen gar nicht exprimiert wird. Es müsste zudem in hohen Konzentrationen vorliegen um mit einer hohen Wahrscheinlichkeit mit dem Immunsystem in Kontakt zu geraten, und es müsste zuverlässig auf den MHC-I Molekülen präsentiert werden. Das Hauptkriterium, das auch unsere LAAs erfüllen, ist die tumorfördernde Wirkung des vorliegenden Antigens. So konnte in 100% [13] der AML-Patienten eine Expression des apoptoseassoziierten Proteins Survivin in leukämischen Zellen nachgewiesen werden [72]. Die in 25-30% der AML-Patienten vorkommende ITDFlt3 Mutation ist mit einer erhöhten Survivin-Expression verbunden und mit einer schlechteren Prognose assoziiert [32,33,121]. Survivin ist das Antigen, das in Tumoren am vierthäufigsten exprimiert wird [59], und mit einem höheren Proliferationsindex und einer reduzierten Apoptoserate verbunden ist. Ebenso sind Assoziationen zwischen Survivin und erhöhter Chemoresistenz, sowie einer höheren Rezidivrate bekannt. Umstände, die Survivin als Ziel einer Immuntherapie äußerst attraktiv machen [61]. Eine Überexpression der ebenfalls von uns getesteten Aurorakinase A findet man neben der AML [87], auch in diversen weiteren Tumorentitäten [55,73,126]. Gleiches gilt für die Aurorakinase B [36]. Die Überexpression der Aurorakinasen führt zu genetischer Instabilität und einer Deregulation von Tumorsuppressor- und Onkoprotein-regulierten Abläufen [95], und ist mit einer schlechteren Prognose für die Patienten verbunden [8]. Ebenfalls Umstände, die sowohl die Auroakinase A, als auch die Aurorakinase B zu einem vielversprechenden Ziel einer Immuntherapie machen. 4.2.1 Peptidvakzinierungsstudien in der klinischen Prüfung Veröffentlicht wurden bisher Ergebnisse zu Peptidvakzinierungsstudien mit den LAAs Proteinase-3, Wilms Tumor Gen 1 und RHAMM/CD168 [61,95,101]. Das von Proteinase-3 abstammende Epitop PR1 konnte in einer Phase I/II Studie in 50% der Patienten eine spezifische Immunantwort, sowie klinische Antworten 62 4. DISKUSSION darauf auslösen. WT-1 Vakzinierungen wurden ebenfalls in einer Phase I/II Studie getestet und zeigten eindeutige klinische Effekte. So erlangte hierunter ein Patient mit partieller Remission, in eine komplette Remission. Zwei weitere Patienten konnten im Status der kompletten Remission gehalten werden [61]. Mittels RHAMM/CD168 Vakzinierungen konnte im Rahmen einer Phase I/II Studie in einem von drei AML-Patienten eine komplette Remission erreicht werden, einer konnte seinen Krankheitsverlauf stabilisieren und bei einem Patienten konnte ein Progress der Erkrankung nicht aufgehalten werden [101]. In allen drei Vakzinierungsstudien konnten die subkutanen Impfungen sicher und nebenwirkungsarm appliziert werden [41]. Aktuelle Studien testen die klinische Wirksamkeit einer polyvalenten Impfung, d.h. einer Peptidvakzinierung mit mehreren LAAs. So wurde in einer Phase ISicherheitsstudie bereits die Anwendung einer Vakzine aus PR1 und WT1 erprobt. Es wurden hierbei keine hämatopoetischen oder autoimmunen Nebenwirkungen beobachtet [95]. 4.3 Ausblick Die bisherigen Erfolge der Vakzinierungen mit Leukämie assoziierten Antigenen erscheinen erfolgversprechend. Allen bislang durchgeführten klinischen Studien ging eine Phase der Suche nach geeigneten LAA-Epitopen voraus. Gefolgt wurde diese Suche von klinischen Sicherheitsstudien und diese wiederum von der Erprobung der klinischen Wirksamkeit der Impfstoffe. Diese Arbeit zeigt zwei mögliche neue Kandidaten, die eine Rolle in der Immuntherapie erlangen könnten. Jedoch müssen weitere Untersuchungen an einem größeren Patientenkollektiv angeschlossen werden. Auch sollte systematisch untersucht werden, welchen Einfluss die Krankheitsaktivität auf eine Immunantwort hat. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse liefern in jedem Fall die Grundlage für eine weitere Charakterisierung und folgende Erprobung vielversprechender LAAs. 63 5. ZUSAMMENFASSUNG 5. ZUSAMMENFASSUNG Die Prognose für Patienten der Akuten myeloischen Leukämie (AML) ist trotz der aktuell angewandten genotypspezifischen Therapie mit unterschiedlichen Regimes der Polychemotherapie und/oder Stammzelltransplantation weiterhin ungünstig. Für Patienten die unter einer minimalen Resterkrankung (MRD), einer Chemotherapie-refraktären Erkrankung oder einem Rezidiv leiden, könnte eine spezifische Immuntherapie eine zusätzliche therapeutische Option darstellen. Bei Patienten die bereits eine komplette Remission erreicht haben, könnte eine spezifische Immuntherapie das Risiko eines Rezidivs reduzieren. Für die Leukämie assoziierten Antigene Proteinase 3, WT-1 und RHAMM wurden bereits Peptidvakzinierungsstudien für AML-Patienten initiiert, die sowohl positive immunologische als auch klinische Effekte zeigten. Die Antigene Survivin, Aurorakinase A und Aurorakinase B sind ebenfalls interessante Zielstrukturen für eine spezifische Immuntherapie, da diese Antigene ein tumorassoziiertes Expressionsmuster zeigen, in leukämischen Zellen von AML Patienten exprimiert werden und spezifische, CD8+ T-Lymphozyten vermittelte Immunantworten auslösen können. Von diesen Antigenen induzierte Immunantworten wurden in dieser Arbeit immunologisch charakterisiert. Dazu wurden sowohl Epitope untersucht über die bereits publiziert wurde, als auch Epitope, die mittels des Computerprogramms SYFPEITHI ausgewählt wurden. Der ELISPOT konnte durch die Induktion einer spezifischen Immunantwort für die in dieser Arbeit untersuchten antigenen Peptide etabliert werden, wobei bei zwölf gesunden Probanden (HVs) und neun AML Patienten Interferon-γ- und Granzyme B- Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assays durchgeführt wurden. In den hierfür durchgeführten Assays konnten die von der Aurorakinase B abstammenden Epitope B5, B1 und B4 als die immunogensten Epitope in AMLZellen identifiziert werden. Es gilt daher, diese Epitope in weiteren Untersuchungen auf ihren möglichen Einsatz als sichere und wirksame PeptidImpfstoffe, und damit als Zielstruktur einer CTL-vermittelten Immunantwort zu untersuchen. 64 6. LITERATURVERZEICHNIS 6. LITERATURVERZEICHNIS 1. Allan C., Clarke P.: Apoptosis and autophagy: Regulation of caspase-9 by phosphorylation. FEBS J 2009; 276: 6063-6073 2. 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Er hat mir das Thema dieser Dissertation überlassen und mich auf dem Weg zur Fertigstellung der Arbeit stets geduldig, hilfsbereit und zuverlässig in allen Belangen und Fragen unterstützt. Frau Dr. med. Susanne Hofmann danke ich für die vielen wertvollen Ratschläge und Hilfestellungen, die zur Erstellung dieser Arbeit ebenfalls bedeutend beigetragen haben. Dem Laborteam um Frau Marlies Götz gilt ebenfalls besonderer Dank. Durch sie wurde ich schnell in das Team integriert und in die Durchführung der Versuchsreihen eingearbeitet. Auch hier war die Zusammenarbeit sowohl fachlich, als auch menschlich eine Bereicherung. Herrn Prof. Dr. med. Hartmut Döhner, dem Ärztlichen Direktor der Klinik für Innere Medizin III des Universitätsklinikums Ulm, danke ich für die Möglichkeit, die Versuche zu meiner Dissertation in den Laboratorien der Medizinischen Klinik III durchgeführt haben zu können. Für die bedingungslose Unterstützung, Forderung und Förderung meines Seins danke ich zu guter Letzt meinen Eltern. Danke. LEBENSLAUF PERSÖNLICHE DATEN Name: Stephanie Egenrieder Geburtsdatum: 20.07.1985 Geburtsort: Schwäbisch Gmünd SCHULBILDUNG 1992-1996: Grundschule Großdeinbach 1996-2005: Parler-Gymnasium Schwäbisch Gmünd, Allgemeine Hochschulreife AKADEMISCHE AUSBILDUNG 10/2005-10/2011: Universität Ulm, Studium der Humanmedizin 09/2007: Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 11/2011: Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung PRAKTISCHES JAHR 08/2010-12/2010: Bundeswehrkrankenhaus Ulm: Innere Medizin, Abteilung Kardiologie und Hämatologie und Onkologie 12/2010-04/2011: Bundeswehrkrankenhaus Ulm: Neurologie 04/2011-07/2011: Bundeswehrkrankenhaus Ulm: Chirurgie, Abteilung für Gefäßchirurgie und endovaskuläre Chirurgie und Thorax- und Viszeralchirurgie
