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Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung...................................................................................................... 1 1.1 Biologie von Schwämmen............................................................................... 2 1.2 Symbiosen von Schwämmen.......................................................................... 5 1.2.1 Bakterielle Symbionten in Schwämmen ............................................ 6 1.2.2 Pilzliche Symbionten in Schwämmen ................................................... 9 1.3 Fragestellung ................................................................................................ 11 2 Untersuchungsgebiete und Probennahme ..................................... 12 2.1 2.2 2.3 2.4 Untersuchungsgebiete.................................................................................. 12 Probennahme ............................................................................................... 12 Aufarbeitung der Schwammproben .............................................................. 14 Hälterungsansatz.......................................................................................... 15 3 Material und Methoden .......................................................................... 16 3.1 Morphologische Untersuchung der Schwämme ........................................... 16 3.1.1 Lichtmikroskopie.............................................................................. 16 3.1.1.1 Vibratomschnitte ................................................................ 16 3.1.1.2 Histologische Färbungen ................................................... 17 3.1.1.3 Kollagenase-Nachweis ...................................................... 18 3.1.2 Transmissionselektronenmikroskopie ............................................. 19 3.1.3 Rasterelektronenmikroskopie.......................................................... 20 3.2 Mikrobiologische Untersuchungen................................................................ 20 3.2.1 Pilzisolation und Kultivierung........................................................... 20 3.2.2 Pilzkultivierung für naturstoffchemische Untersuchungen ............... 22 3.2.3 Bakterienisolation und Kultivierung ................................................. 22 3.3 Molekularbiologische Methoden ................................................................... 23 3.3.1 DNA-Extraktion................................................................................ 23 3.3.1.1 DNA Extraktion aus Schwammproben............................... 23 3.3.1.2 DNA Extraktion aus Bakterienreinkulturen......................... 25 3.3.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .................................................. 25 3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................ 27 3.3.4 Verdau der bakteriellen 16S rRNA zum Artenvergleich der Schwamm-Isolate............................................................................ 27 3.3.5 Klonierung der bakteriellen 16S rRNA PCR-Produkte..................... 28 3.3.6 Einzelstrang Konformationspolymorphismus (SSCP) ..................... 29 3.3.7 Reamplifikation von SSCP-Banden................................................. 31 3.3.8 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE)................... 32 3.3.9 Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH)....................................... 33 3.3.10 Sondengenerierung für FISH .......................................................... 36 3.3.11 Sequenzanalyse.............................................................................. 37 3.3.12 Stammbaumberechnung ................................................................. 38 4 Ergebnisse ..................................................................................................39 4.1 Vergleichende histologische Untersuchungen zu mikrobiellen Endound Epibionten verschiedener Schwammarten...........................................39 4.1.1 Besiedlung der Schwammoberfläche...............................................39 4.1.2 Besiedlung des Schwammgewebes ................................................40 4.2 Bakterielle Endobionten in Axinella verrucosa ..............................................48 4.2.1 Fadenförmige Mikroorganismen im Spongin ...................................49 4.2.2 Bakterien in intrazellulären Vakuolen...............................................53 4.2.3 Kollagenaseaktivität.........................................................................54 4.2.4 Hälterungsexperiment......................................................................55 4.3 Kultivierte bakterielle Diversität in Axinella verrucosa ...................................57 4.4 Genetische Diversität der Bakterien in Axinella verrucosa ............................59 4.4.1 Klonierte bakterielle Diversität in Axinella verrucosa........................59 4.4.2 Vergleich der Bakterienpopulationen von Axinella verrucosa und Vergleichsschwämmen mit SSCP und DGGE .........................65 4.5 Bestimmung der Bakterien in Axinella verrucosa durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) .........................................................................71 4.5.1 Untersuchungen mit domäne- und gruppenspezifischen Gensonden ......................................................................................71 4.5.2 Generierung von spezifischen Sonden für Axinella verrucosa Bakterien..........................................................................................73 4.6 Isolierbare pilzliche Diversität ausgewählter mediterraner Schwämme .........77 4.6.1 Hyphenpilze .....................................................................................77 4.6.2 Pilzähnliche Protisten.......................................................................78 4.6.3 Neue Sekundärmetabolite aus schwammisolierten Pilzen...............79 5 Diskussion ..................................................................................................81 5.1 Mikrobielle Epi- und Endobionten verschiedener Schwammspezies.............81 5.1.1 Mikrobielle Besiedlung der Schwammoberfläche ............................81 5.1.2 Mikrobielle Besiedlung des Schwammgewebes ..............................82 5.2 Bakterielle Endobionten von Axinella verrucosa ...........................................86 5.2.1 Bakterien des Mesohyls...................................................................86 5.2.2 Filamentöses ˺-Proteobakterium im Sponginskelett........................87 5.2.3 Bakterien in Vakuolen der Schwammzellen.....................................93 5.2.4 Kultivierte bakterielle Diversität........................................................94 5.2.5 Klonierte bakterielle Diversität .........................................................96 5.3 Pilze aus den Schwammproben ..................................................................101 5.3.1 Isolierte Hyphenpilze aus den untersuchten Schwämmen.............101 5.3.2 Isolierte pilzähnliche Protisten aus den untersuchten Schwämmen ..................................................................................105 5.4 Schlussbetrachtung.....................................................................................106 6 Zusammenfassung ................................................................................108 7 Literaturverzeichnis ...............................................................................109 8 Abkürzungen ............................................................................................132 9 Anhang .......................................................................................................134
